Le misurazioni spaziali di perfusione, interstiziale pressione del fluido e liposomi accumulo nei tumori solidi

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Stapleton, S., Mirmilshteyn, D., Zheng, J., Allen, C., Jaffray, D. A. Spatial Measurements of Perfusion, Interstitial Fluid Pressure and Liposomes Accumulation in Solid Tumors. J. Vis. Exp. (114), e54226, doi:10.3791/54226 (2016).

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Abstract

L'accumulo eterogeneo intra-tumorale di liposomi è un determinante fondamentale della loro efficacia. Sia la microcircolazione tumorale caotica ed elevato IFP sono legati alla distribuzione eterogenea intra-tumorale di sistemi di rilascio di farmaci basati sulle nanotecnologie come liposomi. Nel presente studio, il rapporto tra microcircolo tumorale, elevata IFP, e l'accumulo di nanoparticelle è stata studiata attraverso in vivo la sperimentazione. Ciò è stato realizzato valutazione del microcircolo tumorale utilizzando contrasto dinamico tomografia computerizzata (DCE-CT) e la misurazione di IFP tumore usando un nuovo sistema di posizionamento dell'ago robotico immagine guidata collegata allo scanner micro-CT. L'accumulo intra-tumorale di liposomi è stata determinata dalla valutazione CT basato su immagini di una formulazione liposomiale nanoparticelle che stabilmente incapsulare il ioexolo mezzo di contrasto (CT-liposomi). TC consentito per co-localizzazione della distribuzione spaziale diemodinamica tumorali, l'IFP e l'accumulo CT-liposomi in un individuo sottocutaneo modello di xenotrapianto del mouse di cancro al seno. Misurazioni portato alla scoperta che perfusione e frazione di volume plasmatico sono potenti mediatori della distribuzione intra-tumorale di liposomi. Inoltre, i risultati suggeriscono che l'IFP svolge un ruolo indiretto nel mediare la distribuzione liposomi attraverso modulando il flusso di sangue.

Introduction

Misurare l'accumulo intra-tumorale di drug delivery systems nanoparticelle possono prevedere uno strumento importante per determinare se una adeguata concentrazione di farmaco citotossico è stato raggiunto all'interno del tumore. Lo sviluppo di sistemi liposomiali "immagine-grado" permette di non invasiva e quantitativa in vivo di rilevamento del veicolo di consegna della droga utilizzando modalità di imaging come la tomografia ad emissione di positroni (PET) 1, la fluorescenza ottica 2, e la tomografia computerizzata (CT) 3, 4 e la risonanza magnetica (MRI) 5. Imaging è stata utilizzata per determinare la farmacocinetica e biodistribuzione di sistemi di lancio di liposomi e di rivelare il grado di eterogeneità tra soggetto e intra-tumorale in accumulo di nanoparticelle 6,7. Tuttavia, l'imaging di nanoparticelle sola non identificare le barriere biologiche che hanno contribuito alla scarsa accumulo e distribuzione. Questa conoscenza è fondamentale per la Rlo sviluppo azionale di formulazioni più efficaci e strategie per migliorare l'accumulo intra-tumorale 8. È stato dimostrato che le strategie terapeutiche possono essere applicate per modulare specifiche barriere biologiche con conseguente miglioramento dei trasporti nanoparticelle 9. Inoltre, le formulazioni di nanoparticelle sono state sviluppate per superare specificamente specifica barriera trasporto biologica 10. In entrambi i casi, le misurazioni di barriere biologiche possono essere usati per guidare l'uso di un appropriato strategia drug delivery nanoparticelle.

Microcircolazione tumorale ed elevata IFP si ritiene siano due fattori determinanti della accumulo intra-tumorale di nanoparticelle, come i liposomi, nei tumori solidi 9,11. Tuttavia, altre barriere che al contribuiscono all'accumulo liposomi poveri includono una matrice extracellulare densa, vascolarizzazione impermeabili, e la pressione tessuto solido 12. Queste barriere sono legati in un spazio-temporalemodo, con il flusso di sangue anormale e l'elevata pressione del fluido interstiziale essere due fattori importanti che guidano il consegna iniziale e stravaso di nanoparticelle. Come precedentemente discusso, stabilire il rapporto tra la microcircolazione tumorale, elevata IFP, e l'accumulo intra-tumorale di liposomi è fondamentale per la corretta interpretazione dei dati di imaging liposomi. Qui metodi quantitativi per misurare il rapporto tra la microcircolazione tumorale, elevata IFP, e l'accumulo nanoparticelle in un tumore solido sono rappresentati. Questo si ottiene effettuando misurazioni co-localizzate della distribuzione intra-tumorale di un agente di contrasto liposomi CT utilizzando TC volumetrica, la microcircolazione del tumore utilizzando contrasto dinamico Enhanced Imaging tomografia computerizzata, e IFP tumore utilizzando un sistema di posizionamento dell'ago robotica guidata dalle immagini, chiamato il robot CT-IFP 13.

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Protocol

Tutti gli esperimenti in vivo sono stati eseguiti in un protocollo approvato dal Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa University Health Network.

1. Modello Animal

  1. Cultura tra i 5 a 7 x 10 6 MDA-MB-231 cellule di adenocarcinoma mammario tumorali in DMEM insieme con 10% siero fetale bovino (FBS) e 100x di diluizione della penicillina-streptomicina.
  2. Celle di raccolta quando sono 80% confluenti utilizzando una soluzione di tripsina-EDTA 0,05%. Dopo 3-5 min neutralizzare tripsina-EDTA con un volume 3x di DMEM. Prendete una un'aliquota 15 microlitri di cellule e contare con un emocitometro. Centrifugare le cellule in un pellet per 5 minuti a 200 xg, e risospendere in HBS ad una concentrazione di 10 x 10 6 cellule per ml.
  3. Implant sottocutanea (SC) tumori iniettando 1 a 2 x 10 6 cellule dell'arto posteriore di ogni 8 a 12 settimane di età topo femmina SCID (n = 5). Utilizzare un ago da 25 G standard per l'iniezione.
  4. Monitor tumor crescita usando pinze (Volume = 0,5 x lunghezza x larghezza 2) e avviare le misure una volta che i tumori SC hanno raggiunto un volume> 200 mm 3 (circa 7 a 9 giorni).

2. CT-liposomi preparazione e caratterizzazione

  1. liposomi Preparazione
    1. Sciogliere i componenti lipidici (200 mmol / L) per CT-liposomi, tra cui 1,2-dipalmitoil-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), il colesterolo (CH), e 1,2-distearoil-sn-glycero-3 -phosphoethanolamine-N-poli (glicole etilenico) (2000 DSPE-PEG2000) in etanolo anidro a 70 ° C in un rapporto molare di 55: 40: 5 DPPC: CH: DSPE-PEG2000.
    2. Evaporare etanolo mantenendo calore a 70 ° C, quindi aggiungere l'agente di contrasto iohexol CT (300 mg / ml di iodio) alla soluzione tale che la concentrazione di lipidi finale è di 100 mM.
    3. Mantenere la soluzione a 70 ° C per 4 ore con vortex frequenti.
    4. Per ottenere vescicole unilamellari, estrudere il campione 5 times attraverso due impilati 200 membrane con pori nm ad una pressione di 250 psi ed estrudere nuovamente 5 cicli attraverso due membrane impilate dimensione dei pori 80 nm a 400 psi utilizzando 10 ml di lipidi estrusore. Pipettare un volume di 10 ml di liposomi nell'estrusore all'inizio di ogni ciclo di estrusione e raccogliere in uno sterile conica tubo o fiala di vetro dopo ogni ciclo di estrusione.
    5. Rimuovere il ioexolo non-incapsulato con 16 ore di dialisi, con un peso molecolare di 100 kDa tagliato (MWC) sacchetto di dialisi contro un volume in eccesso di 250 volte di 0,02 soluzione mM HEPES-buffered saline (HBS, pH 7,4). Ad esempio, inserire 1 ml di soluzione di liposomi all'interno del sacchetto di dialisi con 250 ml di HBS fuori del sacchetto in un becher.
    6. Concentrato CT-liposomi che utilizzano un sistema di flusso nomico 750.000 MWC commerciale tangenziale in base alle istruzioni del produttore. Concentrato ad una concentrazione di iodio finale di circa 55 mg ml -1.
  2. liposomi Caratterizzazione
    1. Misurare l'efficienza di incapsulamento da rottura CT-liposomi con un volume in eccesso di 10 volte di etanolo per rilasciare il ioxehol e poi diluite con un volume in eccesso di 100 volte di acqua deionizzata (ossia 10 ml di liposomi rotti con 100 ml di etanolo e poi diluito ad un volume finale di 10 ml).
    2. Determinare la concentrazione ioexolo usando uno spettrometro UV con rilevamento ad una lunghezza d'onda di 245 nm. Calcolare l'efficienza incapsula prendendo la quantità rapporto tra agente ioexolo rilasciato alla quantità di agente aggiunto durante la preparazione.
    3. Misurare il potenziale zeta diametro e idrodinamico utilizzando un sistema analizzatore di dimensione delle particelle di dispersione della luce dinamica secondo le istruzioni del produttore. Diluire la soluzione CT-liposomi da 200x (cioè 5 ml di liposomi in 1 ml di volume finale) in acqua deionizzata per facilitare misurazioni.

3. CT Imaging di Tumor microcircolazione e CT-liposomiDistribuzione

NOTA: seguire le istruzioni del produttore per l'esecuzione di una scansione volumetrica se si usa la versione differente o le attrezzature del software.

  1. Anestetizzare ogni mouse utilizzando 2% isoflurano miscelato con aria o ossigeno medica e confermare pizzicando la punta e osservando alcuna reazione. Applicare una pomata per gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Immobilizzare animale in posizione prona con nastro adesivo zampe ad una scheda di plastica sottile.
  2. Posizionare un personalizzato 27 G catetere, collegato a 20 cm di tubi PE10, nella vena della coda laterale e fissare con diversi pezzi di nastro adesivo.
  3. Preparare una siringa da 1 ml a contenere almeno 200 ml di CT-liposomi. Preparare una siringa da 1 ml con soluzione salina da utilizzare per irrigare il catetere. Infine, preparare una siringa da 1 ml con almeno 150 ml di iohexolo libero mescolato con soluzione salina (9: 1 rapporto in volume).
  4. Posizionare il mouse prona sul piano dello scanner micro-CT. Utilizzare il sistema di posizionamento del laser per posizionare il Tumor approssimativamente nello stesso orientamento per ogni scansione.
  5. Posizionare la siringa CT-liposomi in una pompa a siringa e collegare il catetere alla siringa. Impostare la velocità della pompa di 10 ml al secondo.
  6. Inizializzare il sistema effettuando una scansione calibrazione chiaro-scuro utilizzando il software console scanner CT. Selezionare l'opzione di scansione chiaro-scuro per ogni protocollo di imaging di interesse, selezionare luminoso-scuro dal menu a discesa e premere il pulsante di scansione per avviare la calibrazione.
  7. Eseguire volumetrico anatomica micro-CT del tumore prima di qualsiasi iniezione mezzo di contrasto. Guardate l'indicatore software della console CT scanner per garantire la sicurezza CT scanner interblocchi sono state cancellate. Sulla console di scansione selezionare CT scanner selezionare una energia dei raggi X di 80 kV, una corrente tubo di 70 mA, e cattura 1.000 proiezioni di immagini nel corso del tempo 16 sec. Premere il pulsante di scansione per avviare la scansione.
  8. Utilizzare la pompa a siringa per iniettare un bolo di CT-liposomi ad una concentrazione di 400 kg di iodio mg-1. Impostare la pompa per iniettare un volume di circa 150 ml (assumendo 25 g del mouse). Premere il pulsante 'start' sulla pompa per iniettare. irrigare manualmente il catetere con 50 ml di soluzione fisiologica (il doppio del volume del catetere) per garantire la totalità agente è stato iniettato e il catetere è chiara.
  9. Attendere 10 min dopo l'iniezione di CT-liposomi e quindi eseguire una seconda scansione anatomica utilizzando lo stesso metodo e le impostazioni descritto al punto 3.5.
  10. Eseguire una scansione DCE-CT impostando la pompa a siringa per iniettare un volume di 100 microlitri della iohexol libera mescolato con soluzione salina (9: 1 rapporto in volume) utilizzando la stessa impostazione velocità di iniezione descritto in 3.3.
    1. Sulla console CT scanner selezionare la scansione dinamica 5 minuti che utilizza un ambiente di energia dei raggi X di 80 kV, un'energia tubo di 90mA, e cattura 416 proiezioni di immagini ogni secondo per i primi 30 secondi e seguito da un acquisto ogni 10 sec . Cattura 5 sec di dati DCE-CT e quindi premere il pulsante di avvio sul iniectiopompa n.
    2. Dopo la scansione DCE-CT eseguire una scansione anatomica micro-CT volumetrica.
  11. Cattura immagini anatomiche CT tra le 48 e 72 ore dopo l'iniezione di CT-liposomi, utilizzando le stesse impostazioni TC volumetriche come descritto nei passaggi 3.5.
  12. Ricostruire i dati anatomici CT e DCE-CT utilizzando il software GPU-ricostruzione.
    1. Caricare l'immagine nel software di ricostruzione. Selezionare la regione di interesse da ricostruire disegnando un ROI sull'immagine utilizzando un mouse. Impostare il percorso di salvataggio e il nome del file per il ricostruito ripreso e selezionare il tipo di file di output come '.mat'.
      NOTA: Il software imposta automaticamente la dimensione voxel ricostruito a 0,153 x 0,153 x 0,153 mm 3 per le scansioni anatomiche e 0,153 x 0,153 x 0,462 millimetri 3 per le scansioni DCE-CT. Fare clic sul pulsante 'avviare la ricostruzione'.
  13. Utilizzare la pre-iniezione e scansioni post-iniezione 10 min di CT-liposomi per calcolare lafrazione di volume del plasma come precedentemente descritto 3. Inoltre, utilizzare la pre-iniezione e 5 min scansioni post-iniezione di iohexolo per calcolare la frazione di volume interstiziale come precedentemente descritto 7.
  14. Ottenere intensità tempo curve (TIC) importando i dati DCE-CT in un software che fornisce la capacità di identificare una regione di interesse (ROI) all'interno del volume del tumore. Quindi calcolare il CT miglioramento medio nella ROI in funzione del tempo. In questo esperimento di software personalizzato è stato sviluppato per identificare un ROI e calcolare il TIC.
  15. Ottenere stime quantitative di perfusione e permeabilità vascolare montando TIC misurati utilizzando un modello cinetico due compartimenti tracciante. Montaggio può essere effettuata utilizzando il software di analisi DCE-CT e utilizzare le stime a priori della frazione di volume del plasma e frazioni di volume interstiziale come parametri fissi nel modello cinetico due compartimenti tracciante. Utilizzare i metodi riportati in precedenza per ottenere stime a priori del plasmauna e le frazioni di volume interstiziali 14.

4. Le misurazioni spaziali di tumore interstiziale pressione del fluido

  1. Per misurare IFP collegare l'ago spinale 25 G al trasduttore di pressione ed al sistema di acquisizione IFP attraverso 50 cm di PE20 tubo di polietilene. Lavare l'intero sistema con una soluzione di solfato di eparina / soluzione salina (1,10). Sterilizzare l'ago con il 70% isopropilico prima dell'uso.
  2. Accendere il sistema di acquisizione e avviare il software di acquisizione IFP e caricare i file delle impostazioni per calibrare il sistema di acquisire misurazioni IFP in mmHg. Fare clic sul pulsante acquisiscono per raccogliere continuamente dati di IFP.
  3. Effettuare misure IFP tra 48 e 72 ore dopo l'iniezione di CT-liposomi (questo corrisponde al tempo approssimativo di accumulo picco del CT-liposomi nel tumore), utilizzando i metodi descritti in 4.8. Attaccare l'ago IFP al robot CT-IFP.
  4. Eseguire scansioni di calibrazione per allineare i sistemi di coordinate peril robot CT-IFP e lo scanner CT. Aggiungere l'attaccamento marcatore fiduciali al robot CT-IFP ed eseguire una TAC volumetrica quattro con il marcatore fiducial in quattro posizioni diverse.
    1. Avviare il software di controllo del robot CT-IFP, inizializzare il robot, e spostare il robot per le tre posizioni inserendo i x, y, z mira posizioni e facendo clic sul pulsante 'go'.
    2. Prendere una TAC al seguente x, y, z coordinate: (1) 0,0,0; (2) -10,0,0; (3) 0,7,0; e (4) 0,0,10. Selezionare un 90 kV, 10 mA, 16 scansione sec utilizzando il software CT scanner e premere il tasto 'Start' per avviare la scansione. Ricostruire la scansione come descritto in 3.10.
  5. Avviare il software di allineamento del robot CT-IFP. Fare clic sul pulsante 'add' caricata nella regione 'Dati di Registrazione "e selezionare le quattro scansioni di registrazione ricostruiti ottenuti in 4.3, quindi fare clic su' aperto '.
    NOTA: La posizione dei pixel del marker fiduciali verrà automaticamente inserito nella softwari.
    1. Fare clic sul pulsante 'Calcola Transform' e fare clic sul pulsante 'Applica Transform'. Questo genera dati di allineamento che verrà utilizzato per convertire il sistema di coordinate del robot CT-IFP allo scanner CT sistema di coordinate. Dopo la calibrazione, collegare la piattaforma animali al robot CT-IFP.
  6. Anestetizzare ogni mouse utilizzando 2% isoflurano miscelato con aria o ossigeno medica e confermare pizzicando la punta e osservando alcuna reazione. Immobilizzare animale sulla piattaforma robotica CT-IFP e posizionare il mouse tale che il tumore è accessibile al sistema robotico CT-IFP. Immobilizzare il tumore con del nastro in modo tale che non si sposti durante l'inserimento dell'ago IFP.
  7. Eseguire una scansione di micro-CT anatomica prima di inserire l'ago IFP. Ricostruire i dati CT utilizzando la procedura descritta in 3.10.
  8. Caricare i dati inserimento CT pre-ago nel software di allineamento del robot CT-IFP. Regolare la finestra e livello per visualizzare il tumore. Clicca su °e orlo del tumore in qualsiasi immagine, quindi fare clic su una seconda posizione cerchio.
    NOTA: Il software calcola una serie di posizioni lungo una linea lineare tra le due posizioni. Nota la x, y, z coordinate per una serie di 5 a 8 punti distribuiti uniformemente dalla lista.
  9. Preparare il sistema IFP irrigando l'ago con soluzione salina eparina prima dell'inserimento.
  10. Inserire le prime posizioni dell'ago predeterminati in x, y, z, nel software di controllo del robot CT-IFP e premere-move per pulsante 'GO' per spostare il robot nella posizione desiderata. Fare clic sul pulsante 'Insert Ago' per inserire l'ago nel tessuto.
    1. Dopo aver inserito l'ago garantire una buona comunicazione fluida tra l'ago IFP e il tessuto pizzicando e rilasciando il tubo PE20, notando che la misura IFP aumenta e ritorna al valore di pre-pizzicare sul software di acquisizione IFP. Rifiuta le misure che non restituiscono al basale.
  11. acquisire unTAC anatomica con l'ago inserito, quindi fare clic sul pulsante 'ritirare l' ago 'sul software di controllo del robot CT-IFP per ritrarre l'ago dal tessuto. Rifiuta qualsiasi misurazione IFP in cui il valore di IFP non ritorna al valore di inserimento pre-ago dopo il ritiro dell'ago. Questo significa che l'ago può essere ostruito durante la misurazione. Ripetere i passaggi 4,8-4,10 per ogni posizione dell'ago.
  12. Determinare la posizione dell'ago all'interno del volume del tumore calcolando x, yez posizioni del porto dell'ago rispetto al centro di massa del volume del tumore, come identificato nel post-inserimento volumetrica CT scan dell'ago.
  13. Rientro animali per gabbia, dopo tutte le misurazioni sono state completate. Non lasciare gli animali incustoditi, e prendersi cura di osservare loro fino a quando la coscienza è stato ripreso e sono in grado di mantenere decubito sternale.

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Representative Results

Il protocollo di cui sopra dovrebbe produrre CT-liposomi con una concentrazione di incapsulato ioexolo, diametro medio liposomi, e il potenziale zeta di 55 mg ml -1, 91,8 ± 0,3 nm e -45,5 ± 2,5 mV, rispettivamente. Figura 1a comprende rappresentante di imaging DCE-CT i risultati, producendo una serie storica di dati volumetrici che mostrano i cambiamenti temporali in accumulo intra-tumorale di ioexolo. Selezione di una ROI all'interno del tumore produce un TIC che può essere quantificato utilizzando traccianti metodi di modellazione cinetici per ottenere stime di perfusione, permeabilità vascolare, frazione di volume del plasma, e frazione in volume interstiziale (Figura 1b). In questo studio, un modello cinetico due compartimenti tracciante è stato utilizzato e adatta alla misura TIC utilizzando una curva di routine montaggio non lineare implementato in Matlab 14. Segmentando il volume del tumore in più zone di interesse di pari dimensioni permette la quantificazione del tegli Distribuzione spaziale dei parametri emodinamici all'interno del volume del tumore (Figura 1c). Segmentazione può essere eseguita sia manualmente, che è tempo e difficile, o automaticamente interpretato qui utilizzando un algoritmo che divide il tumore in più ROI uguali dimensioni usando un sistema di coordinate sferiche. I metodi DCE-CT forniscono stime quantitative della distribuzione spaziale della perfusione, permeabilità vascolare, frazione di volume del plasma, e frazione di volume interstiziale. Questi parametri sono stati osservati essere spazialmente eterogenei con alti livelli di perfusione, plasma e frazioni di volume interstiziale lungo la periferia rispetto al volume tumorale centrale.

Il metodo di imaging CT volumetrico rivela la biodistribuzione e la distribuzione intra-tumorale di CT-liposomi. Figura 2a mostra la biodistribuzione del CT-liposomi a livello post-iniezione 48 ore. L'agente è ancora in circolazione in thsistema vascolare e con assorbimento sostanziale osservata nella milza e nel fegato. L'accumulo intra-tumorale di CT-liposomi è stata osservata essere eterogenea, con accumulo prevalentemente periferico rispetto al centro, come indicato dalle regioni luminose all'interno del volume del tumore (Figura 2b).

L'imaging volumetrico CT può essere utilizzato per tenere traccia della posizione delle misurazioni IFP effettuato utilizzando la configurazione del robot CT-IFP. Figura 3a mostra il posizionamento dell'ago IFP all'interno del volume del tumore, come ripreso utilizzando ad alta risoluzione di micro-CT. L'ago può chiaramente essere identificato all'interno del volume del tumore consentendo localizzazione spaziale delle misurazioni IFP all'interno del volume del tumore (Figura 3b). È possibile generare una mappa spaziale di IFP tutta tumore effettuando misurazioni multiple IFP all'interno del volume del tumore. La IFP spaziale può poi essere correlato con le corrispondenti misure dimicrocircolazione del tumore e l'accumulo CT-liposomi.

L'imaging volumetrico CT permette un quadro comune di riferimento che permette di co-localizzare le misure di emodinamica, IFP, e l'accumulo CT-liposomi. Figura 4 mostra un esempio di misure spazialmente co-localizzate di accumulo CT-liposomi, IFP, perfusione, permeabilità vascolare, frazione di volume del plasma, e frazione di volume interstiziale. È stato osservato che la perfusione e la frazione di volume del plasma era significativamente correlata con l'accumulo intra-tumorale di CT-liposomi in sottocutaneo MDA-MB-231 tumori. Inoltre, la distribuzione radiale della IFP correlata con le misure emodinamiche. Questi risultati suggeriscono esiste un complesso rapporto spazio-temporale tra la microcircolazione tumorale, IFP e l'accumulo intra-tumorale di liposomi 14.

Figura 1 Figura 1: DCE-CT Imaging del microcircolo tumorale (a) Una serie rappresentativa di immagini temporali TC raccolte all'interno del volume del tumore, raffiguranti la cinetica di contrasto come una funzione del tempo.. Il contorno rosso rappresenta un ROI in cui viene misurata la curva intensità tempo (TIC). (B) Il TIC è in forma utilizzando un tracciante modello cinetico due compartimenti per produrre stime quantitative dei parametri emodinamici all'interno del ROI. (C) distribuzione spaziale Rappresentante dei parametri emodinamici quantitativi nel tumore. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: volumetrico CT-Imaging di liposomi Attacco accumulatore zione. (a) Una immagine rappresentativa 3D volume-reso dimostrare la biodistribuzione del CT-liposomi. (B) assiali Rappresentante, coronale e sagittale fette prese attraverso il centro del tumore che mostra l'accumulo intra-tumorale di CT-liposomi a 48 ore dopo l'iniezione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3:. Image Guided IFP Misure (a) Una immagine volumetrica 3D rappresentativa del sistema robotizzato CT-IFP (verde) di inserimento post-ago in un tumore sottocutaneo a 48 ore dopo l'iniezione di CT-liposomi (arancione). (B) Una immagine rappresentativa CT dell'inserimento post-aghi./54226/54226fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4:. Co-localizzato Misure di tumore microcircolazione, IFP, e l'accumulo CT-liposomi pannello che mostra un rappresentante spaziale co-localizzazione di accumulazione preso post-iniezione, IFP, la perfusione, la permeabilità vascolare, frazione di volume del plasma 48 ore CT-liposomi e frazione di volume interstiziale. Re-stampa con il permesso di 14. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

I metodi di misurazione basato su immagini qui presentati consentono di determinare la distribuzione spaziale delle proprietà del tumore microcircolazione, IFP, e l'accumulo di CT-liposomi. I precedenti tentativi di mettere in relazione queste proprietà hanno fatto affidamento su come eseguire misurazioni di massa su più animali portatori di tumore e quindi manca la sensibilità per chiarire i meccanismi responsabili della eterogeneità accumulo intra-tumorale che è stato comunemente osservato per i sistemi di consegna di droga nano-dimensioni 15. DCE-CT fornisce uno strumento per misurare le variazioni intra-tumorale nelle proprietà del microcircolo tumorale, volumetrica CT fornisce una rappresentazione accurata di CT-liposomi cinetica di deposizione, e il sistema robotico CT-IFP fornisce uno strumento per eseguire la mappatura spaziale di IFP in lo stesso animale. Inoltre, l'imaging DCE-CT è un metodo clinico approvato per misurare l'emodinamica tumorali in ambito clinico, rendendo i risultati di questo studio transl potenzialmente clinicamenteun tavolo.

Data la complessità delle misurazioni, ci sono diversi fattori critici per assicurare la raccolta di serie di dati robusti. DCE-CT quantificazione basata del microcircolo tumorale è probabilmente la più difficile garantire stime accurate di emodinamica tumorali. Si richiede l'ottenimento di TIC con alto rapporto segnale rumore (SNR) e impiegando un robusto algoritmo di raccordo per quantificare gli IAT 16,17. ispezione visiva dei tic può essere usato per rimuovere dati a bassa SNR dall'analisi. Inoltre, se non si prendono precauzioni, allora il montaggio di alta SNR TIC può anche portare a stime errate di perfusione del tumore, la permeabilità vascolare, frazione di volume del plasma, e la frazione di volume interstiziale 16. Al fine di massimizzare la precisione quantificazione una strategia è stato impiegato per ottenere modello stime indipendenti delle frazioni di plasma e di volume interstiziale, che vengono successivamente utilizzati come parametri fissi durante l'adattamento del modello di tic misurati. Questo metodogarantisce stime robuste di perfusione del tumore e la permeabilità vascolare sono ottenuti 15.

analisi robusta della distribuzione intra-tumorale di CT-liposomi richiede l'esecuzione di TC volumetrica dopo accumulo sufficiente dell'agente. Da studi precedenti, l'accumulo del tumore picco del CT-liposomi si verifica tra 48 a 72 ore in xenotrapianti di topo 3,15. Inoltre esiste una relazione lineare tra la concentrazione di CT-liposomi e di contrasto in TC che consente semplice quantificazione delle variazioni di accumulo intra-tumorale di CT-liposomi 15.

misurazioni accurate della IFP con il metodo dell'ago basato richiedono una buona comunicazione di fluido tra il catetere e il tessuto. Inoltre, è importante solo tumori uso che hanno alta tumore IFP centrale (> 5 a 10 mmHg), altrimenti ci saranno variazioni spaziali minimi in IFP. misure spaziali di IFP utilizzando il CT-IFP robot systemcan essere difficile a causa del movimento del tessuto causata da inserzione dell'ago. Imaging pre e post-posizionamento dell'ago è fondamentale per identificare con precisione il posizionamento dell'ago; Tuttavia, può essere difficile mettere in relazione la posizione tra successivi posizionamenti dell'ago a causa di deformazioni tessuto tra le misurazioni. Si è constatato che la scelta in modo casuale posizioni dell'ago risultati in significativa deformazione dei tessuti durante l'inserimento dell'ago. Come risultato, questo metodo ha fornito il meno accurata mappatura spaziale di IFP. Al contrario, l'esecuzione di misurazioni lungo una pista lineare attraverso il volume del tumore e di inserire l'ago tangenziale alla pista in grado di migliorare la precisione spaziale delle misurazioni IFP. Inserimento dell'ago tangente alla traccia minimizza gli effetti di deformazione del tessuto lungo alla pista di misura.

Questo studio ha dimostrato la capacità di misurare la distribuzione spaziale del microcircolo tumorale, l'IFP e l'accumulo CT-liposomi in un singolo tumore. Dopo aver imparato queste tecniche, è quindi possibile eseguire queste misure indipendentemente o insieme per caratterizzare il microambiente tumorale e suoi effetti sulla somministrazione di farmaci. L'utilizzo di questi metodi nel modello di xenotrapianto seno MDA-MB-231 ha rivelato che la perfusione e la frazione di volume del plasma sono forti mediatori della distribuzione intra-tumorale di liposomi 14. Non ci è risultato essere una forte relazione tra l'IFP e la distribuzione liposomi. Tuttavia, l'IFP è stata fortemente correlata alle misure di perfusione del tumore, suggerendo che l'IFP può svolgere un ruolo indiretto nel mediare la distribuzione liposomi attraverso la modulazione del flusso sanguigno.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
MDA-MB-231 metastatic breast adenocarcinoma tumor cells  ATCC HTB-26
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)  Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F1051
HyClone Penicillin-Streptomycin 100x Solution GE Healthcare Life Sciences SV30010
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red ThermoFisher Scientific 25300-054
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) Avanti Lipids Inc., USA 850355P
Cholesterol (CH) Avanti Lipids Inc., USA 700000P
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-poly(ethylene glycol) 2000 (DSPE-PEG2000) Avanti Lipids Inc., USA 880128P
Omnipaque (Iohexol) 300 mg of iodine/ml  GE Healthcare, CA
80 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes Whatman Inc., USA
200 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes Whatman Inc., USA
10 m Lipex Extruder  Nothern Lipids Inc, CA
Dialysis Bag Molecular Weight Cut Off (MWCO) of 8 kDa Spectrum Labs, USA 
750,000 Nomical Molecular Weight Cut Off (NMWC) Tangential flow column  MidGee ultrafiltration cartridge, GE Healthcare, CA
Peristaltic pump  Watson Marlow Inc., USA
UV spectrometer Helios γ, Spectronic Unicam,  USA
90Plus particle size analyzer  Brookhaven, Holtsville, USA
eXplore Locus Ultra micro-CT system  GE Healthcare, CA Manipulated using CT-Console Software
AxRecon GPU-based Reconstruction  Acceleware Corp. CA
27 G Catheter SURFLO Winged Infusion Set Terumo Medical Products, USA SV*27EL
PE20 polyethylyne tubing Becton Dickinson, USA 427406
Pen tip 25 G × 3.5′′ Whitacre spinal needle  Becton Dickinson, USA 405140 IFP needle
P23XL  pressure transducer  Harvard Apparatus, CA P23XL
PowerLab 4/35, Bridge Amp, with LabChart Pro 7.0 ADInstruments Pty Ltd., USA PL3504, FE221 IFP acquisition system and acquisition software
CT-Sabre Small Animall Intervention system (CT-IFP Robot) Parallax Innovations, CA Manipulated using CT-IFP robot Control Software
CT-IFP robot alignment software Custom Matlab software
DCE-CT Analysis Software Custom Matlab software
Matlab 2013b Mathworks, USA

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References

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