Пространственные измерения перфузии, интерстициальный давления жидкости и Липосомы Накопление в солидных опухолях

JoVE Journal
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Stapleton, S., Mirmilshteyn, D., Zheng, J., Allen, C., Jaffray, D. A. Spatial Measurements of Perfusion, Interstitial Fluid Pressure and Liposomes Accumulation in Solid Tumors. J. Vis. Exp. (114), e54226, doi:10.3791/54226 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Гетерогенный внутри опухолевой накопление липосом является критическим фактором, определяющим их эффективность. И хаотичным микроциркуляции опухоли и повышенные IFP связаны с гетерогенной внутрибрюшного опухолевое распределения на основе нанотехнологий систем доставки лекарственных средств, таких как липосомы. В настоящем исследовании, взаимосвязь между опухолью микроциркуляции, повышенной IFP и накопления наночастиц было исследовано с помощью экспериментов в естественных условиях. Это было достигнуто путем оценки микроциркуляции опухоли с использованием динамической контрастности расширенной компьютерной томографии (АКД-КТ) и измерение опухоли IFP с использованием нового изображения наведением системы размещения роботизированная иглы, соединенный с микро-КТ сканера. Внутри опухолевой накопление липосом определяли с помощью КТ изображения на основе оценки липосомном наночастиц, которые стабильно герметизировать Контрастное вещество иогексол (CT-липосом). КТ изображения позволило совместной локализации пространственного распределенияОпухолевые гемодинамика, IFP и накопление КТ-липосома в индивидуальной модели подкожного ксенотрансплантата мыши рака молочной железы. Измерения привели к открытию того, что перфузия и объем фракции плазмы являются сильными медиаторами распределения внутрибрюшного опухолевый липосом. Кроме того, результаты показывают, что ПСИ играет косвенную роль в опосредовании распределение липосом путем модуляции кровотока.

Introduction

Измерение внутри опухолевой накопление наночастиц системы доставки лекарственных средств может стать важным инструментом для определения наличия адекватной концентрации цитотоксического препарата была достигнута в опухоли. Развитие «Имидж-состоянии" липосомальных систем позволяет неинвазивным и количественное в естественных условиях обнаружение доставки лекарственного средства транспортного средства с использованием методов визуализации , таких как позитронно - эмиссионной томографии (ПЭТ) 1, оптической флуоресценции 2 и компьютерной томографии (КТ) 3, 4 и магнитно - резонансная томография (МРТ) 5. Обработки изображений используется для определения фармакокинетики и биораспределение липосомальных систем доставки и выявить степень межпредметных и внутри опухолевой гетерогенности в наночастицами накопления 6,7. Тем не менее, изображения наночастиц в одиночку не идентифицирует биологические барьеры, которые способствовали их плохого накопления и распределения. Это знание имеет первостепенное значение для гАЦИОНАЛЬНЫЙ разработка более эффективных составов, а также стратегии улучшения внутри опухолевой накопления 8. Было показано , что терапевтические стратегии могут быть применены для модулирования специфические биологические барьеры что приводит к улучшению переноса наночастиц 9. Кроме того, препараты из наночастиц были разработаны специально для преодоления специфической биологической транспортного барьера 10. В обоих случаях измерения биологических барьеров могут быть использованы для руководства использования соответствующей стратегии наночастиц для доставки лекарственного средства.

Опухоль микроциркуляции и повышенные ПСИ как полагают, являются двумя ключевыми факторами , определяющими внутриатомного опухолевый накопления наночастиц, такие как липосомы, в солидных опухолях 9,11. Тем не менее, другие барьеры, чтобы способствовать накоплению плохой липосом включают плотный внеклеточный матрикс, непроницаемый сосудистую сеть , и давление 12 твердой ткани. Эти барьеры связаны в пространственно-временнойСпособ, с ненормальным кровотока и повышение интерстициального давления жидкости является двумя важными факторами, способствующими первоначальную поставку и кровоизлияние наночастиц. Как уже обсуждалось ранее, установление взаимосвязи между микроциркуляции опухоли, повышенное IFP, и внутриливанской опухолевый накопление липосом является обязательным для правильной интерпретации данных липосомами изображений. При этом количественные методы для измерения отношения между микроциркуляции опухоли, повышенное IFP, и накопление наночастиц в твердой опухоли представлены. Это достигается путем выполнения колокализуются измерений внутри опухолевой распределения КТ липосомная контрастного агента с использованием объемной КТ, опухоль микроциркуляции с помощью динамической контрастности усиливается вычисленный изображений томографии, а также опухоли IFP с использованием изображения наведением роботизированной системы позиционирования иглы, названные робот CT-IFP 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты в естественных условиях были проведены в соответствии с протоколом , утвержденным Institutional уходу и использованию животных комитета университета сеть здравоохранения путем.

1. Животная модель

  1. Культура от 5 до 7 х 10 6 MDA-MB-231 опухоли аденокарциномы молочной железы клеток в DMEM вместе с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 100 - кратном разведении пенициллин-стрептомицина.
  2. Урожай клетки, когда они 80% сплошности с использованием 0,05% раствора трипсина-ЭДТА. Через 3-5 мин нейтрализации трипсин-ЭДТА с 3-кратным объемом DMEM. Возьмите 15 мкл аликвоты клеток и подсчета использованием гемоцитометра. Центрифуга клетки в гранулы в течение 5 мин при 200g, и повторно приостанавливать в HBS при концентрации 10 х 10 6 клеток на мл.
  3. Имплантат подкожно (SC) опухоли путем инъекции 1 до 2 × 10 6 клеток в задней конечности каждой от 8 до 12 недельных самок SCID мышей (п = 5). Используйте стандартный 25 G иглы для инъекций.
  4. монитор тumor роста , используя суппорты (объем = 0,5 х длина х ширина 2) и начать измерения , как только опухоли SC достигли объема> 200 мм 3 (приблизительно от 7 до 9 дней).

2. CT-липосома Получение и определение характеристик

  1. липосом Подготовка
    1. Растворите липидные компоненты (200 ммоль / л) для CT-липосом, в том числе 1,2-дипальмитоил-SN-глицеро-3-фосфохолина (ДПФХ), холестерин (СН), и 1,2-дистеароил-Sn-глицеро-3 -phosphoethanolamine-N-поли (этиленгликоль) 2000 (DSPE-PEG2000) в безводном этаноле при 70 ° с при мольном соотношении 55: 40: 5 DPPC CH: ДСФЭ-PEG2000.
    2. Выпаривают этанол, поддерживая высокую температуру при 70 ° С, а затем добавить КТ контрастное вещество иогексол (300 мг / мл йода) к раствору так, чтобы конечная концентрация липида составляет 100 мМ.
    3. Поддержание раствора при 70 ° С в течение 4 ч с частым встряхиванием.
    4. Для получения однослойных везикул, прессовать образец 5 тимЕ. С. через два уложены 200 размер нм пор мембран при давлении 250 фунтов на квадратный дюйм и выталкивать снова на 5 циклов через два сложенных 80 нм мембран с размером пор при 400 фунтов на квадратный дюйм с использованием 10 мл липидного экструдера. Капают объем 10 мл липосом в экструдер в начале каждого цикла экструзии и собирают в стерильную пробирку или стеклянную пробирку коническим после каждого цикла экструзии.
    5. Удалить неразделанный инкапсулированные иогексол на 16 ч диализа с использованием молекулярной массой 100 кДа, отрезали (MWC) диализный мешок против 250-кратного объема избытка 0,02 мМ HEPES-солевом буферном растворе (HBS, рН 7,4). Например, поместите 1 мл раствора липосом внутри мешка диализом с помощью 250 мл HBS вне мешка в стакане.
    6. Концентрат CT-липосом с использованием 750,000 сономических MWC коммерческую систему тангенциального потока в соответствии с инструкциями изготовителя. Концентрат до конечной концентрации йода примерно 55 мг мл -1.
  2. липосом Характеристика
    1. Измерить эффективность инкапсулирования путем разрывания CT-липосом с использованием 10-кратного объема избытка этанола , чтобы освободить ioxehol , а затем разбавленным с помощью 100-кратного объема избыток деионизированной воды (т.е. 10 мкл липосом разрываются с использованием 100 мкл этанола , а затем разбавляли до конечного объема 10 мл).
    2. Определить концентрацию йогексола с помощью УФ-спектрометра с детектированием при длине волны 245 нм. Расчет эффективности инкапсулированных, принимая величину коэффициента высвобождаемого иогексола агента к количеству агента, добавленного в процессе приготовления.
    3. Измерьте диаметр и дзета-потенциал гидродинамический с использованием динамического рассеяния света частиц по размерам системы анализатора в соответствии с инструкциями изготовителя. Развести КТ-раствора липосом путем 200x (т.е. 5 мкл липосом в 1 мл конечного объема) в деионизированной воде для облегчения измерений.

3. КТ опухолевой микроциркуляции и CT-липосомраспределение

Примечание: Следуйте инструкциям производителя для выполнения объемного сканирования, если используется другая версия программного обеспечения или оборудования.

  1. Обезболить каждой мыши, используя 2% изофлуран, смешанный с медицинским кислородом или воздухом и подтвердить зажимая палец и не соблюдая никакой реакции. Нанесите мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость под наркозом. Зафиксировать животное в положении лежа пластырем лапы к тонкой пластиковой доске.
  2. Поместите заказ 27 G катетер, соединенный с 20 см на PE10 трубки, в боковую хвостовую вену и зафиксировать на месте с помощью нескольких кусков ленты.
  3. Подготовить 1 мл шприц, чтобы содержать, по меньшей мере, 200 мкл CT-липосом. Подготовьте 1 мл шприц с физиологическим раствором, чтобы использовать для промывки катетера. И, наконец, подготовить 1 мл шприц с, по меньшей мере 150 мкл свободного иогексола, смешанного с физиологическим раствором (9: 1 соотношение по объему).
  4. Поместите мышь ничком на микро-КТ планшете сканера. С помощью лазерной системы позиционирования для размещения TUMOR примерно в той же ориентации для каждого сканирования.
  5. Поместите CT-липосом шприц в шприцевой насос и прикрепить катетер к шприцу. Установите скорость насоса 10 мкл в секунду.
  6. Инициализировать систему, выполняя ярко-темно-калибровочный сканирование с использованием программного обеспечения консоли КТ-сканера. Выберите опцию сканирования ярко-темным для каждого протокола формирования изображения интереса, выберите ярко-темный из выпадающего меню и нажмите на кнопку сканирования, чтобы начать процесс калибровки.
  7. Выполните объемный анатомический микро-КТ опухоли до начала любой инъекции контрастного вещества. Посмотрите на индикатор консоли программного обеспечения томограф для обеспечения безопасности КТ-сканера блокираторы были очищены. На КТ сканера консоли выберите сканирования выберите энергию рентгеновского излучения 80 кВ, ток трубки 70 мА, и захватывает 1000 проекции изображения с течением времени 16 сек. Нажмите кнопку сканирования, чтобы начать сканирование.
  8. С помощью шприцевого насоса, чтобы ввести болюс КТ-липосом при концентрации 400 мг йода на кг-1. Установите насос для того чтобы придать объем приблизительно 150 мкл (при условии 25 г мыши). Нажмите кнопку "Пуск" на насосе, чтобы впрыснуть. Вручную промойте катетер с 50 мкл физиологического раствора (в два раза объем катетера), чтобы обеспечить весь объем агента посеянный и катетер ясно.
  9. Подождите 10 мин после инъекции CT-липосом, а затем выполнить вторую анатомическое сканирование, используя тот же метод и параметры, описанные в 3.5.
  10. Выполните сканирование АКД-CT, установив шприцевой насос для впрыска объемом 100 мкл свободного иогексола, смешанного с физиологическим раствором (соотношении 9: 1 по объему) с использованием той же установки скорости впрыска, описанной в разделе 3.3.
    1. На консоли КТ-сканера выберите 5 мин динамическое сканирование, которое использует установку рентгеновского энергии 80 кВ, энергии трубки 90мА, улавливает 416 изображений проекции каждую секунду в течение первых 30 секунд и с последующим приобретением каждые 10 сек , Захват 5 сек данных АКД-CT, а затем нажать кнопку запуска на injectioп насос.
    2. После АКД-КТ выполняют объемную анатомическую микро-КТ.
  11. Захват анатомических КТ-изображений между 48 и 72 ч после инъекции CT-липосом, используя те же самые объемные параметры трансформаторов тока, как описано в 3.5 шагов.
  12. Восстанавливают анатомические данные КТ и АКД-КТ с помощью программного обеспечения GPU-реконструкции.
    1. Загрузите изображение в программу реконструкции. Выберите интересующую область быть реконструирована рисовании ROI на изображение с помощью мыши. Установить место сохранения и имя файла для реконструированный отображаемого и выбрать выходной тип файла как '.mat'.
      Примечание: Программное обеспечение автоматически установит реконструированного размер воксела к 0,153 х 0,153 х 0,153 мм 3 для анатомических сканирования и 0,153 х 0,153 х 0,462 мм 3 для сканирования АКД-КТ. Нажмите на кнопку "начать реконструкцию».
  13. С помощью предварительного впрыска и 10 мин сканирование после инъекции CT-липосом для расчетаПлазма объемная доля , как описано ранее 3. Кроме того, использование предварительного впрыска и 5 мин после инъекции сканирование иогексола для расчета интерстициальный объемной доли , как описано выше 7.
  14. Получить интенсивность времени кривые (тиков) путем импорта данных АКД-CT в программное обеспечение, которое обеспечивает возможность идентификации области интереса (ROI) в пределах объема опухоли. Затем рассчитывают среднее повышение КТ в ROI в зависимости от времени. В этом эксперименте специальное программное обеспечение было разработано, чтобы определить ROI и рассчитать ТЭП.
  15. Получить количественные оценки перфузии и сосудистой проницаемости путем подгонки измеренных ТЭП с использованием кинетической модели двухкамерный копира. Место может быть выполнена с помощью программного обеспечения АКД-КТ анализа и использования априорной оценки объема плазмы фракции и фракции интерстициального объема в качестве фиксированных параметров в кинетической модели двухкамерный копиром. Использование ранее сообщалось о способах получения априорных оценок плазмыа и интерстициальные объемные доли 14.

4. Пространственные измерения опухолевого интерстициального давления жидкости

  1. Для измерения IFP соединить спинальную иглу 25 G к датчику давления и к системе сбора IFP через 50 см от PE20 полиэтиленовых труб. Промыть всю систему с гепарин сульфат / солевой раствор (1:10). Стерилизовать иглу с 70% изопропилового перед использованием.
  2. Включите систему сбора и запустить программное обеспечение сбора IFP и загрузить файлы настроек для калибровки системы измерений приобрести IFP в мм ртутного столба. Нажмите кнопку нажить непрерывно собирать данные IFP.
  3. Провести измерения IFP между 48 и 72 ч после инъекции CT-липосом (это соответствует приблизительное время пика накопления КТ-липосом в опухоли), с использованием способов, описанных в пункте 4.8. Присоединить иглу IFP к роботу CT-IFP.
  4. Выполнение калибровки сканирования для выравнивания систем координат дляробот CT-IFP и сканер КТ. Добавьте фидуциального вложение маркера для робота CT-IFP и выполнить четыре объемных КТ с нормирующего маркера в четырех различных положениях.
    1. Запуск программного обеспечения контроллера робота CT-IFP, инициализировать робота, и переместите робота на три позиции, введя х, у, z таргетинг позиции и нажав кнопку "Go".
    2. Возьмите КТ по ​​следующему х, у, г координаты: (1) 0,0,0; (2) -10,0,0; (3) 0,7,0; и (4) 0,0,10. Выберите 90 кВ, 10 мА, 16 сек сканирования с помощью программного обеспечения КТ-сканера и нажмите 'Start', чтобы начать сканирование. Реконструировать сканирование, как описано в 3.10.
  5. Запустите программное обеспечение выравнивания робота CT-IFP. Нажмите на кнопку "Добавить", загруженную в регионе "Регистрационные данные" и выберите четыре реконструированные регистрации сканирования, полученные в 4.3, затем нажмите кнопку "открытым".
    Примечание: Пиксель расположение нормирующего маркера будет автоматически введен в Softwaчисло рейнольдса
    1. Нажмите на кнопку "Рассчитать" Transform, а затем нажмите кнопку "Применить" Transform. Это генерирует данные выравнивания, которые будут использоваться для преобразования робот CT-IFP системы координат к томографа системе координат. После завершения калибровки, прикрепить платформу животных к роботу CT-IFP.
  6. Обезболить каждой мыши, используя 2% изофлуран, смешанный с медицинским кислородом или воздухом и подтвердить зажимая палец и не соблюдая никакой реакции. Зафиксировать животное на платформе робота CT-IFP и расположите мышь таким образом, что опухоль доступна для системы робота CT-IFP. Зафиксировать опухоль с помощью липкой ленты таким образом, что он не двигается во время введения иглы IFP.
  7. Провести анатомическую микро-КТ до введения иглы IFP. Реконструировать данные КТ, используя шаги, описанные в 3.10.
  8. Загрузите предварительно иглы вставки CT данных в программное обеспечение выравнивания робота CT-IFP. Отрегулируйте окно и уровень визуализации опухоли. Нажмите на гое край опухоли в любом изображении, а затем нажмите на втором месте обода.
    Примечание: Программа будет вычислять ряд позиций вдоль линейной линии между двумя позициями. Обратите внимание, что х, у и г координаты для ряда 5 до 8 равномерно расположенных позиций из списка.
  9. Подготовка системы IFP путем промывки иглы с гепарином физиологическим раствором перед введением.
  10. Введите первые заранее определенные позиции иглы в х, у, г, в программное обеспечение управления роботом CT-IFP и пресс-перейти на кнопку "Go" для перемещения робота в нужное положение. Нажмите кнопку "Вставьте иглу", чтобы вставить иглу в ткань.
    1. После введения иглы обеспечивают хорошую жидкостную связь между иглой IFP и ткани, зажимая и отпуская PE20 трубки, отметив, что измерение увеличивается IFP и возвращается к предварительно зажимая значение на программном обеспечении приобретения IFP. Отклонить измерения, которые не возвращают к исходному уровню.
  11. Приобретатьанатомическое КТ с иглой, вставленной, а затем нажмите кнопку "RETRACT игла" на программное обеспечение управления роботом CT-IFP, чтобы убрать иглу из ткани. Отклонить любые IFP измерения, где значение IFP не возвращается к значению вставки предварительно иглы после извлечения иглы. Это означает, что игла может быть засорены во время измерения. Повторите шаги 4.8 до 4.10 для каждого положения иглы.
  12. Определить положение иглы в пределах объема опухоли путем вычисления x, y, и Z позиции иглы порта относительно центра масс объема опухоли, как это определено в пост-вставки объемной КТ иглы.
  13. Возвращение животных в клетки после того, как все измерения завершены. Не оставляйте животных без присмотра, и заботиться, чтобы наблюдать за ними, пока сознание не было вновь, и они способны поддерживать грудины лежачее.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Указанный протокол должен давать CT-липосом с инкапсулированным концентрацией иогексола, средний диаметр липосом и дзета - потенциал 55 мг мл -1, 91,8 ± 0,3 нм и -45.5 ± 2,5 мВ соответственно. На рисунке 1а включает в себя репрезентативную АКД-КТ результаты, получая временные ряды объемных данных, которые показывают временные изменения в внутри опухолевого накопления иогексола. Выбор ROI в пределах опухоли дает TIC , которая может быть определена количественно с использованием методов кинетического моделирования трассирующие для получения оценок перфузии, проницаемости сосудов, плазмы объемной доли и интерстициальной объемной доли (рис 1b). В этом исследовании, кинетическая модель двухкамерный трейсер использовали и подтянутым к измеренной ТЭП с использованием нелинейной кривой подгонки рутина , реализованный в Matlab 14. Сегментация объема опухоли на несколько областей, представляющих интерес одинакового размера позволяет количественно оценить тон пространственное распределение гемодинамических параметров в пределах объема опухоли (рис 1в). Сегментация может быть выполнена либо вручную, что отнимает много времени и трудно, или автоматически, как выполняются здесь, используя алгоритм, который делит опухоль в нескольких трансформирования одинакового размера с помощью сферической системы координат. Методы АКД-CT обеспечивают количественные оценки пространственного распределения перфузии, проницаемости сосудов, плазменной объемной доли и интерстициальной объемной доли. наблюдались эти параметры, чтобы быть пространственно неоднородны с более высоким уровнем перфузии, плазмы и интерстициальной объемных долей по периферии по сравнению с центральным объемом опухоли.

Метод объемной визуализации КТ выявляет биораспределение и внутри опухолевой распределение CT-липосом. На рисунке 2а показаны биораспределение CT-липосом на 48 ч после инъекции. Агент по-прежнему циркулирует в год сосудистой системы, при значительном поглощении наблюдается в селезенке и печени. Внутриизмерительные опухолевый накопление КТ-липосом наблюдалось гетерогенна, с преимущественно периферического накопления по сравнению с центром, как обозначено ярких областей в пределах объема опухоли (2б).

Объемный КТ изображения может использоваться для отслеживания местоположения измерений IFP с использованием установки робота - СТ-IFP. На рис.3 показано размещение иглы IFP в пределах объема опухоли , как визуализируют с помощью высокого разрешения микро-КТ. Игла может быть четко определены в объеме опухоли , позволяя для пространственной локализации IFP измерений в пределах объема опухоли (рис 3b). Можно сформировать пространственную карту IFP по всей опухоли путем выполнения нескольких IFP измерений в пределах объема опухоли. Пространственное IFP затем могут быть соотнесены с соответствующими измерениямимикроциркуляция опухоли и накопление КТ-липосомами.

Объемный КТ томография позволяет общей системе отсчета , дающими возможность совместно локализовать измерения гемодинамики, IFP, и накопление КТ-липосомами. Рисунок 4 приведен пример пространственно колокализуются измерений КТ-липосом накопления, IFP, перфузия, проницаемость сосудов, плазма объемная доля, и интерстициальный объемная доля. Было отмечено, что перфузию и объем фракции плазмы значимо коррелировали с интра-опухолевый накопления КТ-липосом в подкожных MDA-MB-231 опухолей. Кроме того, радиальное распределение IFP коррелирует с гемодинамическими измерений. Эти результаты указывают на сложный пространственно-временная связь существует между микроциркуляции опухоли, IFP и внутрибрюшного опухолевое накопления липосом 14.

Рисунок 1 Рисунок 1: ДСЕ-КТ опухоли микроциркуляции (а) представитель серии временных КТ - изображений , собранных в пределах объема опухоли, изображающая кинетику контрастный агент , как функции от времени.. Красный контур представляет собой ROI, где измеряется кривая интенсивности времени (TIC). (Б) TIC годен с использованием двухкамерной кинетической модели копира , чтобы получить количественные оценки гемодинамических параметров в пределах ROI. (С) представитель пространственное распределение количественных параметров гемодинамики в опухоли. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Объемный КТ-визуализации липосом Accumul вания. (а) представитель 3D - объем-воспроизводимое изображение демонстрирует биораспределение CT-липосом. (Б) представитель осевые, корональной и сагиттальной срезы , взятые через центр опухоли , показывающий внутрисетевой опухолевое накопление КТ-липосом на 48 ч после инъекции. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рис . 3: Изображение Ведомый IFP Измерения (а) Представитель 3D объемного изображение из системы робота CT-IFP (зеленый цвет) вставки после иглы в подкожной опухоли на 48 ч после инъекции CT-липосом (оранжевый). (Б) представитель КТ изображение вставки после иглы./54226/54226fig3large.jpg "Целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4:. Колокализуются Измерения опухолевого микроциркуляции, IFP, и накопление КТ-липосом панель , показывающая репрезентативную пространственное совместной локализации КТ-липосом накопления приняты 48 ч после инъекции, IFP, перфузии, проницаемость сосудов, объемной фракции плазмы и интерстициальный объемная доля. Повторная печать с разрешением от 14 лет . Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Методы измерения на основе изображения, представленные здесь позволяют определить пространственное распределение свойств опухоли микроциркуляции, IFP и КТ-липосом накопления. Предыдущие попытки связать эти свойства полагались на выполнение объемных измерений на нескольких несущих опухоль животных и , следовательно , не хватает чувствительности для выяснения механизмов , ответственных за неоднородности в внутрибрюшного опухолевое накопления , которые обычно наблюдались для наноразмерных систем доставки лекарственных средств 15. АКД-КТ обеспечивает инструмент для измерения внутри- опухолевый вариации свойств микроциркуляции опухоли, объемная КТ дает точного описания кинетики осаждения КТ-липосом, и робот-система КТ-ПСИ обеспечивает инструмент для выполнения пространственной отображение IFP в то же животное. Кроме того, АКД-КТ томография является клинически одобрен метод измерения опухолевые гемодинамику в клинических условиях, что делает результаты этого исследования потенциально клинически TRANSLстол.

Учитывая сложность измерений, есть несколько важных факторов, чтобы обеспечить сбор надежных наборов данных. АКД-КТ на основе количественной оценки микроциркуляции опухоли, вероятно, наиболее трудно обеспечить точные оценки опухолевых гемодинамики. Это требует получения ТЭП с высоким отношением сигнал - шум (SNR) и используя надежный алгоритм подбора для количественного определения тиков 16,17. Визуальный осмотр ТЭП может быть использован для удаления данных низкого SNR из анализа. Кроме того, если не принять мер , то установка высокого SNR ТЭП может также привести к ошибочным оценкам опухоли перфузии, проницаемости сосудов, плазмы объемной доли и интерстициальный объемной доли 16. В целях обеспечения максимальной точности количественного определения использовалась стратегия для получения модели независимой оценки плазмы и интерстициальной объемных долей, которые затем используются в качестве основных параметров в процессе модели подгонки измеренных ТЭП. Этот методобеспечивает надежные оценки перфузии опухоли и проницаемости сосудов получают 15.

Надежный анализ внутрисуставной опухолевый распределения КТ-липосом требует проведения объемной КТ после достаточного накопления агента. Из предыдущих исследований, накопление опухоли пик КТ-липосом происходит между 48 до 72 ч в ксенотрансплантатов мыши 3,15. Кроме того , существует линейная зависимость между концентрацией CT-липосом и контрастного усиления в компьютерной томографии , позволяющей для простого количественного вариаций внутри опухолевого накопления КТ-липосом 15.

Точные измерения IFP с использованием метода игольчатый основе требуется хорошая жидкостную связь между катетером и ткани. Кроме того, важно только опухолей использования, которые имеют высокий уровень центральной опухоли IFP (> 5 до 10 мм рт.ст.), в противном случае будут минимальными пространственные вариации в IFP. Пространственные измерения IFP с использованием CT-IFP ограбитьOT systemcan быть сложной задачей из-за движения ткани, вызванное введением иглы. Обработки изображений до и после размещения иглы имеет решающее значение для точного определения размещения иглы; Тем не менее, это может быть трудно соотнести положение между последующими игольчатых размещений из-за ткани короблению между измерениями. Было установлено, что случайный выбор игольчатых позиций, приводит к значительной деформации ткани при введении иглы. В результате, этот способ при условии, наименее точный пространственное отображение IFP. С другой стороны, выполнение измерений вдоль линейной дорожки поперек объема опухоли и введение иглы по касательной к трассе может улучшить пространственную точность измерений IFP. Установка иглы по касательной к дорожке минимизирует эффект деформации ткани вдоль направления измерения дорожки.

Это исследование продемонстрировало способность измерять пространственное распределение опухолей микроциркуляции, IFP и накопление КТ-липосом в индивидуальной опухоли, После освоения этих методов, можно затем выполнить эти измерения независимо друг от друга или вместе, чтобы охарактеризовать микроокружение опухоли и ее влияние на доставку лекарственного средства. Используя эти методы в модели рака молочной ксенотрансплантата MDA-MB-231 показали , что перфузионная и объем фракции плазмы являются сильными медиаторами внутриатомного опухолевое распределения липосом 14. Там не было установлено, что тесная взаимосвязь между IFP и распределение липосом. Тем не менее, ПСИ был сильно коррелирует с измерениями опухоли перфузией, предполагая, что ПСИ может играть косвенную роль в опосредовании распределение липосом путем модуляции кровотока.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MDA-MB-231 metastatic breast adenocarcinoma tumor cells  ATCC HTB-26
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)  Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F1051
HyClone Penicillin-Streptomycin 100x Solution GE Healthcare Life Sciences SV30010
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red ThermoFisher Scientific 25300-054
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) Avanti Lipids Inc., USA 850355P
Cholesterol (CH) Avanti Lipids Inc., USA 700000P
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-poly(ethylene glycol) 2000 (DSPE-PEG2000) Avanti Lipids Inc., USA 880128P
Omnipaque (Iohexol) 300 mg of iodine/ml  GE Healthcare, CA
80 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes Whatman Inc., USA
200 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes Whatman Inc., USA
10 m Lipex Extruder  Nothern Lipids Inc, CA
Dialysis Bag Molecular Weight Cut Off (MWCO) of 8 kDa Spectrum Labs, USA 
750,000 Nomical Molecular Weight Cut Off (NMWC) Tangential flow column  MidGee ultrafiltration cartridge, GE Healthcare, CA
Peristaltic pump  Watson Marlow Inc., USA
UV spectrometer Helios γ, Spectronic Unicam,  USA
90Plus particle size analyzer  Brookhaven, Holtsville, USA
eXplore Locus Ultra micro-CT system  GE Healthcare, CA Manipulated using CT-Console Software
AxRecon GPU-based Reconstruction  Acceleware Corp. CA
27 G Catheter SURFLO Winged Infusion Set Terumo Medical Products, USA SV*27EL
PE20 polyethylyne tubing Becton Dickinson, USA 427406
Pen tip 25 G × 3.5′′ Whitacre spinal needle  Becton Dickinson, USA 405140 IFP needle
P23XL  pressure transducer  Harvard Apparatus, CA P23XL
PowerLab 4/35, Bridge Amp, with LabChart Pro 7.0 ADInstruments Pty Ltd., USA PL3504, FE221 IFP acquisition system and acquisition software
CT-Sabre Small Animall Intervention system (CT-IFP Robot) Parallax Innovations, CA Manipulated using CT-IFP robot Control Software
CT-IFP robot alignment software Custom Matlab software
DCE-CT Analysis Software Custom Matlab software
Matlab 2013b Mathworks, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seo, J. W., Zhang, H., Kukis, D. L., Meares, C. F., Ferrara, K. W. A novel method to label preformed liposomes with 64Cu for positron emission tomography (PET) imaging. Bioconjugate chemistry. 19, (12), 2577-2584 (2008).
  2. Huang, H., Dunne, M., Lo, J., Jaffray, D., Allen, C. Comparison of Computed Tomography- and Optical Image-Based Assessment of Liposome Distribution. Molecular Imaging. 12, (3), 148-160 (2013).
  3. Stapleton, S., et al. A mathematical model of the enhanced permeability and retention effect for liposome transport in solid tumors. PloS one. 8, (12), e81157 (2013).
  4. Zheng, J., et al. A multimodal nano agent for image-guided cancer surgery. Biomaterials. 67, 160-168 (2015).
  5. Zheng, J., Liu, J., Dunne, M., Jaffray, D. A., Allen, C. In vivo performance of a liposomal vascular contrast agent for CT and MR-based image guidance applications. Pharmaceutical research. 24, (6), 1193-1201 (2007).
  6. Harrington, K. J., et al. Effective targeting of solid tumors in patients with locally advanced cancers by radiolabeled pegylated liposomes. Clinical Cancer Research. 7, (2), 243-254 (2001).
  7. Stapleton, S., Allen, C., Pintilie, M., Jaffray, D. A. Tumor perfusion imaging predicts the intra-tumoral accumulation of liposomes. J Control Release. 172, (1), 351-357 (2013).
  8. Lammers, T., Kiessling, F., Hennink, W. E., Storm, G. Nanotheranostics and image-guided drug delivery: current concepts and future directions. Mol. Pharm. 7, 1899-1912 (2010).
  9. Stapleton, S., Milosevic, M. F. Cancer Targeted Drug Delivery. Springer. 241-272 (2013).
  10. Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nature biotechnology. 33, (9), 941-951 (2015).
  11. Heldin, C. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 4, (10), 806-813 (2004).
  12. Chauhan, V. P., Stylianopoulos, T., Boucher, Y., Jain, R. K. Delivery of molecular and nanoscale medicine to tumors: transport barriers and strategies. Annual review of chemical and biomolecular engineering. 2, 281-298 (2011).
  13. Bax, J. S., et al. 3D image-guided robotic needle positioning system for small animal interventions. Medical physics. 40, (1), 011909 (2013).
  14. Stapleton, S., Milosevic, M., Tannock, I. F., Allen, C., Jaffray, D. A. The intra-tumoral relationship between microcirculation, interstitial fluid pressure and liposome accumulation. Journal of Controlled Release. 211, 163-170 (2015).
  15. Stapleton, S., Allen, C., Pintilie, M., Jaffray, D. A. Tumor perfusion imaging predicts the intra-tumoral accumulation of liposomes. J Control Release. 172, (1), 351-357 (2013).
  16. Brix, G., Zwick, S., Kiessling, F., Griebel, J. Pharmacokinetic analysis of tissue microcirculation using nested models: multimodel inference and parameter identifiability. Medical physics. 36, (7), 2923-2933 (2009).
  17. Brix, G., Griebel, J., Kiessling, F., Wenz, F. Tracer kinetic modelling of tumour angiogenesis based on dynamic contrast-enhanced CT and MRI measurements. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 37, (1), 30-51 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics