전립선 암과 기타 노화 관련 병리 또는 대사 질환의 생물 물리학 트리거로 지하실 막 강성을 공부하는 방법

Cancer Research
 

Summary

여기에서 우리는 가교 및 당화 산물 (은 AGEs)에 의해 유도 된 기저막 (BM)의 증가 강성 병리학 적 관련성이있는 생물 물리학 적 미세 환경을 모델링하기위한 프로토콜을 설명합니다.

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Rodriguez-Teja, M., Breit, C., Clarke, M., Talar, K., Wang, K., Mohammad, M. A., Pickwell, S., Etchandy, G., Stasiuk, G. J., Sturge, J. How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases. J. Vis. Exp. (115), e54230, doi:10.3791/54230 (2016).

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Abstract

여기서 우리는 연령과 관련된 병리 및 대사성 질환 (예를 들면 암, 당뇨병, 미세 혈관 질환, 망막증, 신장 병증 및 신경 병증) 중에 증가 된 두께 및 기저막 (BM)의 강도에 관련된 생물 물리학 적 미세 환경을 연구하는데 사용될 수있는 프로토콜을 설명 . 모델의 전제는 메일 라드 반응 (Maillard reaction)을 통해 당화 최종 생성물 인 (AGE) 생성을 촉진하는 글리콜 알데히드 (GLA)로 처리하여 재구성 BM (RBM) 행렬의 비 효소 가교이다. AGE 생성 비 효소 적 가교 결합을 확인하는데 사용 GLA의 강성을 증가시킬 수 실험실 기술로서는 RBM이 설명되어 처리 하였다. 광도 분석 및 면역 형광 현미경, 소듐 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드에 의한 그것의 비 효소 가교의 AGE 함량 : 이러한 결정 용 (GLA 처리) 단단한 RBM (포스페이트 - 완충 염수, PBS 처리) 네이티브 RBM의 제조를 포함겔 전기 영동 (SDS 페이지)과 공 초점 현미경, 그 증가 된 강성 사용 유변학. 여기에 설명 된 절차는 병든 인간 전립선 조직에 비해 건강에 대한 측정과 일치 3.2 배까지 RBM의 강성 (탄성 계수, E)을 증가시키기 위해 사용될 수있다. 노화와 질병 전립선과 관련된 생물 물리학 적 미세 환경을 다시 만들려면 세 가지 전립선 세포 유형을 기본 RBM과 뻣뻣한 RBM에에 소개 된 글 랜드 : RWPE-1, 전립선 상피 세포 (농도 (PEC)) 정상 전립선에서 파생 된; BPH-1, 양성 전립선 비대증 (BPH)에 의해 영향을받는 전립선 유래의 농도 (PEC); 및 PC3 전이성 세포들은 전립선 암 유래 이차 골 종양으로부터 유래. 여러 매개 변수의 크기, 형상 및 강성 RBM 대 네이티브에 RWPE-1 BPH-1에 의해 형성된 3 차원 샘 꽈리의 침입 특성, 및 평균 셀 길이 이동성 속도 및 3D spher의 세포 이동의 지속성을 포함한 측정 할 수있다동일한 조건 하에서 PC3 세포에 의해 형성 된 OID. 경로 및 단백질의 세포 내 지역화 신​​호 셀도 평가 될 수있다.

Protocol

GLA 처리에 의한 BM 강성 1. 유도 (비 효소 가교)

  1. 4 ℃에서 배양하여 BM 매트릭스 (10 ㎖)의 냉동 병을 녹여 유리 병의 내용이 될 때까지 액체 (8-16 시간) (추운 방이나 냉장고에서 얼음에 서).
    주의 : 추운 방 / 냉장고를 사용하지 않는 경우, 얼음 전체 병을 커버합니다. 이는 고화 BM의 원액을 방지한다.
  2. 미래의 실험과 반복 동결 해동 사이클을 피하기 BM 행렬의 각각의 새로운 10 ㎖의 유리 병에서 25 X 0.4 ml의 분취 량을 준비하는. 제조업체가 표시된 유효 기간까지 -80 ° C에서 보관 유리 병. 필요한 경우, 2 시간 동안 얼음에 서 4 ° C에서 튜브를 해동.
  3. 얼음의 경우에도 표면을 준비합니다. 코팅 과정 동안 4 ℃의 온도를 유지하기 위해 얼음 위에 8 웰 챔버 슬라이드 유리를 배치했다. 4 ℃에서 BM 행렬의 병을 해동.
    주 : BM 행렬의 한 0.4 mL의 바이알 COA에 충분전체 1 × 8 잘 챔버 슬라이드에서 t. 응고에서 BM 행렬을 방지하기 위해 처리하는 동안 얼음에 덮여 유리 병을 유지합니다.
  4. 가위를 사용하여 200 μL 피펫 팁의 분배 단부를 잘라. 4 ° C에 무딘 종단 200 μL 피펫 팁을 냉각하고 200 μL 용량의 피펫 원조로에 배치합니다. 피펫 팁에 차가운 BM 매트릭스 용액 40 μl를 차지하며 냉장 8 잘 챔버 유리 슬라이드에 잘으로 전송합니다.
    주 : BM 용액 40 ㎕를 0.8 ㎠의 면적을 커버하기에 충분하다. BM 용액의 고화를 방지하기 위해 코팅 과정 동안 냉각 피펫 팁을 유지. BM 매트릭스 용액에 기포를 도입하고, 또한 균일 가장자리 가시 메 니스 커스의 형성없이 도포 보장하지 않는다.
  5. 필요한 우물과 챔버의 수에 따라 단계를 반복 1.4.
  6. 도포 후, 중합 반응을 촉진하기 위해 30 분 동안 37 ° C에서 8 웰 챔버 슬라이드를 배치BM의. 액체 RBM의 불필요한 방해를 피하기 위해 매우 조심스럽게 인큐베이터 문을 닫습니다. RBM 겔의 탈수를 방지하기 위해 30 분의 배양 시간을 초과하지 않는다.
    참고 얻어진 겔 네이티브 재구성 BM (RBM)이다. 37 ° C 배양 단계는 5 % CO 2를 필요로하지 않습니다. 그러나, 편의를 위해 37 ° C, 5 % (습윤)와 CO 2로 설정된 조직 배양 인큐베이터에서이 단계를 수행한다.
  7. 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.8)에 희석 된 50 밀리미터 글리콜 알데히드 (GLA)을 준비한다. 50 mL의 주사기를 이용하여 0.22 마이크론 실린 지 필터를 통과하여 용액을 소독.
    1. 50 mM의 GLA 250 μL의 최종 부피에서 가교 반응의 경우, 0.5 M 소듐 사이 아 노보로 하이드 라이드 또는 100 mM의 GLA (배 주) 125 ㎕의 0.2 M 인산 완충액 100 ㎕ (pH가 7.8-2.5 M 아미노 구아니딘의 25 μL를 추가 ). 50 mL의 주사기를 이용하여 0.22 마이크론 실린 지 필터를 통해 전달하여 원액을 소독.
      주의 : 흄 후드에서 작업하는 동안 실험실 코트, 장갑, 비 산물 또는 유해한 및 마스크를 착용하는 시아 노 수소화 붕소 나트륨을 처리합니다.
  8. 중합 RBM 젤을 커버하고 뻣뻣한 RBM 겔을 생산하는 반 강성 RBM 젤 또는 14 시간을 생산하는 6 시간 동안 37 ° C에서 부화 GLA 용액 250 μl를 추가합니다.
    주 : GLA의 용적이 중합 RBM 겔을 커버해야 첨가 따라 조정되어야한다. 다른 GLA 배양 시간을 사용하는 경우, 겔은 RBM (단계 2.4 참조) RBM 강성의 폴드 증가를 결정하기 위해 분석되어야한다.
    1. 37 ° C에서 14 시간 동안 멸균 인산염 완충액 (PBS) 250 ㎕를 네이티브 RBM 겔 배양하여 대조군을 준비한다.
    2. 50 mM의 나트륨 시아 노보로 하이드 라이드 250 밀리미터 아미노 구아니딘을 첨가하여, 가교 반응시 쉬프 염기 또는 아마 드리 부가 재배치의 형성이 억제되는 두 개의 추가 제어를 준비한다.
  9. 1 M 글리신 전자를 준비PBS에 희석로 메틸 에스터 (GEE). 50 mL의 주사기를 이용하여 0.22 마이크론 실린 지 필터를 통과하여 용액을 소독.
  10. 표시된 배양 시간 후에, 조심스럽게 가교 RBM 겔로부터 GLA 용액을 제거 제어 네이티브 RBM 겔로부터의 제어 RBM 겔 및 PBS에서 억제제 GLA를 함유하는 용액. RBM 젤의 모든 GEE 솔루션의 250 μl를 추가하고 1 시간 동안 37 ° C에서 품어.
    주의 :이 단계는 가교 반응을 소멸.
  11. GLA와 GEE의 모든 흔적을 제거하기 위해 500 μl의 PBS의 모든 RBM 겔 10 회 반복한다. 그들의 탈수를 방지하기 위해 PBS 400 ㎕를 37 ° C에서 하룻밤 RBM 젤을 품어.
    1. AGE 축적, 비 효소 가교 및 점탄성 특성 (단계 2.1-2.4)에 대한 RBM 젤을 분석합니다. 자신의 점탄성 특성의 레오 메트릭 분석을 위해 복제 반지의 RBM 젤 (2.4 단계) 준비합니다.
    2. 세포 배양를 들어, RBM 젤 500 μL 문화 2 번 씻어 내세포를 파종하기 전에 디아가 (5 단계와 6 단계). 겔 표면을 만져 피펫 팁없이 부드럽게 세척을 수행합니다.

비 효소 가교 및 RBM의 강성 2. 정량 GLA로 치료

  1. 광도 분석
    1. GLA 처리 AGE의 축적을 측정 메일 라드 반응의 정도를 결정하기 위해 광도 분석을 사용 RBM 겔을 제어한다.
      1. 단계 1.11 후, 8 웰 챔버 슬라이드에서 RBM 젤에서 PBS를 제거하고 250 μL 얼음처럼 차가운 증류수를 추가합니다. 매트릭스가 완전히 액화 될 수 있도록 16 ~ 24 시간 동안 4 ° C에서 품어.
        참고 :이 솔루션의 RBM 펩타이드 자동 형광 특성을 가진 나이가 들어 있습니다.
      2. 1.5 ㎖의 튜브에 액화 BM 용액을 옮기고, 분광 광도계 (여기 파장 = 370 nm의, 발광 파장 = 440 nm의)을 사용하여 용액의 형광 발광을 측정한다.
  2. 시안 브로마이드 펩티드의 SDS-PAGE 분석
    1. GLA 가교 및 매크로 섬유의 형성을 유도하는 것을 확인하기 위해 폴리 아크릴 아미드 겔에 GLA 처리 및 제어 RBM 겔 해결.
      1. 실온에서 5 분 동안 10,000 XG에서 단계 2.1.1.2 수집 액화 BM 용액을 원심 분리기.
      2. 2g / 아세토 니트릴로 희석 시아 노겐 브로마이드의 용액을 함유하는 스톡 용액을 제조 하였다.
        주의 : 실험실 코트, 장갑, 비 산물 또는 유해한 및 마스크를 착용하는 동안 항상 흄 후드에 브롬화 시안을 처리합니다.
      3. + 70 % v / V를 포름산 20 ㎎ / ㎖ 시안 브로마이드 500 μL에 뜨는, 다시 일시 중단 BM 젤 펠렛을 제거하고 RT에서 밤새 품어.
      4. 3.5 kDa의 차단 분자량 투석 카세트에 재현 탁 BM 겔 펠릿을 전송할 1 ml의 일회용 주사기를 사용한다.
      5. 증류수 500 ml의 자기 교반 막대를 함유하는 500 mL의 유리 비이커에 카세트를 담근다.자석 교반기에이를 놓고 시안 브로마이드와 포름산의 모든 흔적을 제거하기 위해 (차가운 방에서) 4 ° C에서 하룻밤 (16 시간)을 투석.
      6. 1.5 ML 튜브에 카세트에서 투석 BM 솔루션을 전송하기 위해 1 ml의 일회용 주사기를 사용합니다.
      7. 12 % v / V를 폴리 아크릴 아미드 겔 10, 11에 각각 BM 샘플의 25 μl를 분석한다. SDS-PAGE에 따라, 시아 노겐 브로마이드 매트릭스 펩티드 (13)의 전기 영동 패턴을 시각화하기 위해 폴리 아크릴 아미드 겔 (12)은 염색을 실시하고 있습니다.
  3. 면역 형광 현미경 분석
    1. GLA의 면역 염색 치료 수행하고 안티 에이지 / pentosidine, 안티 - 콜라겐 IV와 가교 RBM에 축적 연령과 콜라겐 IV / 라미닌 섬유 구조 재 배열을 시각화하는 공 초점 현미경으로 다음 항 라미닌 항체가 13 젤 RBM 젤을 제어 할 수 있습니다.
      참고 : 항상 enti를 커버하기에 충분한 볼륨을 사용피펫 팁과 RBM 표면을 만져없이 배양 및 세척시 RBM 젤 재. 면역에 의해 3D 꽈리 문화 분석의 자세한 내용은 참조 6 참조 및 3D 꽈리의 공 초점 현미경에 대한 참조 (14)을 참조하십시오.
      1. 워시 GLA는 PBS + 300 ㎕의 RT에서 5 분 동안 (PBS 0.1 mM의 CaCl2를 0.5 밀리미터의 MgCl 2를 함유)로 8 웰 챔버 슬라이드에서 2 시간 처리하고, 제어 RBM 젤.
      2. PBS를 +는 각 RBM 젤을 충당하기 위해 PBS + 희석 V 파라 포름 알데히드 (PFA) 승 / 4 %의 300 μl를 추가, 제거. RBM 컴포넌트를 수정, 실온에서 30 분 동안 인큐베이션.
      3. PFA 솔루션 V / 승 4 %를 제거합니다. 75 mM의 NH 4 CL + 0.5 밀리미터의 MgCl 2 용액 300 μl를 추가 추가하고 고정을 해소하기 위해 (배를 반복) RT에서 5 분 동안 품어.
      4. HPO 4, 3.5 밀리미터의 NaH 130 mM의 NaCl을, 7 밀리미터 나 2 : 멸균 물에 다음과 같은 솔루션을하여 면역 형광 버퍼 (완충 IF) 준비2 PO 4, 7.7 mM의 NaN의 3, 0.1 %의 v / w 소 혈청 알부민, 0.5 % v / V를 폴리에틸렌 글리콜 옥틸 페닐 에테르 0.05 % v / V를 폴리에틸렌 글리콜 소르 비탄 모노 라우 레이트.
      5. 보완하여 버퍼를 차단하는 경우 준비 IF 20 % v / V를 염소 혈청 버퍼입니다.
      6. 담금질 솔루션을 제거하고 RBM 젤에 버퍼를 차단하는 비특이적 인 반응을 방지하는 경우 300 μl를 추가합니다. 진탕 플랫폼에서 실온에서 2 시간을 품어.
      7. 는 IF 차단 버퍼를 제거하고 희석 차 항체의 300 μL와 4 ° C에서 16 시간의 RBM 젤을 품어 버퍼를 차단 IF (1 : 500 마우스 항 - pentosidine 단클론 항체, 1/250 토끼 항 - 콜라겐 IV의 PAB 1 / 250 토끼 항 라미닌의 A / C PAB).
        참고 : 이상 20 시간 동안 항온 4 °의 C에서 RBM을 liquidize 수 있습니다.
      8. 진탕 플랫폼에서 실온에서 IF 버퍼의 300 μl를 3 회 (10 분 각각) 차 항체를 제거하고 씻는다.
      9. 는 IF 버퍼를 제거하고버퍼를 차단하는 경우 500 : 1 희석 한 형광 색소와 결합 된 이차 항체의 300 μL (염소 항 - 토끼 또는 항 - 마우스 IgG [H + L]을)를 추가합니다. 진탕 플랫폼에서 실온에서 2 시간 동안 품어.
      10. 이차 항체를 제거하고 10 분 동안 실온에서 IF 버퍼 300 μL에서 배양한다. 는 IF 버퍼를 제거하고 실온에서 PBS + 300 ㎕의 3 × 10 분 세척 하였다.
      11. (단계 2.3.1.2 및 2.3.1.3) 전술 한 바와 같이, 수정 및 두번째 급랭.
      12. 설치 미디어에서 스테인드 RBM 젤을 마운트 및 epifluorescent 또는 공 초점 현미경을 사용하여 주요 구성 요소의 조밀 한 다발의 형성을 분석 할 수 있습니다.
        주 : 면역에 의해 3D 꽈리 문화 분석의 세부 사항 참조 6 참조 및 3D 꽈리의 epifluorescent 및 공 초점 현미경에 대한 참조 (14)을 참조하십시오.
  4. 유변학 적 분석
    1. GLA의 레오 메트릭 분석 처리를 수행하고 자신의 V를 측정하는 RBM 젤을 제어iscoelasticity (강성).
      1. 8mm의 직경 원형 금형 두께 1mm는 RBM 젤을 설정합니다. 이를 위해, 24 웰 배양 플레이트의 웰 안에 클로닝 고리 (8 mm 직경)을 배치하고 BM에게 1.3-1.6 단계에 기재된대로 제조 매트릭스 용액을 첨가.
        주 : 실험에 사용 된 RBM 겔 정확한 재현부 들면, 레오 메트릭 분석을 위해 제조 된 겔은 RBM 8 웰 챔버에서 설정 RBM 겔과 동일한 면적 및 두께를 가질 필요가있다. 그림 3에서 분석 RBM 젤은 두께 1mm 직경 8mm이었다.
      2. (단계 1.11-1.8) 전술 한 바와 같이 14 시간 동안 6 시간 동안 PBS, GLA와 GLA와 복제 링에서 설정 한 RBM 젤을 취급합니다.
      3. 고정 주파수 1Hz의의 진동 및 21 ° C의 온도에서 1 ~ 3 % 변형의 범위, 평행 판 형상을 톱니 모양의 8 mm의 레오 미터에 8 mm 직경 RBM 젤의 탄성 계수 (E)를 측정한다. 에 대한 더 자세한 정보는ECM 젤의 레오 메트릭 분석 참조 참조 13,15,16를 참조하십시오.
        주 : E '는 다음 식 E = 2 *를 이용하여 G 얻어진 전단 저장 탄성율 (G)'으로부터 결정된다 * (1 + v)를 참조하여 13, 15에 기재된 바와 같이 V는 0.5의 포아송 비이고 16.

3. 문화 일반 PEC 라인의 처리, RWPE-1

  1. 성장 RWPE-15 ng / ml의 상피 세포 성장 인자 (EGF)와 보충 각질 세포의 무 혈청 배지에서 세포 (KSFM)를 50㎍ / ml의 소 뇌하수체 추출물 (BPE), 50 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 50 U가 / ㎖ 페니실린 ( ) KSFM를 완료합니다.
    참고 : 상피 - 투 - 중간 엽의 유도를 방지하기 위해 (EMT) -like 전환은 혈청에 RWPE-1 세포에 노출시키지 마십시오. 전체 KSFM 4 ° C에서 저장 영역에서 제거한 후 30 분 동안 RT에 도달이는 EGF 및 BPE을 비활성화하는 바와 같이 37 ° C의 물을 욕조에 따뜻한하지 않습니다 수 있습니다.
  2. 전체를 대기음RWPE-1 세포의 합류 10cm 2 판에서 KSFM은 미리 예열 PBS 5 ㎖로 씻어 모든 셀이 솔루션을 적용하는 것을 보장 5 ml의 0.05 %의 v / V를 트립신을 추가합니다.
    1. 5 ~ 10 분 동안 37 ° C, 5 % CO 2 (가습 포함)의 표준 상태로 설정 조직 문화 인큐베이터에서 세포를 놓습니다. 5 분 후 트립신의 범위를 확인하고 부드럽게 세포를 분리 할 수​​있는 문화 판을 누릅니다.
      주 : 동시에 두 개 이상의 판을 처리하지 의뢰되도록 RWPE-1 세포를 트립신 장시간을 용납하지 않는다. 이 클론의 선택을 회피하도록 판의 모든 세포를 해리하는 것도 중요하다.
  3. 모든 RWPE-1 세포가 해리되면 트립신을 종결 2 % V / V 소 태아 혈청 (FCS)을 함유하는 따뜻한 PBS 5 mL를 추가한다. 조심스럽게 원심 분리기 튜브에 세포를 전송하기 전에 세포 집합체를 깨고 아래로 피펫합니다.
  4. X 125-150에서 해리 세포를 원심 분리기25 ° C에서 5 분 동안 g는, 상층 액을 제거하고 단일 세포 현탁액을 수득 될 때까지 완전한 KSFM 5 ml의 세포 펠렛을 다시 일시.
  5. 전송 한 새로운 튜브에 다시 정지 세포 ml의 1에 세포를 전파 완전한 KSFM 9 ml에 추가 후속 실험적인 사용을위한 5 유로 희석. 꽈리를 설정하는 혈구 세포를 이용하여 나머지를 계산 (섹션 5.1 참조).
    참고 : 문화의 후 장기간 이후 10 개 이상의 구절에 대한 안 문화 RWPE-1 세포들이 올바른 구조와 꽈리를 형성하지 않습니다.
  6. 배양 배지에게 EGF 및 BPE가 활성 상태로 유지하도록 최선 48 시간을 변경합니다.
    참고 : 48 시간 이상으로 연장하는 치료에 대해이 매체 변화를 포함합니다.

4. 문화와 BPH 세포주의 처리, BPH-1

  1. RPMI의 문화 BPH-1 세포는 1640 미디어는 50 U / ㎖ 페니실린 및 50 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 5 % v / v의 FCS와 보완. 따뜻한문화 미디어, PBS와 w 0.25 % / V 사용하기 전에 37 ° C에 트립신 0.53 M EDTA 솔루션입니다.
    참고 : 세포는 2.5 % v / V를 FCS 8 미디어에서 배양 할 수있다.
  2. BPH-1 세포 융합 10cm 2 플레이트로부터 배지를 흡인하고 트립신 반응을 종결 할 수있다 혈청 배지의 모든 흔적을 제거하기 위해 PBS 3 ㎖로 세포를 2 × 씻는다.
  3. PBS를 흡인하고, 세포를 포함하는 트립신 EDTA 용액 3ml를 추가한다. 5 분 동안 37 ° C와 (가습)와 5 % CO 2로 설정 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. 세포가 둥근하지만 접시에 부착 된 상태를 유지하면 트립신 EDTA 용액을 제거합니다. PBS 5 ㎖로 세포를 씻으십시오.
  4. PBS를 제거한 후, 단일 세포 현탁액을 생성하기 위해 아래로 배지 5 ㎖를 추가하고 부드럽게 피펫. 15 ML 튜브에 세포를 전송합니다.
  5. 완전한 미디어 8 ml의 새로운 원심 분리 튜브에 세포 현탁액 2 ㎖를 타고 BPH-1 세포 플레이트 ONT이후 실험적인 사용을위한 5 유로 희석 : 1에서 OA 10cm 2 배양 플레이트. 꽈리를 설정하는 혈구 세포를 이용하여 나머지를 계산 (섹션 5.2 참조).
    참고 : 적절한 아키텍처와 꽈리를 형성하지 않는 이전 BPH-1 세포로, 통로 번호를 기록해 두십시오. 구절 번호 10 개 이상은 바람직하지 않다.
  6. 문화 매체마다 72 시간을 변경합니다.

기본 및 뻣뻣한 RBM에 전립선 꽈리 5. 3D 문화

  1. RWPE-1 세포, 꽈리 형성 완료 KSFM 300 μL의 단계 3.5에서 제조 한 5,000 세포를 희석하여 사용되는 경우 BM 용액의 2 % V / V를 보충.
  2. BPH-1 세포, 꽈리 BM을 형성하는 용액의 2 % V / V를 보충 된 RPMI 1640 배지 300 ㎕를 단계 45에서 제조 한 2,500 세포를 희석하여 사용되는 경우.
    참고 : BPH-1 세포가 막 다른 6 일 후에 꽈리 비슷한 분포를 얻기 위해 사용된다 BPH-1 세포의 매우 낮은 번호 RWPE-1 세포보다 큰사실.
  3. 조심스럽게 37 ° C, 5 % CO 2로 설정 인큐베이터에 문화를 배치 조심스럽게 네이티브 및 AGE-보강 RBM에 세포를 씨앗과 (가습과) 잘 및 각 세포 분열이 성장 꽈리의 고른 분포를 보장하기 위해 하나 acina를 생성한다.
  4. 2 일마다 세포는 성장 인자가 정상 acina 필요했는지 확인하기 위해 2 % V / V의 BM 솔루션을 포함하는 신선한 배지와 배양 배지를 교체 항상성.
  5. 시야 현미경 (13)를 사용하여 성장 문화에서 선포 형태를 모니터링합니다.
    참고 : 문화 3 일 후 각각의 세포는> 3 세포의 클러스터를 형성하고 ~의 직경 일주 전립선의 꽈리 후 50 μm의 관찰됩니다.
  6. 세포 - 매트릭스 유착, 세포 - 세포 유착, apico - 기초 극성 침입 (13)의 마커에 특이적인 항체를 사용하여 면역을 수행하기 위해 2.3에 설명 된 프로토콜을 따르십시오.

기본 및 뻣뻣한 RBM 6. 3D 문화 전립선의 종양 세포 집합체

  1. 50 μg의가 / ㎖ 스트렙토 마이신과 10 % V / V의 FCS 50 U / ㎖ 페니실린을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 배양 PC3 세포. 사용하기 전에 37 ° C로 문화 미디어, PBS와 w 0.25 % / V 트립신 0.53 M EDTA 솔루션을 따뜻하게.
  2. PC3 세포의 융합 성이 10cm 배양 접시에서 배양 배지를 흡인하고, 세포를 트립신에 반응을 종결 할 수 FCS의 흔적을 제거하기 위해 PBS 3 ㎖로 2 배 씻는다.
  3. PBS를 흡인하고, 세포를 포함하고 1 분 동안 배양 트립신 EDTA 용액 3ml를 추가한다.
  4. 세포는 둥근 될,하지만 조심스럽게 트립신 - EDTA 솔루션을 기음과 PBS의 3 ㎖에 씻어 접시에 부착 남아있는 경우트립신의 모든 흔적을 제거합니다.
  5. PBS를 제거한 후, 단일 세포 현탁액을 생성하기 위해 아래로 배지 5 ㎖를 추가하고 부드럽게 피펫. 15 ML 튜브에 세포를 전송합니다.
  6. 새로운 원심 분리기 튜브에 PC3 세포 현탁액 1 mL를 취하여 배양 배지 9 ml에 추가 할 수 있습니다. 이후 실험적인 사용을 위해 10cm 2 배양 접시 (1시 10분 희석)에 세포를 플레이트. 혈구를 사용하여 잔여 세포를 카운트.
  7. 배양의 구배 겔의 형성을 허용하도록 BM 용액의 2 % V / V를 보충 된 RPMI 1640 배지 300 ㎕의 단계 6.6에서 제조 한 2500 PC3 세포를 희석.
  8. 부드럽게 네이티브 및 AGE-보강 RBM에 세포를 시드 조심스럽게 잘에서 타원체를 성장도 분배를 보장하기 위해 37 ° C와 (가습)와 5 % CO 2로 설정 인큐베이터에 문화를 배치합니다.
  9. 문화 매체마다 72 시간을 변경합니다.
  10. 뻣뻣한 (AGE 리치) RBM의 효과를 연구하려면전립선 종양 세포 이동, 온도 / CO 2 제어 및 가습 실 (17)을 사용하여 시야 비디오 시간 경과 현미경을 사용하여 이미지 PC3 세포에.
    참고 : PC3 세포가 기본 RBM에 가닥 성장과 루멘과 꽈리를 형성하지 않지만, 기본 RBM에 이상이 72 시간 성장을 떠나는 경우가 3 차원 회전 타원체를 형성 할 것이다.
  11. 데이터 수집 후, 수동 PC3 세포를 추적하고 그 이동 속도, 형상 (신장율) 및 마이그레이션 17-19 지속성을 계산한다.
    참고 : 지속성 = 비 D / T, D = 거리 처음부터 셀 궤도, 세포 궤도의 T = 전체 길이의 끝.

Representative Results

뻣뻣한 RBM에 3D 전립선 선포 세포 배양

문화 6 일 후, 농도 (PEC)이 정상 전립선 조직에서 파생 된 (RWPE-1) (그림 1A)와 BPH 조직 (BPH-1) 상피의 균일 한 회전 타원체로 구성됩니다 (그림 1B) 기본 (PBS 치료) RBM에 양식 꽈리 세포. 이 꽈리는 극성 - 기초 - 정점 및 가시 내강 공간 13, 20 고도로 조직 된 페치 특성을 가지고있다.

정상 전립선 조직에서 파생 된 농도 (PEC)에 의해 형성된 꽈리 (RWPE-1) (그림 1A) 및 (GLA 처리) 보강 (AGE 리치) RBM에 BPH 조직 (BPH-1) (그림 1B)를 중단 구조를 가지고 (이동 모양과 세포의 다각형에 구상에서) 나이가 풍부한 RBM) (그림 1A로 선포 세포에서 이주 / 돌출. 이들 꽈리 또한 작거나 존재하지 않는 공간 (13) 내강 그들의 정점 간 기저 극성을 잃었다 고 무질서 농도 (PEC)을 특징으로한다.

그림 1
그림 1 :. 기본 및 뻣뻣한 재구성 지하 막 (RBM)에 3D 샘 꽈리로 자란 전립선 상피 세포 (A) RWPE-1 세포의 브라이트 이미지는 PBS (기본) 또는 처리 RBM 젤 6 일 12 시간까지 재배 14 시간 (; 뻣뻣한 AGE 리치) 50 MM의 글리콜 알데히드; 스케일 바는 50 μm의 =. 패널 (A)에 기재된 바와 같이 재배 (B) BPH-1 세포; 스케일 바는 50 μm의 =; 데이터는 3 독립적 인 실험의 대표입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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표 1. 기본, 세미 뻣뻣한과 까다로운 재구성 지하 막 (RBM)에 재배 전립선 상피 RWPE-1 꽈리의 특성 RWPE-1 꽈리 GLA (RBM 14 시간 (기본), 글리콜 알데히드 PBS로 전처리 성장했다 ) 6 시간 동안 (반 강성) 또는 14 시간 (딱딱한)에 대한 GLA. 선포 모양의 경우, 백분율 (%)은 라운드의 표준 편차 (SD)를 ±, 반 다각형과 다각형 꽈리는 (50 꽈리는 조건에 따라 정량) 5 독립적 인 실험에서 계산 하였다. 상대 선포 크기는 세 독립적 인 실험에서 (기본 RBM = 100 %)을 산출 하였다. 침입 들어, 하나 이상의 돌출 세포 SD 된 꽈리 % ± 3 독립적 인 실험으로부터 계산 하였다. 배 변화 기본 조건에 대응하는 값에 의해, 반 강성 또는 강성 조건에서 얻어진 평균값으로 나누어 계산한다. P 값은 스튜던트 t 검정 (α = 0.05)을 사용하여 계산 하였다.

ontent "FO : 유지-together.within 페이지 ="1 "> AGE 따라 증가 RBM 강성은 PC3 전립선 종양 세포의 이동을 촉진

PC3 세포는 나이가 풍부한 (딱딱한)에 성장하는 반면 기본 RBM 성장 PC3 세포는 서로 (그림 2A)에서 독립적으로 연속 세포 - 세포 접촉을 유지하여 RBM 움직임을 마이그레이션 할 수 있습니다. 문화 PC3 세포에 72 시간은 기본에 초점 (타원체)를 형성 한 후 회전 타원체에서하지 않고 독립적으로 (그림 2B)를 마이그레이션 강성 (AGE 리치) RBM에 PC3 세포 반면, RBM을 (PBS 치료). 뻣뻣한 (AGE 리치) RBM에 PC3 세포는 기본 RBM (그림 2C)에 성장 PC3 세포보다 더 긴합니다. 뻣뻣한 RBM에 PC3 세포는 기본 RBM (그림 2D)에 성장 PC3 세포보다 더 빠르게 이동한다. 뻣뻣한 RBM에 PC3 세포는 네이티브 RBM (도 2e) 상에 성장 PC3 세포에 비해 지속성의 저하를 표시.

"그림 그림 2 :. 기본 및 뻣뻣한 재구성 지하 막 (RBM)에 전립선 종양 세포 마이그레이션 (A) 14 시간 동안 PBS (기본) 또는 50 밀리미터 글리콜 알데히드로 처리 RBM 젤에 성장 PC3 세포의 브라이트 이미지 (AGE-풍부하고 뻣뻣한) . 세포를 명 시야 현미경 (10X 대물 렌즈) 및 궤도를 생성하는 트래킹 셀 다음 12 시간 동안 시간 당 1 화상의 취득 속도를 사용하여 영상화되었다. 도시 된 이미지는 0, 3, 6, 9 및 12 시간 이후의 시점에 대응한다. 단일 세포의 궤도는 12 시간 시점에 대해 표시됩니다. 스케일 바 = 100 μm의. 패널 (A)에 기재된 바와 같이 (B) PC3 세포는 72 시간 동안 천연 또는 뻣뻣한 RBM상에서 배양하고, 묘화. 스케일 바 = 100 μm의. 세부 배의 배율에서 선택한 영역을 보여줍니다. (C) 평균 ± SD 셀 길이 (μm의); 기본 RBM과 뻣뻣한 RBM 사이에 유의 한 차이 (p = 1.2 × 10 -23). ( (E) 평균 ± SD 지속성 (비 D / T, 여기서 D = 처음부터 셀 궤도, 세포 궤도의 T는 = 총 길이의 끝 부분까지의 거리) 기본 RBM과 뻣뻣한 RBM (P = 0.0007) 사이에 유의 한 차이. CE> 10 세포를 분석 하였다 패널의 경우, 데이터가 3 독립적 인 실험의 대표입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

순수 RBM 젤 6 MEC의에서 3D 선의 선포 세포의 생성을위한 프로토콜은 내가 RBM 행렬에 콜라겐 4 ㎎ / ㎖ 유형의 추가에 의해 이전의 연구에서 수정되었습니다. 콜라겐의 첨가는 1,589 ± 380 ± 175 파스칼 (37)로부터 증가 RBM 겔 탄성률 결과. 강성이 9.1 배 증가 MEC의 (21)의 성장, 생존, 마이그레이션 및 차별화를 변조. - (-) - RBM 겔에 첨가 한 타입 I 콜라겐의 비 효소 적 가교 결합을 촉진하기 리보스 프로토콜은 D와 처리 공정을 포함하여 다시 변경되었다. 강성의 결과로 15 배 증가 그들의 침략 행위 (22)을 촉진하기 위해 MEC의의 종양 변화와 협력 밝혀졌다. I가 RBM 겔 콜라겐 추가 유형의 실험 방법에만 기질 간의 물리적 배리어 후 인체 조직에서 발생하는 콜라겐 섬유와 MEC의 직접적인 상호 작용을 용이상기 BM에 의해 제공 상피 단백질 가수 분해를 거친다. 순수 RBM 젤 GLA로 사전 처리의 농도 (PEC)에서 3D 선의 선포 세포를 생성하여, 현재의 프로토콜은 BM 강성 자체가 자신의 침략 행위 (그림 3)을 실행할 수있는 방법을 연구하는 방법을 엽니 다. 이 프로토콜에 의한 BM 강성의 수준은 생리 학적 관련성을 가지고있다. 6 시간, 14 시간 동안 50 mM의 GLA와 배양은 각각 PBS (표 1)로 처리 RBM 젤 122 ± 55 파스칼에 비해 175 ± 90, 322 ± 160 순수 RBM 젤의 탄성 계수 증가했다. RBM의 강성이 1.7-3.2 배 증가는 정상 전립선 또는 BPH 조직 23-26에 비해 악성 관찰 강성에서 2.5로 3.4 배 증가 되풀이되었습니다. 최근 책에서 PEC 꽈리의 나이와 RBM 강성의 축적에 의해 유발 13 형태 학적 변화를 설명 된대로 아칸소에서 통계적으로 유의 한 변화에 대한 정량화 할 수있다다각형 모양에 ounded, 내강 / 총 선포 영역 및 AGE 풍부한 RBM (그림 3)에 acina에서 이주 돌출 세포를 감소. 면역 또한 EMT의 마커를 평가하기 위해 상기 수축 거동 (예 인산화 미오신 경쇄 -2 pMLC2 13) 강성 RBM 대 정상 성장 농도 (PEC)에서 (도 3) (E-cadherin의 (13)의 소멸)을 사용할 수있다. 130 : 및 GM130 초기 엔도 좀 항원 1 : 면역 염색 및 공 초점 현미경을 사용하여 추가 평가 (예를 들어, 라미닌, 콜라겐 IV와 AGE 축적 13), 휴대 혀끝 - 투 - 기초 극성 (예를 들어 정점 EEA1의 현지화 BM을 시각화에 적용 할 수 kDa의 시스 - 골지 마커 13)과 접착 분자의 세포 패턴 (세포 - 세포 접합 (13)에 예를 들어, E-cadherin의 현지화) (그림 3).

"그림 그림 3 :. 여기에 제시된 다른 프로토콜의 개요도 (준비 글리콜 알데히드 (메일 라드 반응)으로 재구성 기저막 (RBM), 뻣뻣한 RBM에게 세포를 시드하는 방법, 뻣뻣한 RBM을 분석을 단단하게하는 방법을 보여줍니다 메일 라드 반응) 및 AGE 풍부한 RBM에 의해 유도 된 세포 및 분자 변화를 분석 할 수있는 절차 정도. AGE, 당화 산물; BM, 기저막; DAPI, 4 ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌; EEA1, 초기 엔도 좀 항원 (1); GAPDH, 글리 세르 알데히드 -3- 포스페이트 데히드로게나; GLA, 글리콜 알데히드; GEE 글리신 에틸 에스테르; GM130, 130 kDa의 시스 - 골지 마커; P-MLC2 (Thr18 / Ser19), 미오신 경쇄-이 사이트에서 인산화 (18)과 세린 (19) 트레오닌; RBM, 재구성 기저막; SDS-PAGE 나트륨 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동. RWPE1 꽈리 스케일 바 = 10 μm의; PC3 종양 전지용타원체 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림은 참조 (13)에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

- (-) - 리보스 RBM위한 가교제로서 선택되는 D가 표시된 경우 단계가 필요할 것이다. (- -) - 72 시간 동안 리보오스, 이전에 RBM / 콜라겐 젤 (22)에 기재 한 바와 같이, RBM 젤의 탈수 및 수축의 결과 프로토콜 개발 과정은 1 M의 D와 치료를 한 것으로 나타났습니다. - (-) - D의 낮은 농도의 평가 리보스 짧은 치료 시간은 이러한 한계를 극복하는 데 도움이된다.

RBM 강성의 높은 수준이 요구되는 경우, 프로토콜의 미래의 애플리케이션에 제한 전위가 발생 될 수있다. 긴 배양 시간 및 GLA의 높은 농도가 RBM 겔 강성의 높은 수준을 유도하기 위해 사용되는 경우가 필요할 것이다 이러한 처리 조건은 세포 생존 및 증식에 영향을 줄 수 있는지 여부를 미리 13 바와 같이 평가한다. 또한 혈청 RWPE-1 세포의 배양은 피해야 혈청 또는 혈청 - 함유 물질에 대한 표현형 EMT 같은 전이 노광을 유도함을 유의해야한다. 실험 짧은 RNA (siRNA의) 뉴클레오티드 간섭의 형질 전환을 포함하는 경우, 예를 들어, 절차는 낮은 혈청 형질 감염 배지로 세포를 전환하지 않고, KSFM 성장 RWPE-1 세포를 이용하여 최적화되어야한다. 일과성의 siRNA를 사용하는 모델에 접근 할 때 유전자 수준을 손상시킬 수있는 단점이 달성의 음소거. 일부 단백질 표적을 위해 그것은 조정 가능한 유전자 침묵과 단백질 수준에서 원하는 감소를위한 유도의 shRNA 벡터를 사용하는 것이 좋습니다 것입니다. 간질 세포 또는 종양 세포 관련 리실 산화 효소 (LOX) (17)에 의해 효소 가교를 통합 적응은 미래 모델에 통합 될 수있다.

jove_content은 ">이 프로토콜은 프로 침습적 농도 (PEC)에 AGE 의존 BM 강성에 의해 트리거 메커니즘 (RWPE-1, BPH-1) 및 침입 PTCS (PC3)에 반 전이 대상의 평가의 미래 연구를 촉진 할 것이다. BPH 점을 감안 대사 장애 (27)로 간주됩니다,이 프로토콜은 또한 신진 대사 장애 및 증가 된 전립선 암 위험 사이의 링크의 우리의 개선 된 이해를 향해 길을 불법 체류자.은 AGEs에의 노출에 의해 유도 된 BM 강성이 다른 암에 침입하기위한 트리거가 될 수 있음을 감안할 때 유형은, 다른 기관 (예를 들어 유방, 결장, 난소, 췌장)에서 정상 상피 세포와 종양 세포를 포함 유사한 모델을 설정 프로토콜을 사용하여 관심을 가질 것이다.

함께 그들의 타이밍과 프로토콜 내에서 중요한 단계는도 4에 요약되어있다. 초기 단계에서는 그것의 POL 방지 해동하면서 4 ° C에서 RBM의 원액을 유지하는 것이 필수적이다ymerization. 그들은 4 ° C로 냉각 될 때까지 피펫 팁은 RM은 원액에 배치 할 수 없습니다. 다음 단계는 그들이 RBM 용액 코팅 전에 상기 챔버 슬라이드는 4 ℃에 평형화 보장하기 위하여 중요하다. 즉시 RBM 용액의 온도는 39 ° C의 이상 증가로는 겔을 형성하기 위해 비가역 중합을 거칠 것이다. 이는 필수적인 RBM은 짝수 세포 배양 및 현미경 분석에 적합한 표면을 형성하도록 중합 단계 동안 방해되지 않도록. 또는 메일 라드 반응 (시아 노 수소화 붕소 나트륨과 amingoguanidine)의 억제제없이 GLA와 인큐베이션 기간은 RBM 겔 방법 뻣뻣하게 결정할 것이다. 뻣뻣한 조건 (표 1) 필요한 경우는 반 강성 조건이 필요한 경우 GLA와 함께 6 시간 배양를 사용하는 것이 좋습니다, 14 시간 배양한다. GLA의 다른 배양 시간 또는 상이한 농도 수준 경우 사용될 수있다강성 요구된다. RBM 겔이 경우 유동 학적 분석에서 필수적인 단계로 통합 될 필요가있다. GEE 함께 배양하고 PBS로 후속 세척 단계에 의해 메일 라드 반응을 급냉하는 단계에 이어, RBM 겔 바로 사용되거나 종래의 세포 배양을위한 그들의 용도에 최대 48 시간 동안 4 ℃에서 보관. 세포 배양이 설정된 후에는 이틀 (모든 치료 포함) 배지를 변경하는 것이 중요하다. 조사중인 파라미터에 따라 3~12일 대한 3 차원 세포 배양 물을 유지하도록 권장한다. 3D를 들어 PEC는 6 일 후에 문화를 분석하는 것이 좋습니다 및 3D PTC는 첫 번째 인스턴스에서 배양 3 일 후 권장 분석을 회전 타원체위한 것입니다 꽈리.

그림 4
그림 4 :. 중요한 단계 및 타이밍과 프로토콜의 간단한 개요 표기됩니다 플로w도 준비하고 표시된 중요한 단계 및 타이밍과 글리콜 알데히드 (메일 라드 반응)으로 재구성 기저막 (RBM)를 단단하게하는 방법을 보여줍니다. 프로토콜이 중단 될 수 있고, RBM 겔 저장 지점도 표시된다. RBM, 재구성 기저막; GLA, 글리콜 알데히드; GEE 글리신 에틸 에스테르; ON, 밤새; PBS, 인산염 완충 염수; RT, 실내 온도가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
I - Material for monolayer culture
BPH-1 CaP Cell Line Database PCaCL-132 Contact: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu
Complete keratinocyte serum-free media  ThermoFisher Scientific 17005-075 Do not warm at 37 ºC before use
Fetal calf serum  First Link UK Ltd 02-00-850 Store at -20 ºC in aliquots
PC3  American Type Culture Collection CRL-1435
Penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15070-063
Phosphate Buffer Saline (Dulbecco A) tablets Oxoid BR0014G
RPMI 1640 medium  Sigma-Aldrich R5886 warm in 37 ºC water bath before use
RWPE-1  American Type Culture Collection CRL-11609
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T4049
Name Company Catalog Number Comments
II - Material for 3D culture
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004
Aminoguanidine hydrochloride Sigma-Aldrich 396494 Irritating to eyes, respiratory system and skin
Chamber slides, 8-well  Thermo Scientific Nunc Lab-Tek TKT-210-816M
Culture Matrix reconstituted basement membrane (rBM) reduced growth factor extract  AMS Biotechnology 3445-005-01 Store Basement membrane (BM) at -80 ºC in aliquots
Cyanogen bromide  Sigma-Aldrich C91492 Toxic by contact skin and inhalation
Formic acid Sigma-Aldrich 695076
Glycine ethyl ester hydrochloride (GEE) Sigma-Aldrich 50060 Irritating to eyes
Glycolaldehyde dimer (GLA) Sigma-Aldrich G6805
Sodium cyanoborohydride  Sigma-Aldrich 71435 Highly flammable; Toxic by contact skin and inhalation
Syringe filter 0.22 microns Appleton Woods BC680
Name Company Catalog Number Comments
III - Material to quantify Maillard reaction
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ThemoFisher Scientific D3571 light sensitive and store at -20 ºC in aliquots
Cloning cylinders Sigma-Aldrich C1059
Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate ThemoFisher Scientific A-11001 light sensitive
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate ThemoFisher Scientific A-11034 light sensitive
Goat serum Abcam ab7481 Store at -20 ºC in aliquots
Vectashield mounting media  Vector Laboratories H-1000
Mouse anti-pentosidine clone PEN-12 mAb TransGenic Inc KH012
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich F8775 Store at -20 ºC in aliquots
Rabbit anti-human collagen IV polyclonal antibody   Acris Antibodies R1041 Store at -20 ºC in aliquots
Rabbit anti-laminin A/C pAb Santa Cruz Biotechnology Inc sc-7292 Store at -20 ºC in aliquots
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton-X100) Sigma-Aldrich T9284
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Tween-20) Sigma-Aldrich P1379
Dialysis cassette Slide-A-Lyzer ThemoFisher Scientific 66333
Name Company Catalog Number Comments
IV - Equipment
ARG2 controlled strain rotational rheometer T.A. Instruments
Axiovert S100 (20X magnification) microscope Zeiss
CO2 controlled humidified incubation chamber for Zeiss Axio S100 microscope Solent Scientific
Confocal Axiovert 200M (40X, 63X magnification) microscope Zeiss
Olympus LH50A microscope fitted with a digital camera using phase-contrast  Olympus 
PHERAstar Plus plate reader spectrophotometer BMG Labtech
Name Company Catalog Number Comments
V - Software
Image J 1.47v National Institute of Health, USA
MetaXpress Molecular Divices

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References

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