Tリンパ球接着分子の相互作用の研究のための接着性の下でせん断応力の測定

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Immunology and Infection

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Summary

この流接着アッセイは、T細胞、上皮細胞間相互作用の単純な、耐衝撃性モデルを提供します。シリンジポンプは、剪断応力を生成するために使用し、共焦点顕微鏡は、定量化のための画像を捕捉します。これらの研究の目的は、効果的に流れ条件を使用して、T細胞接着を定量化することです。

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Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Peled, M., Mor, A. Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions. J. Vis. Exp. (112), e54203, doi:10.3791/54203 (2016).

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Abstract

全体的に、T細胞の接着は、免疫学的シナプスの形成における抗原提示細胞(APC)と炎症との相互作用の部位への細胞漸増の明確なプロセスに貢献し、機能の重要なコンポーネントです。 T細胞の接着のこれら二つのコンテキストは、T細胞 - 血管相互作用が循環自体によって生じるせん断応力によりチャレンジされている間の相互作用は、静的と考えることができるT細胞APCが異なります。 2つの細胞パートナーが互いに静的な相対的であるという点で、T細胞APCの相互作用は、静的に分類されます。通常、この相互作用は、リンパ節内で発生します。 T細胞は、血管壁と相互作用するように、細胞が停止し、生成された剪断応力に耐えなければならない。1,2-これらの違いは、より優れた二つの別個の調節プロセスとして流動条件下での静的接着性及び密着性を理解する必要性を強調しています。 T細胞の接着の調節は、最も簡潔に詐欺のように記述することができます細胞表面上に発現される分子をインテグリン、それによって相互作用する細胞の表面に発現接着分子リガンドとインテグリンとの相互作用を調節する親和性状態をトローリング。インテグリン親和性状態の規制の我々の現在の理解は、in vitroモデル系において 、多くの場合、単純化から来ています。ここで説明したフロー条件を使用して接着のアッセイは、刺激に続くリアルタイムでT細胞、上皮細胞間相互作用の可視化と正確な定量を可能にします。フローアッセイの下の密着性が阻害または刺激性物質で処理した後のT細胞内のシグナル伝達接着の研究にも適用することができます。さらに、このアッセイは、任意の接着白血球集団および任意のインテグリン接着分子対にT細胞シグナル伝達を超えて拡張することができます。

Introduction

Tリンパ球の接着は、T細胞輸送および抗原提示において重要な役割を果たし3、健康な免疫系に異なるプロセスの数を媒介します。免疫監視またはアクティブな免疫応答の間の接着のために、これらの二つの大きな役割が重要であるかどうか。4 T細胞-内皮細胞相互作用の生理学的なシグナル伝達イベントは、T細胞抗原提示細胞(APC)の相互作用とは区別されるため、別個の方法を必要と最高の関与するシグナル伝達カスケードを理解するための研究。リンパ球の血管外遊出中の血管壁へのT細胞の強固な接着を迅速かつ動的なインテグリン活性化を必要とします。内皮に沿って、アクティブ状態のインテグリンおよび接着分子間の緊密な相互作用は、T細胞は、細胞の通過に許容エリアの探索に表面に沿ってクロールすることができ、血液の流れに耐性の密着性につながる。5 T細胞の双方向のクロール-directionally ALONGA血管壁は、T細胞の異なる接着フロントエンドと、偏接着に頼るである。 図6は、最も重要なことは、強固な接着および遊出は、血流を循環させることにより生成される剪断力に対する抵抗を必要とします。

リンパ球の接着を研究するための実験を​​設計する場合、注意が興味のある特定の刺激に支払われるべきです。インテグリン活性化は、T細胞の接着のすべての形態の共通の重要な要素であるが、活性化のカスケードは、個々の受容体および共受容体の下流で一意である可能性があります。同様に、インテグリンおよび接着分子のペアは、特殊な微小環境で、特定の部分集団に機能します。このようにして、これらのペアは非常に異なって調節され得ます。ここで紹介するモデルは、せん断応力条件下で行わインテグリン活性化をもたらすシグナル伝達カスケードの研究のための理想的です。7これらの相互作用が十分に静的adhesiで理解することはできませんシステム上の衝撃によるこれらの力は、T細胞の挙動に直接有することが示されている。8のシステムは、T細胞およびヒトICAM-1(CHO-ICAM細胞)を発現するように操作されたCHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞をここにすることができる提示けれども簡単に異なる白血球集団または接着分子を研究するために改変することができます。

このアッセイは、白血球の血管外遊出の強固な接着段階のためのモデルを提供し、剪断応力を用いて、T細胞の接着およびインテグリンの活性化を定量化する方法を提供します。 CHO-ICAM細胞の使用を介して、生細胞中のそのリガンドに対するLFA-1の親和性は、目的の種々の刺激に応答してリアルタイムで調べることができます。この手法は、簡単に大きく、他のモデルと比較して、血流および剪断応力をモデル化するために必要な設備を簡素化、シリンジポンプと組み合わせた市販のマイクロ流チャンバを得る必要があります。9このアッセイの別の主要な利点は、特定のシグナリングでありますカスケードおよび個々のインテグリンの結果として生じる活性化状態は、きれいに、目的のヒトの接着分子を発現する操作されたCHO細胞を使用することによって研究することができます。さらに、生細胞イメージングで定量的データの組み合わせは、この方法の重要な利点です。静的なT細胞の接着のアッセイ数がうまくT細胞APCの相互作用をモデル化することが記載されているが全体として、これらのモデルは、T細胞、上皮細胞接着の動的なプロセスを取り込むには不十分です。接着アッセイを選択する際にこのような理由から、問題の刺激を考慮しなければなりません。

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Protocol

1.めっきCHO-ICAM細胞

注:このステップの目標は、コンフルエントな単層を生成することを目標に一晩成長のためのフローチャンバーにCHO-ICAMの細胞をプレーすることです。

  1. 37℃で10mlの%ウシ胎児血清(FBS)を補充したRPMI培地および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(CHO-ICAM完全培地)中で10cmの組織培養処理された培養皿にCHO-ICAM細胞を維持する5% CO 2。
  2. 細胞を収集するには、1ミリリットルの0.5%トリプシン-EDTAを追加し、穏やかに振盪しながら1分間室温でインキュベートします。メディアの4mlでトリプシンを中和します。
  3. 血球計を用いてCHO-ICAM細胞をカウントし、室あたり0.75×10 5細胞を計算します。注:この実験では:2.25×10 5細胞が3室をシードするために必要とされます。
  4. 遠心分離機0.75×10 500×gで5分間室あたり5 CHO-ICAM細胞、室温およびCHOの室あたり30μlの細胞ペレットを再懸濁-ICAM完全培養培地。
    注:この実験では90μlを3室をシードするために必要とされます。
  5. ゆっくりとフローチャンバーの1リザーバ内にセルを追加。細胞は、5%CO 2で37℃インキュベーターで5分間沈降することを可能にします。
  6. 各チャンバの2つのリザーバを横切って完全培養培地200μlのを追加します。システムが平衡するように、細胞の移動を避けるためには、2つの間の代替の追加。
  7. 5%CO 2で一晩37℃のインキュベーター内部の細胞をインキュベートします。

T細胞の調製

注:このアッセイは、初代ヒトT細胞またはT細胞株を用いて行うことができます。血液からのT細胞の単離のプロトコールは、以前に記載されている。10、一次ヒトT細胞を使用する場合、最良の結果のために新鮮に単離された細胞を使用します。 T細胞株を使用する場合、セルのソースによって指定された培養プロトコルに従います。蛍光microscoの細胞を検出するためにT細胞をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)で標識されているPE。

  1. 血球計を使用したT細胞をカウントし、室あたり2×10 6細胞を計算します。注記:この実験では、6×10 6細胞を、3室のために必要とされるであろう。
  2. 遠心分離機2×10 500×gで5分間の室あたり6 T細胞を、室温で、1%グルコースまたは2%FBSを含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)1ml中の細胞を再懸濁します。
  3. 1でCFSEを追加:1,000希釈(5 mMのに行われた株式)。光から覆い、室温で8分間インキュベート
  4. 5分、RTのために500×gでスピン。
  5. RPMI培地血清を欠くの条件あたり240μlの再懸濁細胞ペレット(第4章「注意」を参照してください)​​。この実験では、プレーンなRPMIの720μlの細胞ペレットを再懸濁します。各チャンバ、チューブあたり240μlのために標識空の1.5ミリリットルチューブに細胞を分割します。使用するまで37℃のヒートブロック中で細胞を保管してください。

3.番目のセットアップ電子入力/出力ホースとシリンジポンプ

  1. 37°Cまでの顕微鏡ライブイメージング室を温めます。
  2. 入力ホースを準備します。
    1. 水と500ミリリットルのガラス瓶を記入し、蓋に2穴を作ります。 「中」とホールのラベルを付け、「アウト。」 これは、 入力メディアの加熱水浴として機能します。
    2. 蓋の穴を通って水浴中にホースの入力を実行します。 "アウト"穴から来るシリンジに接続するホースの側が穴"で"と入力リザーバに接続する側を通って来ていることを確認してください。
    3. システムから空気を除去し、水60mlでホース入力を洗い流します。
    4. プライムRPMI培地は、血清を欠くとホースの入力は 37℃に温めました。 60ミリリットル注射器を記入し、ホースが完全にプライミングされた、任意の気泡を欠くするまでメディアを押し通します。
      注:lengtに応じて、チューブの時間は異なりますプライムに必要なボリュームを使用していました。
      1. (ここでは3)の実験でチャンバーの数により分(5分)の数で流れ(ここでは0.3 ml /分)の速度を乗算することにより、実験に必要なメディアの量を計算します。この実験では、4.5ミリリットルのメディアを使用しています。注:私たちは、プライミングした後、注射器に残っている(ここでは9.5ミリリットル合計)5ミリリットルに余分な容積を有するお勧めします。
    5. 37℃を維持するために、顕微鏡のライブイメージングのエンクロージャに全体を入力セットアップを置きます。筐体の外にホースとシリンジを実行して、シリンジポンプにシリンジをロードします。
  3. 出力ホースを準備します。
    1. 出力廃棄物として使用するために250ミリリットルボトルの蓋に穴を作ります。
    2. 穴を通ってボトルへ出力チューブを実行します。大まかにすべての方法を閉じていない、ふたを固定します。
    3. マイルのライブイメージングのエンクロージャに出力設定を置きますcroscope。
  4. 所望の剪断応力(ダイン/ cm 2)を生成するために必要な流量(ml /分)を計算します。せん断応力はせん断​​応力レベルを決定する際に、したがって考慮細胞研究するタイプやトリートメントを含む全体的なモデルを取る、別の血管の区画で変化します。
    注:これらの実験は、密接に小静脈設定を模倣する0.4ダイン/ cm 2で行われます。
    1. せん断応力を計算する際に考慮室の寸法を取ります。フローチャンバーのために(メーカー11によって提供される)次の式を使用し(材料の表を参照してください)ここで使用される:T =η* 176.1 *øここで、T =せん断応力、η=動的粘度、O =流量。注:37℃でRPMI媒体の動的粘度は、0.007です。

細胞のフローチェンバースと刺激の4読み込んでいます

注:接着を開始するために、T細胞が刺激されなければなりません。以下の実験では、細胞が刺激されていないままにするか、またはSDF-1α12またはホルボールミリステートアセテート(PMA;陽性対照)で刺激されている13。 T細胞へのケモカインの適切なプレゼンテーションのために、CHO-ICAM細胞は、細胞表面上での提示を可能にする、(シリアル回洗浄した)SDF-1αと共にプレインキュベートされています。 PMAは、二次メッセンジャーのジアシルグリセロール(DAG)に構造的に類似しているホルボールエステルです。ここでは、陽性対照として使用します。 T細胞は、直前フローチャンバーにロードし、PMAで処理されます。

  1. 顕微鏡でのフローチャンバースライドを配置し、20Xの対物レンズを用いてCHO-ICAMの単層上で焦点面を設定します。
  2. 37℃のヒートブロック内の他のすべての条件をCFSEで染色したT細胞を保管してください。その条件のためのアッセイの直前に、次のようにCHO-ICAMまたはT細胞を準備します。
    1. 刺激されていない状態(チャンバ1)の場合、1チューブ/フローCHを保ちます未処理の琥珀は、刺激のための陰性対照として機能します。
    2. PMA刺激(チャンバ2)については、陽性対照として役立つようにPMA(10ng / ml)でT細胞の管を刺激します。フローチャンバーにロードする直前に扱います。
    3. SDF-1α刺激、(チャンバ3)の場合は、上部の貯水池( 出力リザーバー )から一度に3回を70μLを除去した後、自衛隊の70μLを加えることによって、SDF-1α(100ng / mlの)第3フローチャンバーを刺激します-1α(100ng / mlの)下池( 入力リザーバ )へ。 5分間インキュベートします。
  3. 1室の出力リザーバーから3回を削除し、一度に70μLを捨てます。
  4. 3回入力リザーバに前処理された70μlの(該当する場合)のT細胞懸濁液を追加します。細胞は、チャンバ(「中」)の入口から移動できるように5分待ってから、チャンバーの近位出口(「アウト」)に達します。
  5. この間、画像5CFSE染色T細胞のためのフィールド。チャンバーの中央( 図1)全体に分散されたフィールドを選択してください。励起レーザ波長:以下の励起/発光条件使用488nmでの、放射捕集フィルタ:500から540 nmの。これらの画像は、プレフロー細胞数となります。
  6. フローチャンバーの貯水池に同時に入力出力のチューブを取り付けます。
    注意:チャンバー内に気泡を導入し、チャンバ内の全体的な平衡を維持しないように同時にチューブを取り付けることが重要です。
  7. CFSE染色T細胞を可視化しながら、0.3ミリリットル/分(0.4ダイン/ cm 2)とで流れを開始します。フローは、特に第一のチャンバと、開始すると、したがって、T細胞の移動の開始タイミングで5分間の開始、多くの場合、流れを開始し、T細胞ローリングを観察する間に遅延が存在します。
  8. 5分後にフローを終了し、CFSEチャネル内の画像5フィールド。ランダムのthro分散フィールドを選択します。フローチャンバーの中心ughout( 図1)。これらの画像は、後流の細胞数となります。

5.接着細胞の割合の判定

注:取得された画像中の細胞の数の決意を自動化ソフトウェアを使用して客観的に行われます。我々の研究のために我々は、そのようなImageJの(バージョン1.48V)などのソフトウェアVolocity(バージョン6.2.1)が、他のソフトウェアを使用するにも適用可能です。

  1. 各条件のためのフィールドプリフロー当たりの細胞数を決定します。 5フィールドの平均は「プレフロー平均細胞数」である。7
  2. 各条件についてフィールドポストフロー当たりの細胞数を決定します。 5フィールドの平均は「ポストフローの平均細胞数」である。7
  3. 以下の式を使用して接着細胞の割合を計算する: 接着細胞のパーセンテージ=(ポストフロー平均細胞数)/(プレフロー平均細胞数)×100%。

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Representative Results

代表的な結果は、Jurkat細胞および初代ヒトCD3 + T細胞を用いたフロー接着アッセイで示され、示されているように、SDF-1αで刺激しました。すべて示される実験における負の対照は、刺激されていない細胞です。非刺激細胞の閾値基礎パーセント接着は、5との間にある - 10%。特に、この範囲を超える塩基の密着性が問題と実験を示し、T細胞の開始集団は非特異的製剤に予め活性化した示唆しています。非刺激細胞の上に、各条件でポストフローは、パーセント接着の計算に加えて、計算することができる接着細胞の数の増加を折ります。これら2つの計算方法を表すデータはここに含まれています。

図2Aは、各条件の前後の流れのためのフローチャンバ内のフィールドの代表的な画像を示します。実験の前に、ジャーカット(ショーnは図2A)または初代ヒトCD3 + T細胞中、精製計数し、CFSEで標識されます。各実験条件について2×10 6細胞を標識しました。非刺激T細胞は、SDF-1αの存在下または非存在下でのCHO-ICAM細胞を含むフローチャンバーに入れました。 T細胞は、5分間チャンバ内に移動させ、蓄積させ、この時間の間に画像が前のフロー数を決定するために捕捉しました。異なる刺激間の細胞の同等の数プレ流れが均一な実験条件を確保することが不可欠です。流れによって生じる連続的な剪断応力の5分後に、画像が再びポストフローの数を決定するために捕捉しました。これは、SDF-1αは、せん断応力下でCHO-ICAM細胞に接着することができるT細胞の数を増加させ、これらの代表的な画像を介して明らかです。

図2Bは、校正などのT細胞接着の変化倍率を示しますジャーカットT細胞の数非刺激またはSDF-1αの存在のいずれかで前後のフローに基づいてculated。すべての条件の5フィールドプリフロー及び5フィールドポストフローの平均細胞数を測定し、非刺激に対するSDF-1α刺激の比較は、T細胞の接着における倍数変化を計算するために使用されます。ここに示されているように、SDF-1αは、非刺激に比べて密着性に近い2倍の増加を誘導します。

図2Cは、データ演算の代替方法を示しています。ここでSDF-1αの存在下または非存在下で初代ヒトCD3 + T細胞のパーセント接着は、まずプリフロー平均によってポストフローの平均を分割する、平均前後の流T細胞数を決定することによって決定されますこの計算により100によって全体プリフロー集団を乗算して、100%の接着を表します。ここに示されているように、未刺激T細胞の15%が剪断STRE下付着しますSDF-1αで刺激したT細胞の50%と比較してssです。

図1
図1には均一な流れにさらされる領域のみを分析することが重要である。フィールドは、撮像されるべき場所の目安で使用されるフローチャンバの概略図。チャンバー製造業者によって提供された情報に従って、事前設定流量は、この図にオレンジ色で示されるチャンバの中心を通して達成されます。チャンバーの国境に近い流量が低下し、実験的なイメージングや分析に含まれるべきではない。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2. <強い> SDF-1αは、 剪断応力下ICAM-1へのT細胞接着を誘発する。A.ジャーカットT細胞を、5μMの濃度のCFSEで標識しました。次に、細胞は、SDF-1α(100ng / ml)または非刺激し、共焦点顕微鏡に設定し、5分間チャンバー内に移動し、蓄積することが許さで前処理したフローチャンバーに入れました。代替的に、ジャーカットT細胞を、前のフローチャンバーに加えにPMA(10ng / ml)で前処理しました。それらの5分間のプレ流像を通して捕捉しました。フローはその後5分間剪断応力を作成するために0.4ダイン/ cm 2で開始しました。完了時に、ポストフロー画像を捕捉しました。ジャーカットT細胞の代表的な画像は、スケールバーは50μmを示す。ジャーカットT細胞の接着におけるB.倍数変化を最初に各条件について平均前後フローセルの数を決定し、平均ポストフローの数を割ることによって算出しました。平均プリフローの共同により各条件について個別にUNT。各刺激条件について、この接着商、ここでSDF-1α又はPMAは、次に接着における倍数変化を決定するために、刺激されていない接着商によって分割されます。バーは、まず、各条件について平均前後のフロー細胞数を決定することによって計算された初代ヒトCD3 + T細胞のSEM。C.パーセント接着±3回の実験の平均を表します。各条件について、平均ポストフローカウントが平均プリフロー数で除算し、得られたパーセント接着はプリフロー細胞数を100%接着さに基づいて100を乗じました。バーはSEM±5回の実験の平均を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3. T細胞は、最初に、CHO-ICAM単層上を流れるその後蓄積する。ジャーカットT細胞を、5μMの濃度のCFSEで標識しました。次に、細胞は、SDF-1α(100ng / mlの)で前処理し、共焦点顕微鏡に設定し、5分間チャンバー内に移動し、蓄積させたフローチャンバーに入れました。これらの5分の画像を通して、タイムラプスシリーズとして捕獲されました。まだ(A)フレーム。フローはその後5分間剪断応力を作成するために0.4ダイン/ cm 2で開始しました。これらの5分の画像を通して、タイムラプスシリーズとして捕獲されました。まだ(B)フレーム。これらの画像内の流れの方向は、下から上にあり、焦点面は、CHO-ICAM単層に設定されています。 (1)流量で単層に沿って転動T細胞が可視化されるように短く、水平線画像化されながら、彼らは急速に動いているので、フィールドを横切って下から上に移動する:T細胞は、3つの群に分類することができます。 (2)T細胞crawlin単層に沿っグラム。これらの細胞は、しっかり流れに対する抵抗に基づいて接着されており、このモデルにおいて観察されていない細胞の通過に許容領域の探索における可能性がクロールされています。 (3)単層強固に接着T細胞を、フローに耐性があるが、不動です。これらの細胞は積極的に圧延または単層に沿ってクロールされていません。より洗練された分析をさらに定量化または特徴付けのためのこれらの細胞集団を分析するように設計されたImageJのスクリプトを使用することにより、研究の目的に基づいて、行うことができます。スケールは50μmのバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4. CHO-ICAM細胞がコンフルエントな単層を形成しなければならない。コンフルエントCHO-ICAM monolayの代表画像をフローチャンバー内の小胞体。スケールバーは10μm。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

正常T細胞の接着を分析するために、刺激は、インビトロの方法を選択する際に考慮しなければならない研究に含まれます。 LFA-1の活性化および結合ICAM-1につながる信号を研究するためのいくつかのアッセイがありますが、すべてのメソッドには互換性がありません。静的接着アッセイ10は、T細胞、APCの相互作用を研究するのに最適な、その代わりに、ここで詳述せん断応力法は、T細胞の上皮細胞の相互作用をモデル化することが理想的である。 インビボケモカインは内皮細胞に沿って提示されているように、T細胞を圧延すると、しっかりと血流14,15のせん断応力を接着し、抵抗することによって応答しなければなりません。この理由のために、ケモカインシグナル伝達の研究は、最高の剪断応力を組み込むアッセイにおいて研究されるのに適しています。フロー条件を使用して、この接着の主な利点は、T細胞とインテグリンの間の相互作用のモデリングにおけるその単純です。このアッセイは、非常にユニークに機能的および機械を組み合わせました1インテグリン接着分子ペアの研究のための環境をモデル化することによって研究。この方法のもう一つの強みはその適応性です。この方法は、任意の接着分子への白血球の接着を定量化するために使用することができます。この方法は、複数の薬物または変更されたインテグリン活性化を介してT細胞の動員と溢出を変えることが期待遺伝子操作の効果をスクリーニングするために使用することができます。

任意のインビトロ方法と同様に、このアッセイのいくつかの制限があります。このモデルは、操作されたCHO細胞ではなく、他のモデルのように刺激された初代内皮細胞を使用している使用しています。16これは私たちに、単一のインテグリンの活性化状態に影響を与えるシグナル伝達事象を理解する能力を提供しますが、これは、モデルの弱点と考えることができます。 CHO細胞により発現ないセレクチンが存在しないように、アッセイは、2つのステップで行われます。第一段階(蓄積段階)の間、T細胞は、入力RESERVに注入されますチャンバーの一方の側にOIRおよび最小の圧力と毛管力によって反対側に移動します。これらの5分を通してT細胞の挙動図3Aで観察することができます。 5分後、第二工程(フロー相)の間に流量が増加し、細胞が転動を開始し、付着します。流れは(図3B)が大きくなるように、蓄積段階の間にチャンバを横切る入力リザーバ移動に注入し、すべてのT細胞、およびこれらの細胞が単層に沿って回転しないことに留意することが重要です。このように、溢出の圧延段階を人工的に強化されますが、このモデルでは、排除されません。

接着細胞の最大数は、チャンバー内に入る入力セルの数の表現であるので、実験間生の数の変動の可能性があります。彼らはaccounに反映されていませんので、プリフローの画像が完全に100%、最大T細胞集団を表すものではありませんが入力リザーバT、個別にカウント2つの異なる細胞型が比較される場合は特に、計算に含めるための重要な制御です。さらに、一次爆発のリンパ球は、単一の可変接着分析に使用することが推奨されていません。すなわち、T細胞受容体(TCR)及び/又は共受容体を介してT細胞の予備刺激は接着の目的の治療効果を混乱することができる、と言うことです。これらの変数は、実験設計時に考慮すべきです。同様に、以前に凍結したPBMCとの機能的研究は、多くの場合、交絡結果が得られ、そしてこの理由のための細胞株または新たに単離した主要なPBMCを、このアッセイで最適に動作します。 PBMCは、研究に含まれるために刺激されていない接着の通常のベースレベルを理解することは、非特異的に交絡結果につながる予備活性化された細胞集団を特定する上で重要です。

正確にこのアッセイを複製するには、そのいくつかのステップが不可欠ですセトリングを含むプロトコルでの、およびインキュベーション時間を流れ、すべての条件のうち、正確かつ均一です。この同じ光では、CHO-ICAM細胞は一様にも正確でなければならないすべてのフローチャンバー( 図4)およびT細胞数全体でコンフルエントにする必要があります。これらの要因の17でさえ小さな違いが、最終的に細胞数の精度に影響を与える可能性があります。このアッセイの将来の応用は、個別に、他のシグナル伝達カスケードには、この方法の影響を拡大するセレクチンおよび接着分子を発現する細胞株の一連の開発です。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
T cell samples (cell line or primary) ATCC TIB-152 Peripheral human T cells
CHO-ICAM-1 cells ATCC CRL-2093
µ-Slide VI 0.4 ibiTreat ibidi 80606
500 ml glass bottle Fisher FB800500
250 ml glass bottle Fisher FB800250
Silicone tubing 0.8 mm ibidi 10841
Confocal microscope with incubator chamber Ziess 700 Any wide field fluorescent microscope
Syringe pump New Era Pump Systems NE-300
60 ml syringe BD 309653
CFSE eBioscience 65-0850
SDF-1α R&D 350-NS-010/CF
RPMI Lonza 12-702F/12
PBS  Lonza 17-516F
Microcentrifuge Eppendorf  5424
D-Glucose Sigma Aldrich G8270 
PMA Sigma Aldrich 16561-29-8
Volocity software Perkin Elmer Version 6.2.1
ImageJ software NIH Version 1.48V
Tissue-culture treated culture dishes Falcon 353003
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red Gibco 25200114
Heat Inactivated FBS Denville FB5001-H
Penicillin/Streptomycin Fisher BP295950

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References

  1. Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Curr Opin Cell Biol. 20, (5), 525-532 (2008).
  2. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, (9), 678-689 (2007).
  3. Dustin, M. L., Bivona, T. G., Philips, M. R. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5, (4), 363-372 (2004).
  4. Mor, A., Dustin, M. L., Philips, M. R. Small GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
  5. Rose, D. M., Alon, R., Ginsberg, M. H. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
  6. Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24, (5), 670-676 (2012).
  7. Su, W., et al. Rap1 and its effector RIAM are required for lymphocyte trafficking. Blood. 126, (25), 2695-2703 (2015).
  8. Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophys J. 102, (2), L5-L7 (2012).
  9. Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12, (12), 2618-2622 (1997).
  10. Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Pedoeem, A., Mor, A. Static adhesion assay for the study of integrin activation in T lymphocytes. J Vis Exp. (88), (2014).
  11. Ibidi GmbH. Shear stress and shear rates for ibidi μ-Slides - based on numerical calculations. Application Note 11. Available from: http://ibidi.com/fileadmin/support/application_notes/AN11_Shear_stress.pdf (2014).
  12. van Gijsel-Bonnello, M., et al. Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration. J Cell Physiol. 230, (10), 2415-2425 (2015).
  13. Tozeren, A., et al. Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1. Biophys J. 63, (1), 247-258 (1992).
  14. Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability. Immunol Lett. 145, (1-2), 2-9 (2012).
  15. Rot, A. In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells. J Immunol Methods. 273, (1-2), 63-71 (2003).
  16. Yang, L., et al. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106, (2), 584-592 (2005).
  17. Long, E. O. ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion. J Immunol. 186, (9), 5021-5023 (2011).

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