Generación e identificación de GM-CSF Derivado alveolares-como los macrófagos y las células dendríticas A partir de médula ósea de ratones

1Microbiology and Immunology, University of British Columbia
Published 6/25/2016
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Immunology and Infection

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Dong, Y., Arif, A. A., Poon, G. F., Hardman, B., Dosanjh, M., Johnson, P. Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow. J. Vis. Exp. (112), e54194, doi:10.3791/54194 (2016).

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Abstract

Los macrófagos y células dendríticas (DC) son células inmunes innatas que se encuentran en tejidos y órganos linfoides que juegan un papel clave en la defensa contra los patógenos. Sin embargo, son difíciles de aislar en número suficiente para estudiar en detalle, por lo tanto, los modelos in vitro se han desarrollado. Cultivos in vitro de macrófagos derivados de médula ósea y células dendríticas son valiosos métodos bien establecidos y para estudios inmunológicos. Aquí, se describe un método para el cultivo y la identificación de ambos DCs y macrófagos a partir de un único cultivo de células de médula ósea primaria de ratón utilizando el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos de citoquinas (GM-CSF). Este protocolo se basa en el procedimiento establecido primera desarrollada por Lutz et al. en 1999 para los países en desarrollo derivadas de médula ósea. El cultivo es heterogénea, y MHCII y hialuronano fluoresceinado (FL-HA) se utilizan para distinguir los macrófagos de CD inmaduras y maduras. Estos GM-CSF derivado macrófagos procionar una fuente conveniente de in vitro macrófagos derivados que se parecen mucho macrófagos alveolares tanto en fenotipo y la función.

Introduction

Varios métodos de cultivo in vitro se han descrito para generar macrófagos de médula derivadas de médula (BMDMs) y las DC derivadas de médula ósea (BMDCs) utilizando uno o una combinación de factores de crecimiento. BMDMs se puede generar mediante el cultivo de células de médula ósea usando factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) o GM-CSF 1,2. Para BMDCs, la adición de ligando FLT3 para el cultivo de médula ósea da lugar a DCs plasmacitoides clásicos y no adherentes (CD11c alta MHCII alta y CD11c lo /, B220 +, respectivamente) después de 9 días en cultivo 3,4. En contraste, las células no adherentes generan después de 7 a 10 días en cultivo con GM-CSF solo 5,6, GM-CSF e IL-4 7, o GM-CSF y FLT3 ligando 8,9 generan BMDCs se parece más a los países en desarrollo inflamatorias (alta CD11c, CD11b + MHCII alta) 10. Si bien se utilizan estos cultivos in vitro para generar los macrófagos oLos países en desarrollo, no está claro si cada cultura da lugar a poblaciones puras. Por ejemplo, aunque se describen las células adherentes en los cultivos GM-CSF para ser macrófagos 5, las células no adherentes de la misma cultura se utilizan como los DC 6,11-13, con la presunción de que son homogéneos y cualquier variabilidad observada es debido a las diferentes etapas de desarrollo 14,15. Además, los estudios han encontrado GM-CSF para ser un factor de crecimiento esencial para el desarrollo de los macrófagos alveolares in vivo 16,17, y se pueden utilizar in vitro para generar los macrófagos alveolares como 16,17,18.

Aparte de la adhesión, los procedimientos para la generación de los macrófagos y los países en desarrollo de cultivos de médula ósea tratados con GM-CSF son muy similares sugiriendo heterogeneidad puede existir dentro de cultivos de médula ósea de GM-CSF. De hecho, esto parece ser el caso como dos documentos informan de la presencia de BMDMs en la fracción no adherente de las culturas BMDC. En uno de papel, que identified una población de células como CD11c +, CD11b +, MHCII mediados, MerTK + y CD115 +, que expresa una expresión genética que se parecía más estrechamente los macrófagos alveolares y tenía una capacidad reducida para activar las células T 19. El segundo papel utilizado MHCII y FL-HA para identificar una población de macrófagos alveolares similar (CD11c +, MHCII media / baja, FL-HA de alto) que era distinta de inmaduros (CD11c +, MHCII mediados, FL-HA baja) y madura DC (CD11c +, MHCII alta), tanto fenotípicamente y funcionalmente 18. Estos documentos ilustran que ambos cultivos GM-CSF BMDC son heterogéneos, que contiene tanto los macrófagos y DC poblaciones que indica que se debe tener cuidado al interpretar los datos a partir de cultivos de BMDC.

Este protocolo describe cómo aislar de la médula ósea, células de médula ósea en cultivo GM-CSF, e identificar el alveolar similar a macrófagospoblación de los países en desarrollo inmaduro y maduros en el cultivo de médula ósea mediante citometría de flujo utilizando la unión y la expresión MHCII FL-HA. Este procedimiento se basa en el procedimiento establecido de Lutz et al 6 y es capaz de generar. 5 - 10 x 10 6 células no adherentes en el día 7 de un cultivo de 10 ml. El cultivo se puede utilizar desde días 7 a 10 y se obtiene una población heterogénea de macrófagos, células dendríticas inmaduras y maduras, así como algunos progenitores en el día 7. Esto proporciona un método simple para crecer y aislar in vitro macrófagos alveolares-como en grandes cantidades.

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Protocol

Los ratones fueron sacrificados de acuerdo con el Consejo Canadiense para el manejo de estos animales para la investigación con animales ética mediante procedimientos aprobados por la Universidad de Cuidado de Animales Columbia Británica.

1. La adquisición de una sola célula de médula ósea de ratón Suspensión de fémur y tibia

  1. Cambiar en una cabina de seguridad biológica (BSC) 15 minutos antes de comenzar el procedimiento para purgar el aire del gabinete y permitir la estabilización del flujo de aire, superficie BSC continuación, limpia / el aerosol con un 70% de etanol. Mantener todo lo más estéril posible para la totalidad del protocolo. No cortar los huesos en condiciones no estériles.
  2. Preparar herramientas de disección por inmersión en etanol al 70% (1 par de tijeras de disección, 2 pares de pinzas), solución salina equilibrada de Hank con 5% de suero de ternera fetal (HBSS-FCS), placas de Petri estériles (100 mm x 15 mm), 1 jeringas ml, 26½ agujas de calibre, tubos de recogida cónicos (15 ml o 50 ml), y toallas de papel en el BSC.
  3. La eutanasia del ratón usandolos protocolos aprobados por el comité de ética de la investigación institucional de animales. Poner en el BSC, colocar en la parte superior de una o dos toallas de papel y rociar el ratón con un 70% de etanol.
  4. En el BSC, abra una asépticamente estéril placa de Petri, alícuota de 10 ml de HBSS-FCS a la base y de 1 - 2 ml a la tapa.
  5. Coloca el ratón sobre su estómago con la espalda hacia arriba y levantar la piel alrededor de las secciones torácica con los dedos de la mano no dominante. Use las tijeras para hacer una incisión en la piel se tersa.
  6. Aferrarse a ambos extremos de la corte, un extremo con cada mano y con cuidado separar la piel alrededor del ratón desde la parte posterior al estómago, continuará tirando hasta dos extremos de la incisión se reúnen en el estómago.
  7. Da la vuelta al ratón para el estómago hacia arriba, y con una mano tire de la mitad inferior de la piel hacia abajo hacia la pierna, seguir tirando hacia atrás la piel hasta que las patas están expuestos.
  8. Mantenga los pies del ratón hacia arriba y cortar los tendones de Aquiles por encima de la articulación del tobillo ylos ligamentos que conectan los músculos a los pies en el extremo inferior de la tibia con unas tijeras. Esto afloja los pies de los huesos de la pierna.
  9. Mientras sostiene la pata por el pie, cortar los músculos y ligamentos con tijeras todo alrededor de la articulación de la rodilla en el extremo inferior del fémur para cortar los músculos del muslo de la pierna inferior. El uso de fórceps para tirar suavemente los músculos aflojados lejos del peroné y superficies femorales. Tenga cuidado de no cortar la arteria femoral para evitar el sangrado abundante.
  10. Con una mano se aferra a los pies, prensa tijeras abajo abierto en el extremo superior del fémur en la articulación de la cadera, rotar la pierna y tirar suavemente para separar el fémur de la articulación de la cadera durante el uso de las tijeras para hacer el corte final a la libre la pierna del cuerpo.
  11. Desde este punto en adelante, solamente mantener el tejido con pinzas estériles. Aferrarse a la pierna en un extremo y sacar el pie en el otro.
    NOTA: Esto no debería requerir mucha fuerza, como ligamentos que conectan se cortan en el paso1.9. Alternativamente, cortar la tibia justo por encima del tobillo en el que se fusiona el hueso.
  12. Mantenga la pierna por el extremo distal del fémur con un juego de fórceps y el extremo proximal de la tibia y el peroné con otra, doblar cuidadosamente la tibia y el peroné en la dirección opuesta de la articulación de la rodilla para separarlos de fémur y la rótula.
  13. El uso de fórceps para tirar hacia abajo los ligamentos y los músculos que quedan todavía unido a los huesos inferiores de la pierna. Aquí, retire el peroné junto con los tejidos conectivos con pinzas, ya que es demasiado pequeño para ser lavado para células de la médula ósea. Coloque la tibia limpiado en la tapa invertida placa de Petri.
  14. Mantenga el extremo inferior del fémur con un juego de fórceps y la rótula con otra, doblar la rótula y los tejidos circundantes en la dirección opuesta de la articulación para su eliminación. Después se limpia restante tejidos conectivos del fémur; tirar a la basura con fórceps, y colocarlo en la tapa invertida placa de Petri. Desechar la rótula.
  15. repetir 1,7- 1.13 con la otra pierna, si es necesario. La transferencia de los huesos de 1,6 ml tubos de microcentrífuga que contiene 1 ml de HBSS estéril-FCS para el transporte si es necesario.
  16. Coloque los huesos en la tapa de la placa Petri invertida, con 1 - 2 ml de HBSS-FCS, el uso de fórceps para limpiar cualquier tejido residual todavía unido a la tibia y el fémur, a continuación, transferir los huesos a la base de placa de Petri que contiene 10 ml de HBSS FCS. Alternativamente, limpiar los huesos y eliminar el tejido muscular unida mediante un tejido empapado de etanol al 70%.
  17. Cortar cada uno de los huesos por la mitad con unas tijeras. Parcialmente proteger la placa de Petri con una tapa estéril durante el corte para asegurar que los huesos se mantengan en el plato. Alternativamente, cortar el extremo de cada hueso que permite la purga en la siguiente etapa.
  18. Una el 26½ aguja G en la jeringa de 1 ml, y elaborar 1 ml de HBSS-FCS de la placa de Petri. Inserte la punta de la aguja en el extremo de un trozo de hueso y eliminar las células de la médula ósea (tejido rojo suave dentro de los huesos). Insertar la aguja en la cabezadel hueso y el extremo abierto, hasta que se quite toda la médula de color rojo. Observar los huesos de color blanco.
  19. Pasar los grumos visibles de la médula ósea a través de la jeringa un par de veces para formar una sola suspensión celular.
  20. Desechar los huesos enrojecidas. Usar una pipeta de 10 ml para mezclar la suspensión de células bien y transferir al tubo de recogida. Enjuagar la placa de Petri una vez con 5 ml de HBSS-FCS para recoger las células residuales en el plato. Colocar las células en hielo.
    NOTA: La suspensión de células de médula ósea es todavía viable si se almacena por 2 - 3 horas a 4 ° C.

2. Chapado y cultivo de células de médula ósea (BMC)

  1. Preparar los siguientes reactivos y materiales de construcción.
    1. Preparar tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC) haciendo cloruro de amonio 0,84% en una solución final de 2 mM Tris pH 7,2, y luego esterilizar por filtración a través de un filtro de 0,2 micras.
    2. Preparar medios BMC mediante la adición de 10% de FCS, HEPES 20 mM, 1x aminoácido no esencial, 55 y #181; M 2-mercaptoetanol, 50 U / ml de penicilina y estreptomicina, piruvato de sodio 1 mM, y 2 mM L-glutamina al medio RPMI 1640.
    3. Obtener disponible comercialmente GM-CSF recombinante o usar GM-CSF que contiene sobrenadante de células de mieloma AG8.653 transfectadas con el gen de GM-CSF 20. Determinar la concentración de GM-CSF en el sobrenadante por ELISA y añadir el equivalente a 20 ng / ml a los medios de BMC.
  2. Centrifugar las células de médula ósea a 314 xg durante 5 min. El sedimento es rojo, debido a los glóbulos rojos. En el BSC, aspirar el sobrenadante con una pipeta Pasteur de vidrio estéril unida a la succión del vacío, afloje el sedimento tocando, a continuación, añadir 10 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos. Vortex para resuspender las células y se incuba en tampón de lisis RBC a temperatura ambiente durante 5 min.
  3. Añadir 10 ml de HBSS-FCS a continuación, girar las células a 314 xg durante 5 min y aspirar el sobrenadante. Observe el sedimento celular como el color blanco. Resuspender las células en volumen deseado de los medios de BMC.
  4. Contar el resuspended células utilizando un hemocitómetro después de teñir las células muertas con 0,4% de azul de tripano.
    NOTA: Si se utiliza la médula ósea de una pierna (solo la tibia y el fémur), se vuelve a suspender en 5 ml de medio de BMC, tomar 10 l de suspensión celular y se diluye con 70 l de 0,4% azul de tripano, mezclar bien y la transferencia de 10 l de la dilución 1/8 de células a la cámara de hemocitómetro. Contar las células viables en cuatro cuadrantes: el promedio de los cuatro cargos cuadrante x factor de dilución x 10 4 = número de células por ml. Un fémur y una tibia de una pierna lo general, resultados aproximadamente de 2 - 4 x 10 7 células después de la lisis de glóbulos rojos.
  5. Estimar el número de 10 ml platos de cultivos de médula ósea necesarias para los experimentos de aguas abajo basado en el número total de células necesarias para los experimentos en el final del cultivo.
    NOTA: Cada plato requiere 2 x 10 6 células de médula ósea de siembra inicial y los rendimientos de 5 - 10 x 10 6 células en el día 7.
    1. Aliquot el número total de células para el recubrimiento en un nuevo tubo, girar hacia abajo a 314 xg durante 5 min, aspirar el sobrenadante, y resuspender las células en 4 x 10 6 células / ml en medio BMC.
  6. Prepare un nuevo 100 mm estéril x 15 mm placa de Petri con 9,5 ml de medio de BMC que contiene 200 ng de GM-CSF (recombinante o de GM-CSF que contiene sobrenadante). Añadir 500 l de las células de médula ósea 4 x 10 6 células / ml en el centro de la placa de Petri para la concentración final de 2 x 10 5 células / ml en 10 ml.
    NOTA: Es importante no utilizar una placa de Petri estéril de una placa de cultivo de tejidos. Además, cuando la adición de las células, las células garantizar siguen concentradas en el centro y minimizar las molestias a los platos después de la siembra y durante los cambios de los medios de comunicación. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2. Este es el día 0 en la cultura.
  7. El día 3, se añaden 10 ml de medio fresco que contenía BMC 200 ng de GM-CSF a cada placa de células. Tener cuidado para minimizar la perturbación of las células concentradas en suspensión. Volumen total de cultivo celular es ahora de 20 ml.
  8. Observar las células bajo el microscopio óptico con un aumento de 100X. Observar numerosas células no adherentes (redondos) y unas pocas células adherentes (planas). Las células en grupos de tres o cuatro pétalos que se asemejan de una flor se puede ver, lo que indica proliferación.
  9. En el día 6 realizar un cambio de la mitad de los medios de comunicación. Retirar con cuidado 10 ml de medio en un tubo cónico de 50 ml estéril, centrifugar a 314 xg durante 5 minutos, aspirar y descartar el sobrenadante.
  10. Resuspender el sedimento celular en 10 ml de medio BMC frescas que contienen 20 ng / ml de GM-CSF, suavemente vórtice y añadir a la placa de cultivo celular original para un volumen total de 20 ml. Observar las células bajo el microscopio.
    NOTA: El día 7 de cultivo debe ser al 70% o mayor en la confluencia con células adherentes planas y densas nubes de células no adherentes redondas.

3. Recolección y Preparación BMDC y BMDMs por Citometría de Flujo

    <li> Mantenga todos los tampones a 4 ° C.
  1. Recoger las células de día 7 al día 10. Para cosechar las células, primera transferencia de 10 ml del sobrenadante del cultivo a un tubo de recogida cónico de 50 ml, a continuación, inclinar el plato vertical en aproximadamente 30 grados y se lava el plato pipeteando los restantes 10 ml de la cultura de la parte superior del plato. Repita este lavado 5 veces, cada vez rotación de la placa por tercera.
  2. La transferencia de los restantes 10 ml de células con el mismo tubo de recogida y desechar la placa y las células adherentes.
    NOTA: Los lavados se eliminar las células no adherentes y de baja adherencia; las células adherentes planas son resistentes a los lavados. Por lo general, entre 5 - Se espera que 10 x 10 6 células no adherentes de una placa en el día 7 y 2 - 5 x 10 6 células en el día 10, aunque Lutz et al. reportadas 10 x 10 6 células en el día 10. No se toman normalmente las células adherentes. Sin embargo, si estas células tienen que ser en comparación con las células no adherentes, Que se puede quitar de la siguiente manera. Añadir 5 ml de EDTA 0,7 mM en 1 x PBS, pH 7,4 a la placa después se retiran las células no adherentes, se incuba a 37 ° C durante 5 min, la pipeta hacia arriba y abajo para eliminar las células adherentes y recoger en un tubo separado.
  3. Centrifugar las células recogidas en 314 xg durante 5 min y aspirar el sobrenadante. Volver a suspender en 5 ml de medio BMC estériles a 4 ° C y agitar suavemente para mezclar, y contar usando azul tripán y un hemocitómetro.
    NOTA: Cada plato rendirá 5 - 10 x 10 6 células no adherentes de un cultivo de 7 días. A partir de ahora, realizar todos los pasos a 4 ° C.
  4. Para el análisis de citometría de flujo, la transferencia de 2 x 10 5 células para cada muestra en 5 ml de poliestireno tubos de fondo redondo, añadir 300 l de tampón de FACS a 4 ° C (1x salina tamponada con fosfato, EDTA 2 mM y 2% de suero de albúmina bovina) a cada muestra.
  5. Girar las células hacia abajo a 314 xg durante 5 min y aspirar el sobrenadante. Observar un sedimento blanco opaco visible en la parteparte inferior del tubo.
  6. Resuspender las células en 100 l de receptor Fc no marcado Ab para bloquear los receptores Fc de unión (Uso décimo sobrenadante de 2.4G2 producir la línea celular de mieloma) y se incuba durante 20 min a 4 ° C. A continuación, añadir 300 l de tampón de FACS a cada muestra, suavemente vórtice, a continuación, girar las células hacia abajo a 314 xg durante 5 min y aspirar el sobrenadante.
  7. Resuspender las células en 100 l de CD11c-PeCy7 en 0.2 g / ml, azul Gr1-Pacífico en 0.25 g / ml, MHCII-APC en 0.05 g / ml, y FL-HA en aproximadamente 2 mg / ml para identificar los macrófagos y las DC.
    NOTA: FL-HA fue preparado en casa usando fluoresceína y sal sódica del ácido hialurónico cresta de gallo como se describió previamente 21.
  8. Incubar durante 20 min a 4 ° C para permitir la unión a la superficie celular. Añadir 300 l de tampón de FACS a cada muestra, suavemente vórtice, a continuación, girar las células hacia abajo a 314 xg durante 5 min a 4 ° C y aspirar el sobrenadante. NOTA: Si biotinylated anticuerpos se utilizan en 3.8, 3.8 repetir - 9 con fluorescente-estreptavidina.
  9. Lavar las células con otra 300 l de tampón de FACS, suavemente vórtice para mezclar y centrifugar las células a 314 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 200 l de tampón FACS que contiene 0,1 a 0,2 g por ml de yoduro de propidio o DAPI para marcar las células no viables. Las células están ahora listas para el análisis de citometría de flujo 22.
    NOTA: Ver resultados y la Figura 3 para más detalles de las poblaciones y cómo fueron con acceso a las células.

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Representative Results

Un diagrama de flujo que resume los principales pasos de este método se muestra en la Figura 1. La densidad y morfología del cultivo de médula ósea en diferentes momentos del cultivo se muestra en la Figura 2. En el día 1, las células son pequeñas y escaso pero por día 3, hay más células, algunas son más grandes y algunos han comenzado a adherirse. Por día 6 hay un adherente definido y la fracción no adherente (Figura 2A). El cultivo se puede cosechar de días 7-10 con un mayor porcentaje de células CD11c + presentes en día 10. La figura 2B muestra la cultura día 7 antes de la cosecha, así como las fracciones de células adherentes y no adherentes se separaron. La fracción adherente consiste en las células después de los lavados de luz que eliminan la fracción no adherente. La fracción no adherente se enriquece en gran medida para las células con una morfología dendrítica, que puede verse más claramente en la im ampliada digitalmentelas edades en las inserciones en la figura 2B. Una vez que la fracción no adherente se retira (día 7 o día 10), las células se analizaron por citometría de flujo después del marcaje con anticuerpos fluorescentes contra marcadores clave de la superficie celular, como se describe anteriormente. La Figura 3 muestra un resultado representativo de citometría de parcelas de la no adherente fracción de la cultura en el día 7 y el día 10.

Para la identificación de ambos los macrófagos y las CD, puerta en CD11c + Gr1 y - células después de la primera compuerta en tamaño y células vivas (Figura 3A y B). En el día 7 culturas, el CD11c + Gr1 - población en la fracción celular no adherente es típicamente 60 a 70% de células vivas totales, y esto se aumentó a 90% o más en el día 10 (Figura 3B). El CD11c + Gr1 - población en el día 7 y el día 10 se pueden dividir en tres subgrupos principales utilizando MHCII y bindi FL-HAng: MHCII media / baja FL-HA de unión de alta macrófagos (P1), MHCII mediados FL-HA células bajas (P2) de unión que contiene CD inmaduras, y MHCII alta FL-HA unión a los DC de baja maduros (P3) (Figura 3C y referencia 18 ). El, MHCII baja población de bajos FL-HA (P0) observado en el día 7 se ha demostrado que contienen progenitores de las células P1-P3 18. Esta población no es evidente en el día 10 lo que implica que se ha producido aún más la maduración de la cultura. Esto también está apoyado por el mayor porcentaje de células CD11c en el cultivo, así como ligeramente más altos porcentajes de las poblaciones P2 y P3 DC en día 10. La Figura 3D muestra MerTK, considerada como un marcador de macrófagos, es altamente expresado en tanto los macrófagos y poblaciones inmaduros DC (P1 y P2), sino que se expresa en menor medida en las DC maduras (células P3). En particular, el análisis de la fracción adherente revela la presencia de la P0, P1 ypoblaciones P2, pero no a la población P3 madura DC (datos no mostrados). Por lo tanto los macrófagos están presentes en las fracciones adherentes y no adherentes, pero sólo DC maduras están presentes en la fracción no adherente.

Figura 1
. Figura 1: Un diagrama de flujo que indica los pasos clave del método primario de células se obtienen de la médula ósea, en placas y se mantuvieron en cultivo durante 7 - 10 días cuando se cosechan para su uso en otros experimentos, purificadas o utilizados en el análisis FACS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: El examen microscópico de GM-CSF células derivadas de la médula ósea. UN) el cultivo de médula ósea en el día 1, 3, y 6 muestra el aumento del número de células, los cambios en la morfología, y la aparición de fracciones adherentes y no adherentes distintas. B) El panel izquierdo muestra el cultivo de médula ósea el día 7 y la densidad celular típico. El panel central muestra el día 7 células adherentes después de la cosecha de la fracción no adherente y el panel derecho muestra la fracción no adherente cosechado en el día 7. Las inserciones se magnifican digitalmente imágenes de las células en esta fracción con una morfología dendrítica. La barra de escala blanca representa 50 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Fenotipo representativo de la cultura de GM-CSF en el día 7 y el día 10. No adherentescélulas del cultivo se etiquetan con CD11c, Gr1, MHCII, FL-HA, y MerTK en el día 7 o el día 10 y se analizaron por su fenotipo por citometría de flujo. A) Las células fueron cerrada por primera vez en tamaño a continuación, las células vivas. b) muestra una parcela de las células cerradas con CD11c y Gr1 (la / marcador de monocitos neutrófilos) e identifica el CD11c + Gr1 - población que contiene los macrófagos y las células dendríticas. De apertura de puerta en esta población, C) muestra el gráfico de citometría de flujo de MHCII y FL-HA de unión, que muestra la separación de los macrófagos alveolares como (P1) de DCs inmaduras (P2) y madurar las DC (P3), como se describe en Poon et al. 18. D) los histogramas que comparan la expresión MerTK entre el P1 (macrófagos), P2 (CD inmaduras), y las poblaciones P3 (madurar las DC) en el día 7 y el día 10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figure.

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Discussion

En este manuscrito, se proporciona un método para la generación de los macrófagos y las CD GM-CSF derivados de una sola cultivo de médula ósea de ratón que está adaptado de Lutz et al. 6. MHCII expresión y FL-HA distingue entre países en desarrollo inmaduro y macrófagos vinculante en esta cultura (ver Figura 3C), que previamente ha sido difícil. Esto, junto con otro informe de Helft et al. 19, demuestra la heterogeneidad dentro de las culturas BMDC inducidos GM-CSF que se pensaba previamente que sólo los países en desarrollo. Helft et al. 19 utiliza con bastante diferentes condiciones de cultivo para generar BMDCs sin embargo también encontró una población significativa de los macrófagos. Macrófagos inducidos GM-CSF se asemejan a los macrófagos alveolares y los países en desarrollo inducidas GM-CSF se asemejan a los DC inflamatorias, mientras que FLT3 ligando complementado culturas BMDC producen los DC clásicas y plasmocitoide 3,4. Diferentes poblaciones de DC y los macrófagos también se observan en la ONU vivoder condiciones homeostáticas e inflamatorias, y hay mucha discusión en el campo de lo que define a una corriente continua y un macrófago 10. Esto es particularmente cierto cuando se trata de DCs derivadas de monocitos inflamatorios y esto también es relevante en este BMC. Por tanto, es importante usar varios marcadores fenotípicos, datos funcionales y, posiblemente, datos de expresión génica para caracterizar una población particular. También es posible que estas DC in vitro de macrófagos y las poblaciones pueden ser subdivididos como marcadores más funcionales y fenotípicas se descubren.

En este método, la CD11c marcadores, Gr1, MHCII, y FL-HA se utilizan para distinguir los macrófagos a partir de células dendríticas inmaduras y maduras en la fracción no adherente de la cultura BMC. Esto es diferente a Helft et al. 19, que utilizó el CD11c marcadores, CD11b, CD115, CD135, MerTK, y MHCII distinguir una población de macrófagos de las CD maduras. MerTK niveles de expresión podrían distinguisH entre los macrófagos (P1) y madurar las DC (P3), pero no inmaduras DCs (P2) (Figura 3D). Por lo tanto FL-HA y MHCII son marcadores útiles para discriminar los macrófagos de las dos poblaciones de DC inmaduras y maduras. Estos macrófagos también son funcionalmente diferentes de las CD en esta cultura BMC y esto se demuestra en más detalle en otra parte 18. En pocas palabras, después de la estimulación con LPS a los macrófagos BMC producen diferentes citoquinas que madura países en desarrollo y no activan las células T ingenuas 18. Estos macrófagos también se parecen mucho a los macrófagos alveolares, tanto fenotípicamente y funcionalmente ya que ambos se unen FL-HA y expresan CD11c, MerTK, CD200R, CD206 y F4 / 80 y después de la estimulación con LPS de TNF-α producto aún no son capaces de activar las células T ingenuas 18. Sin embargo, también hay diferencias: los macrófagos BMC son CD11b + y tienen niveles más bajos de Siglec F en comparación con el ex-vivo macrófagos alveolares, lo que sugiere que estas células son similares pero no identiCal a los macrófagos alveolares.

Hay varios pasos importantes para garantizar el éxito de este protocolo. Es importante mantener la esterilidad de la exposición de la médula ósea en adelante. Cuando se mueve dentro y fuera de la BSC, rocíe las manos y los objetos con 70% de etanol guantes. Aunque es útil para enjuagar herramientas en etanol al 70% para esterilizar, el etanol es tóxico para las células de la médula ósea, por lo que el aire seque las herramientas y asegurar que el etanol se ha evaporado antes de traer los huesos o las células en contacto con ellos. Además, evitar el contacto con los tejidos de ratón o células con el equipo no estéril o las manos durante la extracción de la médula ósea. Aunque la penicilina y la estreptomicina suplementación se proporciona en los medios de comunicación, manejo descuidado de las células puede conducir a la contaminación por hongos o levaduras. Además, ya que las células inmunes con la actividad fagocítica se generan en esta cultura, la contaminación menor puede no ser detectado por la simple observación del cultivo celular al microscopio, por lo tanto es importante identificar tél firma de contaminación. Por ejemplo, el número de células se pueden reducir y la expresión de marcadores de activación celular, tales como CD40 y CD86 pueden aumentar cuando se analizaron por citometría de flujo. color de medios de comunicación también se puede tornar amarilla que refleja un cambio de pH debido a la contaminación. Cuando se produce la contaminación, la cultura BMC es inutilizable. Para mantener la coherencia experimental, es importante para generar una suspensión de células de la médula ósea por agitación y obtener un recuento de células precisa para establecer los cultivos de BMC. Además, si cualquier tejido conectivo del hueso termina en la suspensión de células individuales, filtrar a través de un filtro de 70 micras estéril para eliminarlo. Los rendimientos celulares típicas para una placa de la fracción no adherente en día 7 son entre 5 - 10 x 10 6 células. El número de células suelen ser una buena indicación de que el protocolo está funcionando bien. Con este procedimiento se obtiene por lo general entre 2 - 5 x 10 6 células en el día 10, mientras que Lutz informa de 10 x 10 6 células. Llevamos a cabo la lisis de glóbulos rojos en el the células de médula ósea inicial, mientras que el protocolo de Lutz et al. y no lo que este paso puede ser opcional. Las variaciones en el porcentaje de células CD11c, así como los números y las proporciones de los macrófagos y los países en desarrollo pueden surgir de diferentes fuentes o lotes de FCS y lo que es fundamental para poner a prueba nuevos lotes de FCS en cultivos de BMC para los resultados experimentales consistentes. concentración de GM-CSF se varió de 5 ng / ml a 40 ng / ml y esto no afectó significativamente el rendimiento celular. La densidad celular también puede influir en la maduración de la cultura. Por ejemplo, Helft et al. cabeza de serie 1 x 10 7 células en 4 ml de medio que produjeron un mayor porcentaje de células con alta expresión de MHCII 19. El punto de tiempo en que se recogieron las células también puede afectar el porcentaje de poblaciones presentes en la fracción no adherente. Las células se recogieron por lo general entre los días 7 - 10 25-27, pero algunos estudios BMC recogen en el día 6 19,23,24. Si se necesitan más células, la cultura BMCen x 15 mm placas de Petri de 150 mm mayor en 40 ml de la misma densidad. En este caso un cambio de medio a medio volumen se realiza en ambos días 3 y 6 días (es decir, 20 ml de medio eliminadas, las células se centrifugaron y se reemplaza con frescos 20 ml de medio suplementado con 20 ng / ml rGM-CSF). Estas placas suelen generar 3 - 6 x 10 7 células por placa en el día 7. FL-HA es un reactivo importante, junto con MHCII, para distinguir los macrófagos de las CD inmaduras y maduras en la cultura del BMC. Así, una vez que está hecho, valorar el FL-HA para su uso en células sabe que se unen constitutivamente HA como los macrófagos alveolares 18 o células BW5147 T y confirmar su especificidad utilizando un anticuerpo CD44 HA-bloqueo (KM-81, disponible en el mercado), HA no marcado o una célula deficiente CD44. CD11c - células Gr1 + en el cultivo puede funcionar como un control interno para las células no HA-unión, y una fluorescencia menos uno de control (FMO) o culturas BMC con deficiencia de CD44 son muy recomendables para los Ajustes precisag de la puerta de unión a FL-HA.

Aunque los experimentos se pueden realizar utilizando una cultura heterogénea, es aconsejable para enriquecer para el DC o población de macrófagos utilizando fluorescencia clasificación de células activadas o perlas magnéticas recubiertas de anticuerpo 18 sobre la base de la expresión de CD11c, Gr1, MHCII, y la unión de HA. Posibles experimentos incluyen la estimulación con agonistas de los receptores Toll-like tales como LPS para medir la activación y la producción de citoquinas, los ensayos de activación de células T, o caracterización adicional mediante citometría de flujo. Por ejemplo, después de 8 o 24 h de estimulación, citometría de flujo se puede utilizar para medir la tinción intracelular de citoquinas y / o marcaje de la superficie de moléculas coestimuladoras tales como CD40 y CD86, como se describe en 18. procedimientos de etiquetado intracelular de citoquinas requieren tratamiento previo de las células con Brefeldina A, que evita que la secreción y permite que la citoquina se acumule dentro de la célula. Para los ensayos de activación de células T que implican el loading de un antígeno tal como el péptido OVA por una célula presentadora de antígeno, los macrófagos purificados basan en MHCII y HA de unión no activar las células T mientras inmaduros y maduros DCS 18. Cabe señalar que el procedimiento de clasificación por sí sola puede activar las células dendríticas, en cierta medida, por lo que es importante incluir controles negativos en todos los experimentos.

Al igual que con cualquier método in vitro, hay ventajas y desventajas comparado con el uso en las células in vivo o ex vivo. La desventaja es que en las células in vitro derivados pueden no células exactamente imitan in vivo, pero tienen la ventaja de que se pueden generar en número suficiente para permitir el análisis funcional y bioquímico, algo que a menudo no es factible con las células ex vivo. Este método de identificación de los macrófagos y DC permitirá que las futuras investigaciones para obtener poblaciones celulares más homogéneas de una cultura con hetero previamente subestimadogeneidad. Como macrófagos purificados a partir de este cultivo GM-CSF se parecen mucho a los macrófagos alveolares de los pulmones 18, que proporciona una fuente conveniente de los macrófagos alveolares como para el análisis in vitro. Por ejemplo, estos macrófagos de unión de HA se podrían usar para seleccionar fármacos que modifican la función de los macrófagos alveolares y para investigar los mecanismos de infección por Mycobacterium tuberculosis y resistencia. Dado el reciente descubrimiento de que GM-CSF y el hueso M-CSF derivada de la médula trasplante de macrófagos pueden aliviar proteinosis pulmonar en ratones 28,29, este método para identificar los macrófagos a partir de cultivos GM-CSF puede ayudar a aumentar la eficacia de esta terapia propuesta.

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Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) (Grant RP-119503) y el Consejo de Ciencias e Ingeniería de la Naturaleza de Canadá (NSERC). CRSNG también apoyó becas de verano para YD YD y AA es apoyado por la Universidad de Columbia Británica (UBC), con un premio de beca de 4 años, AA es apoyado por CIHR con la concesión de un Maestro estudiante graduado (CGS-M). Agradecemos a Calvin Roskelley para obtener ayuda con el microscopio utilizado para generar las imágenes en la Figura 2. También reconocemos el apoyo de los animales y el flujo de Instalaciones de citometría de UBC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Flow Cytometer BD  LSR-II
Automated Inverted Microscope  Leica  DMI4000 B
Centrifuge  Thermo Fisher ST-40R
Biosafety Cabinet Nuaire NU-425-600
Syringe 1 ml BD 309659
26 1/2 Gauge Needle BD 305111
50 ml Conical Tube  Corning 357070 *Falcon brand
Eppendorf tubes (1.5 ml) Corning MCT-150-C
5 ml polystyrene round bottomed tubes Corning 352052
Dissection Tools Fine Science Tools  *Various  *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep 
Hemocytometer  Reichert 1490
Sterile 100 mm x 15 mm Petri Dish Corning 351029 *Falcon brand
2-Mercaptoethanol Thermo Fisher 21985-023
Ammonium Chloride BDH BDH0208-500G
Bovine Serum Albumin Fisher Bioreagents BP1600-1
Brefeldin A Sigma B7651-5MG
EDTA Sigma E5134-1KG Ethylenediaminetetraacetic acid
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 16000-044
Hank's Balanced Salt Solution Thermo Fisher 14175-095 
HEPES Thermo Fisher 15630-080 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
L-Glutamine Sigma G8540-100G
LPS Ultrapure Invivogen tlrl-3pelps
MEM Non-Essential Amino Acids Solution  Thermo Fisher 11140-050
Penicillin/Streptomycin 100x Thermo Fisher 15140-122
Potassium Phosphate Monobasic BDH BDH0268-500G
Potassium Chloride BDH BDH9258-500G
Recombinant GM-CSF Peprotech 315-03-A
Rooster Comb Sodium Hyaluronate  Sigma H5388-1G *Used to make fluoresceinated hyaluronan
RPMI-1640  Thermo Fisher 21870-076 No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37 °C before using.
Sodium Chloride Fisher  5271-10  
Sodium Phosphate Dibasic Sigma 50876-1Kg
Sodium Pyruvate Sigma P5290-100G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Fisher Bioreagents BP152-5
Trypan Blue Sigma T8154
Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant N/A N/A Clone: 2.4G2
Anti-CD11c PeCy7 eBioscience 25-0114-82 Clone: N418
Anti-Gr-1 efluor450 eBioscience 48-5931-82 Clone: RB6-8C5
Anti-MHCII APC eBioscience 17-5321-82 Clone: M5/114.15.2
Biotinylated Anti-MerTK Abcam BAF591 Goat polyclonal IgG
Streptavidin PE eBioscience 12-4317-87
Propidium Iodide Sigma P4170-25MG
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) Sigma D9542-5MG

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References

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