जीर्ण Amyloid-बीटा Oligomer निषेचन के एक पशु मॉडल में Neurodegeneration आसमाटिक पंप के साथ एंटीबॉडी उपचार संचार द्वारा counteracted है

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Sajadi, A., Provost, C., Pham, B., Brouillette, J. Neurodegeneration in an Animal Model of Chronic Amyloid-beta Oligomer Infusion Is Counteracted by Antibody Treatment Infused with Osmotic Pumps. J. Vis. Exp. (114), e54215, doi:10.3791/54215 (2016).

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Abstract

हिप्पोकैम्पस पर निर्भर स्पष्ट स्मृति (तथ्यों और घटनाओं के लिए स्मृति) में गिरावट अल्जाइमर रोग (ई) की जल्द से जल्द नैदानिक ​​लक्षण में से एक है। यह अच्छी तरह से स्थापित है कि अन्तर्ग्रथन घटाने और आगामी neurodegeneration ईस्वी में स्मृति दोष के लिए सबसे अच्छा predictors हैं। नवीनतम अध्ययन घुलनशील amyloid बीटा oligomers (Aβo) है कि लगभग 10 से 15 वर्ष करने के लिए मानव मस्तिष्क में जमा करने से पहले नैदानिक ​​लक्षण स्पष्ट हो शुरू की न्यूरोटोक्सिक भूमिका पर बल दिया है। कई रिपोर्टों से संकेत मिलता है कि घुलनशील Aβo ई मॉडल और मनुष्यों में स्मृति घाटे के साथ सहसंबंधी। Aβo प्रेरित neurodegeneration न्यूरोनल और मस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों में मनाया अधिक कई पशु मॉडल में पुन: पेश करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो गया है। यहाँ दिखाया दोहराया Aβo सुई लेनी के मॉडल को इस मुद्दे पर काबू पाने और नई बीमारी को संशोधित करने के उपचारों के विकास के लिए दो प्रमुख डोमेन को संबोधित अनुमति: जैविक मार्कर की पहचान जल्दी ई निदान करने के लिए, और आणविक व्यवस्था का निर्धारणnisms ईस्वी की शुरुआत में Aβo प्रेरित स्मृति घाटे underpinning। घुलनशील Aβo कुल अपेक्षाकृत तेजी में अघुलनशील Aβ तंतुओं है कि रोगियों के नैदानिक ​​राज्य के साथ खराब सहसंबंधी के बाद से, घुलनशील Aβo हौसले से तैयार और हिप्पोकैम्पस में उल्लेखनीय कोशिका मृत्यु का उत्पादन करने के लिए छह दिनों के दौरान एक बार प्रति दिन इंजेक्ट किया जाता है। हम प्रवेशनी इस्तेमाल किया विशेष Aβo के एक साथ सुई लेनी और हिप्पोकैम्पस आसमाटिक पंप का प्रयोग करने में Aβo एंटीबॉडी (6E10) की सतत प्रेरणा के लिए डिजाइन। इस विवो विधि में अभिनव अब नया विज्ञापन चिकित्सा कि पूर्व मनोभ्रंश रोगियों में बयान और Aβo की न्यूरोटॉक्सिटी को रोकने सकता है की दक्षता को मान्य करने के preclinical अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

यह शुरू में प्रस्तावित किया गया था मस्तिष्क में अघुलनशील Aβ प्रजातियों की कि संचय ई रोगजनन के लिए केंद्रीय था। 1,2 हालांकि, सजीले टुकड़े भी कुछ संज्ञानात्मक सामान्य बुजुर्ग में पता चला रहे हैं। 3-7 सहसंबंध गरीब पट्टिका बयानों और संज्ञानात्मक घाटे के बीच मौजूदा काबू पाने के लिए विज्ञापन में, नवीनतम रिपोर्ट रोग है, जो ज्यादा रोगियों के नैदानिक ​​राज्य के साथ बेहतर है। 8-14 Aβ oligomerization की प्रक्रिया के बाद से सहसंबंधी की शुरुआत में विषाक्त घुलनशील Aβo की मौजूदगी से पता चला है बहुत गतिशील है, यह सुझाव दिया था कि न्यूरोटॉक्सिटी oligomer का केवल एक विशिष्ट प्रकार के बजाय विभिन्न Aβo से प्रेरित है। 14-16 के बाद से कई अध्ययनों से पता चला है कि Aβo अन्तर्ग्रथन और neuronal नुकसान करने से पहले अन्तर्ग्रथन रोग आरंभ कर सकते हैं, 17-24 मौजूदा सिद्धांतों से संकेत मिलता है कि Aβ संबंधी उपचार में कारगर हो सकता है बल्कि बाद के चरणों की तुलना में जल्दी ई के रूप में क्लिनिकल परीक्षण में अब तक का परीक्षण किया।

ई रोगजनन में से एक बानगी सुविधा विशाल और व्यापक सेल रोग की देर चरणों में मनाया मौत, और महत्वपूर्ण अन्तर्ग्रथन और neuronal नुकसान स्थानीय मस्तिष्क क्षेत्रों में मनाया जब स्मृति घाटे नैदानिक ​​स्तर पर पहचाने जाने जाते हैं। पर्फोरेंट मार्ग है कि entorhinal प्रांतस्था (ईसी) दांतेदार गाइरस के लिए (डीजी) से परियोजनाओं ईस्वी के prodromal राज्य के दौरान विज्ञापन के प्रारंभिक शुरुआत में स्पष्ट रूप से परेशान है। 25,26 जब हल्के संज्ञानात्मक हानि (एमसीआई) स्पष्ट महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु हो जाता है डीजी में synaptic नुकसान के साथ ही चुनाव आयोग में पता चला है। 25,26

हालांकि सबूत का एक बड़ा शरीर जल्दी ईस्वी में घुलनशील Aβo के जहरीले कार्रवाई केंद्रित किया है, 8-14 Aβo प्रेरित neurodegeneration न्यूरोनल संस्कृति या organotypic मस्तिष्क टुकड़ा संस्कृति में मनाया अधिक पशु मॉडल में पुन: पेश करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो गया है। 27 ट्रांसजेनिक विज्ञापन का सबसे मॉडल एक overexpressingβ सजीले टुकड़े, ताऊ hyperphosphorylation, synaptic की कमी और स्मृति घाटे की है। 27 हालांकि, इन मॉडलों के विज्ञापन रोगियों के हिप्पोकैम्पस में मनाया मॉडलिंग कोशिका मृत्यु में बहुत कम सफल रहे हैं। इन तकनीकी मुद्दों पर काबू पाने के लिए हम घुलनशील Aβo की इन्ट्रासेरेब्रल सुई लेनी के आधार पर एक मॉडल विकसित किया है। हम पहले यहाँ दोहराया है कि घुलनशील Aβo के हिप्पोकैम्पस लेनी क्रमिक न्यूरोनल हानि और ताऊ hyperphosphorylation, दो रोग ईस्वी में स्मृति गिरावट के साथ जुड़े पहचान के लिए प्रेरित सूचना दी। 28, हम प्रवेशनी का उपयोग करके विज्ञापन के उपचारों का परीक्षण करने के लिए एक उपन्यास विधि दिखा रहे हैं विशेष रूप से Aβo के एक साथ सुई लेनी के लिए डिजाइन और Aβo एंटीबॉडी (6E10) आसमाटिक पंपों के साथ की सतत प्रेरणा।

आसमाटिक पंप सीधे Aβo के अर्क स्थल पर Aβo प्रेरित neurodegeneration के खिलाफ किसी भी एंटीबॉडी (या अन्य यौगिकों) की दक्षता विवो में परीक्षण करने के लिए एक अनोखा तरीका प्रदान करते हैं। इस प्रकार, इन पंपों रेपरएक ठोस सबूत की अवधारणा ईस्वी में संभावित चिकित्सीय एजेंट की कार्रवाई के तंत्र के बारे में स्थापित करने के लिए एक सुविधाजनक उपकरण ESENT। चूंकि हाल की रिपोर्ट ईस्वी के प्रारंभिक दौर में घुलनशील Aβo का महत्वपूर्ण प्रभाव का कहना है, कई Aβo की ओर निर्देशित उपचार वास्तव में शैक्षिक और दवा प्रयोगशालाओं द्वारा जांच की जा रही है। इस उपन्यास पशु मॉडल synaptic और neuronal नुकसान जल्दी ईस्वी में मनाया नकल उतार अनुमति देता है, और आसमाटिक पंप लगातार Aβo अर्क स्थल पर विशेष उपचार एजेंटों तर करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। हल्के में पिछले कुछ वर्षों से अधिक का परीक्षण मरीजों को उदार करने के लिए प्रेरित शोधकर्ताओं पूर्व मनोभ्रंश रोगियों में परीक्षण आरंभ करने के लिए के रूप में प्राधिकृत चिकित्सा के दोहराव विफलताओं से पहले Aβo बहुतायत से जमा और अपरिवर्तनीय मस्तिष्क क्षति उत्पन्न करने के लिए शुरू करते हैं। इस संदर्भ में, नए यौगिकों कि बयान और फलस्वरूप Aβo की न्यूरोटॉक्सिटी रोकने का परीक्षण पूर्व नैदानिक ​​रोगियों के हित में हो सकता है।

Protocol

आचार बयान: इस परियोजना के लिए पशु प्रोटोकॉल पशु की देखभाल पर कनाडा परिषद के दिशा निर्देशों के अनुपालन में Hôpital du Sacré-Coeur de मॉन्ट्रियल के पशु की देखभाल समिति से अनुमोदन प्राप्त किया।

1. Stereotaxic सर्जरी से पहले कैथेटर तैयारी

  1. PE50 कैथेटर (लंबाई में 6 सेमी) है कि आसमाटिक पंपों के साथ प्रवेशनी कनेक्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा कट (चित्रा 1 ए देखें)। कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) के साथ PE50 कैथेटर भरें और कैथेटर के दोनों सिरों मुहर। जब तक इस्तेमाल किया 4 डिग्री सेल्सियस पर कैथेटर रखें।

2. प्रवेशनी आरोपण stereotaxy द्वारा

  1. बाँझ परिस्थितियों में सर्जरी प्रदर्शन। autoclaving द्वारा सभी सर्जिकल उपकरणों और सामग्री जीवाणुरहित। stereotaxic तंत्र और कार्य क्षेत्र अच्छी तरह से साफ है, और एक 70% इथेनॉल समाधान के साथ कीटाणुरहित। एक सर्जिकल मास्क, बाल बोनट और बाँझ दस्ताने पहनें।
  2. intraperitoneally इंजेक्शन लगाने (आईपी) ketamine और xylazine का एक समाधान (100 मिलीग्राम / किग्रा और 10 मिलीग्राम / किग्रा, क्रमशः) द्वारा चूहों anesthetize। एक सज्जन पैर की अंगुली चुटकी के बाद आंदोलन की जाँच करके संज्ञाहरण की पुष्टि करें।
  3. कम से कम 30 मिनट सर्जरी से पहले subcutaneously (एससी) anesthetized-पशु के लिए, एक गैर स्टेरायडल विरोधी भड़काऊ दवा (1 मिलीग्राम / किग्रा Meloxicam) इंजेक्षन।
  4. पशु के सिर दाढ़ी क़ैंची का उपयोग और chlorhexidine gluconate का एक समाधान 2% और isopropyl शराब 2% तीन बार के साथ त्वचा कीटाणुरहित। आँखों पर पशु चिकित्सा नेत्र मरहम लागू जबकि संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए।
  5. कान सलाखों के साथ एक stereotaxic फ्रेम पर पशु रखें। stereotaxic फ्रेम के धारक बांह पर एक प्रवेशनी को ठीक करें। इंजेक्ट (सुप्रीम कोर्ट) के एक स्थानीय संवेदनाहारी एजेंट (Bupivacaine (1.5 मिलीग्राम / किग्रा) और lidocaine (1.5 मिलीग्राम / किग्रा) सिर के शीर्ष पर। संज्ञाहरण है एक नाक शंकु 3% isoflurane पहुंचाने रखकर पूरी प्रक्रिया के दौरान बनाए रखता है। पूरे शल्य चिकित्सा क्षेत्र होना चाहिएबंद लिपटी, लेकिन यह यहाँ नहीं किया गया था बेहतर तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए।
  6. एक छुरी के साथ सिर के शीर्ष पर 3 सेमी की एक चीरा। खोपड़ी स्पष्ट छोड़ने के लिए चीरा लगभग 4 अकड़न को स्थापित करें। एक दौर की नोक कैंची का प्रयोग, जानवर के कंधे ब्लेड के बीच त्वचा के नीचे एक जेब (2 एक्स 2 सेमी 2) बनाते हैं।
  7. एक ब्लेड के साथ खोपड़ी के periosteum परिमार्जन। खोपड़ी पर एक धुंध पैड लागू अगर खून बह रहा है।
  8. सत्यापित करें कि खोपड़ी फ्लैट और अच्छी तरह से stereotaxic फ्रेम पर गठबंधन किया है। कि खोपड़ी फ्लैट है सुनिश्चित करने के लिए, जाँच ऊंचाई शीर्षस्थान पर और लैम्ब्डा पर निर्देशांक। शीर्षस्थान कि संदर्भ बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा के निर्देशांक ले लो।
  9. शीर्षस्थान से शुरू, दो गाइड प्रवेशनी के निर्देशांक है कि हिप्पोकैम्पस में द्विपक्षीय प्रत्यारोपित किया जाएगा गणना (अग्रपश्च: - 0.42 सेमी, mediolateral: ± 0.30 सेमी, dorsoventral: - Paxinos और वाटसन चूहे के मस्तिष्क एटलस के अनुसार 0.28 सेमी) 29 । संकेत मिलता हैएक मार्कर के साथ प्रवेशनी की स्थिति।
  10. दोनों प्रवेशनी का आरोपण बिंदु पर खोपड़ी में एक छेद (0.5 मिमी) ड्रिल। ड्रिल दो अन्य छेद लगभग 5 मिमी से ऊपर है और उन अंक नीचे शिकंजा कि प्रवेशनी स्थिर करना होगा जब दंत सीमेंट लागू करने के डालने के लिए।
  11. कैथेटर पहले से एक छुरी के साथ aCSF के साथ भर के एक छोर में कटौती, और प्रवेशनी के कोण हाथ में डालें। दंत सीमेंट के साथ पहली प्रवेशनी को ठीक करें। दूसरी प्रवेशनी पर स्थिति के आसपास दंत सीमेंट डालने से बचें।
  12. 2 के लिए दंत सीमेंट सूखी चलो - 3 मिनट है, तो पहले से प्रवेशनी धारक हाथ हटाने, और उस में दूसरे प्रवेशनी तय कर लो। दोहराएँ 2.11 और 2.12 कदम। दोनों गाइड प्रवेशनी पर डमी प्रवेशनी रखो। सुनिश्चित करें कि डमी और गाइड प्रवेशनी ऊतक घुसपैठ और प्रवेशनी अवरुद्ध को रोकने के लिए एक ही लंबाई के हैं।
  13. जेब में पहले से जानवर के कंधे ब्लेड के बीच किए गए दोनों कैथेटर के मुक्त अंत डालें। अकड़न निकालें और एक साथ त्वचा सिलाईसीवन धागे 4-0।
    नोट: शीर्ष गाइड प्रवेशनी आगामी Aβo सुई लेनी के लिए सुलभ होने की जरूरत है।
  14. stereotaxic फ्रेम से पशु निकालें और अपने पिंजरे में वापस डाल दिया। शल्य चिकित्सा के बाद वसूली के दौरान, एक पानी गर्म कंबल पर पिंजरे जगह जब तक पशु उठता है। पिंजरे पैड पर आंशिक रूप से होना चाहिए, ताकि चूहे गर्मी से दूर स्थानांतरित कर सकते हैं अगर जरूरत है। पशु लगातार निगरानी जब तक यह स्टर्नल लेटना बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना आएगा।
  15. करीब से निगरानी के तहत 10 दिनों के लिए सर्जरी से उबरने के लिए जानवरों की सुविधा के लिए चूहों लौटें।
    ध्यान दें: एक जानवर जब तक पूरी तरह से ठीक है कि अन्य जानवरों की कंपनी के लिए सर्जरी आया है वापस नहीं है। Meloxicam (1 मिलीग्राम / किग्रा) सर्जरी के बाद दर्द के इलाज के लिए दो दिनों के दौरान एक बार प्रति दिन दिया जाता है।

3. आसमाटिक पंप स्थापना

  1. और नियंत्रण IgG1; स्थापना से पहले एक दिन, 6E10 एंटीबॉडी (100 μl 1 मिलीग्राम / एमएल) के साथ आसमाटिक पंप भरनेएंटीबॉडी (1 मिलीग्राम / एमएल, 100 μl) बाँझ शर्त के तहत निर्माता के निर्देशों के अनुसार। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ आसुत जल में पंप रखें पंप सक्रिय करने के लिए।
  2. आसमाटिक पंप (7 दिनों के लिए 0.5 μl / घंटा) स्थापित करने के साथ isoflurane 3% चूहों anesthetize। कंधे ब्लेड के बीच दाढ़ी और chlorhexidine gluconate का एक समाधान 2% और isopropyl शराब 2% के साथ त्वचा कीटाणुरहित। कंधे ब्लेड के बीच एक छुरी PE50 गाइड प्रवेशनी से जुड़े कैथेटर का पता लगाने के साथ 2 सेमी की एक चीरा।
  3. एक छुरी के साथ दंत सीमेंट युक्त PE50 कैथेटर के अंत कट। PE50 कैथेटर को आसमाटिक पंप कनेक्ट करें, और कनेक्शन को सुरक्षित करने के लिए पंप और कैथेटर जंक्शन पर कुछ दंत सीमेंट जोड़ें।
  4. एक सिवनी धागा 4-0 के साथ कसकर त्वचा सिलाई। एक पानी गर्म पैड पर अपने पिंजरे में पशु वापस रखो। पशु जगा तेजी से एक isoflurane संज्ञाहरण (लगभग 5 मिनट) से निरीक्षण करें।
    नोट: सर्जरी appro लेता हैximately 5 से 10 मिनट के लिए।

4. जाग में Aβo आधान और आज़ादी से चलती चूहे

  1. Aβo समाधान (0.2 माइक्रोग्राम / μl) के रूप में पहले से सूचित तैयार करें। 28,30 Aβo अर्क से पहले कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए गतिशील और अनायास कुल करने के लिए अनुमति दें।
  2. एक प्रेरणा पंप पर दो 10 μl सीरिंज को स्थापित करें। बाँझ आसुत जल के 5 μl के साथ सीरिंज भरें। एक छुरी के साथ लंबाई में लगभग 60 सेमी करने के लिए दो PE50 कैथेटर कट। 1 मिलीलीटर सीरिंज और 21G सुइयों का उपयोग बाँझ आसुत जल के साथ दोनों कैथेटर भरें।
  3. कैथेटर के एक छोर पर 1 मिलीलीटर सीरिंज रखें और हैमिल्टन सीरिंज के लिए दूसरे छोर से कनेक्ट। 1 मिलीलीटर सीरिंज निकालें और जाँच है कि वहाँ कैथेटर के भीतर कोई हवाई बुलबुले।
  4. PE50 कैथेटर के अंत में आंतरिक प्रवेशनी डालें। बाँझ आसुत जल का उपयोग करना, PE50 कैथेटर से जुड़े आंतरिक प्रवेशनी भरने to1 हैमिल्टन सीरिंज पर μl। पी द्वारा एक हवाई बुलबुले बनाओ2 μl अप करने के लिए पिस्टन वापस ulling।
  5. ऊपर pipetting द्वारा और पालन के न्यूनतम के एक टिप का उपयोग कर नीचे Aβo समाधान मिश्रण। मिश्रण के दौरान बुलबुले के गठन से बचें। 3.5 μl अप करने के लिए पिस्टन वापस खींच कर Aβo समाधान के 1.5 μl के साथ दोनों आंतरिक प्रवेशनी भरें।
  6. पहले और हवा दोनों कैथेटर में किया बुलबुला के बाद एक मार्कर के साथ लाइनों बनाओ। यह चल रहे निषेचन के लिए एक जांच बिंदु के रूप में कार्य करता है। निषेचन के लिए, आसव पम्प के पास पिंजरे लाने और अपनी कवर हटा दें।
  7. एक टेकना में चूहे की जगह और कसकर अपनी गर्दन के चारों ओर टेकना के हाथ परिमार्जन चूहे के सिर स्थिर करने के लिए। दो गाइड प्रवेशनी से डमी प्रवेशनी निकालें। पहले से गाइड प्रवेशनी में तैयार आंतरिक प्रवेशनी डालें। सत्यापित करें कि वे पूरी तरह से डाला जाता है और गाइड प्रवेशनी के आधार करने के लिए अच्छी तरह से तय की।
  8. टेकना से चूहे जारी है और वापस विवाद तनाव को सीमित करने का यह डाल अपने पिंजरे में। यह सुनिश्चित करें कि कैथेटर toget नहीं मोड़ बारीकी से निगरानीउसे और अर्क ठीक से किया है।
  9. प्रेरणा पंप चालू करें। 0.1 μl / मिनट (10 मिनट) की दर से Aβo समाधान के 1 μl इंजेक्षन। निषेचन के दौरान, जाँच करें कि 2.5 μl 3.5 μl से सिरिंज पिस्टन चलता है, और है कि दोनों PE50 कैथेटर में एयर बबल लगातार चलते हैं।
  10. निषेचन के बाद एक और 5 मिनट के लिए जगह में आंतरिक प्रवेशनी छोड़ दो Aβo समाधान के कुशल प्रसार की अनुमति है। आंतरिक प्रवेशनी और छाया हुआ गाइड प्रवेशनी इंजेक्शन समाधान की भाटा को रोकने के लिए दूर करने के लिए टेकना में वापस चूहा लाओ। डमी प्रवेशनी कि सिर्फ प्रवेशनी के कोण हाथ से पहले बंद का प्रयोग करें। अपने पिंजरे में पशु लौटें।
  11. लगातार 6 दिनों में एक बार Aβo अर्क दोहराएँ प्रति दिन। कत्ल द्वारा पशु euthanize।

Representative Results

Aβo की neurotoxic प्रभाव में प्रवेशनी दाखिल द्वारा लंबे समय से इवांस चूहों में जांच की गई हिप्पोकैम्पस के डीजी। घुलनशील Aβo लगातार छह दिनों में हर दिन इंजेक्ट किया गया। हम प्रवेशनी इस्तेमाल किया विशेष Aβo के एक साथ सुई लेनी और हिप्पोकैम्पस आसमाटिक पंप (चित्रा 1 ए) का उपयोग करने में 6E10 या नियंत्रण IgG1 एंटीबॉडी की सतत प्रेरणा के लिए डिजाइन। चूहों के लिए immunohistochemistry anesthetized थे, 0.9% NaCl के साथ transcardially भरकर रखा जाता है, और दिमाग 24 घंटे के लिए 48 घंटा और 15% sucrose के समाधान के लिए 4% paraformaldehyde समाधान में डूबे। मुक्त अस्थायी राज्याभिषेक वर्गों (40 माइक्रोन), 30 मिनट के लिए 0.3% एच 22 के साथ इलाज किया गया 1 घंटे के लिए 1% बकरी सीरम में अवरुद्ध है, और एक विरोधी अखिल Aβ एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात incubated। धारा एंटीबॉडी लागू करने से पहले 3 मिनट के लिए 70% फार्मिक एसिड के साथ इलाज किया गया। डिटेक्शन एबीसी जटिल और एक 0 उपयोग किया गया था।05% 3,3-diaminobenzidine समाधान। धारा जिलेटिन लेपित गिलास स्लाइड, हवा सूखे 2 घंटा, निर्जलित (30, 70, 95, और 100% शराब), टोल्यूनि 5 मिनट में incubated पर मुहिम शुरू की है, और coverslipped थे। cresyl बैंगनी धुंधला के लिए, वर्गों, एक 0.5% cresyl बैंगनी समाधान में 10 मिनट incubated रहे थे एक 0.5% एसिटिक एसिड के घोल में 1 मिनट, decolored (70, 95, और 100% शराब), टोल्यूनि 5 मिनट में डूबे incubated, और के साथ कवर किया गिलास coverslip।

यहाँ प्रस्तुत परिणामों अर्क साइट के आसपास के क्षेत्र में डीजी में Aβo के बयान, और कोशिका मृत्यु इस संचय के साथ जुड़े दिखा। हमने पाया है कि स्तर Aβo काफी 6E10 एंटीबॉडी उपचार (चित्रा 1 बी) की कमी की गई थी। चिह्नित neurodegeneration Aβo का इंजेक्शन स्थल के निकट मनाया गया, और 6E10 एंटीबॉडी उपचार (चित्रा 1 बी) द्वारा तनु था। इन परिणामों के Aβo संचय है कि हम डीजी में मनाया के साथ संगत कर रहे हैंचूहों में दोहराया Aβo सुई लेनी के बाद। 28 प्रतिरक्षा चिकित्सा द्वारा amyloid बयान की मंजूरी 6E10 एंटीबॉडी यहाँ दिखाया गया है के साथ एक ट्रांसजेनिक ई माउस मॉडल में किया एक और रिपोर्ट के साथ कतार में है। 31

आकृति 1
चित्रा 1. द्विपक्षीय प्रवेशनी साथ पशु की फोटो Aβo आसव के दौरान Aβo का एक समाधान। (0.2 माइक्रोग्राम / μl, 1 μl) (6 दिनों के लिए एक दिन में एक बार) जाग और स्वतंत्र रूप से घूम रहा है चूहों में इंजेक्ट किया गया था आंतरिक प्रवेशनी से जुड़े PE50 कैथेटर का उपयोग कर गाइड प्रवेशनी में डाला। साथ नियंत्रण (सीटीएल) IgG1 या 6E10 एंटीबॉडी उपचार आसमाटिक जानवर के कंधे ब्लेड के बीच subcutaneously स्थित पंपों का उपयोग Aβo लगाने की साइट पर सीधे संचार किया गया था। वें में से एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंआंकड़ा है।

चित्र 2
सीटीएल (IgG1) के साथ लगातार 6 दिनों के दौरान एक बार एक दिन में इंजेक्ट किया गया था, और इलाज या कम से 6E10 एंटीबॉडी, चित्रा 2. न्यूरोनल हानि Aβo बयान से प्रेरित 6E10 एंटीबॉडी उपचार ए, Aβo (1 μl 0.2 / μl माइक्रोग्राम) द्वारा तनु है सेल नुकसान दिखा cresyl वायलेट के साथ निषेचन आसमाटिक पंपों का उपयोग। बी, एक वर्ग पर डीजी में Aβo के प्रतिनिधि संचय तुरंत प्रवेशनी प्रविष्टि के बगल में, और प्रतिनिधि धुंधला की साइट। स्केल सलाखों: 50 माइक्रोन (एन = 4) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

इस प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम है कि विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है। जब प्रवेशनी दाखिल, दंत सीमेंट जब यह दूसरी प्रवेशनी के छेद अवरुद्ध को रोकने के लिए भी तरल है लगाने से बचें। यह P50 पंप से जुड़ी कैथेटर के मुक्त अंत में दंत सीमेंट जगह करने की जलन और एक संभव भड़काऊ प्रतिक्रिया को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। stereotaxic सर्जरी के दिन, डमी प्रवेशनी कि गाइड प्रवेशनी के रूप में एक ही लंबाई का उपयोग प्रवेशनी अवरुद्ध से बचने के लिए। हालांकि, स्थापित करने के बाद पंप कम डमी प्रवेशनी कि बंद से पहले प्रवेशनी के कोण हाथ हिप्पोकैम्पस के लिए पंप से समाधान का उचित जान फूंकना अनुमति देने के लिए उपयोग करें। बारीकी से Aβo लेनी मॉनिटर और सत्यापित करें कि हवा कैथेटर में किया बुलबुला सुई लेनी के दौरान लगातार बढ़ रहा है। हमेशा यकीन है कि इंजेक्शन लगाने प्रवेशनी पूरी तरह से लेनी दौरान गाइड प्रवेशनी में डाला जाता है।

यदि समस्या Aβ निषेचन के दौरान मुठभेड़ हैसत्यापित करें कि आंतरिक प्रवेशनी अवरुद्ध नहीं है। यदि यह मामला है, आंतरिक प्रवेशनी के माध्यम से बाँझ आसुत जल फ्लश। गाइड प्रवेशनी बाधित है, तो गाइड प्रवेशनी में आंतरिक प्रवेशनी की बारी है। अन्यथा आंतरिक प्रवेशनी ऊपर और नीचे ले जाएँ। टेकना में विवाद चूहों के लिए तनावपूर्ण हो सकता है, विशेष रूप से पहले दिन। पशु के तनाव को कम करने के लिए, हम में हेरफेर और stereotaxic सर्जरी से पहले टेकना चूहों अभ्यस्त करने के लिए सलाह देते हैं।

कई फायदे इस उपन्यास के लिए जिम्मेदार ठहराया और इन विवो दृष्टिकोण में लचीला हो सकता है। दरअसल, Aβo की प्रकृति सही अर्क से पहले नियंत्रण किया जा सकता इंजेक्शन, और Aβ तैयारियों के विभिन्न प्रकार (उदाहरण के सिंथेटिक बनाम मस्तिष्क व्युत्पन्न Aβ समाधान के लिए) विवो में उनकी न्यूरोटॉक्सिटी मूल्यांकन करने के लिए इंजेक्शन जा सकता है। यह मॉडल भी तंत्र है जिसके द्वारा विभिन्न Aβ प्रजातियों (जैसे, monomers, निम्न और उच्च आणविक वजन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता राजभाषाigomers, protofibrils) विवो में neurotoxic प्रभाव पैदा कर सकते हैं, और कैसे प्रतिरक्षा चिकित्सा उपचार की तरह दिमाग में उनकी हानिकारक प्रभाव प्रतिक्रिया हो सकती है। चूंकि लेनी जाग, स्वतंत्र रूप से चलती जानवरों में प्रदर्शन कर रहे हैं, वहाँ संवेदनाहारी एजेंटों और संकेत दे रास्ते पर Aβo समाधान के बीच कोई confounding प्रभाव, के रूप में पिछले अध्ययनों में दिखाया गया है स्वतंत्र रूप से पशुओं के बढ़ने में 32,33 आधान कर रहे हैं भी व्यवहार परीक्षण के साथ संगत कर रहे हैं। किसी भी समय से पहले और सुई लेनी के बाद।

Aβo और पंप स्थापना की सुई लेनी अलग अलग उम्र के जानवर में किया जा सकता है उम्र बढ़ने के दौरान Aβo के प्रभाव और उपचार का निर्धारण। चूंकि neurodegeneration अर्क साइट के आसपास के क्षेत्र में होता है अन्तर्ग्रथन और neuronal नुकसान अलग और स्थानीय मस्तिष्क क्षेत्रों में प्रेरित किया जा सकता है। Aβo की जमानत के अर्क और नियंत्रण (वाहन या हाथापाई Aβ) एक ही पशु के भीतर किसी भी बदलाव के लिए नियंत्रित करने की अनुमति देता है। इसके विपरीत, Aβo या नियंत्रण पसंस्थानों सही में द्विपक्षीय इंजेक्शन और हिप्पोकैम्पस छोड़ दिया है, उदाहरण के लिए व्यवहार कार्य में पशुओं का परीक्षण जब जा सकता है। Aβo और उपचार का आसव एक साथ किया जा सकता है या वैकल्पिक रूप से पंप अगर इलाज Aβ बयान के बाद प्रभावी है मूल्यांकन करने के लिए Aβo निषेचन के बाद से स्थापित किया जा सकता है। जब Aβo की Intracerebroventricular लेनी कर रही है यहाँ वर्णित एक ही प्रोटोकॉल का भी इस्तेमाल किया जा सकता है। intracellular संकेत दे रास्ते पर Aβo के प्रभाव से पहले और एक हद तक कम समय सीमा के भीतर neuronal नुकसान के बाद का मूल्यांकन किया जा सकता है। खुराक और Aβ सुई लेनी की संख्या भी एक कम या ज्यादा गंभीर Aβ pathogenicity प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जा सकता है।

हालांकि बहुत बहुमुखी, इस तकनीक कुछ सीमाएँ हैं। प्रवेशनी आरोपण सर्जरी के बाद ऊतक और पहले कुछ दिनों में neuroinflammation के एक यांत्रिक व्यवधान पैदा करता है। इस प्रकार, यह Aβo infu शुरू करने से पहले सर्जरी के बाद कम से कम एक सप्ताह तक प्रतीक्षा करने के लिए आवश्यक हैसायन, और उचित नियंत्रण (वाहन या निष्क्रिय हाथापाई Aβ के इंजेक्शन) इन घटनाओं को ध्यान में रखना जोड़ने के लिए। इसके अलावा, केवल Aβo की एक छोटी मात्रा समाधान के प्रसार को सीमित करने का संचार किया जा सकता है।

आसमाटिक पंप Aβ प्रेरित neurodegeneration रोकने के लिए बनाया एजेंटों की preclinical सत्यापन के लिए एक सुविधाजनक और अद्वितीय वितरण पद्धति प्रतिनिधित्व करते हैं। चूंकि 6E10 एंटीबॉडी के साथ प्रतिरक्षा इससे पहले, मस्तिष्क में Aβ संचय को कम करने के लिए 31 दिखाया गया है कि हम अपने नए विवो दृष्टिकोण को मान्य करने के लिए एक सबूत की अवधारणा के रूप में 6E10 एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया। इस मॉडल में आसमाटिक पंप का इस्तेमाल अब उपन्यास रोग को संशोधित चिकित्सा कि पूर्व नैदानिक ​​ई रोगियों में बयान और Aβo की न्यूरोटॉक्सिटी को रोकने सकता है विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) Harvard Apparatus 59-7316
PE 50 Catheter thin wall Plastics one C232CT
Ketamine Hydrochloride (100 mg/ml) Bioniche 1989529
Xylazine Hydrochloride (100 mg/ml) Bimeda 8XYL004C
Meloxicam (5 mg/ml) Norbrook 215670I01
Solution of chlorhexidine gluconate 2% and isopropyl alcohol 2% Carefusion 260100C
Lidocaine Hydrochloride Alveda Pharma 0122AG01
Bupivacaine Hydrochloride Hospira 1559
ophthalmic ointment Baussh and Lomb inc. 2125706
stereotaxic frame Stoelting 51600
stereotaxic cannula holder arm Harvard Apparatus 72-4837
Drill Dremel 8050-N/18
Guide Cannula Plastics one 326OPG/spc
Injection Cannula Plastics one C315I/spc
Dummy Cannula Plastics one C315DC/spc
Suture thread coated vicryl rapide 4-0 Ethicon VR2297
Dental Acrylic Cement Harvard Apparatus 72-6906
Screws JI Morris Company P0090CE125
6E10 antibody (mouse IgG1 isotype)  BioLegend 803003
Mouse IgG1 isotype control antibody Abcam AB18447
Alzet osmotic pumps model 1007D Durect corporation 290
Isoflurane Baxter CA2L9100
Amyloid-beta 1-42  rPeptide A-1163-1
Hamilton syringe (10 µl) Fisher Scientique 14815279
Infusion Syringe Pump CMA 402 Harvard Apparatus CMA8003110
Syringe 1 ml BD 309659
Needle 21 G Terumo NN-2125R
Snuggle Lomir Biomedical RTS04

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References

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