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अलगाव और mesenchymal स्टेम का विस्तार / stromal कोशिकाओं मानव प्लेसेंटा ऊतकों से निकाली गई

Developmental Biology
 

Summary

इस के साथ साथ हम मानव अवधि नाल से भ्रूण और मातृ ऊतकों के विच्छेदन के लिए विधियों, अलगाव और इन ऊतकों से mesenchymal स्टेम / stromal कोशिकाओं (एमएससी) के विस्तार के द्वारा पीछा वर्णन है।

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Pelekanos, R. A., Sardesai, V. S., Futrega, K., Lott, W. B., Kuhn, M., Doran, M. R. Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue. J. Vis. Exp. (112), e54204, doi:10.3791/54204 (2016).

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Abstract

Introduction

Mesenchymal स्टेम / stromal कोशिकाओं (एमएससी) सेल आधारित चिकित्सा 1 में इस्तेमाल के लिए एक आशाजनक उम्मीदवार के रूप में उभर रहे हैं। अधिकांश आवेदन एमएससी की मध्यस्थता ऊतकों की मरम्मत या प्रतिरक्षा विनियमन 2 लक्ष्य दिखाई देते हैं। इन आवेदनों में से कई में, एलोजेनिक एमएससी ऑटोलॉगस एमएससी 3 के रूप में प्रभावी हो सकता है। एलोजेनिक एमएससी का उपयोग एक ही स्रोत ऊतक 4 से कई सेल खुराक का बड़े पैमाने पर निर्माण कई रोगियों का इलाज करने के साथ संगत होने का आर्थिक लाभ दिया है।

ऐतिहासिक दृष्टि से, पूर्व नैदानिक ​​और नैदानिक ​​अध्ययन का उपयोग किया है अस्थि मज्जा 4 से एमएससी-निकाली गई। अस्थि मज्जा आम तौर पर एक स्वयंसेवक दाता की श्रोणिफलक शिखा से एकत्र किया जाता है। इस प्रक्रिया को आक्रामक है, और केवल मज्जा (~ 20 एमएल) की एक छोटी मात्रा एक भी पंचर के माध्यम से एकत्र किया जाता है। एमएससी की चिकित्सकीय सार्थक संख्या पैदा करने के लिए इन विट्रो विस्तार में व्यापक आवश्यकता है। सेल शक्ति बीतने संख्या के साथ कम हो जाती है 4), जो दाता के लिए कोई जोखिम के साथ सीजेरियन सेक्शन के दौरान aseptically काटा जा सकता है। एमएससी नाल से निकाली गई लंबी अवधि के प्रसार 5 और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी क्षमता 6, अस्थि मज्जा व्युत्पन्न एमएससी करने के लिए बेहतर है। पिछले एक अध्ययन में, हम दिखा दिया है कि एक ही पद नाल अप करने के लिए 7,000 नैदानिक ​​खुराक 4 के निर्माण के लिए पर्याप्त एमएससी निहित। इन विशेषताओं एलोजेनिक एमएससी के निर्माण के लिए एक आदर्श स्रोत ऊतक नाल बनाते हैं।

अपरा एक fetomaternal दोनों भ्रूण और मातृ ऊतक 7 से मिलकर हो सकता है, सैद्धांतिक रूप से, पृथक भ्रूण या मातृ मूल के एमएससी अंग है, और इस प्रकार है। निम्न संदर्भ de प्रदानविकास और विकृति पर पूंछ जानकारी, साथ ही मानव नाल और adnexa 8,9 की सूक्ष्म और स्थूल परीक्षा। नाल उचित काफी हद तक भ्रूण रक्त वाहिकाओं और स्रावी और समर्थन कोशिकाओं trophoblasts बुलाया के शामिल है, जरायु frondosum (प्लेट) 8 द्वारा कवर कोरियोनिक विल्ली बना रही है। branched अपरा विल्ली गर्भाशय सर्पिल धमनियों से बचाया मातृ रक्त में स्नान कर रहे हैं, पोषक तत्व, हार्मोन और भ्रूण और मां के बीच गैस विनिमय सक्षम करने से। नाल मातृ decidual stromal कोशिकाओं और भ्रूण extravillious trophoblasts के माध्यम से अंतर्गर्भाशयकला के लिए लंगर डाले है बाह्य मैट्रिक्स 8 में interspersed हैं। विल्ली भ्रूण कोरियोनिक प्लेट जहां वे गर्भनाल 8 फार्म पर एकाग्र।

अपरा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं पर पहला अंतर्राष्ट्रीय कार्यशाला का नतीजा (2008) अलगाव और characterizatio का मानकीकरण करने की जरूरत की सराहना की थीमानव अवधि नाल 10 से कोशिकाओं के एन। नाल की शरीर रचना के कारण, विभिन्न ऊतकों के विच्छेदन, एमएससी के अलगाव और प्रत्याशित संस्कृति परिणामों क्षेत्र के लिए नए लोगों के लिए भारी हो सकता है। इस प्रोटोकॉल में, अपरा कोरियोनिक ऊतकों की फसल, एमएससी अलगाव और विस्तार के द्वारा पीछा अच्छी तरह से विस्तृत है। से फ्लो के माध्यम से और इन विट्रो भेदभाव में एमएससी लक्षण वर्णन दिनचर्या 5,11-13 माना जाता है, और इस प्रकार केवल संक्षेप में यहां विस्तृत जानकारी दी।

जैसा कि हाल ही में एक व्यवस्थित साहित्य की समीक्षा 14 में प्रकाश डाला, एमएससी प्राप्त से अपरा कोरियोनिक विल्ली आम तौर पर भ्रूण माना जाता है। हालांकि, अध्ययन के केवल 18% एमएससी प्राप्त की उत्पत्ति की जांच की, और उन में से, पढ़ाई का केवल आधा भ्रूण एमएससी और दूसरे आधे मातृ या मिश्रित आबादी एमएससी सूचना दी। तीन ऊतक यहाँ बताया घटकों में से प्रत्येक (कोरियोनिक विल्ली, कोरियोनिक प्लेट और पत्या basalis) कंप्यूटर अनुप्रयोग हैंभ्रूण झिल्ली / विल्ली, और गर्भाशय व्युत्पन्न मातृ कोशिकाओं है, जो जन्म दिया नाल से जुड़े रहने के एक छोटे से अनुपात के मुख्य रूप से osed। हम डेटा का प्रदर्शन है कि, नाल के भ्रूण की ओर नाल की मातृ पक्ष, बजाय से एमएससी अलग-थलग करने के रूप में हम पहले से 5,11 सूचना दी है, एक और अधिक उचित मूल्य उस सामग्री है अगर मातृ एमएससी वांछित हैं प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल भी XY मछली का उपयोग सेल संस्कृतियों के लिए भ्रूण या मातृ योगदान को मान्य करने का वर्णन है। जबकि इस निर्माता से एक मानक प्रोटोकॉल है, इस विश्लेषण अक्सर उपेक्षित है और इसके महत्व को कम करके आंका 14।

Protocol

मेटर स्वास्थ्य सेवा पर मानव अनुसंधान आचार समितियों, रॉयल ब्रिस्बेन और महिला अस्पताल, क्वींसलैंड प्रौद्योगिकी विश्वविद्यालय और क्वींसलैंड विश्वविद्यालय के शोध और अध्ययन में इस्तेमाल मानव नाल नमूनों के संग्रह को मंजूरी दे दी। सभी प्रोटोकॉल राष्ट्रीय अनुसंधान के दिशा-निर्देशों का पालन किया। मरीजों अनुसंधान प्रयोजनों के लिए ऊतक के उपयोग के लिए लिखित सहमति सूचित प्रदान की।

तीसरी तिमाही गर्भनालों ब्रिस्बेन, ऑस्ट्रेलिया में उपर्युक्त अस्पतालों से अवधि में नियमित सीजेरियन सेक्शन (सीएस) के जन्म के बाद स्वस्थ मां से प्राप्त किया गया। अवधि के नमूने के लिए नर बेताल गर्भधारण मातृ कोशिकाओं से भ्रूण को अलग करने के लिए इस अध्ययन में उपयोग किया गया। भ्रूण लिंग जन्म और / या नैदानिक ​​कर्मचारियों द्वारा जन्म के समय नवजात शिशु के दृश्य निरीक्षण करने से पहले अल्ट्रासाउंड के द्वारा निर्धारित किया गया था। एक्स और वाई सीटू संकरण (मछली) में गुणसूत्र प्रतिदीप्ति आगे लिंग और ऊतक के भ्रूण या मातृ मूल से संरक्षित मान्य करने के लिए उपयोग किया गया थामूल गर्भनालों।

1. पहले फसल के लिए, निम्न तैयार

नोट: जब एंजाइम समाधान को बनाने, प्रत्येक उत्पाद के लिए निर्माता द्वारा प्रदान की विशिष्ट आवश्यकताओं और सांद्रता का पालन किया जाना चाहिए। एंजाइमों अक्सर प्रोटीन के एक कच्चे मिश्रण के रूप में प्रदान की जाती हैं, इसलिए विभिन्न कंपनियों से समान एंजाइमों विभिन्न गतिविधियों / सांद्रता है की संभावना है। इस कारण से निर्माता की सलाह को स्वीकार किया जाना चाहिए और समाधान तैयारी के हिसाब से संशोधित किया जा सकता है।

  1. तैयार करें या कुल 1.5 से 2 एल खरीद बाँझ इस प्रोटोकॉल के लिए हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (HbSS)।
  2. और collagenase प्रकार मैं बाहर वजन द्वारा कोलैजिनेज़ मैं शेयर समाधान तैयार धीरे पूरा विघटन सुनिश्चित करने के लिए 1 मिलीग्राम / मिलीलीटर HBSS में और भंवर भंग। 100 यूनिट (यू) / μl (1,000x शेयर समाधान) के लिए collagenase समाधान लाने और फिर उपयोग कर एक 0.2 और फिल्टर करने के लिए आवश्यक HBSS (कैल्शियम और मैग्नीशियम युक्त) की मात्रा का निर्धारण# 181; मीटर सिरिंज फिल्टर। -20 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में अशेष 1 मिलीलीटर की मात्रा और दुकान की जरूरत है जब तक।
  3. कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (DPBS) में 10 मिलीग्राम / एमएल पर गैर बाँझ Dispase भंग द्वारा Dispase शेयर समाधान तैयार है। इसके अलावा 2.4 यू / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना DPBS के साथ पतला। एक 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से बाँझ फ़िल्टर। 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में अशेष 1 मिलीलीटर की मात्रा और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान की जरूरत है जब तक।
  4. 0.15 एम NaCl में 10 मिलीग्राम / एमएल DNase-मैं भंग द्वारा deoxyribonuclease (DNase) -मैं शेयर समाधान तैयार है। एक 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर thorugh फ़िल्टर। 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में अशेष 1 मिलीलीटर की मात्रा और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान की जरूरत है जब तक।
  5. 100 यू / एमएल collagenase प्रकार के संयोजन से काम कर पाचन समाधान तैयार मैं, I.5 माइक्रोग्राम / एमएल DNase मैं और 2.4 यू / एमएल सीरम मुक्त DMEM में Dispase। हौसले defrost और एंजाइम शेयरों तुरंत उपयोग करने से पहले पतला। लगभग एक 1: 1 के अनुपात के पाचन समाधानऊतक मात्रा करने के लिए मात्रा की आवश्यकता होती है (ऊतक के जैसे 10 मिलीलीटर, 50 मिलीलीटर ट्यूब में मापा जाता है, पाचन समाधान के 10 मिलीलीटर की आवश्यकता है)।
  6. पीबीएस में 4% paraformaldehyde (पीएफए) के एक समाधान तैयार है और पीएच 7.4 से 15 को समायोजित। स्टोर लंबी अवधि के लिए या 1 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर -20 डिग्री सेल्सियस पर 25 एमएल aliquots।
  7. DMEM-कम ग्लूकोज (DMEM-एलजी) 1x एंटीबायोटिक और कवकनाशी समाधान और 10% गैर गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक से एमएससी संस्कृति के माध्यम से तैयार करें। एमएससी ग्रेड FBS कई FBS आपूर्तिकर्ताओं से खरीदा जा सकता है।
  8. संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार अग्रिम में विच्छेदन उपकरण बाँझ आटोक्लेव। ये कैंची, संदंश, नलियां, और एक बड़े धातु विच्छेदन ट्रे शामिल हैं। अतिरिक्त बाँझ टिशू कल्चर plasticware और उपभोग्य (जैसे छुरी ब्लेड, 50 मिलीग्राम और 15 मिलीलीटर ट्यूब, 25 मिलीलीटर, 10 मिलीग्राम और 5 मिलीग्राम pipettes, और 75 या 175 सेमी 2 सेल संस्कृति बोतल) ले लीजिए।
  9. एक वर्ग द्वितीय बी: मानक प्राथमिक सेल संस्कृति प्रयोगशाला के उपकरण का प्रयोग करेंप्राथमिक सेल अलगाव के लिए उपयुक्त iosafety कैबिनेट, सेल संस्कृति इनक्यूबेटर 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस, एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक घुमाव, और 50 मिलीलीटर ट्यूब के लिए एक क्षमता के साथ एक सेंट्रीफ्यूज पर निर्धारित किया है।
  10. संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने के 2 जोड़ी (हर समय), सुरक्षा चश्मा, और करीब पंजे जूते: उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का प्रयोग करें।
  11. अग्रिम में संस्थागत दिशा निर्देशों और तरल जैविक कचरे के कंटेनर के अनुसार मानव रक्त नमूनों के लिए उचित परिशोधन समाधान तैयार करें।

2. अपरा एमएससी का अलगाव

  1. अपरा की तैयारी
    1. आवश्यक व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण में ड्रेस है। enzymatic पाचन (धारा 2.5.6) तक प्रक्रिया से बाहर ले जाने के लिए आवश्यक सामग्री, समाधान और कचरे के कंटेनर के साथ जैविक सुरक्षा कैबिनेट सेट करें।
    2. सूचित सहमति और नैतिक अनुमोदन के साथ एक नाल प्राप्त करते हैं। सिजेरियन सेकंड के माध्यम से नाल लीजिएमम्मियाँ शल्य चिकित्सा की शर्तों के तहत मोर्चे, और एक बाँझ बैग या प्रयोगशाला के लिए परिवहन के लिए बाल्टी में पैकेज।
    3. परिवहन और विच्छेदन के लिए पहले के दौरान, कमरे के तापमान या 4 डिग्री सेल्सियस पर नाल की दुकान।
      नोट: ऊतक सेल संस्कृति के प्रदर्शन को प्रभावित किए बिना अप करने के लिए 6 घंटे के लिए भंडारित किया जा सकता है।
      1. नाल संग्रह और ऊतक प्रसंस्करण जहां संभव बीच के समय को सीमित करें। इस सिफारिश व्यावहारिक मुद्दों पर आधारित है। कुछ उदाहरणों में, हम जन्म के बाद 6 घंटे के लिए सेल अलगाव की प्रक्रिया में देरी है। इन उदाहरणों में गर्भनालों कमरे के तापमान या 4 डिग्री सेल्सियस (प्रयोगशाला में या संग्रह केंद्र पर) पर रखा गया है। नहीं detectable मतभेद मनाया गया, सामान्य दाता भिन्नता ऊपर, एमएससी गर्भनालों से प्राप्त में जब वे 4 डिग्री सेल्सियस पर या कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया गया।
    4. जैविक सुरक्षा कैबिनेट में नाल के साथ कंटेनर रखें। कंटेनर खोलें और एक बाँझ ट्रे में नाल हस्तांतरण।
    5. भ्रूण झिल्ली (एमनियोटिक थैली या भ्रूणावरण-कोरियोनिक laeve) 8 बाहर खुले। अपरा के कुछ हिस्सों के साथ केंद्रित हो गया है। भ्रूण पक्ष गर्भनाल प्रविष्टि, जो सामान्य है, केन्द्र नाल में डाला गया है। मातृ पक्ष (पत्या basalis के साथ खड़े हैं), जो भ्रूण पक्ष के विपरीत है, स्पष्ट बीजपत्र (या पालियों) है।
    6. विच्छेदन शुरू करने के लिए, गर्भनाल बाँझ ट्रे में ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के साथ नाल बोध।
      नोट: इस प्रोटोकॉल तीन प्रकार के ऊतकों में से प्रत्येक से एक T175 फ्लास्क में बीज के लिए पर्याप्त कोशिकाओं उपज के लिए बनाया गया है। प्रत्येक डाइजेस्ट ऊतक के लगभग 10 ग्राम के साथ शुरू होता है। यह एक 20 मिलीलीटर अस्थि मज्जा महाप्राण से शुरू एमएससी संस्कृतियों के रूप में बोतल की एक ऐसी ही शुरू संख्या है। अधिक कोशिकाओं वांछित हैं, तो अधिक ऊतक काटा जा सकता है और प्रोटोकॉल रैखिक बढ़ाया जा सकता है। ऊतक के आकार में काटा जा करने के लिए क्या अपरा ऊतक के साथ व्यावहारिक है का केवल संकेत कर रहे हैं। कुछ definin रहे हैंअपरा विल्ली है, जो एक संदर्भ बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है में जी सुविधाओं। संकेत दिया आयाम एक अनुमान के रूप में सेवा और गर्भनाल भ्रूण की सतह पर एक मील का पत्थर के रूप में प्रयोग किया जाता है।
  2. Decidual (डी) ऊतक के विच्छेदन
    1. इसलिए मातृ सतह (पत्या basalis) का सामना करना पड़ रहा है पर नाल पलटें। सुनिश्चित करें कि गर्भनाल सम्मिलन बिंदु के साथ भ्रूण नीचे की ओर का सामना करना पड़ रहा है।
    2. नाल (पत्या basalis ऊतक युक्त) के मातृ पक्ष से 0.5 सेमी मोटाई के टुकड़े काटें।
    3. हाइड्रेटेड ऊतक के टुकड़े रखने के लिए विच्छेदन के दौरान HBSS युक्त एक पेट्री डिश में ऊतक के टुकड़े रखें।
    4. पर्याप्त ऊतक स्थानांतरण एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 10 मिलीलीटर निशान से ऊपर एक ट्यूब को भरने के लिए (इस ऊतक के लगभग 10 ग्राम) है।
  3. Chorionic प्लेट के विच्छेदन (सीपी) ऊतक
    1. यंत्रवत्, नाल (नहीं एमनियोटिक थैली) के भ्रूण सतह से एमनियोटिक झिल्ली के हटाने चो छोड़नेrionic frondosum (कोरियोनिक प्लेट) अक्षुण्ण।
    2. 0.5 सेमी कोरियोनिक थाली से गहरे तक 1 सेमी चौड़ा टुकड़े काट ~। गर्भनाल के सबसे नजदीक क्षेत्र से कोरियोनिक प्लेट फसल, नाल के किनारे से दूर।
    3. उन्हें हाइड्रेटेड रखने के लिए विच्छेदन के दौरान HBSS युक्त एक पेट्री डिश में ऊतक के टुकड़े रखें।
    4. पर्याप्त ऊतक स्थानांतरण 10 मिलीलीटर चिह्न (~ ऊतक के 10 ग्राम) तक एक 50 मिलीलीटर ट्यूब को भरने के लिए।
  4. कोरियोनिक विल्ली के विच्छेदन (सीवी) ऊतक
    1. काटना सीवी ऊतक ~ 1 सेमी 2 एक्स 0.5-1 सेमी अपरा ऊतक जहां सी.पी. पहले ही हटा दिया गया है से गहरे। फिर, क्षेत्र गर्भनाल के सबसे करीब नाल के किनारे से दूर से फसल सीवी। अपरा के मातृ पक्ष से दूर रहने के लिए कम से कम 1 सेमी (युक्त पत्या basalis ऊतक) की कोशिश करो; लक्ष्य अपरा विल्ली ऊतकों के इंटीरियर से ऊतक फसल के लिए है।
    2. ऊतक के टुकड़े disse दौरान HBSS युक्त एक पेट्री डिश में रखेंउन्हें हाइड्रेटेड रखने के लिए ction।
    3. पर्याप्त ऊतक स्थानांतरण 10 मिलीलीटर चिह्न (~ ऊतक के 10 ग्राम) तक एक 50 मिलीलीटर ट्यूब को भरने के लिए।
  5. क़ीमा और डी, सी पी के enzymatic पाचन, और सीवी अपरा ऊतक
    1. देखते हैं के रूप में डी के ~ 10 ग्राम, सीपी या CV ऊतकों तीन अलग-अलग 50 मिलीलीटर ट्यूब में, HBSS के लगभग 40 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक ट्यूब को भरने और बार-बार आदेश के ऊतकों को धोने के लिए में ट्यूब पलटना (~ के लिए 10 सेकंड दोहराने)।
    2. सतह पर तैरनेवाला छानना और इस धोने कदम दोहराने 2-3 बार जब तक समाधान खून से काफी हद तक मुक्त है। एक 10 मिलीलीटर पिपेट या लंबे चिमटी का प्रयोग सुनिश्चित करने के लिए जब सतह पर तैरनेवाला decanting ऊतक टुकड़े ट्यूब (एस) के बाहर नहीं खो रहे हैं।
    3. कम से कम तरल हस्तांतरण के साथ एक 10 सेमी पेट्री डिश के लिए ऊतक के टुकड़े लौटें। जल्द / कैंची या रेजर ब्लेड के साथ लगभग 1-5 मिमी 3 के ठीक टुकड़ों में ऊतक कीमा।
    4. वापस उचित लेबल (डी, सीपी या सीवी) 50 मिलीलीटर ट्यूब में कीमा बनाया हुआ ऊतकों स्थानांतरण।
    5. हौसले prepar जोड़ेऊतक (ऊतक के जैसे 10 मिलीग्राम से अधिक मीडिया को पचाने के 10 एमएल) के साथ: 1 के अनुपात में कम से कम एक एड 1 में मीडिया को पचाने। प्रत्येक ट्यूब पर टोपी की जगह और ट्यूबों कई बार मिश्रण करने के लिए पलटना।
    6. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 घंटे के लिए मीडिया को पचाने के साथ ट्यूबों में ऊतकों को सेते हैं। एक humidified वातावरण और 5% सीओ 2 के इस कदम के लिए आवश्यक नहीं हैं।
      नोट: रैपिड झटकों आदेश कुशलता से ऊतक कोशिकाओं से अलग कर देना और एमएससी उपज को अधिकतम करने के लिए आवश्यक है। सीमित उपज बहुत कुछ 48 घंटा और एक प्रथम पारित होने के समय 1-2 सप्ताह से अधिक समय में संस्कृति कुप्पी से जुड़ी कोशिकाओं द्वारा स्पष्ट हो जाएगा। ऊष्मायन समय और मिलाते हुए विधि प्रयोगशाला में उपलब्ध 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर पर निर्भर है और अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।
      1. एक तेजी से और चलाया मिलाते तंत्र, जगह ऊतक के साथ एक मशीन के लिए और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब या बाँझ शंक्वाकार फ्लास्क, इनक्यूबेटर में जगह में मध्यम पचाने और 250 आरपीएम की गति मिलाते हुए निर्धारित किया है। इस का एक पूरा डाइजेस्ट में परिणाम होगा1 घंटे में ऊतक।
      2. वैकल्पिक रूप से, एक कोमल कमाल या कोई कमाल तंत्र के साथ एक मशीन के लिए, मैन्युअल ट्यूब तेजी से और तेजी से हाथ से 10 सेकंड 1.5 से 2 घंटे के लिए हर 30 मिनट के लिए हिला। एंजाइम ऊष्मायन अवधि के लिए एक उपयुक्त समय बेकार त्यागने के लिए, अनावश्यक वस्तुओं की जैव सुरक्षा कैबिनेट स्पष्ट, प्रयोगशाला कोट बदल अगर गंदे और प्रक्रिया के अगले भाग के लिए तैयार है।
  6. Mononuclear कोशिकाओं के संग्रह और बोतल में चढ़ाना
    नोट: पिछले चरण से, वहाँ ऊतक के टुकड़े को पचाने के साथ तीन 50 मिलीलीटर ट्यूब (डी, सीपी या सीवी) कर रहे हैं। ऊतक को पचाने समाधान एक बादल उपस्थिति विकसित और सफेद रक्त वाहिकाओं के ऊतकों में स्पष्ट कर रहे हैं, पाचन पूरा हो गया है।
    1. एंजाइमों पाचन समाधान में निहित निष्क्रिय करने के लिए प्रत्येक ट्यूब FBS युक्त एमएससी मीडिया के 30 मिलीलीटर जोड़ें।
    2. बड़े पचाया मलबे से mononuclear कोशिकाओं को अलग करने के लिए, पल्स 50 मिलीलीटर ट्यूब अपकेंद्रित्र। संक्षेप में, की अनुमति देते हैंसेंट्रीफ्यूज 340 x तक पहुँचने के लिए 5 सेकंड के लिए और फिर बंद करो जी। यह ट्यूब के नीचे गोली तरल निलंबन में mononuclear कोशिकाओं को छोड़ने जबकि बड़े मलबे मजबूर कर देगी।
      नोट: mononuclear कोशिकाओं तरल चरण में रहेगा, तो ट्यूब केवल संक्षिप्त (स्पंदित) centrifuged है। centrifugation बढ़ाया है, तो mononuclear कोशिकाओं को भी ऊतक के टुकड़े के साथ ट्यूब के नीचे गोली, अवांछनीय सेल नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप।
    3. सतह पर तैरनेवाला लीजिए, mononuclear कोशिकाओं से युक्त है, और एक विंदुक के साथ एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब में इस हस्तांतरण।
    4. शेष अपरा ऊतक मलबे को मीडिया या HBSS के 30 मिलीलीटर जोड़ें और सख्ती से हिला। इस निलंबन में शेष अलग mononuclear कोशिकाओं और ऊतकों को लाने से ख्यात एमएससी की एक दूसरी फसल में सक्षम होगा।
    5. पल्स अपकेंद्रित्र ट्यूब एक दूसरी बार, और फिर एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला। इस कदम के लिए एक तीसरी बार अधिकतम करने के लिए संग्रह क्षमता दोहराएँप्रत्येक ऊतक स्रोत से mononuclear कोशिकाओं की।
    6. दो 50 मिलीलीटर ट्यूब में अलग-अलग प्रकार के ऊतकों में से प्रत्येक से supernatants पूल। यह 6 कुल ट्यूब (प्रत्येक डी, सीपी और CV के 2 ट्यूब) निकलेगा। अपकेंद्रित्र पर 340 x जी 5 मिनट के लिए प्रत्येक ट्यूब। यह कदम ट्यूबों के नीचे करने के लिए mononuclear गोली कोशिकाओं होगा।
    7. ध्यान से छानना या कचरे में सतह पर तैरनेवाला बंद पिपेट। यह सतह पर तैरनेवाला की हर बूंद को खत्म करने की कोशिश करने के लिए अनावश्यक है।
      नोट: सेल गोली लाल रक्त कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के कारण कमजोर हो जाएगा। सावधान गलती से गोली त्यागने के लिए नहीं है, तो आप 50 मिलीलीटर ट्यूब से सीधे decanting कर रहे हैं।
    8. सतह पर तैरनेवाला के सबसे हटाने के बाद, धीरे ट्यूब एक उंगली के साथ कई बार झटका सेल गोली को बेदखल करने के लिए। छर्रों का मिश्रण है, इतना है कि वहाँ प्रत्येक डी, सीपी या CV ऊतक के लिए एक एकल ट्यूब है और एमएससी मीडिया के 35 मिलीलीटर में प्रत्येक resuspend।
    9. वैकल्पिक: एक 100 माइक्रोन जाल सेल झरनी के माध्यम से mononuclear अंश फ़िल्टर यू सेटएक 50 मिलीलीटर ट्यूब में पी सेल clumps या रेशेदार पदार्थ हटा दें।
      नोट: फिल्टर आसानी से रोकना और अधिक भर सकते हैं के रूप में की देखभाल की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, हवा के बुलबुले draining से फिल्टर बाधा डालती कर सकते हैं। यदि ऐसा होता है, धीरे-धीरे एक नया फिल्टर करने के लिए सेल संस्कृति मीडिया या मुद्रा के साथ के माध्यम से फिल्टर के तहत प्रवाह करने के लिए हवा, धोने फिल्टर अनुमति देने के लिए ट्यूब से बाहर फिल्टर उठा। छानने के कदम को छोड़कर उपज या बाद में एमएससी संस्कृतियों की गुणवत्ता को बदलने के लिए प्रकट नहीं होता है।
      1. वैकल्पिक रूप से, एक लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) सेल या घनत्व ढाल centrifugation इस स्तर 15 पर किया जा सकता है। हालांकि, हमारा अनुभव है कि आरबीसी एमएससी लगाव या प्रसार और इसलिए आरबीसी सेल के साथ हस्तक्षेप नहीं करते है आवश्यक नहीं है। Mononuclear कोशिकाओं को इस कदम पर गिना जा सकता है अगर आरबीसी हटाने से 15 किया गया। हालांकि, इस स्तर पर कोशिकाओं के विशाल बहुमत एमएससी नहीं हो जाएगा, लेकिन भ्रूण मूल trophoblasts, endothelial कोशिकाओं और hematopoietic कोशिकाओं, साथ ही एमए होternal मूल hematopoietic कोशिकाओं और decidual stromal कोशिकाओं।
    10. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में एक भी T175 फ्लास्क और संस्कृति में प्रत्येक डी, सीपी या CV ऊतक के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण और 5% सीओ 2।
  7. पोस्ट अलगाव-सेल विस्तार
    1. प्रारंभिक अलगाव के बाद 48 घंटा में बोतल (डी, सीपी और सीवी) में से प्रत्येक से मध्यम हटाने और नए सिरे से एमएससी मीडिया के 35 मिलीलीटर के साथ बदलें। खर्च मध्यम और अलग कोशिकाओं, खारिज किया जा सकता के रूप में ख्यात एमएससी टिशू कल्चर कुप्पी 16 से जुड़ा हुआ माना जाता है। एक और 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटर बोतल लौटें।
    2. संस्कृति का एक अतिरिक्त 24 घंटे के बाद, DPBS (25 एमएल) के साथ दो बार बोतल धोने के मलबे और लाल रक्त कोशिकाओं को हटा दें। कुप्पी लाल रक्त कोशिकाओं को बेदखल करने के नीचे चारों ओर तरल भंवर। तरल और मलबे को हटाने के लिए एक पिपेट का प्रयोग करें। बोतल के लिए एमएससी मीडिया के 35 मिलीलीटर जोड़ें और इनक्यूबेटर बोतल वापसी।
    3. दो बार प्रति सप्ताह है, और में मीडिया बदलेंसेल monolayers तक cubate संस्कृतियों 80- 90% मिला हुआ हैं। यह प्रारंभिक विस्तार के ऊतकों की गुणवत्ता पर निर्भर करता है, 4-14 दिन लगते हैं, डाइजेस्ट समाधान के साथ सामग्री और दक्षता और गर्मी के समय शुरू की राशि।

3. pMSCs की उपसंस्कृति

  1. संस्कृतियों 80-90% मिला हुआ हैं, तो 20 मिलीलीटर 1x HBSS या DPBS के साथ दो बार धोने और washes त्यागें। प्रत्येक फ्लास्क trypsin-स्थानापन्न जोड़ें (यानी एक T175 कुप्पी के लिए 5 मिलीलीटर का उपयोग करें)।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते बोतल टिशू कल्चर सतह से एमएससी आजाद कराने के लिए। सेना की टुकड़ी की सुविधा के लिए कुप्पी के पक्ष ठोकर हर ~ 2 मिनट।
  3. कोशिकाओं की सतह से और एक ही सेल निलंबन में अलग कर रहे हैं, एमएससी मीडिया के साथ कुप्पी से कोशिकाओं को धोने और ट्यूबों में कोशिकाओं को इकट्ठा। एमएससी मीडिया पतला और trypsin-स्थानापन्न (प्रयोग T175 कुप्पी प्रति एमएससी मीडिया के 15 मिलीलीटर ~) निष्क्रिय होगा।
  4. एक 50 करने के लिए प्रत्येक टिशू कल्चर कुप्पी की सामग्री स्थानांतरणमिलीलीटर ट्यूब।
  5. 5 मिनट के लिए 340 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूब के गोली कोशिकाओं।
  6. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और एमएससी मीडिया के 1 मिलीलीटर में सेल छर्रों resuspend।
  7. 10 μl trypan नीले रंग में सेल निलंबन के 10 μl पतला। एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना और 15 कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना।
  8. ताजा एमएससी मीडिया में 1,150 कोशिकाओं / 2 सेमी पर नई बोतल कोशिकाओं स्थानांतरण और एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में सेते हैं। इस बोने घनत्व में एमएससी मीडिया के 35 मिलीलीटर में प्रत्येक नए T175 फ्लास्क में 200,000 एमएससी बीज। जब तक 80-90% मिला हुआ प्रति सप्ताह दो बार कोशिकाओं फ़ीड। 1,150 कोशिकाओं / 2 सेमी या प्रत्येक T175 फ्लास्क में 200,000 एमएससी में बाद के मार्ग बीज।
  9. जब मार्ग 1 (P1) या p2 कोशिकाओं मिला हुआ हैं, भविष्य में उपयोग के लिए कोशिकाओं के बहुमत cryopreserve, और आगे प्रसार और लक्षण वर्णन के लिए केवल एक ही T175 कुप्पी reseed। प्रचारित कोशिकाओं mesodermal भेदभाव assays और फ्लोरिडा के माध्यम से सेल लक्षण वर्णन के लिए पी 3 या पी 4 में इस्तेमाल किया जा सकता हैओउ cytometry।
    नोट: प्रारंभिक मार्ग में, वहाँ बहुत कुछ विरल अलग कालोनियों हो सकता है, लेकिन प्रत्येक कॉलोनी के भीतर स्थानीय सेल घनत्व बहुत अधिक हो सकती है। इस रूप में कोशिकाओं के स्थानीय घने पैकिंग संपर्क निषेध में परिणाम होगा, विकास में देरी और संस्कृति के प्रदर्शन को कम करने, आदर्श नहीं है। हम अनुशंसा करते हैं जब घने कालोनियों मनाया जाता है, कोशिकाओं को काटा और एक नई कुप्पी में reseeded किया जाना चाहिए। इस पुनर्वितरण प्रक्रिया कमरे पैदा करने के साथ कोशिकाओं प्रदान करता है, और समग्र संस्कृति के प्रदर्शन में सुधार किया जाएगा।
  10. एमएससी cryopreserve करने के लिए, 90% और 10% एफसीएस dimethylsulphoxide (DMSO) के 1 मिलीलीटर में ~ 1 x 10 6 कोशिकाओं को इकट्ठा करने और मानक प्रोटोकॉल का उपयोग फ्रीज।
    नोट: प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में, वहाँ एमएससी लक्षण वर्णन प्रवाह cytometry का उपयोग, mesodermal भेदभाव और XY मछली विश्लेषण के विवरण के तीन अलग-अलग (डी, सीपी और सीवी) का विस्तार सेल आबादी के लिंग का निर्धारण करने के लिए कर रहे हैं। हमारे अध्ययन में, गर्भनालों पुरुष बच्चों से थे; इस प्रकार सभीभ्रूण कोशिकाओं पुरुष (वाई गुणसूत्र) के रूप में प्रतिष्ठित किया जा सकता है और सभी मातृ कोशिकाओं (केवल एक्स गुणसूत्र) महिला के रूप में प्रतिष्ठित किया जा सकता है।

Representative Results

अपरा एमएससी अलगाव प्रक्रिया चित्रा 1 में संक्षेप अपरा शरीर रचना विज्ञान से एमएससी अलग थे के तीन क्षेत्रों में चित्रा 2 में डाला जाता है इन मातृ पत्या, साथ ही कोरियोनिक प्लेट और कोरियोनिक विल्ली का काफी हद तक भ्रूण ऊतकों हैं। कई पाठ्य पुस्तकों, लेखों और ऑनलाइन संसाधनों विस्तार विकास और विभिन्न अपरा ऊतकों के कार्यात्मक भूमिका (कृपया संदर्भ 8 देखें)।

संस्कृतियों अलगाव और ऊतक मलबे को हटाने के बाद 48 घंटा की आकृति विज्ञान।
संस्कृति के 48 घंटा के बाद, MSCs, टिशू कल्चर प्लास्टिक से जुड़ी है, जबकि लाल रक्त कोशिकाओं और सबसे अन्य सेलुलर मलबे संलग्न है नहीं होंगे। इस समय, मध्यम ताजा संस्कृति के माध्यम से 35 मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। इस माध्यम का आदान-प्रदान करने से पहले, यह वजह से सटीक टिप्पणियों बनाने के लिए मुश्किल हैलाल रक्त कोशिकाओं की बड़ी संख्या है, जो दृश्य मूल्यांकन में बाधा डालती जाएगा। संस्कृति सतह पर तैरनेवाला की उपस्थिति नाल दाताओं के बीच काफी भिन्न हो सकते हैं। इस बदलाव उदाहरण 1 और 2 (चित्रा 3 ए) में नेत्रहीन देखा जा सकता है। इन दो एमएससी isolations है, जो बहुत अलग हो दिखाई दिया, दो अलग अलग गर्भनालों से एक साथ प्रदर्शन किया गया। हालांकि, एक बार धोया, दोनों संस्कृतियों समान दिखाई दिया (धोया उदाहरण के लिए 3, चित्रा 3A देखें)।

एक माइक्रोस्कोप के तहत, 48 घंटा मीडिया आदान-प्रदान के बाद, केवल कुछ कोशिकाओं कुप्पी (चित्रा 3 बी) के साथ संलग्न किया जाएगा, और कोशिकाओं को और अधिक बड़े पैमाने पर विस्तार किया MSCs से काफी अलग दिखाई देगा। कुछ मलबा और लाल रक्त कोशिकाओं को अस्थायी या संलग्न गुच्छों के रूप में दिखाई जाएगी और इन MSCs के विकास के साथ हस्तक्षेप नहीं करेगा। अब fibroblastic कुप्पी की तह तक पालन कोशिकाओं, एमएससी, hematopoietic सहित कोशिकाओं का एक मिश्रण होने की संभावना हैtrophoblastic या endothelial कोशिकाओं। फिर, गैर एमएससी कोशिकाओं एमएससी संस्कृतियों समझौता नहीं करते, जैसा कि आम तौर पर इन कोशिकाओं एमएससी संस्कृति की स्थिति में अधिक से अधिक 1-2 मार्ग जीवित नहीं होगी। संस्कृतियों के प्रारंभिक स्वरूप में कुछ बदलाव के बावजूद, बाद में विस्तार परिणाम आम तौर पर संगत कर रहे हैं।

समय के साथ एमएससी संस्कृतियों की आकृति विज्ञान।
इस प्रतिनिधि उदाहरण में, अलगाव के बाद सात दिन, छोटे fibroblastic एमएससी कालोनियों दिखाई दे रहे थे, हालांकि गैर एमएससी कोशिकाओं को भी दौर के रूप में देखा जा सकता है या शिथिल संलग्न कोशिकाओं (चित्रा 4 क)। जुड़ी कोशिकाओं क्या मूल रूप से एक "उपनिवेश इकाई के गठन करार दिया गया था रहे हैं -fibroblast "(CFU-एफ) के 17 और बाद में एमएससी 18 करार दिया। तेरह दिन अलगाव के बाद, fibroblastic एमएससी कालोनियों बड़े (चित्रा 4 बी) थे। आम तौर पर, monolayer इस बिंदु पर 80-90% मिला हुआ हो जाएगा और कोशिकाओं Passa होना चाहिए GED। पारित होने के बाद से 2, अपरा एमएससी monolayer संगम (चित्रा 4C) में विशेषता भँवर की तरह आकृति विज्ञान का विकास होगा। जब तक कोशिकाओं को कम घनत्व पर passaged हैं, CFU एफ गठन नहीं रह मनाया जाएगा। कम घनत्व में अपरा व्युत्पन्न एमएससी वयस्क अस्थि मज्जा व्युत्पन्न एमएससी 1 से एक छोटे, squarer भूमिका है। अपरा व्युत्पन्न एमएससी और अस्थि मज्जा व्युत्पन्न एमएससी समान प्रसार दरों का प्रदर्शन करते हैं, अपरा व्युत्पन्न कोशिकाओं कम तेजी वार्धक्य 5 से ग्रस्त हैं।

इन विट्रो में अपरा एमएससी की विशेषता।
प्रत्येक का विस्तार सेल की आबादी सुनिश्चित करने के लिए कि यह मानक एमएससी मानदंड 16 (1) प्लास्टिक पालन (2) mesenchymal सतह मार्कर की उपस्थिति और hematopoietic सतह मार्कर के अभाव, और (3) क्षमता mesodermal से गुजरना करने सहित के अनुरूप विशेषता किया जाना चाहिए भेदभाव।

"Fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> अपरा MSCs प्लास्टिक पक्षपाती हैं।
के रूप में चित्रा 4 में दिखाया गया है, संस्कृति में MSCs प्लास्टिक पक्षपाती हैं और एक fibroblastic की तरह आकृति विज्ञान है; इस पुष्टि की है कि कोशिकाओं को पहला मानदंड है कि एमएससी 16 को परिभाषित मिलते हैं।

अपरा एमएससी प्रदर्शन mesenchymal सतह मार्करों।
दूसरी परिभाषित एमएससी विशेषता mesenchymal सतह मार्कर की उपस्थिति और hematopoietic सतह मार्कर 16 का अभाव है। कोई भी निश्चित एक एमएससी की पहचान करने में सक्षम मार्कर वहाँ के रूप में, मार्कर के पैनल आम तौर पर प्रवाह cytometry विश्लेषण के साथ संयोजन के रूप में उपयोग किया जाता है कि कोशिकाओं mesenchymal हैं की पहचान करने के लिए, लेकिन hematopoietic नहीं। यहाँ प्रदान प्रतिनिधि डेटा सेट में (चित्रा 5 ए), हम mesenchymal मार्कर CD73, CD105, CD90, CD146, और CD44, hematopoietic मार्कर CD45 और CD34, और एचएलए डॉ, wel के रूप में की सेल अभिव्यक्ति का मूल्यांकनendothelial मार्कर CD31 के रूप में एल। इस अपरा एमएससी लक्षण वर्णन प्रक्रिया में उपयोग किया एंटीबॉडी की सभी सामग्री / उपकरणों की तालिका में सूचीबद्ध हैं। धुंधला के अनुसार, विनिर्माण निर्देश यहां 19 में वर्णित विश्लेषण के तरीकों के साथ प्रदर्शन किया गया था।

उम्मीद के रूप में 5,20 कोशिकाओं, mesenchymal मार्कर CD73, CD105, CD44, और कोशिका की सतह मार्कर CD45, CD34, एचएलए DR और CD31 के लिए नकारात्मक के लिए सकारात्मक थे। लगभग 37% और हमारे प्रतिनिधि डेटा सेट में कोशिकाओं के 57% CD90 और CD146 21 के लिए सकारात्मक है, क्रमशः थे। दोनों CD90 और CD146 आमतौर पर उपयोग किया जाता है एमएससी मार्करों 21। एमएससी कोशिका की सतह मार्कर प्रोफाइल एमएससी ऊतक स्रोत, मध्यम रचना, या मार्ग संख्या 22 के आधार पर अलग-अलग हो सकता है। हमारे अनुभव के कई वर्षों में, हम नहीं अपरा व्युत्पन्न एमएससी की लंबी अवधि के प्रदूषण को गैर-mesenchymal कोशिकाओं के साथ 1-2 पी निम्नलिखित मनायाassages 5,11।

अपरा एमएससी प्रदर्शन mesenchymal भेदभाव की क्षमता
परिभाषा के अनुसार, एमएससी इन विट्रो mesodermal भेदभाव क्षमता 5,13 होने चाहिए। Mesodermal भेदभाव की क्षमता आमतौर पर या तो त्रिकोणीय या द्वि-वंश भेदभाव assays के माध्यम से मूल्यांकन किया है। द्वि-वंश assays आम तौर पर, osteogenic और adipogenic भेदभाव क्षमता का आकलन करते हुए त्रि-वंश assays के अतिरिक्त chondrogenic भेदभाव क्षमता का आकलन करें। यहाँ प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणामों में, हम बताते हैं कि विस्तार एमएससी आबादी दोनों कैल्शियम जमा, osteogenic भेदभाव का संकेत है, और लिपिड रिक्तिकाएं, वसाजनन का संकेत (चित्रा 5 ब) के रूप में।

एमएससी आबादी यहां बताया चिह्नित करने के लिए, हम कोशिकाओं 24 संस्कृति कुओं में 6 एक्स 10 4 कोशिकाओं पर प्रेरण के माध्यम से 1 मिलीलीटर में वरीयता प्राप्त। मध्यम कम्पोnents सामग्री / उपकरणों की तालिका में सूचीबद्ध हैं। जबकि प्रेरण मध्यम योगों साहित्य में आम हैं, वहाँ प्रकाशित योगों में काफी परिवर्तनशीलता है। इस कारण से हम संक्षेप में हमारी प्रेरण मध्यम योगों और धुंधला दृष्टिकोण यहाँ की सूची। Osteogenic प्रेरण मध्यम DMEM-पारा, 10% FBS, 1x एंटीबायोटिक कवकनाशी समाधान, 10 मिमी β-ग्लिसरॉल phophate, 100 एनएम dexamethasone, और 50 माइक्रोन के एल-एस्कॉर्बिक एसिड 2-फॉस्फेट निहित। Adipogenic प्रेरण मध्यम DMEM-पारा, 10% FBS, 1x एंटीबायोटिक कवकनाशी समाधान, 10 माइक्रोग्राम / एमएल इंसुलिन, 100 एनएम dexamethasone, 200 माइक्रोन के इंडोमिथैसिन, और 500 माइक्रोन 3-isobutyl-1-मिथाइल xanthine निहित। इधर, संस्कृतियों एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में रखा जाता है और 14 दिनों के लिए सुसंस्कृत थे। प्रेरण मध्यम संस्कृति की अवधि में प्रति सप्ताह दो बार का आदान-प्रदान किया गया था। प्रेरण के 14 दिनों के बाद, संस्कृतियों या तो हड्डी की तरह मैट्रिक्स (osteogenesis) या लिपिड रिक्तिकाएं (वसाजनन) हमारे आखिरी अनुसार के लिए विशेषता थेious प्रकाशन 5। Osteogenic कैल्शियम मैट्रिक्स बयान विश्लेषण पहले, मध्यम बंद aspirating 20 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde के साथ संस्कृतियों फिक्सिंग, DPBS के साथ monolayer धोने, और फिर निर्देश विनिर्माण के अनुसार Alizarin लाल एस के साथ धुंधला द्वारा हासिल की थी। Adipogenic प्रेरण निर्देश विनिर्माण के अनुसार मध्यम बंद aspirating, 20 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde के साथ संस्कृतियों फिक्सिंग, monolayer धोने, और धुंधला तेल लाल हे समाधान के साथ द्वारा मूल्यांकन किया गया था। सना कैल्शियम जमा और तेल रिक्तिकाएं तो एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ कल्पना कर रहे थे, और छवियों को भविष्य में संदर्भ के लिए बचाया।

पिछले प्रकाशनों में, हम अपरा व्युत्पन्न एमएससी की भेदभाव की क्षमता अधिक बड़े पैमाने पर 4.5 की विशेषता है। जबकि वसाजनन अपरा व्युत्पन्न एमएससी 5 में आम तौर पर कम कुशल है अपरा व्युत्पन्न एमएससी osteogenesis, अस्थि मज्जा व्युत्पन्न एमएससी करने के लिए इसी तरह की है </ Sup>। हम नियमित रूप से, कई कारणों के लिए chondrogenic भेदभाव बाहर ले जाने के लिए नहीं है, हालांकि यह पहले से अपरा-एमएससी 5 के लिए हमारे द्वारा सूचित किया गया है है। सबसे पहले, जबकि mesodermal भेदभाव क्षमता एमएससी की एक परिभाषित विशेषता है, यह माध्यमिक महत्व 23-25 ​​की संभावना है, विशेष रूप से जहां चिकित्सीय लाभ एमएससी पैराक्राइन स्राव 26 से निकाली गई किए जाने की संभावना है। दूसरे, हालांकि डोमिनिकी एट अल। मानव वयस्क अस्थि मज्जा व्युत्पन्न एमएससी 16, के नैदानिक ​​उत्पादन के लिए न्यूनतम मानदंड प्रस्तावित अधिक हाल के अध्ययनों से संकेत मिलता है एमएससी अलग niches से अलग अंतर्निहित गुण और भेदभाव क्षमताओं 5,13,27-32 है। वास्तव में, Parolini एट अल। प्रस्तावित है कि नाल व्युत्पन्न एमएससी "एक या एक से अधिक mesodermal" के बजाय सभी तीन प्रजातियों 10 प्रजातियों में अंतर करना चाहिए। अंत में, कई एमएससी के अध्ययन chondrogenic भेदभाव को बाहर के रूप में यह एक समान माध्यम से होता हैosteogenesis के रूप में intracellular संकेतन मार्ग (TGFβ परिवार मार्ग) 33-35।

अपरा एमएससी प्रारंभिक सामग्री की संरचनात्मक स्थान के बावजूद, संस्कृति की इस पद्धति का उपयोग कर मूल में मातृ हैं।
कई प्रकाशनों को लगता है कि कोशिकाओं संस्कृति 14 पर भ्रूण जरायु उपज भ्रूण एमएससी से अलग किया। लेकिन, जैसा कि हम पहले 5 सूचना दी है, सभी संस्कृतियों भ्रूण जरायु से निकाली गई, इस प्रोटोकॉल, तेजी के रूप में intuitively मातृ decidual एमएससी संस्कृतियों के लिए उम्मीद की होगी मातृ एमएससी के लिए समृद्ध हो जाते हैं का उपयोग कर। इन प्रतिनिधि परिणामों में हम पुरुष बच्चों से अपरा ऊतक का इस्तेमाल किया तो यह है कि यह संभव हो गया था आसानी से विस्तार सेल आबादी में भ्रूण और मातृ सेल योगदान चित्रित करने के लिए। इन अध्ययनों के लिए हम XY मछली सामग्री / उपकरण की तालिका में सूचीबद्ध किट का इस्तेमाल किया, और निर्माताओं के निर्देशों का पालन किया।

(चित्रा 6) । पारित होने के 2, सेल मातृ ऊतकों से निकाली आबादी थे ~ 100% मातृ कोशिकाओं (XX), और भ्रूण कोशिकाओं (XY) undetectable थे। यह पता चलता है मातृ ऊतक के भौतिक विच्छेदन बाद संस्कृतियों में मातृ कोशिकाओं का संवर्धन करने के लिए नेतृत्व किया। हालांकि, यह भ्रूण कोरियोनिक विल्ली और कोरियोनिक प्लेट व्युत्पन्न संस्कृतियों से संस्कृति परिणामों पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है। पारित होने के 0 पर, दोनों भ्रूण कोरियोनिक विल्ली और कोरियोनिक प्लेट निकाली गई संस्कृतियों थे ~ 85% XY, या भ्रूण मूल के, यह दर्शाता है कि लक्षित विच्छेदन भ्रूण कोशिकाओं (चित्रा 6) के लिए समृद्ध। पारित होने के 0 पर, दोनों संस्कृतियों निहित ~ 15% मातृ सेल (XX) संदूषण। हैरानी की बात है, मार्ग 2 पर, दोनों भ्रूण संस्कृतियों ~ 100% मातृ कोशिकाओं (XX), और भ्रूण कोशिकाओं (XY) के साथ आबादी वाले थेअब कोई detectable थे। XY मछली विश्लेषण से पता चलता है कि मातृ कोशिकाओं (XX गुणसूत्रों) तेजी से और लगातार अधिग्रहण संस्कृतियों भ्रूण कोरियोनिक ऊतकों से निकाली गई। यह एक महत्वपूर्ण संस्कृति अवलोकन है कि अक्सर अनदेखी 5 है। इस विश्लेषण का विस्तार इस प्रोटोकॉल में शामिल है क्योंकि यह बहुत महत्वपूर्ण टिप्पणी है कि मातृ कोशिकाओं के तेजी से सभी संस्कृतियों आबाद जब DMEM 10% FBS के साथ पूरक भ्रूण व्युत्पन्न आबादी का समर्थन करने के लिए बनाया गया अतिरिक्त कारकों के बिना प्रयोग किया जाता है दर्शाता है।

आकृति 1
चित्रा 1:। अपरा एमएससी अलगाव की प्रक्रिया का सारांश (चरण 1) नाल शरीर रचना विज्ञान के साथ अपने आप ओर मालूम। (चरण 2) मैन्युअल या तो पत्या, कोरियोनिक विल्ली या कोरियोनिक प्लेट कैंची का उपयोग करने से ऊतक के 10 ग्राम काटना। (चरण 3) कीमा टीवह कैंची या एक छुरी के साथ ठीक टुकड़ों में पत्या, कोरियोनिक विल्ली या कोरियोनिक प्लेट ऊतकों के कुछ भागों विच्छेदित।
(चरण 4) Dispase और collagenase I. में 1-2 घंटा पाचन के माध्यम से ठीक टुकड़े से कोशिकाओं आजाद
(चरण 5) नाड़ी centrifugation और / या एक सेल झरनी के माध्यम से उन्हें धोने से रेशेदार ऊतकों से कोशिकाओं को अलग करें। लीजिए और संस्कृति के माध्यम में कोशिकाओं resuspend और संस्कृति बोतल में रखा गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Mesenchymal stromal कोशिकाओं (एमएससी) प्लास्टिक पालन और जीवित और संस्कृति के माध्यम में पैदा करने की क्षमता के लिए उनकी प्रवृत्ति के आधार पर चयन किया जाएगा। अंत में, परिणाम अनुभाग में, विस्तार एमएससी विशेषता है और भविष्य के प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए भंडारित किया जा सकता है।


चित्रा 2:। मानव अवधि नाल और ऊतकों को इस प्रक्रिया में पृथक के एनाटॉमी पहले ऊतक काटा जा मातृ पत्या है। पत्या ऊतक कि नाल की सतह पर एक पतली परत के रूप में रहता है के बाद यह (पत्या हरी मार्कर द्वारा की पहचान की है) गर्भाशय की दीवार से बहाया जाता है। दूसरी ऊतक कि नाल के इंटीरियर से काटा जाएगा भ्रूण कोरियोनिक विल्ली (नीला मार्कर) है। तीसरे ऊतक काटा जा भ्रूण कोरियोनिक प्लेट (लाल मार्कर) (संदर्भ 36 से अनुकूलित) है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: अलगाव और फिर बाद 48 घंटा संस्कृतियों की आकृति विज्ञानऊतक मलबे घूम रहा है। (ए) संस्कृति सतह पर तैरनेवाला की उपस्थिति मलबे बंद धोने से पहले नाल दाताओं के बीच काफी भिन्न हो सकते हैं। उदाहरण संस्कृतियों 1 और 2 के इस बदलाव का प्रदर्शन। इन दो isolations एक साथ प्रदर्शन किया, लेकिन दो अलग गर्भनालों से थे। एक बार धोया संस्कृतियों लाल रक्त कोशिकाओं और ऊतकों को मलबे के स्पष्ट उदाहरण 3 में दिखाया गया बाद में विस्तार परिणाम आम तौर पर संगत कर रहे हैं होगा। (बी) 48 घंटा मीडिया आदान-प्रदान के बाद, केवल कुछ कोशिकाओं कुप्पी से जुड़ी होगी। स्केल बार = 200 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। समय के साथ एमएससी संस्कृतियों की आकृति विज्ञान (ए) अलगाव के बाद सात दिन, छोटे चibroblastic एमएससी कालोनियों दिखाई दे रहे हैं, हालांकि गैर-एमएससी कोशिकाओं को भी गोल या शिथिल जुड़ी कोशिकाओं के रूप में उपस्थित रहेंगे। (बी) के अलगाव के बाद 13 दिन, fibroblastic एमएससी कालोनियों बड़े हैं और अक्सर एमएससी की monolayer मिला हुआ है और पारित होने के लिए तैयार है। (सी) के पारित होने के बाद से 2, एमएससी monolayer संगम पर एक विशेषता भँवर की तरह आकृति विज्ञान का विकास होगा। स्केल बार = 200 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। फ्लो और mesodermal भेदभाव से एमएससी लक्षण वर्णन (ए) अपरा कोरियोनिक विल्ली व्युत्पन्न एमएससी विश्लेषण प्रवाह cytometry द्वारा एक क्लासिक एमएससी मार्कर प्रोफ़ाइल प्रदर्शित, हालांकि इन कोशिका की सतह मार्करों के लिए, एक्सप्रेशंससायन मानव एमएससी के सभी प्रकार के लिए समान है। प्रत्येक हिस्टोग्राम संकेत तीव्रता (एक्स अक्ष) (मैक्स का%) वाई अक्ष पर सामान्यीकृत कोशिकाओं की संख्या की तुलना में पता चलता है। इस प्रतिनिधि डेटा सेट में कोशिकाओं hematopoietic मार्कर CD45 और CD34 और एचएलए डॉ CD73, CD105 और CD44 के लिए सकारात्मक और नकारात्मक थे। (बी) अपरा एमएससी आम तौर पर मजबूत osteogenic भेदभाव से गुजरना है, तथापि (सी) adipogenic भेदभाव अस्थि मज्जा व्युत्पन्न एमएससी के साथ तुलना में कम कुशल हो सकता है। कैप्शन बी और सी में छवियाँ 40x बढ़ाई पर ले जाया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: अपरा एमएससी प्रारंभिक सामग्री की संरचनात्मक स्थान के बावजूद, संस्कृति की इस पद्धति का उपयोग कर मूल में मातृ हैं।भूखंडों भ्रूण (पुरुष, XY) और मातृ हर दूसरे बीतने पर decidual, कोरियोनिक विल्ली और कोरियोनिक प्लेट ऊतकों से अलग अपरा एमएससी संस्कृतियों के (महिला, XX) सेल रचना की मात्रा का ठहराव दिखा। मातृ कोशिकाओं (XX) तेजी से और reproducibly संस्कृतियों भ्रूण कोरियोनिक ऊतकों से निकाली गई पर ले लो। भ्रूण = पुरुष = XY गुणसूत्रों एक व्यक्ति के सेल में पता चला, मातृ = मादा = XX गुणसूत्रों एक व्यक्ति के सेल में पता चला। यहां प्रस्तुत डाटा 100 XY मछली के लिए दाग और प्रत्येक डेटा बिंदु के लिए गिना कोशिकाओं की एक न्यूनतम के साथ एन = 3 पुरुष बच्चों से स्वतंत्र दाता गर्भनालों से किया गया था। बार्स का औसत प्रतिनिधित्व करते हैं, और त्रुटि सलाखों के एक मानक विचलन दर्शाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

अपरा एक शारीरिक रूप से बड़े fetomaternal अंग है, जिसमें से भ्रूण या मातृ एमएससी 22 अलग किया जा सकता है। इस के साथ साथ, हम कैसे विशेष रूप से पत्या (मातृ), कोरियोनिक विल्ली (भ्रूण), और कोरियोनिक प्लेट (भ्रूण) ऊतक (चरण 2.2-2.4) काटना करने पर अपरा शरीर रचना विज्ञान और शिक्षा का एक विस्तृत अवलोकन प्रदान की है। बाद में, हम एक मजबूत प्रोटोकॉल है कि इन तीन ऊतकों (चरण 2.5-2.6) में से प्रत्येक से एमएससी अलगाव में सक्षम बनाता है रेखांकित किया। अपरा एमएससी विस्तार कुशल है और संस्कृतियों अस्थि मज्जा व्युत्पन्न एमएससी संस्कृतियों (आंकड़े 3 और 4) के समान दिखाई देते हैं। जबकि adipogenic भेदभाव आम तौर पर कम कुशल (चित्रा 5C) 5 osteogenic भेदभाव, विश्वसनीय (चित्रा 5 ब) है।

क्षेत्र के लिए कई नए चेहरे अनुमान होगा कि भ्रूण कोरियोनिक विल्ली या कोरियोनिक प्लेट ऊतकों से निकाली गई संस्कृतियों भ्रूण एमएससी के लिए समृद्ध होगा। हालांकि, हमारे हाथों में फेताल सेल संवर्धन केवल क्षणिक है जब इस तरह के DMEM-एलजी + मानक के रूप में एमएससी विस्तार मध्यम 10% FBS उपयोग किया जाता है 5। यहाँ हम एक पुरुष बच्चे से निकाली गई अपरा ऊतकों का उपयोग प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करते हैं। एक पुरुष बच्चे से अपरा ऊतक का उपयोग करके, भ्रूण कोशिकाओं जबकि मातृ कोशिकाओं XX गुणसूत्रों होने के रूप में पहचाने जाने योग्य हैं, आसानी से पहचान से XY गुणसूत्रों होने के रूप में कर रहे हैं। चित्रा 6 एक प्रतिनिधि संस्कृति के लिए चलता XY मछली का परिणाम है। जबकि भ्रूण एमएससी (XY) समृद्ध कर रहे हैं (अप करने के लिए 80%) भ्रूण कोरियोनिक विल्ली या कोरियोनिक प्लेट ऊतकों से निकाली गई प्रारंभिक संस्कृतियों में, ये वही संस्कृतियों तेजी से पहले दो मार्ग के ऊपर आगे निकल रहे हैं (~ 100%) मातृ द्वारा (XX) एमएससी । मानक माध्यम में, DMEM-एलजी + 10% FBS, कुछ मातृ व्युत्पन्न एमएससी कि दूषित भ्रूण ऊतकों संस्कृति में भ्रूण व्युत्पन्न कोशिकाओं outcompete की रचना की।

इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित एक महत्वपूर्ण कदम अपरा शरीर रचना विज्ञान के और जहां भ्रूण से एक प्रशंसा हैऔर मातृ ऊतक सबसे प्रभावी ढंग से काटा जा सकता है। के रूप में प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में उल्लिखित, भ्रूण ऊतक के विच्छेदन भ्रूण व्युत्पन्न एमएससी के लिए क्षणिक संवर्धन सक्षम करता है। विस्तार मध्यम तैयार करने में सुधार, विशिष्ट बहिर्जात वृद्धि कारक मध्यम पूरकता के माध्यम से भ्रूण व्युत्पन्न एमएससी आबादी के चुनिंदा विस्तार के लिए एक सेल उत्पाद है कि मातृ कोशिकाओं भ्रूण के बजाय के लिए समृद्ध है (हमारे समूह वर्तमान में इस तरह के माध्यम के योगों विकसित कर रहा है) के निर्माण की अनुमति चाहिए, और। के रूप में भ्रूण एमएससी अधिक से अधिक angiogenesis और बराबर मातृ एमएससी आबादी 37 से immunosuppressive गुण होते हैं कथित हैं भ्रूण एमएससी आबादी के निर्माण, लाभ के एक नंबर हो सकता है।

वर्णित अलगाव प्रोटोकॉल से प्रत्येक में, हम ऊतक के लगभग 10 ग्राम इस्तेमाल किया। एक पूरी नाल आम तौर पर 500-750 ग्राम है, और पिछले काम में हम दिखा दिया है कि स्वचालित ऊतक को पचाने और एक सेल विस्तार बायोरिएक्टर proc के माध्यम सेesses कि यह संभव होना चाहिए एक एकल नाल 4 से 7,000 से अधिक नैदानिक ​​सेल खुराक निर्माण करने के लिए। ये संख्या एलोजेनिक एमएससी चिकित्सा में अपरा व्युत्पन्न एमएससी, और इस विधि के महत्व के संभावित उपयुक्तता एमएससी मूल (भ्रूण या मातृ) की परवाह किए बिना पर प्रकाश डाला। एक चिकित्सकीय दृष्टिकोण से, यह उपयोगकर्ताओं को सेल उत्पाद और क्षमता को मज़बूती से इस सेल उत्पाद का निर्माण करने की पूरी समझ है कि सबसे अधिक महत्वपूर्ण है। हमें उम्मीद है कि हमारे वीडियो शोधकर्ताओं की सहायता करेंगे नाल शरीर रचना विज्ञान को समझते हैं, नाल से एमएससी अलग, और उनकी संस्कृतियों की संभावना भ्रूण या मातृ कोशिका संरचना पूर्वानुमान करने के लिए।

Acknowledgements

आरपी एक राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (NHMRC) postdoctoral प्रशिक्षण फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया। वी.एस. एक विश्वविद्यालय क्वींसलैंड अंतर्राष्ट्रीय स्नातकोत्तर छात्र की छात्रवृत्ति के द्वारा समर्थित किया गया। MRD NHMRC और इनर व्हील ऑस्ट्रेलिया द्वारा समर्थित किया गया।

हम रोगी सहमति और नमूना संग्रह में सहायता के लिए नैदानिक ​​और नर्सिंग स्टाफ को धन्यवाद। हम प्रसूति में व्यावहारिक विचार विमर्श, Feto-अपरा विकास और नाल शरीर रचना के लिए प्रो Nickolas फिस्क, प्रो केरी एटकिंसन और डॉ रोहन Lourie धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
HBSS Gibco/Invitrogen 14185-052 Long name: Hanks Balanced Salt Solution
FBS Gibco/Invitrogen Long name: Fetal Bovine Serum
trypsin-substitute Gibco/Invitrogen 12563-029 Long name: TrypLE Select
DMEM-LG Gibco/Invitrogen 11885-092 Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-Low Glucose
DMEM-HG Gibco/Invitrogen 11965118 Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L)
PBS (Mg+Ca+ free) Gibco/Invitrogen 14190-250 Long name: Dulbecco's Phosphate buffered saline, magnesium and calcium free
Anti- anti- Gibco/Invitrogen 15240-062 Long name: antibiotic-antimycotic solution x100
paraformaldehyde powder or 4% solution any 
Collagenase I Invitrogen 17100-017  2,500 U/ml
Dnase I Sigma D5025 10 mg/ml in  0.15 M NaCl
Dispase Invitrogen 17105-041  10 mg/ml in water (20,000 U/ml).
Material Company Catalog Number Comments
Disposables:
50 ml centrifuge tubes Falcon or any brand
petri dishes, sterile plactic (25 cm and 10 cm diameter) Nunc
Cell strainers (100 μm) Becton Dickinson 352340
175 and 75 cm2 (T175 and T75) tissue culture flasks Nunc
5 ml, 10 ml, 25 ml sterile serolgical pipettes any brand
Material Company Catalog Number Comments
Equipment:
 Centrifuge  
 tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2
Biological safety cabinet
 Sterile scissors and tweezers
Tube racks 
Pipette-boy or equivalent
Gilson type pipetters and sterile tips 1,000 µl, 200 µl, 20 µl.
rocking or shaking incubator (37 °C)
personal protective equipment
cleaning solutions (suitable for blood)
waste containers, correct disposal bins for tissue/blood
Reagents for MSC characterization
Antibody (Clone ID) Manufacturer Catalogue No. Isotype
CD73 (AD2) Miltenyi Biotec 130-095-183 Mouse IgG1
CD105 (43A4E1) Miltenyi Biotec 130-094-941 Mouse IgG1
CD90/Thy-1 (AC122) Miltenyi Biotec 130-095-403 Mouse IgG1
CD45 (5B1) Miltenyi Biotec 130-080-202 Mouse IgG2a
CD34 (AC136) Miltenyi Biotec 130-090-954 Mouse IgG2a
HLA-DR (AC122) Miltenyi Biotec 130-095-298 Mouse IgG2a
CD31 (PECAM-1) BD Pharmingen 555446 Mouse IgG1
CD146 (541-10B2) Miltenyi Biotec 130-092-849 Mouse IgG1
CD44 (DB105) Miltenyi Biotec 130-095-180 Mouse IgG1
Isotype Controls (Clone ID) Manufacturer Catalogue No.
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) Miltenyi Biotec 130-092-214
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) Miltenyi Biotec 130-092-212
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) Miltenyi Biotec 130-092-213
Mouse IgG2a (S43.10) Miltenyi Biotec 130-091-837
Mouse IgG2a (S43.10) Miltenyi Biotec 130-098-849
MACS Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Osteogenic differentation Manufacturer Catalogue No.
DMEM-HG Gibco/Invitrogen 11965118 Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L)
FBS Gibco/Invitrogen Long name: Fetal Bovine Serum
Anti- anti- Gibco/Invitrogen 15240-062 Long name: antibiotic-antimycotic solution x100
Dexamethasone Sigma D4902
β-Glycerol Phophate Sigma 50020
L-ascorbic acid 2-phosphate Sigma A8960-5G
Alizarin Red S Sigma A5533-25G For calcium matrix staining
Adipogenic differentation Manufacturer Catalogue No.
DMEM-HG Gibco/Invitrogen 11965118 Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L)
FBS Gibco/Invitrogen Long name: Fetal Bovine Serum
Anti- anti- Gibco/Invitrogen 15240-062 Long name: antibiotic-antimycotic solution x100
insulin Sigma I2643
Dexamethasone Sigma D4902
Indomethacin Sigma I7378
3-isobutyl-1-methyl xanthine Sigma I5879
Oil Red O solution Sigma O1391-250ML For lipid vacuole staining
XY FISH kit to determine fetal or maternal origin of cells
XY chomosome FISH kit Vysis (Abbott Molecular) 07J20-050 Long name: CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Direct Labeled Fluorescent DNA Probe Kit

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References

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