Генерация и идентификация GM-CSF производный альвеол, как макрофаги и дендритные клетки из костного мозга мыши

1Microbiology and Immunology, University of British Columbia
Published 6/25/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Dong, Y., Arif, A. A., Poon, G. F., Hardman, B., Dosanjh, M., Johnson, P. Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow. J. Vis. Exp. (112), e54194, doi:10.3791/54194 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Макрофаги и дендритные клетки (ДК) являются врожденные иммунные клетки, которые находятся в тканях и органах лимфоидных, которые играют ключевую роль в защите от патогенных микроорганизмов. Тем не менее, их трудно выделить в достаточном количестве , чтобы изучить их подробно, поэтому, модели в пробирке, были разработаны. В пробирке культуры из костного мозга макрофаги и дендритные клетки являются хорошо зарекомендовавшие и ценные методы иммунологических исследований. Здесь описан способ культивирования и идентификации как ДТС и макрофаги от одной культуры клеток костного мозга первичной кости мыши с использованием колониестимулирующий фактор макрофагов гранулоцитов цитокина (GM-CSF) описывается. Этот протокол основан на установленном порядке первой разработанной Лутц и др. в 1999 году из костного мозга РС. Культура неоднородна, и MHCII и fluoresceinated гиалуронана (FL-HA) используются для различения макрофаги от незрелых и зрелых ДК. Эти GM-CSF, полученный макрофаги просмотри удобный источник в пробирке полученных макрофагов , которые близко напоминают альвеолярные макрофаги в обоих фенотипа и функции.

Introduction

Существует несколько методов культурах клеток, были описаны для генерации из костного мозга макрофаги (BMDMs) и из костного мозга (DCS BMDCs) с использованием одного или комбинации факторов роста. BMDMs могут быть получены путем культивирования клеток костного мозга с использованием либо макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF) или GM-CSF 1,2. Для BMDCs, добавление лиганда FLT3 к культуре костного мозга приводит к неприлипающими классических и плазмоцитов ГЦ (CD11c высокий / MHCII высокий и CD11c Lo, B220 + соответственно) через 9 дней в культуре 3,4. В отличие от этого , не прилипшие клетки генерироваться после 7 до 10 дней в культуре с использованием только GM-CSF 5,6, GM-CSF , и IL-4 , 7, или GM-CSF , и FLT3 лиганд 8,9 генерировать BMDCs более близко напоминающих воспалительные DCs (CD11c высокий, высокий MHCII CD11b +) 10. В то время как эти культуры в пробирке используются для создания макрофаги илиКонтроллеры домена, неясно, если каждая культура порождает чистых популяций. Например, хотя прилипшие клетки в GM-CSF культур описаны как макрофаги 5, неадгезивные клетки из той же самой культуры используются в качестве контроллеров домена 6,11-13, с предположения , что они являются однородными и любых наблюдаемых изменчивость из - за различных этапах развития 14,15. Кроме того, исследования показали , GM-CSF , чтобы стать существенным фактором роста для развития альвеолярных макрофагов в естественных условиях 16,17, и может быть использовано в пробирке для генерации альвеолярных типа макрофаги 16,17,18.

Кроме соблюдения, процедуры генерации макрофаги и контроллеры домена с GM-CSF, обработанных культурах костного мозга очень похожи предполагает гетерогенность может существовать в GM-CSF культурах костного мозга. Это на самом деле, кажется, так, как две газеты сообщают о присутствии BMDMs в неприлипающими фракции BMDC культур. В одном документе, они Опознавательнаяред популяция клеток как CD11c +, CD11b +, MHCII середине, MerTK + и CD115 +, выразившего экспрессии генов подписи , который наиболее близко напоминающее альвеолярные макрофаги и имели пониженную способность активировать Т - клетки 19. Второй документ используется MHCII и FL-HA для идентификации альвеолярного макрофага типа населения (CD11c +, MHCII средний / низкий, FL-HA высокий) , который был отличен от незрелых (CD11c +, MHCII середина, FL-HA низкий) и пожилые РС (CD11c +, MHCII высокий), как фенотипически и функционально 18. Эти документы показывают, что оба GM-CSF BMDC культуры являются гетерогенными, содержащие как макрофаги и популяции DC, указывающего, что следует проявлять осторожность при интерпретации данных из BMDC культур.

Этот протокол описывает, как изолировать костный мозг, клетки мозга кости в культуре GM-CSF, а также определить альвеолярного микрофагоподобныхнаселение от незрелых и зрелых ДК в культуре костного мозга с помощью проточной цитометрии с использованием связывания и экспрессию MHCII FL-HA. Эта процедура основана на установленном порядке Лутц и др 6 и способен генерировать . 5 - 10 х 10 6 неприкрепленных клеток на 7 -й день в 10 мл культуры. Культура может использоваться от 7 дней до 10 и дает гетерогенную популяцию макрофагов, незрелых и зрелых ДК, а также некоторых клеток - предшественников на 7. Это обеспечивает простой способ , чтобы расти и изолировать в пробирке альвеолярно-как макрофаги в больших количествах день.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Мыши были умерщвлены в соответствии с Канадским советом по руководящим принципам ухода за животными для этических исследований животных по методикам, утвержденным в Университете Британской Колумбии Animal Care комитета.

1. Получение единственной клетки костного мозга мышей от подвески бедром и голенью

  1. Включите шкаф биологической безопасности (BSC) 15 мин до начала процедуры, чтобы очистить воздух кабинета и позволяют для стабилизации потока воздуха, затем чистой / спрей BSC поверхность с 70% -ным этанолом. Держите все как стерильные, насколько это возможно для полноты протокола. Не режьте кости в нестерильных условиях.
  2. Подготовка рассечение инструментов путем замачивания в 70% этаноле (1 пара рассечение ножницами, 2 пары щипцов), Хэнка сбалансированный солевой раствор с 5% эмбриональной телячьей сыворотки (HBSS-FCS), стерильные чашки Петри (100 мм х 15 мм), 1 шприцы мл, 26½ калиброванными иглами, конические пробирки для сбора (15 мл или 50 мл), и бумажные полотенца в BSC.
  3. Эвтаназии мышь с помощьюпротоколы, утвержденные комитетом по этике исследований на животных учреждения. Привести в BSC, место на вершине одного или двух бумажных полотенец и распылить мышь с 70% этанола.
  4. В BSC, открыть стерильную чашку Петри в асептических, аликвоту 10 мл HBSS-FCS к основанию и 1 - 2 мл на крышке.
  5. Поместите мышь на животе с задней стороной вверх и поднимите кожу вокруг грудных участков с пальцами не доминантной рукой. Используйте ножницы, чтобы сделать надрез, где поднятый кожа.
  6. Держись к обоим концам разреза, один конец с каждой стороны и аккуратно растащить кожу вокруг мыши со спины на живот, продолжайте тянуть до двух концах разреза встречаются в желудке.
  7. Переверните мышь к животу лицевой стороной вверх и с одной стороны тянут нижнюю половину кожи вниз к ноге, продолжайте отходили кожу, пока ноги не подвергаются.
  8. Держите ногу мыши вверх и вырезать ахиллова сухожилия выше голеностопного сустава исвязки, соединяющие мышцы ног в нижней части большеберцовой кости с помощью ножниц. Это ослабляет ногу от костей ног.
  9. Удерживая ногу на ногу, сократить мышцы и связки ножницами вокруг коленного сустава у нижнего конца бедренной кости, чтобы разъединить мышцы бедра из нижней части ноги. Используйте пинцет, чтобы аккуратно потянуть ослабленные мышцы от малоберцовой кости и бедренной кости поверхностей. Будьте осторожны, чтобы не перерезать бедренную артерию, чтобы избежать сильного кровотечения.
  10. С одной стороны, держась за ногу, надавите открытые ножницы в верхней части бедренной кости в тазобедренном суставе, повернуть ногу и осторожно потяните, чтобы отделить бедро от тазобедренного сустава при использовании ножниц, чтобы сделать окончательный разрез на бесплатной нога от тела.
  11. С этого момента, только держать ткани с стерильным пинцетом. Держись к ноге на одном конце и снять ногу с другой.
    Примечание: Это не должно требовать больших усилий, так как соединительные связки нарезают на этапе1.9. В качестве альтернативы, сократить берцовую кость чуть выше лодыжки, где слит кость.
  12. Удерживая ногу дистального конца бедренной кости с одним набором щипцов и проксимального конца большеберцовой и малоберцовой костей с другой, осторожно согнуть большеберцовой и малоберцовой костей в противоположном направлении коленного сустава, чтобы отделить их от бедренной кости и коленной чашечки.
  13. Используйте пинцет, чтобы тянуть вниз остальные связки и мышцы все еще прикрепленные к костей голени. Здесь, удалите малоберцовой кости вместе с соединительной ткани с щипцами, как он слишком мал, чтобы быть промыты в клетках костного мозга. Положите вымытую большеберцовой кости на перевернутой чашки Петри крышкой.
  14. Держите нижний конец бедренной кости с одним набором щипцов и коленной чашечки с другой, согнуть надколенника и окружающие ткани в направлении, противоположном направлению соединения для удаления. Затем счистить оставшиеся соединительные ткани от бедренной кости; потянув их прочь с пинцета, и поместить его на перевернутую чашку Петри крышкой. Откажитесь коленной чашечки.
  15. Повторите 1.7- 1.13 с другой ногой, если это необходимо. Перенесите кости до 1,6 мл микроцентрифужных пробирки, содержащие 1 мл стерильной HBSS-FCS для транспортировки в случае необходимости.
  16. Поместите кости на перевернутой чашки Петри, крышки, с 1 - 2 мл HBSS-FCS, использование щипцов для очистки любых остатков ткани все еще прикрепленные к большеберцовой и бедренной кости, а затем перенести кости к основанию чашки Петри, содержащую 10 мл HBSS- FCS. В качестве альтернативы, очистить кости и удалить прикрепленный мышечную ткань, используя 70% -ный этанол пропитанной ткани.
  17. Разрежьте каждый из костей пополам с помощью ножниц. Частично щит чашку Петри со стерильной крышкой во время резки, чтобы обеспечить кости остаются в блюде. В качестве альтернативы, отрезать конец каждой кости, чтобы позволить промывку в следующем шаге.
  18. Прикрепите 26½ G иглу на 1 мл шприца, и составлять 1 мл HBSS-FCS из чашки Петри. Вставьте кончик иглы в конце костной части и вымывать клетки костного мозга (мягкая красная ткань внутри костей). Вставьте иглу в головкукости и открытым концом, пока весь красный цвет мозг не будет удален. Обратите внимание на кости, как белый цвет.
  19. Передавать любые видимые сгустки костного мозга через шприц несколько раз, чтобы сформировать одноклеточной суспензии.
  20. Откажитесь промытой кости. С помощью 10 мл пипетки для смешивания суспензии клеток хорошо и передать в пробирку. Ополосните чашку Петри один раз 5 мл HBSS-FCS для сбора остаточных клеток в чашке. Поместите клетки на льду.
    Примечание: Суспензию клеток костного мозга все еще ​​жизнеспособна , при хранении в течение 2 - 3 ч при температуре 4 ° С.

2. Покрытие и Культивирование клеток костного мозга (контроллеров BMC)

  1. Подготовьте следующие реагенты и расходные материалы.
    1. Подготовка красных кровяных клеток (эритроцитов) буфера для лизиса путем 0,84% хлорида аммония в конечном растворе 2 мМ Трис, рН 7,2, а затем стерилизуют фильтрацией через фильтр 0,2 мкм.
    2. Подготовка контроллера ВМС носитель путем добавления 10% FCS, 20 мМ HEPES, 1x заменимая аминокислота, 55 & #181; М 2-меркаптоэтанола, 50 ед / мл пенициллина и стрептомицина, 1 мМ пирувата натрия, и 2 мМ L-глутамина в RPMI среде 1640.
    3. Получают коммерчески доступный рекомбинантный GM-CSF или используют GM-CSF , содержащий супернатант из Ag8.653 клеток миеломы , трансфицированных геном GM-CSF 20. Определить концентрацию GM-CSF в супернатанте с помощью ELISA и добавляют эквивалент 20 нг / мл в средствах массовой информации BMC.
  2. Спин вниз клеток костного мозга при 314 мкг в течение 5 мин. Осадок красного цвета, из-за эритроцитах. В BSC, аспирация супернатант, используя стерильную стеклянную пипетку Пастера, прикрепленную к вакуумного отсоса, ослабьте осадок, нажав, а затем добавляют 10 мл буфера для лизиса эритроцитов. Вихревой для ресуспендирования клеток и инкубировать в буфере для лизиса эритроцитов при комнатной температуре в течение 5 мин.
  3. Добавьте 10 мл HBSS-FCS затем оплетают клетки при 314 мкг в течение 5 мин и аспирата супернатант. Обратите внимание на клеточный осадок в виде белого цвета. Ресуспендируют клетки в желаемом объеме БМК сред.
  4. Подсчитайте RESUтовар.Обращайте-клетки с помощью гемоцитометра после окрашивания отмершие клетки с 0,4% трипановым синим.
    Примечание: Если костный мозг от одной ноге (одиночный большеберцовой кости и бедренной кости) используется, ресуспендируют в 5 мл БМК сред, принимают по 10 мкл клеточной суспензии и развести его с 70 мкл 0,4% трипанового синего, хорошо перемешать и передать 10 мкл 1/8 ячейки разбавления в камере гемоцитометра. Количество жизнеспособных клеток в четырех квадрантах: среднее из четырех отсчетов квадранте х коэффициент разбавления х 10 4 = количество клеток на мл. Бедренной кости и большеберцовой кости с одной ноги, как правило , получается примерно 2 - 4 × 10 7 клеток после лизиса эритроцитов.
  5. Оценить количество 10 мл блюд культур костного мозга, необходимых для последующих экспериментов, основанных на количестве общего числа клеток, необходимых для проведения экспериментов в конце культуры.
    Примечание: Каждое блюдо требует 2 × 10 6 клеток костного мозга при первичном посеве и урожайность 5 - 10 × 10 6 клеток на 7 -й день.
    1. АлиQuot общее количество клеток для металлизации в новую пробирку, спином вниз на 314 мкг в течение 5 мин, аспирата супернатант и ресуспендирования клеток в 4 - х 10 6 клеток / мл в средах ВМС.
  6. Подготовьте новый стерильный 100 мм х 15 мм чашки Петри с 9,5 мл БМК среде, содержащей 200 нг GM-CSF (рекомбинантный или из GM-CSF, содержащего супернатант). Добавьте 500 мкл 4 × 10 6 клеток / клеток костного мозга мл в центр чашки Петри для конечной концентрации 2 × 10 5 клеток / мл в 10 мл.
    Примечание: Важно использовать стерильную чашку Петри а не блюдо культуры ткани. Кроме того, при добавлении клеток, обеспечить клетки остаются сосредоточены в центре и свести к минимуму помехи для блюд после посева и во время смены носителя. Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% CO 2. Это день 0 в культуре.
  7. На 3-й день, добавляют 10 мл свежей среды, содержащей ВМС 200 нг GM-CSF, в каждую чашку клеток. Позаботьтесь, чтобы свести к минимуму воздействие Oе клеток, сосредоточенных в суспензии. Общий объем клеточной культуры в настоящее время в 20 мл.
  8. Заметим клетки под световым микроскопом при 100-кратном увеличении. Заметим, многочисленные, не прилипшие клетки (круглый) и несколько прилипших клеток (плоские). Клетки в группах из трех или четырех, напоминающих лепестки цветка можно увидеть, что указывает на пролиферацию.
  9. На 6-й день выполнить половину смены носителя. Осторожно удалите 10 мл среды в стерильный 50 мл коническую пробирку, спином вниз на 314 мкг в течение 5 мин, аспирация и отбросить супернатант.
  10. Ресуспендируют осадок клеток в 10 мл свежей среды, содержащей ВМС 20 нг / мл GM-CSF, мягко вихрем и добавить к исходной клеточной культуры блюдо для общим объемом 20 мл. Обратите внимание клетки под микроскопом.
    Примечание: День 7 культура должна быть на уровне 70% или больше , в сплошности с присоединенными плоскими клетками и плотных облаков круглых неслипшихс клеток.

3. Сбор и подготовка BMDC и BMDMs для проточной цитометрии

    <li> Храните все буферы при 4 ° С.
  1. Сбора клеток с 7-го дня до 10-й день Для сбора клеток сначала перенесите 10 мл надосадочной жидкости культуры в 50 мл коническую пробирку, а затем наклонить антенну вертикально примерно на 30 градусов и мыть посуду с помощью пипетки оставшиеся 10 мл культуры от верхней части блюда. Повторите этой промывки 5 раз, каждый раз поворачивая блюдо на одну треть.
  2. Перенесите оставшиеся 10 мл клеток в той же пробирку для сбора и выбросить тарелку и прилипшие клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Промывки удалит неадгезированных и свободно прилипшие клетки; плоские прилипшие клетки устойчивы к стирок. Как правило, между 5 - 10 х 10 6 , не прилипшие клетки , как ожидается , с одной пластины на 7 -й день и 2 - 5 х 10 6 клеток на 10 -й день, хотя Лутц и др. сообщили 10 × 10 6 клеток на 10 -й день Адгезивные клетки обычно не принимаются. Однако, если эти клетки должны быть по сравнению с неприлипающими клеток, Они могут быть удалены следующим образом. Добавляют 5 мл 0,7 мМ ЭДТА в 1X PBS, рН 7,4 в чашке после неадгезивные клетки удаляются, инкубировать при 37 ° С в течение 5 мин, пипеткой вверх и вниз, чтобы удалить прилипшие клетки и собирают в отдельную пробирку.
  3. Спин вниз собранные клетки при 314 мкг в течение 5 мин и аспирата супернатант. Ресуспендируют в 5 мл стерильной БМК среде при температуре 4 ° С, вихревое осторожно перемешать, и рассчитывать с помощью трипанового синего и гемоцитометра.
    Примечание: Каждое блюдо даст 5 - 10 х 10 6 неприкрепленных клеток из культуры , 7 -й день. С этого момента, выполнять все действия при 4 ° С.
  4. Для анализа методом проточной цитометрии, передачи 2 × 10 5 клеток для каждого образца в 5 мл полистирола с круглым дном пробирки, добавляют 300 мкл буфера FACS при температуре 4 ° С (1х забуференный фосфатом физиологический раствор, 2 мМ ЭДТА и 2% бычий сывороточный альбумин) в каждой образец.
  5. Спин клетки вниз на 314 мкг в течение 5 мин и аспирата супернатант. Обратите внимание видимый белый, непрозрачный осадок в тоДно трубки.
  6. Ресуспендируют клеток в 100 мкл немеченого рецептора Fc-Ab блокировать рецептор Fc связывания (Use 1/10 супернатант из 2.4G2 продуцирующей клетки миеломной линии) и инкубируют в течение 20 мин при 4 ° C. Затем добавляют 300 мкл буфера FACS для каждого образца, осторожно вихревым, затем оплетают клетки вниз на 314 мкг в течение 5 мин и аспирата супернатант.
  7. Ресуспендируют клеток в 100 мкл CD11c-PeCy7 при 0,2 мкг / мл, Gr1-Pacific Blue при 0,25 мкг / мл, MHCII-АРС в количестве 0,05 мкг / мл, и FL-HA приблизительно 2 мкг / мл для идентификации макрофаги и ДКБ.
    Примечание: FL-HA был подготовлен в доме с использованием флуоресцеин и петушиных гребней натриевую соль гиалуроновой кислоты , как описано выше 21.
  8. Инкубировать в течение 20 мин при 4 ° С для обеспечения связывания с клеточной поверхностью. Добавьте 300 мкл буфера FACS для каждого образца, мягко вихрь, затем оплетают клетки вниз на 314 мкг в течение 5 минут при 4 ° С и аспирата супернатант Примечание:. Если биоtinylated антитела используются в 3.8, 3.8 повторить - 9 с люминесцентными-стрептавидина.
  9. Промыть клетки с еще 300 мкл буфера FACS, осторожно перемешать вихре и спином вниз клетки при 314 х г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и клетки вновь суспендируют в 200 мкл FACS буфера, содержащего 0,1 - 0,2 мкг на мл пропидийиодидом или DAPI для обозначения нежизнеспособные клетки. Клетки теперь готовы для анализа 22 проточной цитометрии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: См Результаты и Рисунок 3 Подробную информацию о популяциях и как были закрытого типа клетки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Блок - схема кратко описываются основные этапы этого способа показана на рисунке 1. Плотность и морфологию культуры костного мозга в разное время культивирования показаны на рисунке 2. В 1 -й день, клетки маленькие и редкие , но с 3 -й день, есть больше клеток, некоторые из них больше, и некоторые из них уже начали придерживаться. К 6 -й день существует определенная приверженцем и не приверженец фракция (рис 2А). Культура может быть собран с первого дня 7 - 10 с более высоким процентом CD11c + клеток , присутствующих в день 10. Рисунок 2B показывает культуру 7 -й день до сбора урожая, а также отделенных прилипшие и неадгезированных фракции клеток. Приверженец фракция состоит из клеток, оставшихся после легких стирок, которые удаляют неприлипающими фракции. Неадгезивные фракция сильно обогащена клеток с дендритной морфологии, которые могут быть более четко видны в цифровом виде увеличенных имвозраст в вставках на рисунке 2B. После того , как не прилегающего фракция удаляется (день 7 или 10 день), клетки анализировали с помощью проточной цитометрии после мечения с флуоресцентными антителами против ключевых маркеров клеточной поверхности, как описано выше. Рисунок 3 показывает репрезентативную проточной цитометрии участков неадгезивные доля культуры в 7-й день и 10-й день.

Для идентификации обоих макрофагов и ДК, ворота на CD11c + и Gr1 - клетки после первого стробирования по размеру и живых клеток (рис 3А и В). В день 7 культурах, CD11c + Gr1 - население во фракции не прилипших клеток , как правило , от 60 до 70% от общего числа живых клеток, и это увеличивается до 90% или более на 10 -й день (рис 3б). CD11c + Gr1 - население в 7 -й день и 10 -й день можно разделить на три основных подмножеств с использованием MHCII и FL-HA биндинг: MHCII средний / низкий FL-HA связующем макрофаги (P1), MHCII середины FL-HA связывания низкие (P2) клетки , содержащие незрелые контроллеры домена, и MHCII высокой FL-HA связывания низкой зрелых DCs (P3) (рис 3C и ссылки 18 ). FL-HA низкий, низкий MHCII популяции (Р0) , наблюдаемые в 7 -й день было показано, содержат клетки - предшественники для клеток P1-P3 18. Это население не бросается в глаза на 10-й день подразумевая, что дальнейшее созревание культуры произошло. Это также поддерживается больший процент CD11c клеток в культуре, а также несколько более высокий процент населения P2 и P3 постоянного тока в день 10. Рисунок 3D показывает MerTK, который считается Фагоцит маркером, высоко экспрессируется как на макрофагах и популяции незрелых DC (P1 и P2), но выражается в меньшей степени, на зрелых DCs (P3 клетки). В частности, анализ показывает, прилегающего фракции присутствие P0, P1 иP2 популяции, но не население P3 зрелые DC (данные не показаны). Таким образом, макрофаги присутствуют в адгезивных и неприлипающими фракций, но только зрелые ДК присутствуют в неприлипающими фракции.

Рисунок 1
. Рисунок 1: Диаграмма последовательности операций , обозначающая ключевых шагов первичного способа клетки собирают из костного мозга, высевают и выдерживают в культуре в течение 7 - 10 дней , когда они собирают для использования в дальнейших экспериментах, очищенных или используемых при анализе FACS. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: микроскопическое исследование GM-CSF производный клеток костного мозга. А) культуру костного мозга в 1-й день, 3 и 6, показывающий увеличение количества клеток, изменения в морфологии, и появление различных адгезивных и неприлипающими фракций. B) Левая панель показывает 7 -й день культуры костного мозга и типичную плотность клеток. Средняя панель показывает день 7 прилипшие клетки после сбора урожая в неприлипающими фракции и правой панели показывает неприлипающими фракцию собирают в день 7. вставках в цифровом виде увеличенных изображений клеток в этой фракции с дендритной морфологии. Белая шкала полоса представляет 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Представитель фенотип GM-CSF культуры на 7день и 10 день неприлипающимиКлетки из культуры помечены CD11c, Gr1, MHCII, ФЛ-HA, и MerTK на 7 -й день или 10 -й день и анализируют на их фенотипа с помощью проточной цитометрии. A) Сначала клетки закрытого типа от размера затем живые клетки. Б) показывает участок огороженных клеток с CD11c и Gr1 (нейтрофилами / моноцитов маркера) и идентифицирует CD11c + gr1 - популяции , содержащей макрофаги и дендритные клетки. Gating на этой популяции, C) показывает цитометрии участок MHCII и FL-HA связывания, который показывает разделение альвеолярного типа макрофагов (P1) из незрелых ДК (P2) и зрелые РС (Р3), как описано в Пун и др. 18. D) гистограмм , сравнивающих выражение MerTK между P1 (макрофаги), P2 (незрелые DCS) и популяции P3 (зрелые РС) на 7 -й день и день 10. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этого FIGUчисло рейнольдса

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой рукописи, мы предлагаем способ генерирования GM-CSF , полученных макрофаги и контроллеры домена от одной мыши костного мозга культуры , который заимствован из Лутц и др. 6. Выражение MHCII и FL-HA связывание между незрелых отличает ДК и макрофагов в этой культуре (см Рисунок 3C), который ранее уже был трудным. Это, вместе с другим докладом Helft и др. 19, демонстрирует гетерогенность в GM-CSF индуцированных культур BMDC , которые ранее считались быть только контроллеры домена. Helft и др. 19 использовали совершенно разные условия культивирования для создания BMDCs пока также обнаружили значительное население макрофагами. GM-CSF , индуцированные макрофаги напоминают альвеолярных макрофагах и GM-CSF , индуцированные ДК напоминают воспалительные контроллеры домена, в то время как FLT3 лиганд , дополненной BMDC культуры производят классические и плазмоцитов контроллеры домена 3,4. Различные популяции DC и макрофагов также наблюдаются в естественных условиях ООНдер гомеостатических и воспалительных состояний, и есть много дискуссий в области относительно того , что определяет DC и макрофаги 10. Это особенно верно, когда речь идет о моноцитов полученных воспалительных ГЦ, и это также актуально в этом БМК. Таким образом, важно использовать несколько фенотипических маркеров, функциональные данные, и, возможно, данные экспрессии генов для характеристики конкретной популяции. Также возможно , что эти ин витро популяции DC и макрофаги могут быть дополнительно подразделены , как более функциональных и фенотипических маркеров обнаружены.

В этом методе, маркеры CD11c, Gr1, MHCII и FL-HA используются для различения макрофагами от незрелых и зрелых дендритных клеток в неприлипающими фракции культуры БМК. Это отличается от Helft и др. 19, которые использовали маркеры CD11c, CD11b, CD115, CD135, MerTK и MHCII отличить популяцию макрофагов от зрелых ДК. Уровни экспрессии MerTK может distinguisч между макрофагами (Р1) и зрелые DCs (Р3), но не незрелые РС (P2) (рис. 3D) Таким образом, FL-HA и MHCII являются полезными маркерами для различения макрофаги от обоих незрелых и зрелых популяций DC. Эти макрофаги также функционально отличаются от контроллеров домена в этой культуре , и это БМК демонстрируется более подробно в другом месте 18. Если коротко, то после стимуляции LPS макрофаги БМК производят различные цитокины , чем зрелые DCs и не активируют наивных Т - клеток 18. Эти макрофаги также близко напоминают альвеолярных макрофагах, как фенотипически и функционально и как связывания FL-HA и выразить CD11c, MerTK, CD200R, CD206 и F4 / 80 и после стимуляции LPS продукции TNF-α пока не могут активировать наивные Т - клетки 18. Тем не менее, есть и отличия: макрофаги BMC являются CD11b + и имеют более низкие уровни сиглек F по сравнению с экс-естественных условиях альвеолярных макрофагах, предполагая , эти клетки похожи , но не идентифицированыкал для альвеолярных макрофагов.

Есть несколько важных шагов, чтобы обеспечить успех этого протокола. Важно, чтобы поддерживать стерильность от воздействия на костный мозг и далее. При перемещении в и из КБС, распылять руки в перчатках и объекты с 70% этанола. Несмотря на то, что полезно ополаскивать инструменты в 70% этаноле, чтобы простерилизовать, этанол является токсичным для клеток костного мозга, поэтому Высушите инструменты и обеспечить этанол испарится прежде, чем принести кости или клетки в контакте с ними. Кроме того, избегайте контакта тканей мыши или клеток с нестерильным оборудованием или рук во время сбора костного мозга. Хотя пенициллин и стрептомицин добавок обеспечивается в средствах массовой информации, неосторожное обращение клеток может привести к дрожжам или грибкового заражения. Кроме того, так как иммунные клетки с фагоцитарной активности генерируются в этой культуре, незначительное загрязнение может быть не обнаружен, просто наблюдая культуры клеток микроскопически, таким образом, является важным, чтобы определить тон подписывает загрязнения. Например, число клеток, может быть уменьшено, и экспрессия маркеров активации клеток, таких как CD40 и CD86, могут быть увеличены при анализе с помощью проточной цитометрии. Медиа цвет может также желтеют отражает изменение рН из-за загрязнения. Когда происходит заражение, культура BMC является непригодным для использования. Для поддержания экспериментальной последовательности, важно, чтобы создать клеточную суспензию из костного мозга путем встряхивания и получения точного количества клеток для установки культур контроллера ВМС. Кроме того, если какой-либо соединительной ткани от кости заканчивается в одной клеточной суспензии, фильтруют через стерильный фильтр 70 микрон, чтобы удалить его. Типичные выходы сотой для одной пластины не прилипших фракции в количестве 7 -й день составляет от 5 - 10 х 10 6 клеток. Число клеток, как правило, является хорошим показателем, что протокол работает хорошо. С помощью этой процедуры мы обычно получаем от 2 - 5 × 10 6 клеток на 10 -й день, в то время как Lutz сообщает 10 × 10 6 клеток. Мы проводим РБК лизис на гое клетки костного мозга начальная в то время как протокол по Лутц и др. не так и этот шаг может быть необязательным. Изменения в процентах CD11c клеток, а также цифры и пропорции макрофагов и ДК могут возникать из различных источников или партий FCS и поэтому очень важно, чтобы испытать новые партии FCS на BMC культур для последовательных экспериментальных результатов. концентрация GM-CSF варьировалось от 5 нг / мл до 40 нг / мл, и это существенно не влияет на выход клеток. Плотность клеток может также влиять на созревание культуры. Например, Helft и др. высевают 1 × 10 7 клеток в 4 мл среды , которые произвели больший процент клеток с высокой экспрессии MHCII 19. Момент времени, когда собирают клетки могут также влиять на процент населения, присутствующих в неприлипающими фракции. Клетки обычно собирают между днями 7 - 10 25-27, но некоторые исследования собирают на 6 контроллеров BMC день 19,23,24. Если больше клеток необходимы, культуры контроллеров BMCв больших х 15 мм чашках Петри 150 мм в 40 мл при той же плотности. В этом случае изменение половины объема средств массовой информации производится на обоих 3 -й день и день 6 (то есть, 20 мл среды удалены, клетки осаждали центрифугированием и заменяли свежей 20 мл среды , дополненной 20 нг / мл RGM-CSF). Эти пластины обычно генерируют 3 - 6 х 10 7 клеток на блюдо в день 7. FL-HA является важным реагентом, вместе с MHCII, чтобы отличить макрофаги от незрелых и зрелых ДК в культуре BMC. Таким образом , как только это сделано, титровать FL-HA для использования на клетках , известных конститутивно связываться HA , такие как альвеолярные макрофаги 18 или BW5147 Т - клеток и подтвердить свою специфичность с использованием либо HA-блокирующий CD44 антитело (КМ-81, имеющийся в продаже), непомеченная HA или дефицитных клеток CD44. CD11c - Ш1 + клеток в культуре может функционировать в качестве внутреннего контроля для лиц , не ХА-связывающих клеток, и флуоресценции минус один элемент управления (ФМО) или CD44 дефицитных культур БМК настоятельно рекомендуется для точного Настройг связывания ворот FL-HA.

Хотя эксперименты могут быть выполнены с использованием гетерогенного культуры, то целесообразно , чтобы обогатить для постоянного или макрофагальной популяции с использованием либо с активацией флуоресценции сортировки клеток или покрытые антителом магнитных шариков 18 на основе экспрессии CD11c, Gr1, MHCII, и HA связывания. Возможные эксперименты включают в себя стимуляцию с агонистов Toll-подобных, таких как LPS для измерения активации и продукции цитокинов, T анализов активации клеток, или дополнительную характеристику с помощью проточной цитометрии. Например, после того, как 8 или 24 часов стимуляции, проточной цитометрии могут быть использованы для измерения внутриклеточного окрашивания на цитокины и / или поверхностной маркировки костимуляторных молекул , таких как CD40 и CD86, как описано в разделе 18. Внутриклеточные процедуры маркировки цитокина требуют предварительной обработки клеток с брефелдин А, что предотвращает секрецию и позволяет цитокин скапливаться внутри клетки. Для Т-анализов активации клеток с участием ЛоаDing антигена , такие как OVA пептид антиген - представляющей клетки, очищенные макрофаги основанный на MHCII и HA связывания не активирует Т - клетки , в то время как незрелых и зрелых ДТС 18. Следует отметить, что сортировка процедура сама по себе может активировать дендритные клетки, в некоторой степени, что делает его важным, чтобы включать в себя отрицательный контроль во всех экспериментах.

Как и с любым методом в пробирке, есть свои преимущества и недостатки по сравнению с использованием в естественных условиях или экс-естественных условиях клетки. Недостаток заключается в том, что в пробирке клеток , полученных могут не точно имитируют VIVO клетки , но они имеют то преимущество , что они могут быть получены в достаточном количестве , чтобы обеспечить функциональную и биохимический анализ, то , что часто невозможно с экс-виво клеток. Этот метод макрофагами и идентификации DC позволит дальнейшие исследования для получения более однородной популяции клеток из культуры с ранее недооцененным гетерородность. Как очищенные макрофаги этого GM-CSF культуры близко напоминают альвеолярных макрофагов из легких 18, он обеспечивает удобный источник альвеолярных макрофагов, как и для анализа в лабораторных условиях . Например, эти связывающие макрофаги HA могут быть использованы для скрининга лекарственных средств , которые модифицируют альвеолярного макрофага и исследовать механизмы инфекции микобактерий туберкулеза и резистентности. Учитывая недавнее открытие , что GM-CSF и M-CSF из костного мозга Трансплантация макрофаг может облегчить легочную протеинозе у мышей 28,29, этот метод , чтобы идентифицировать макрофаги из GM-CSF культур может помочь увеличить эффективность предлагаемой терапии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Эта работа была профинансирована Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR) (грант СС-119503) и наук и инженерного совета природного Канады (NSERC). NSERC также поддерживает летние studentships с Ю.Д. и А. А. Ю.Д. поддерживается в Университете Британской Колумбии (UBC) с присуждением стипендий 4 года, AA поддерживается CIHR с присуждением аспирантом магистра (РКУ-М). Мы благодарим Кельвин Roskelley за помощью микроскопа , используемого для формирования изображения на рисунке 2. Мы также отмечаем поддержку со стороны UBC животных и проточной цитометрии сооружений.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Flow Cytometer BD  LSR-II
Automated Inverted Microscope  Leica  DMI4000 B
Centrifuge  Thermo Fisher ST-40R
Biosafety Cabinet Nuaire NU-425-600
Syringe 1 ml BD 309659
26 1/2 Gauge Needle BD 305111
50 ml Conical Tube  Corning 357070 *Falcon brand
Eppendorf tubes (1.5 ml) Corning MCT-150-C
5 ml polystyrene round bottomed tubes Corning 352052
Dissection Tools Fine Science Tools  *Various  *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep 
Hemocytometer  Reichert 1490
Sterile 100 mm x 15 mm Petri Dish Corning 351029 *Falcon brand
2-Mercaptoethanol Thermo Fisher 21985-023
Ammonium Chloride BDH BDH0208-500G
Bovine Serum Albumin Fisher Bioreagents BP1600-1
Brefeldin A Sigma B7651-5MG
EDTA Sigma E5134-1KG Ethylenediaminetetraacetic acid
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 16000-044
Hank's Balanced Salt Solution Thermo Fisher 14175-095 
HEPES Thermo Fisher 15630-080 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
L-Glutamine Sigma G8540-100G
LPS Ultrapure Invivogen tlrl-3pelps
MEM Non-Essential Amino Acids Solution  Thermo Fisher 11140-050
Penicillin/Streptomycin 100x Thermo Fisher 15140-122
Potassium Phosphate Monobasic BDH BDH0268-500G
Potassium Chloride BDH BDH9258-500G
Recombinant GM-CSF Peprotech 315-03-A
Rooster Comb Sodium Hyaluronate  Sigma H5388-1G *Used to make fluoresceinated hyaluronan
RPMI-1640  Thermo Fisher 21870-076 No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37 °C before using.
Sodium Chloride Fisher  5271-10  
Sodium Phosphate Dibasic Sigma 50876-1Kg
Sodium Pyruvate Sigma P5290-100G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Fisher Bioreagents BP152-5
Trypan Blue Sigma T8154
Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant N/A N/A Clone: 2.4G2
Anti-CD11c PeCy7 eBioscience 25-0114-82 Clone: N418
Anti-Gr-1 efluor450 eBioscience 48-5931-82 Clone: RB6-8C5
Anti-MHCII APC eBioscience 17-5321-82 Clone: M5/114.15.2
Biotinylated Anti-MerTK Abcam BAF591 Goat polyclonal IgG
Streptavidin PE eBioscience 12-4317-87
Propidium Iodide Sigma P4170-25MG
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) Sigma D9542-5MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J Immunol. 178, (8), 5245-5252 (2007).
  2. Lari, R., et al. Macrophage lineage phenotypes and osteoclastogenesis--complexity in the control by GM-CSF and. Bone. 40, (2), 323-336 (2007).
  3. Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96, (9), 3029-3039 (2000).
  4. Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175, (1), 189-195 (2005).
  5. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, (6), 1693-1702 (1992).
  6. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223, (1), 77-92 (1999).
  7. Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. J Immunol. 162, (1), 168-175 (1999).
  8. Berthier, R., Martinon-Ego, C., Laharie, A. M., Marche, P. N. A two-step culture method starting with early growth factors permits enhanced production of functional dendritic cells from murine splenocytes. J Immunol Methods. 239, (1-2), 95-107 (2000).
  9. Brasel, K., et al. Flt3 ligand synergizes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor to mobilize hematopoietic progenitor cells into the peripheral blood of mice. Blood. 90, (9), 3781-3788 (1997).
  10. Segura, E., Amigorena, S. Inflammatory dendritic cells in mice and humans. Trends Immunol. 34, (9), 440-445 (2013).
  11. West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305, (5687), 1153-1157 (2004).
  12. Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24, (2), 179-189 (2006).
  13. Goodridge, H. S., et al. Activation of the innate immune receptor Dectin-1 upon formation of a 'phagocytic synapse. Nature. 472, (7344), 471-475 (2011).
  14. Shalek, A. K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation. Nature. 510, (7505), 363-369 (2014).
  15. Vander Lugt, B., et al. Transcriptional programming of dendritic cells for enhanced MHC class II antigen presentation. Nat Immunol. 15, (2), 161-167 (2014).
  16. Shibata, Y., et al. GM-CSF regulates alveolar macrophage differentiation and innate immunity in the lung through PU.1. Immunity. 15, (4), 557-567 (2001).
  17. Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and Macrophage-CSF Dependent Macrophage Responses by In Vitro Models. J Immunol. 188, (11), 5752-5765 (2012).
  18. Poon, G. F., et al. Hyaluronan Binding Identifies a Functionally Distinct Alveolar Macrophage-like Population in Bone Marrow-Derived Dendritic Cell Cultures. J Immunol. 195, (2), 632-642 (2015).
  19. Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42, (6), 1197-1211 (2015).
  20. Stockinger, B., Zal, T., Zal, A., Gray, D. B. cells solicit their own help from T cells. J. Exp. Med. 183, (3), 891-899 (1996).
  21. de Belder, A. N., Wik, K. O. Preparation and properties of fluorescein-labelled hyaluronate. Carbohydr Res. 44, (2), 251-257 (1975).
  22. Stewart, C. C., Stewart, S. J. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. Wiley, J., & Sons, Inc. Champter 6, Unit 6.2 (2001).
  23. Dearman, R. J., Cumberbatch, M., Maxwell, G., Basketter, D. A., Kimber, I. Toll-like receptor ligand activation of murine bone marrow-derived dendritic cells. Immunology. 126, (4), 475-484 (2009).
  24. Abdi, K., Singh, N. J., Matzinger, P. Lipopolysaccharide-Activated Dendritic Cells: 'Exhausted' or Alert and Waiting. J Immunol. 188, (12), 5981-5989 (2012).
  25. Contreras, I., et al. Impact of Leishmania mexicana Infection on Dendritic Cell Signaling and Functions. PLoS Negl Trop Dis. 8, (9), (2014).
  26. Feng, T., Cong, Y. Z., Qin, H. W., Benveniste, E. N., Elson, C. O. Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid. J Immunol. 185, (10), 5915-5925 (2010).
  27. Grauer, O., et al. Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique. Histochem Cell Biol. 117, (4), 351-362 (2002).
  28. Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514, (7523), 450-454 (2014).
  29. Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6, (250), (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats