Sådan Undersøgelse Basement Membrane stivhed som en biofysisk Trigger i prostatakræft og andre aldersrelaterede patologier eller metaboliske sygdomme

Cancer Research
 

Summary

Her forklarer vi en protokol til modellering af biofysiske mikromiljø hvor krydsbinding og øget stivhed af basalmembranen (BM) induceret af avancerede glykering slutprodukter (alder) har patologisk relevans.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Rodriguez-Teja, M., Breit, C., Clarke, M., Talar, K., Wang, K., Mohammad, M. A., Pickwell, S., Etchandy, G., Stasiuk, G. J., Sturge, J. How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases. J. Vis. Exp. (115), e54230, doi:10.3791/54230 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Her beskriver vi en protokol, som kan anvendes til at studere den biofysiske mikromiljø relateret til øget tykkelse og stivhed af basalmembranen (BM) under aldersrelaterede patologier og metaboliske lidelser (fx cancer, diabetes, mikrovaskulær sygdomstilstande, retinopati, nefropati og neuropati) . Udgangspunktet for modellen er ikke-enzymatisk krydsbinding af rekonstitueret BM (rbM) matrix ved behandling med glycolaldehyd (GLA) for at fremme avanceret glykering slutprodukt (AGE) generation via Maillard reaktion. Eksempler på laboratoriemetoder, der kan anvendes til at bekræfte AGE generation, ikke-enzymatisk tværbinding og øget stivhed i GLA behandlet rbM er skitseret. Disse omfatter fremstilling af nativt rbM (behandlet med phosphatbufret saltvand, PBS) og stiv rbM (behandlet med GLA) til bestemmelse af: dens alder indhold ved fotometrisk analyse og immunofluorescens-mikroskopi, dens ikke-enzymatisk tværbinding ved natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS PAGE) samt konfokal mikroskopi, og dets øgede stivhed ved hjælp rheometri. Den her beskrevne fremgangsmåde kan anvendes til at forøge stivheden (elasticitetsmoduler, E) på rbM op til 3,2 gange, i overensstemmelse med målinger foretaget i rask versus sygdomsramt humant prostatavæv. For at genskabe den biofysiske mikromiljø forbundet med den aldrende og syge prostata tre prostata celletyper blev introduceret på indfødte rbM og stiv rbM: RWPE-1, prostata epitelceller (PEC) afledt af en normal prostata; BPH-1, PEC'er afledt af en prostata ramt af benign prostatahyperplasi (BPH); og PC3, metastatiske celler afledt af en sekundær knogle tumor stammer fra prostatacancer. Flere parametre kan måles, herunder størrelse, form og invasive egenskaber af 3D glandulær acini dannet af RWPE-1 og BPH-1 på nativ versus stiv rbM og gennemsnitlig celle længde, vandrende hastighed og persistens af celle bevægelse af 3D Sphereoids dannet af PC3 celler under de samme betingelser. Celle signalveje og den subcellulære lokalisering af proteiner kan også vurderes.

Protocol

1. Induktion af BM Stivhed induceret af GLA Behandling (Ikke-enzymatisk Tværbinding)

  1. Tø en frossen hætteglas med BM matrix (10 ml) ved inkubering ved 4 ° C (stående på is i et kølerum eller køleskab), indtil indholdet i hætteglasset er blevet væske (8-16 timer).
    Forsigtig: Hvis der ikke anvendes et koldt rum / køleskab, dække hele flasken med is. Dette vil forhindre stamopløsningen af ​​BM fra størkne.
  2. Til fremtidige eksperimenter og for at undgå gentagne fryse-tø cykler, forberede 25 x 0,4 ml portioner fra hver ny 10 ml hætteglas med BM matrix. Opbevar hætteglas ved -80 ° C indtil udløbsdatoen angivet af fabrikanten. Efter behov, tø hætteglas ved 4 ° C stående på is i 2 timer.
  3. Forbered en jævn overflade af is. Placer en 8-brønds kammer objektglas oven på is for at holde en temperatur på 4 ° C under coatingen procedure. Optø et hætteglas med BM matrix ved 4 ° C.
    Bemærk: En 0,4 ml hætteglas med BM matrix er tilstrækkelig til at coat en hel 1 x 8-godt kammer dias. Opbevar hætteglasset dækket af is under håndteringen at forhindre BM matrix størkner.
  4. Afbrød dispenseringsenden af ​​en 200 pi pipettespids med en saks. Afkøl stumpendede 200 pi pipettespids til 4 ° C og placere den på til en kapacitet pipettering bistand 200 pi. Tag 40 pi den kolde BM matrix løsning i pipettespidsen og overføre det til en brønd på kølede 8-brønd kammer objektglas.
    Bemærk: 40 pi BM løsning er nok til at dække et overfladeareal på 0,8 cm2. Hold pipettespidser kølet under coatingprocessen procedure for at undgå størkning af BM opløsning. Ikke indfører luftbobler ind i BM matrix opløsning og sikre brønden jævnt belagt uden dannelse af en synlig menisk ved kanterne.
  5. Gentag trin 1.4 i forhold til antallet af brønde og kamre påkrævet.
  6. Efter coating placere 8-brønds kammer objektglas ved 37 ° C i 30 minutter for at fremme polymerisationaf BM. Luk inkubator døren meget omhyggeligt for at undgå uønsket forstyrrelse af væsken rbM. Overskrid ikke 30 min inkubationstid for at undgå dehydrering af RBM gel.
    Bemærk: Den resulterende gel er den indfødte rekonstitueret BM (rbM). 37 ° C-inkuberingstrin ikke kræver 5% CO2. Men for nemheds skyld udføre dette trin i en vævsdyrkningsinkubator indstillet til 37 ° C og 5% CO2 (med befugtning).
  7. Forbered 50 mM glycolaldehyd (GLA) fortyndet i 0,2 M phosphatbuffer (pH 7,8). Steriliser opløsningen ved passage gennem et 0,22 mikron sprøjtefilter anvendelse af en 50 ml sprøjte.
    1. For en tværbindingsreaktion i et endeligt volumen på 250 pi af 50 mM GLA, tilsættes 25 pi 0,5 M natriumcyanoborhydrid eller 2,5 M aminoguanidin til 125 pi 100 mM GLA (2x stamopløsning) og 100 pi 0,2 M phosphatbuffer (pH 7,8 ). Sterilisere stamopløsninger ved at passere dem gennem en 0,22 mikron sprøjte filter ved hjælp af en 50 ml sprøjte.
      Forsigtig: Håndter natriumcyanoborhydrid iført en kittel, handsker, ansigtsskærm og åndedrætsværn, mens du arbejder i et stinkskab.
  8. Tilsættes 250 pi GLA løsning til at dække det polymeriserede rbM gel og inkuberes ved 37 ° C i 6 timer for at frembringe en semi-stiv rbM gel eller 14 timer for at fremstille en stiv rbM gel.
    Bemærk: Mængden af ​​GLA tilføjede skal dække den polymeriserede rbM gel og bør justeres i overensstemmelse hermed. Hvis der anvendes forskellige GLA inkubationstider bør RBM geler analyseres for at bestemme fold-stigning i rbM stivhed (se Trin 2.4).
    1. Der fremstilles en negativ kontrol ved inkubation af en nativ rbM gel i 250 pi sterilt phosphatbufret saltvand (PBS) i 14 timer ved 37 ° C.
    2. Forbered to yderligere kontroller, hvor dannelsen af ​​Schiff-base eller Amadori additionsprodukt omlejring under tværbindingsreaktionen der inhiberes ved tilsætning af 50 mM natriumcyanoborhydrid eller 250 mM aminoguanidin.
  9. Forbered en M glycin ethyl ester (GEE) fortyndet i PBS. Steriliser opløsningen ved passage gennem et 0,22 mikron sprøjtefilter anvendelse af en 50 ml sprøjte.
  10. Efter den angivne inkubationstid, forsigtigt fjerne GLA løsning fra krydsbundne RBM geler, GLA opløsning indeholdende inhibitorer fra kontrol- RBM geler og PBS fra kontrol- native RBM geler. Tilsættes 250 pi GEE løsning på alle de ringmekanismer geler og inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
    Bemærk: Dette trin slukker tværbindingsreaktionen.
  11. Vask alle RBM geler 10 gange i 500 pi PBS for at fjerne alle spor af GLA og GEE. Inkuber RBM gelerne natten over ved 37 ° C i 400 pi PBS for at forhindre deres dehydrering.
    1. Analyser RBM geler til AGE ophobning, ikke-enzymatisk tværbindende og viskoelastiske egenskaber (trin 2.1-2.4). For Rheometric analyse af deres viskoelastiske egenskaber forberede RBM geler i kloning ringe (Trin 2.4).
    2. For cellekultur, skyl RBM geler 2 gange med 500 pi kultur migdia før podning af celler (trin 5 og 6). Udfør vasker blidt uden pipettespidsen berøre geloverfladen.

2. Kvantificering af ikke-enzymatisk Krydsbinding og stivhed rbM Behandlet med GLA

  1. fotometrisk Analyse
    1. Mål AGE-akkumulering i GLA-behandlede og kontrol RBM geler ved fotometrisk analyse for at bestemme omfanget af Maillard-reaktionen.
      1. Efter trin 1.11, fjerne PBS fra RBM geler i de 8 brønde kammer dias og tilføje 250 pi iskoldt dobbelt destilleret vand. Der inkuberes ved 4 ° C i 16-24 timer for at sikre, at matrixen er fuldstændig flydende.
        Bemærk: RBM-peptider i denne løsning indeholder aldre med auto-fluorescerende egenskaber.
      2. Overfør den flydende BM opløsningen til en 1,5 ml rør og måle fluorescens-emissionen af ​​opløsningen under anvendelse af et spektrofotometer (excitationsbølgelængde = 370 nm; emissionsbølgelængde = 440 nm).
  2. SDS-PAGE analyse af cyanogenbromid peptider
    1. Løse GLA-behandlede og kontrol RBM geler på en polyacrylamidgel for at bekræfte, at GLA har induceret tværbinding og dannelsen af ​​makro-fibre.
      1. Centrifugeres flydende BM opløsning indsamlet i trin 2.1.1.2 ved 10.000 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
      2. Der fremstilles en stamopløsning indeholdende 2 g / ml cyanogenbromid fortyndet i acetonitril.
        Forsigtig: Håndtér altid cyanogenbromid i et stinkskab, mens iført en kittel, handsker, ansigtsskærm og respirator.
      3. Fjern supernatanten, resuspender BM gel pellet i 500 pi 20 mg / ml cyanogenbromid + 70% volumen / volumen myresyre og inkuber natten over ved stuetemperatur.
      4. Brug en 1 ml engangssprøjte at overføre den resuspenderet BM gel pellet i en dialyse kassette med en molekylvægt afskåret 3,5 kDa.
      5. Sænk kassetten i et 500 ml bægerglas indeholdende 500 ml dobbelt destilleret vand og en magnetisk omrører.Placer dette på en magnetomrører og dialyseres natten over (16 timer) ved 4 ° C (i et koldt rum) for at fjerne alle spor af cyanogenbromid og myresyre.
      6. Brug en 1 ml engangssprøjte at overføre den dialyserede BM opløsning fra kassetten i et 1,5 ml rør.
      7. Analyse 25 pi af hver BM prøve på en 12% v / v polyacrylamidgel 10,11. Efter SDS-PAGE, udføre sølvfarvning af polyacrylamidgel 12 at visualisere det elektroforetiske mønster af cyanogenbromid-matrix peptiderne 13.
  3. Immunfluorescerende Microscopy Analyse
    1. Udfør immunfluorescensfarvning GLA behandlet og styre RBM geler med anti-AGE / pentosidin, anti-collagen IV og anti-laminin antistoffer efterfulgt af konfokal mikroskopi at visualisere akkumulerede aldre og kollagen IV / laminin fiber strukturelle rearrangementer i tværbundet rbM gels 13.
      Bemærk: Brug altid en tilstrækkelig volumen til at dække entire rbM gel under inkubationer og vasker uden at røre rbM overflade med pipettespidsen. For yderligere oplysninger om at analysere 3D acini kulturer ved immunfluorescens se reference 6 og konfokal mikroskopi af 3D acini se reference 14.
      1. Wash GLA behandlede og kontrol RBM geler i 8 brønde kammerskiver 2 gange med 300 pi PBS + (PBS indeholdende 0,1 mM CaCl2 og 0,5 mM MgCl2) i 5 minutter ved stuetemperatur.
      2. Fjern PBS + tilsæt derefter 300 pi af 4% vægt / volumen paraformaldehyd (PFA) fortyndet i PBS + at omfatte hver rbM gel. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur til at fastsætte ringmekanismen komponenter.
      3. Fjern de 4% w / v PFA-opløsning. Tilføj tilføj 300 pi 75 mM NH4Cl + 0,5 mM MgCl2-opløsning og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur (gentag 5x) til standsning af fiksering.
      4. Forbered Immunofluorescens buffer (IF-buffer) ved at gøre følgende løsning i sterilt vand: 130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3,5 mM NaH2 PO 4, 7,7 mM NaN3, 0,1% vægt / volumen okseserumalbumin, 0,5% v / v polyethylenglycol tert octylphenylether og 0,05% v / v polyethylenglycol sorbitanmonolaurat.
      5. Forbered IF blokeringspuffer ved at supplere IF-buffer med 20% v / v gedeserum.
      6. Fjern quenching og der tilsættes 300 pi IF blokerende buffer til ringmekanismen gelerne for at forhindre ikke-specifikke reaktioner. Inkuber 2 timer ved stuetemperatur på et rystebord.
      7. Fjern IF blokerende buffer og inkuberes RBM geler til 16 timer ved 4 ° C med 300 pi primære antistof fortyndet i IF blokerende buffer (1: 500 muse-anti-pentosidin mAb; 1/250 kanin anti-collagen IV pAb; 1 / 250 kanin-anti-laminin A / C pAb).
        Bemærk: Inkuberinger i mere end 20 timer ved 4 ° C kan liquidize RBM.
      8. Fjern det primære antistof og vask 3 gange (10 minutter hver) med 300 pi IF-buffer ved stuetemperatur på et rystebord.
      9. Fjern IF-buffer ogDer tilsættes 300 pi af det sekundære antistof (gede-anti-kanin eller anti-mus IgG [H + L]) konjugeret med et fluorochrom fortyndet 1: 500 i IF blokeringsbuffer. Inkuber i 2 timer ved stuetemperatur på et rystebord.
      10. Fjern det sekundære antistof og inkuberes i 300 pi IF-buffer i 10 minutter ved stuetemperatur. Fjern IF-buffer og vask 3 x 10 min i 300 pi PBS + ved stuetemperatur.
      11. Fix og slukke en anden gang, som beskrevet ovenfor (trin 2.3.1.2 og 2.3.1.3).
      12. Monter farvede RBM geler i montering medier og analysere dannelsen af ​​tætte bundter af større komponenter ved hjælp af epifluorescens eller konfokal mikroskopi.
        Bemærk: Yderligere oplysninger om at analysere 3D acini kulturer ved immunfluorescens se reference 6 og for epifluorescens og konfokal mikroskopi af 3D acini se reference 14.
  4. rheologisk Analyse
    1. Udfør Rheometric analyse af GLA behandlet og styre RBM geler til at måle deres viscoelasticity (stivhed).
      1. Opsæt RBM geler, der er 1 mm tyk i en cirkulær form med en diameter på 8 mm. For at gøre dette, skal du placere en kloning ring (8 mm diameter) i en brønd i en 24-brønd kultur plade og tilføje BM matrix løsning fremstillet som beskrevet i trin 1,3-1,6.
        Bemærk: For nøjagtig sammenfatning af RBM geler anvendes til eksperimenter, RBM geler forberedt til Rheometric analyse nødt til at have det samme areal og tykkelse som RBM geler oprettet i 8 brønde kamre. RBM geler analyseret i figur 3 var 1 mm tyk og 8 mm i diameter.
      2. Behandl RBM geler oprettet i kloning ringe med PBS, GLA for 6 timer og GLA for 14 timer, som beskrevet ovenfor (trin 1.8 til 1.11).
      3. Mål elasticitetsmodulet (E) af de mm diameter 8 RBM geler på en rheometer med en 8 mm parallelle plader takkede geometri, over et område på 1-3% deformation, ved en fast frekvens svingning på 1 Hz og temperatur på 21 ° C. For yderligere oplysninger omRheometric analyse af ECM geler se referencer se reference 13,15,16.
        Bemærk: E bestemmes ud fra den resulterende oplagring forskydningsmodul (G ') ved anvendelse af den følgende ligning E = 2 * G' * (1 + v) hvor v er Poissons forhold på 0,5, som beskrevet i reference 13,15 , 16.

3. Kultur og håndtering af Normal PEC linje, RWPE-1

  1. Grow RWPE-1-celler i keratinocyt serumfrie medier (KSFM) suppleret med 5 ng / ml epidermal vækstfaktor (EGF), 50 ug / ml bovin hypofyse (BPE) og 50 U / ml penicillin med 50 ug / ml streptomycin ( fuldføre KSFM).
    Bemærk: For at undgå induktion af epitelial-til-mesenkymale (EMT) -lignende overgang gør RWPE-1 celler ikke udsættes for serum. Tillad komplet KSFM at nå stuetemperatur i 30 minutter efter fjernelse fra opbevaring ved 4 ° C og ikke varme i en 37 ° C vandbad, da dette vil inaktivere EGF og BPE.
  2. Aspirere den kompletteKSFM fra en konfluerende 10 cm 2 plade af RWPE-1-celler, skylles med 5 ml forvarmet PBS og tilsættes 5 ml 0,05% volumen / volumen trypsin sikre, at alle celler er dækket med opløsningen.
    1. Placer cellerne i en vævskultur-inkubator indstillet ved standardbetingelser på 37 ° C og 5% CO2 (med befugtning) i 5 til 10 min. Kontroller omfanget af trypsinisering efter 5 min og forsigtigt trykke kulturen pladen for at løsne cellerne.
      Bemærk: RWPE-1-celler ikke tåle lange perioder med trypsinisering så det anbefales ikke at håndtere mere end to plader på samme tid. Det er også vigtigt at dissociere alle celler fra pladen for at undgå klonselektion.
  3. Når alle RWPE-1-celler har dissocieret, tilsættes 5 ml varmt PBS indeholdende 2% v / v føtalt kalveserum (FCS) til standsning af trypsin. Pipettér forsigtigt op og ned for at bryde op celleaggregater inden overførsel af cellerne til et centrifugerør.
  4. Centrifuger adskilles celler ved 125-150 xg i 5 minutter ved 25 ° C, supernatanten fjernes, og resuspender pelleten af ​​celler i 5 ml komplet KSFM indtil en suspension af enkeltceller opnås.
  5. Overfør 1 ml af de resuspenderede celler i et nyt rør og tilsættes 9 ml komplet KSFM at udbrede cellerne ved et 1: 5 passage fortynding til efterfølgende eksperimenterende brug. Tæl resten af ​​cellerne ved hjælp af et hæmocytometer til opsætning acini (se afsnit 5.1).
    Bemærk: Må ikke kultur RWPE-1 celler i mere end 10 passager siden efter længere tids kultur, de ikke danner acini med den korrekte arkitektur.
  6. Skift dyrkningsmedier hver 48 timer for at sikre, EGF og BPE forbliver aktive.
    Bemærk: Medtag dette medie ændring for nogen behandlinger, der rækker ud over 48 timer.

4. Kultur og håndtering af BPH Cell Line, BPH-1

  1. Kultur BPH-1 celler i RPMI 1640-medier suppleret med 5% volumen / volumen FCS, 50 U / ml penicillin og 50 ug / ml streptomycin. Opvarmdyrkningsmedier, PBS og 0,25% vægt / volumen trypsin-0,53 M EDTA-opløsning til 37 ° C før brug.
    Bemærk: Celler kan også dyrkes i medier med 2,5% volumen / volumen FCS 8.
  2. Aspireres dyrkningsmedierne fra en konfluerende 10 cm 2 plade af BPH-1-celler og vask af cellerne 2 x med 3 ml PBS for at fjerne alle spor af dyrkningsmedier med serum, som kan standse trypsin reaktionen.
  3. Aspirer PBS og tilsættes 3 ml trypsin-EDTA-opløsning for at dække cellerne. Pladen anbringes i en inkubator indstillet til 37 ° C og 5% CO2 (med befugtning) i 5 minutter. Fjern trypsin-EDTA-opløsning, når cellerne er runde, men forbliver fastgjort til skålen. Vask cellerne med 5 ml PBS.
  4. Efter fjernelse af PBS, tilsættes 5 ml dyrkningsmedier og pipettér forsigtigt op og ned for at fremstille en suspension af enkeltceller. Overfør cellerne til et 15 ml rør.
  5. 2 ml af cellesuspensionen i en ny centrifuge rør med 8 ml komplet medium og plade BPH-1-celler ontoa 10 cm2 dyrkningsplade ved en 1: 5 passage fortynding til efterfølgende eksperimentel anvendelse. Tæl resten af ​​cellerne ved hjælp af et hæmocytometer til opsætning acini (se afsnit 5.2).
    Bemærk: Hold regnskab af passagen nummer, som ældre BPH-1 celler ikke danner acini med en ordentlig arkitektur. En passage nummer mere end 10 ikke er ønsket.
  6. Skift dyrkningsmedier hver 72 timer.

5. 3D Kultur Prostata Gland acini på Native og Stiff rbM

  1. Hvis RWPE-1-celler bliver brugt til at danne acini, fortyndes 5.000 celler fremstillet i trin 3.5 i 300 pi komplet KSFM suppleret med 2% v / v BM opløsning.
  2. Hvis BPH-1-celler bliver brugt til at danne acini, fortyndes 2.500 celler fremstillet i trin 4.5 i 300 pi RPMI 1640 dyrkningsmedier suppleret med 2% v / v BM opløsning.
    Bemærk: BPH-1 celler er større end RWPE-1 celler så lavere antal BPH-1-celler anvendes til at opnå en lignende fordeling af acini efter 6 dages cultur.
  3. Forsigtigt pode celler på det native og AGE-stivnede rbM og anbring forsigtigt kulturerne i en inkubator indstillet til 37 ° C og 5% CO2 (med befugtning) for at sikre en jævn fordeling af voksende acini i brønden, og at hver celle deler at producere et acina.
  4. Hver 2 dage erstatte dyrkningsmediet med frisk dyrkningsmedium indeholdende 2% v / v BM løsning til at sikre, at cellerne er vækstfaktorerne nødvendig for den normale acina homøostase.
  5. Overvåg acinar morfologi i voksende kulturer ved hjælp lysfeltmikroskopi 13.
    Bemærk: Efter 3 dage i kultur vil de enkelte celler danner en klynge af> 3-celler og efter 1 uge prostata acini med en diameter på ~ vil blive observeret 50 um.
  6. Følg beskrevne protokol i 2.3 til at udføre immunofluorescens ved hjælp af antistoffer specifikke for markører for celle-matrix sammenvoksninger, celle-celle sammenvoksninger, apico-basal polaritet og invasiv 13.

6. 3D Culture af prostata tumorceller Tilslag om Native og Stiff rbM

  1. Kultur PC3-celler i RPMI 1640 medium indeholdende 10% volumen / volumen FCS og 50 U / ml penicillin med 50 ug / ml streptomycin. Varm dyrkningsmediet, PBS og 0,25% vægt / volumen trypsin-0,53 M EDTA-opløsning til 37 ° C før brug.
  2. Aspireres dyrkningsmedierne fra en konfluerende 10 cm 2 dyrkningsskål af PC3-celler og vask af cellerne 2 gange med 3 ml PBS for at fjerne alle spor af FCS, som kan standse trypsin reaktionen.
  3. Aspirer PBS og tilsættes 3 ml trypsin-EDTA-opløsning for at dække cellerne og inkuberes i 1 min.
  4. Når cellerne bliver afrundet, men forbliver fastgjort til skålen, forsigtigt aspirere trypsin-EDTA-opløsning og vaskes med 3 ml PBS ifjerne alle spor af trypsin.
  5. Efter fjernelse af PBS, tilsættes 5 ml dyrkningsmedier og pipettér forsigtigt op og ned for at fremstille en suspension af enkeltceller. Overfør cellerne til et 15 ml rør.
  6. Der tages 1 ml PC3 cellesuspensionen i en ny centrifugerør og der tilsættes 9 ml dyrkningsmedier. Plate cellerne på en 10 cm2 dyrkningsskål (1:10 fortynding) til efterfølgende eksperimentel anvendelse. Tæl de resterende celler under anvendelse af et hæmocytometer.
  7. Fortynd 2.500 PC3 celler fremstillet i trin 6.6 i 300 pi RPMI 1640 dyrkningsmedier suppleret med 2% v / v BM at give mulighed for dannelsen af ​​en gradient gel i kulturen.
  8. Forsigtigt pode celler på det native og AGE-stivnede rbM og anbring forsigtigt kulturen i inkubatoren indstillet til 37 ° C og 5% CO2 (med befugtning) for at sikre jævn fordeling af voksende sfæroider i brønden.
  9. Skift dyrkningsmedier hver 72 timer.
  10. For at undersøge effekten af ​​stive (AGE-rige) rbMpå prostata tumor celle migration, billede PC3 celler ved hjælp lysfelt video time-lapse mikroskopi hjælp temperatur / CO 2 kontrol og et fugtigt kammer 17.
    Bemærk: PC3 celler vokser i strenge på indfødte rbM og ikke danner acini med et lumen, men hvis venstre til at vokse mere end 72 timer om indfødte rbM de vil danne 3D sphæroider.
  11. Efter dataopsamling, manuelt spore PC3 celler og beregne deres migration hastighed, form (forlængelse ratio) og persistens af migration 17-19.
    Bemærk: Persistens = forholdet D / T, D = afstand fra start til afslutning celle bane, T = samlet længde af celle- bane.

Representative Results

3D Prostata acini dyrket på Stiff rbM

Efter 6 dage i kultur, PEC'er afledt fra normale prostatavæv (RWPE-1) (figur 1A) og BPH tissue (BPH-1) (figur 1B) formular acini på native (PBS-behandlede) rbM der er organiseret i ensartede sfæroider af epitel celler. Disse acini har også karakter af højt organiserede PEC'er med apikal-til-basal polaritet og en synlig luminale rum 13,20.

Den acini dannet af PEC'er afledt fra normale prostatavæv (RWPE-1) (figur 1A) og BPH tissue (BPH-1) (figur 1B) på stivnede (AGE-rige) rbM (behandlet med GLA) har et afbrudt arkitektur (skiftende fra kugleformet til polygonal i form og celler fremspringende / migrering fra acini i AGE-rige rbM) (figur 1A). Disse acini er også karakteriseret ved meget uorganiserede PEC, der har mistet deres apikale-til-basal polaritet med en lille eller ikke-eksisterende luminale rum 13.

figur 1
Figur 1:. Prostata epitelceller dyrkes som 3D Glandulær acini på Native og Stiv Rekonstitueret Basement Membrane (rbM) (A) lysfelt billeder af RWPE-1 celler dyrket i 12 timer op til 6 dage på RBM geler behandlet med PBS (native) eller 50 mM glycolaldehyd for 14 timer (AGE-rige, stiv); Scale bar = 50 um. (B) BPH-1-celler, dyrket som beskrevet i panel A; Scale barer = 50 um; data er repræsentative for 3 uafhængige forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1 "src =" / files / ftp_upload / 54230 / 54230table1.jpg "/>
Tabel 1:. Karakteristik af prostata epithelial RWPE-1 acini dyrket på Native, Semi-Stiff og Stiff Rekonstitueret Basement Membrane (rbM) RWPE-1 acini blev dyrket på rbM forbehandlet med PBS for 14 timer (native), glycolaldehyd (GLA ) i 6 timer (semi-stiv) eller GLA for 14 timer (stiv). For acinar form, den procentvise (%) ± standardafvigelse (SD) af runde blev semi-polygonale og polygonale acini beregnet ud fra 5 uafhængige forsøg (50 acini kvantificeret pr betingelse). Relativ acinar størrelse blev beregnet (native rbM = 100%) fra 3 uafhængige forsøg. For invasivitet, blev% ± SD acini med en eller flere udragende celler beregnet ud fra 3 uafhængige eksperimenter. Fold ændring beregnes ved at dividere den gennemsnitlige værdi opnået under semi-stive eller stive forhold ved den tilsvarende værdi for native betingelser. P-værdier beregnet ved anvendelse af Students t-test (α = 0,05).

Indholdsproduktion "fo: holde-together.within-side =" 1 "> ALDER afhængig øget rbM stivhed fremmer PC3 prostata tumor celle migration

PC3 celler dyrket på indfødte rbM migrere ved at opretholde kontinuerlig celle-celle kontakt, mens PC3 celler dyrket på AGE-rige (stiv) rbM flytte uafhængigt af hinanden (figur 2A). Efter 72 timer i kultur PC3 celler danner foci (sphæroider) på native (PBS behandlede) rbM, mens PC3 celler på stiv (AGE-rige) rbM ikke fra sfæroider og migrere uafhængigt (figur 2B). PC3 celler på stiv (AGE-rige) rbM er mere langstrakt end PC3 celler dyrket på indfødte rbM (Figur 2C). PC3 celler på stiv rbM migrere hurtigere end PC3 celler dyrket på indfødte rbM (figur 2D). PC3 celler på stiv rbM vise et fald i vedholdenhed i forhold til PC3 celler dyrket på indfødte rbM (Figur 2E).

"Figur Figur 2:. Prostata Tumor Cell Migration på Native og Stiv Rekonstitueret Basement Membrane (rbM) (A) lysfelt billeder af PC3 celler dyrket på RBM geler behandlet med PBS (native) eller 50 mM glycolaldehyd for 14 timer (AGE-rige, stiv) . Celler blev afbildet ved hjælp af et lysfelt mikroskop (10X objektiv), og et opkøb på 1 billede pr time for 12 timer efterfulgt af celle sporing at generere baner. Viste billeder svarer til de tidspunkter efter 0, 3, 6, 9 og 12 timer. Baner enkeltceller er vist for 12 hr tidspunkt. Scale bar = 100 um. (B) PC3-celler dyrket på nativt eller stiv rbM i 72 timer, og afbildes som beskrevet i panel (A). Scale bar = 100 um. Detalje viser valgte område ved 2X forstørrelse. (C) gennemsnit ± SD celle længde (um); signifikant forskel mellem nativt rbM og stiv rbM (p = 1,2 x 10 -23). ( (E) gennemsnit ± SD persistens af cellebevægelse (forhold D / T, hvor D = afstand fra start til afslutning celle bane, T = samlet længde på celle bane); signifikant forskel mellem nativt rbM og stiv rbM (p = 0,0007). For paneler CE> 10 celler blev analyseret, data er repræsentativt for 3 uafhængige forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

En protokol til generering af 3D glandulær acini fra MEC'er i rene RBM geler 6 blev ændret i en tidligere undersøgelse ved tilsætning af 4 mg / ml type I collagen til rbM matrix. Tilsætningen af ​​kollagen resulterede i elasticitetsmodulet af rbM gel stigende fra 175 ± 37 til 1589 ± 380 Pa. Dette 9,1-gange stigning i stivheden modulerede væksten, overlevelse, migration og differentiering af MEC'er 21. Protokollen blev ændret igen ved at indbefatte et behandlingstrin med D - (-) - ribose at fremme ikke-enzymatisk tværbinding af type I kollagen, der var blevet tilsat til ringmekanismen gel. Det resulterende 15-gange stigning i stivhed fandtes at samarbejde med oncogen transformation af MEC'er at fremme deres invasive adfærd 22. Den eksperimentelle tilgang tilføjer type I collagen til RBM geler letter direkte interaktion af MEC'er med kollagen fibre, som kun forekommer i humant væv efter fysisk barriere mellem stromaog epithel tilvejebragt af BM undergår proteolytisk nedbrydning. Ved at generere 3D glandulær acini fra PEC i rene RBM geler forbehandlet med GLA, den nuværende protokol åbner vejen at undersøge, hvordan BM stivhed per se kan udløse deres invasive adfærd (figur 3). Niveauerne af BM stivhed induceret i denne protokol har fysiologiske relevans. Inkubering med 50 mM GLA i 6 timer og 14 timer steg henholdsvis de elastiske moduli af det rene rbM gel til 175 ± 90 og 322 ± 160 i forhold til 122 ± 55 Pascal i RBM geler behandlet med PBS (tabel 1). Dette 1,7-3,2 gange stigning i rbM stivhed rekapitulerer den 2,5- til 3,4 gange stigning i stivhed observeret i maligne forhold til normal prostata eller BPH væv 23-26. Som beskrevet i en nylig publikation 13 de morfologiske forandringer som følge af ophobning af AGE og rbM stivhed i PEC acini kan kvantificeres med en statistisk signifikant skift fra arounded til polygonal form, nedsat luminale / total acinære området, og fremspringende celler migrerer fra acina i AGE-rige rbM (figur 3). Immunoblotting kan også anvendes til at vurdere markører for EMT (f.eks tab af E-cadherin 13) og den kontraktile adfærd (fx phosphoryleret myosin let kæde-2, pMLC2 13) i PEC'er dyrket i normalt versus stiv rbM (figur 3). Kan påføres yderligere evaluering ved hjælp immunfluorescensfarvning og konfokal mikroskopi at visualisere BM (f.eks laminin, kollagen IV og AGE ophobning 13), cellulære apikale-til-basal polaritet (f.eks apikal lokalisering af EEA1: tidlig endosomal antigen 1, og GM130: 130 kDa cis-Golgi markør 13) og cellulære mønstre af adhæsionsmolekyler (fx E-cadherin lokalisering til celle-celle vejkryds 13) (figur 3).

"Figur Figur 3:. Oversigt over de forskellige protokoller præsenteres her Diagrammet viser hvordan man kan forberede og stivne den rekonstituerede basalmembran (rbM) med glycolaldehyd (Maillard reaktion), hvordan til frø celler på den stive rbM, hvordan man analyserer den stive rbM ( omfanget af Maillard reaktion) og procedurer, der kan bruges til at analysere de cellulære og molekylære forandringer som følge af AGE-rige rbM. AGE, avancerede glykering slutprodukter; BM, basalmembran; DAPI, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol; EEA1, tidlige endosomale antigen 1; GAPDH, glyceraldehyd-3-phosphat dehydrogenase; GLA, glycolaldehyd; CEE, glycin-ethylester; GM130, 130 kDa cis-Golgi markør; p-MLC2 (Thr18 / Ser19), myosin let kæde-2 phosphoryleret i sites threonin 18 og serin 19; rbM, rekonstitueret basalmembran; SDS-PAGE, natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese. For RWPE1 acini Scale bar = 10 um; for PC3 tumorcellesfæroider Scale bar = 100 um. Dette tal har været ændret siden henvisning 13. Klik her for at se en større version af dette tal.

Fejlfindingstrin vil være nødvendigt, hvis D - (-) - ribose vælges som tværbindingsmidlet for rbM. Under protokol udvikling blev det konstateret, at behandling med 1 M D - (-) - ribose i 72 timer, som tidligere beskrevet for rbM / kollagengeler 22, resulterede i dehydrering og krympning af rettighedsbaserede geler. Evalueringen af ​​lavere koncentrationer af D - (-) - ribose og kortere behandlingstider kan bidrage til at overvinde denne begrænsning.

En potentiel begrænsning i fremtidige anvendelser af protokollen kunne opstå, hvis der ønskes højere niveauer af rbM stivhed. Hvis der anvendes længere inkubationstider og højere koncentrationer af GLA at inducere højere niveauer af rbM gel stivhed vil det være nødvendigt at vurdere, om disse behandlingsmuligheder betingelser har en indvirkning på celle overlevelse og spredning, som tidligere beskrevet 13. Det skal også bemærkes, at inkubation af RWPE-1-celler med serum inducerer en fænotypisk EMT-lignende overgang og udsættelse for serum eller serum-holdige materialer bør undgås. For eksempel, hvis eksperimenter involverer transfektion af lille interfererende RNA (siRNA) oligonukleotider, proceduren bør optimeres ved anvendelse RWPE-1 celler dyrket i KSFM, uden at skifte cellerne til lavt serum transfektion medier. Denne ulempe kan være til skade for gen lyddæmpning opnås ved brug af forbigående siRNA tilgange i modellen. For nogle protein-targets ville det rådes til at ansætte inducerbare shRNA vektorer for justerbar gen lyddæmpning og det ønskede fald i protein niveauer. Tilpasninger som omfatter enzymatisk tværbinding ved stromal celle eller tumorcelle associeret lysyloxidase (LOX) 17 kunne også inkorporeres i fremtidige modeller.

jove_content "> Denne protokol vil lette den fremtidige undersøgelse af pro-invasive mekanismer udløst af AGE-afhængige BM stivhed i Pecs (RWPE-1, BPH-1) og evaluering af anti-metastatiske mål i invasive PTC'er (PC3). Da BPH anses for at være en stofskiftesygdom 27, denne protokol baner også vejen mod vores bedre forståelse af sammenhængen mellem metaboliske sygdomme og øget prostatakræft risiko. i betragtning af, at BM stivhed fremkaldt af sin eksponering mod AGEs kan være en udløsende faktor for invasiv i andre kræft typer, vil det være af interesse at anvende protokollen til at oprette lignende modeller, der omfatter normale epitelceller og tumorceller fra andre organer (f.eks bryst, tyktarm, æggestokke, bugspytkirtel).

Kritiske trin i protokollen sammen med deres tider, er opsummeret i figur 4. Under den indledende skridt er det vigtigt at opretholde stamopløsningen af rbM ved 4 ° C, mens det smelter for at forhindre sin polymerization. Pipettespidser bør ikke placeres i rM stamopløsningen indtil de er kølet til 4 ° C. For det næste trin er det også vigtigt at sikre de kammerskiver har ækvilibreret til 4 ° C, før de overtrækkes med rbM opløsning. det vil så snart temperaturen af ​​rbM opløsningen forøges over 4 ° C undergår irreversibel polymerisation til dannelse af en gel. Det vigtigt, at rbM ikke forstyrres under polymerisationen fase for at sikre, at den danner en jævn overflade egnet til celledyrkning og mikroskopisk analyse. Varigheden af ​​inkubationen med GLA med eller uden inhibitorer af Maillard-reaktionen (natriumcyanoborhydrid og amingoguanidine) bestemmer, hvor stiv RBM gelen bliver. Det anbefales at bruge en 6 timers inkubation med GLA hvis halvstift betingelser er påkrævet, og 14 timers inkubation, hvis stive betingelser er påkrævet (tabel 1). Alternative inkuberingstider eller koncentrationer af GLA kan anvendes, hvis forskellige niveaueraf stivhed er ønsket. I dette tilfælde rheologisk analyse af RBM geler skal indgå som et væsentligt skridt. Efter trinnet til standsning af Maillard-reaktionen ved inkubering med GEE og de efterfølgende vasketrin med PBS, kan ringmekanismen geler anvendes straks eller opbevares ved 4 ° C i op til 48 timer før deres anvendelse til cellekultur. Når cellekulturer er sat op er det vigtigt at ændre dyrkningsmediet (herunder eventuelle behandlinger) hver anden dag. Det anbefales at bevare 3D cellekulturer til 3-12 dage efter de parametre, der undersøges. For 3D PEC acini anbefales det at analysere de kulturer efter 6 dage, og 3D PTC sphæroider analyse anbefales efter 3 dages dyrkning i første instans.

Figur 4
Figur 4:. Enkel Oversigt over protokollen med kritiske stadier og Timings angivet flow diagram viser hvordan man kan forberede og stivne den rekonstituerede basalmembran (rbM) med glycolaldehyd (Maillard reaktion) med kritiske trin og tider, der er angivet. Punkter, hvor protokollen kan stoppes, og RBM geler gemt, er også angivet. rbM, rekonstitueret basalmembran; GLA, glycolaldehyd; CEE, glycin-ethylester; ON, natten over; PBS, phosphatpufret saltopløsning; RT, stuetemperatur. Klik her for at se en større version af dette tal.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
I - Material for monolayer culture
BPH-1 CaP Cell Line Database PCaCL-132 Contact: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu
Complete keratinocyte serum-free media  ThermoFisher Scientific 17005-075 Do not warm at 37 ºC before use
Fetal calf serum  First Link UK Ltd 02-00-850 Store at -20 ºC in aliquots
PC3  American Type Culture Collection CRL-1435
Penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15070-063
Phosphate Buffer Saline (Dulbecco A) tablets Oxoid BR0014G
RPMI 1640 medium  Sigma-Aldrich R5886 warm in 37 ºC water bath before use
RWPE-1  American Type Culture Collection CRL-11609
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T4049
Name Company Catalog Number Comments
II - Material for 3D culture
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004
Aminoguanidine hydrochloride Sigma-Aldrich 396494 Irritating to eyes, respiratory system and skin
Chamber slides, 8-well  Thermo Scientific Nunc Lab-Tek TKT-210-816M
Culture Matrix reconstituted basement membrane (rBM) reduced growth factor extract  AMS Biotechnology 3445-005-01 Store Basement membrane (BM) at -80 ºC in aliquots
Cyanogen bromide  Sigma-Aldrich C91492 Toxic by contact skin and inhalation
Formic acid Sigma-Aldrich 695076
Glycine ethyl ester hydrochloride (GEE) Sigma-Aldrich 50060 Irritating to eyes
Glycolaldehyde dimer (GLA) Sigma-Aldrich G6805
Sodium cyanoborohydride  Sigma-Aldrich 71435 Highly flammable; Toxic by contact skin and inhalation
Syringe filter 0.22 microns Appleton Woods BC680
Name Company Catalog Number Comments
III - Material to quantify Maillard reaction
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ThemoFisher Scientific D3571 light sensitive and store at -20 ºC in aliquots
Cloning cylinders Sigma-Aldrich C1059
Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate ThemoFisher Scientific A-11001 light sensitive
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate ThemoFisher Scientific A-11034 light sensitive
Goat serum Abcam ab7481 Store at -20 ºC in aliquots
Vectashield mounting media  Vector Laboratories H-1000
Mouse anti-pentosidine clone PEN-12 mAb TransGenic Inc KH012
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich F8775 Store at -20 ºC in aliquots
Rabbit anti-human collagen IV polyclonal antibody   Acris Antibodies R1041 Store at -20 ºC in aliquots
Rabbit anti-laminin A/C pAb Santa Cruz Biotechnology Inc sc-7292 Store at -20 ºC in aliquots
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton-X100) Sigma-Aldrich T9284
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Tween-20) Sigma-Aldrich P1379
Dialysis cassette Slide-A-Lyzer ThemoFisher Scientific 66333
Name Company Catalog Number Comments
IV - Equipment
ARG2 controlled strain rotational rheometer T.A. Instruments
Axiovert S100 (20X magnification) microscope Zeiss
CO2 controlled humidified incubation chamber for Zeiss Axio S100 microscope Solent Scientific
Confocal Axiovert 200M (40X, 63X magnification) microscope Zeiss
Olympus LH50A microscope fitted with a digital camera using phase-contrast  Olympus 
PHERAstar Plus plate reader spectrophotometer BMG Labtech
Name Company Catalog Number Comments
V - Software
Image J 1.47v National Institute of Health, USA
MetaXpress Molecular Divices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Timpl, R., Brown, J. C. Supramolecular assembly of basement membranes. Bioessays. 18, (2), 123-132 (1996).
  2. Yurchenco, P. D., Ruben, G. C. Type IV collagen lateral associations in the EHS tumor matrix. Comparison with amniotic and in vitro networks. Am J Pathol. 132, (2), 278-291 (1988).
  3. Halfter, W., et al. Protein composition and biomechanical properties of in vivo-derived basement membranes. Cell Adh Migr. 7, (1), 64-71 (2013).
  4. Candiello, J., Cole, G. J., Halfter, W. Age-dependent changes in the structure, composition and biophysical properties of a human basement membrane. Matrix Biol. 29, (5), 402-410 (2010).
  5. To, M., et al. Diabetes-induced morphological, biomechanical, and compositional changes in ocular basement membranes. Exp Eye Res. 116, 298-307 (2013).
  6. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, (3), 256-268 (2003).
  7. Bello, D., Webber, M. M., Kleinman, H. K., Wartinger, D. D., Rhim, J. S. Androgen responsive adult human prostatic epithelial cell lines immortalized by human papillomavirus 18. Carcinogenesis. 18, (6), 1215-1223 (1997).
  8. Hayward, S. W., et al. Establishment and characterization of an immortalized but non-transformed human prostate epithelial cell line: BPH-1. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 31, (1), 14-24 (1995).
  9. Kaighn, M. E., Narayan, K. S., Ohnuki, Y., Lechner, J. F., Jones, L. W. Establishment and characterization of a human prostatic carcinoma cell line (PC-3). Invest Urol. 17, (1), 16-23 (1979).
  10. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, (5259), 680-685 (1970).
  11. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, (9), 4350-4354 (1979).
  12. Rabilloud, T. Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis. Electrophoresis. 11, (10), 785-794 (1990).
  13. Rodriguez-Teja, M., et al. AGE-modified basement membrane cooperates with Endo180 to promote epithelial cell invasiveness and decrease prostate cancer survival. J Pathol. 235, (4), 581-592 (2015).
  14. Graf, B. W., Boppart, S. A. Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models. Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).
  15. Yao, N. Y., Larsen, R. J., Weitz, D. A. Probing nonlinear rheology with inertio-elastic oscillations. J Rheology. 52, (4), 1013-1025 (2008).
  16. Baker, A. M., Bird, D., Lang, G., Cox, T. R., Erler, J. T. Lysyl oxidase enzymatic function increases stiffness to drive colorectal cancer progression through FAK. Oncogene. 32, (14), 1863-1868 (2013).
  17. Caley, M. P., et al. Tumor-associated Endo180 requires stromal-derived LOX to promote metastatic prostate cancer cell migration on human ECM surfaces. Clin Exp Metastasis. 3, (2), 151-165 (2016).
  18. Sturge, J., Wienke, D., East, L., Jones, G. E., Isacke, C. M. GPI-anchored uPAR requires Endo180 for rapid directional sensing during chemotaxis. J Cell Biol. 162, (5), 789-794 (2003).
  19. Sturge, J., Wienke, D., Isacke, C. M. Endosomes generate localized Rho-ROCK-MLC2-based contractile signals via Endo180 to promote adhesion disassembly. J Cell Biol. 175, (2), 337-347 (2006).
  20. Rodriguez-Teja, M., et al. Survival Outcome and EMT Suppression Mediated by a Lectin Domain Interaction of Endo180 and CD147. Mol Cancer Res. 13, (3), 538-547 (2015).
  21. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, (3), 241-254 (2005).
  22. Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, (5), 891-906 (2009).
  23. Carson, W. C., et al. Material characterization of ex vivo prostate tissue via spherical indentation in the clinic. Med Eng Phys. 33, (3), 302-309 (2011).
  24. Hoyt, K., et al. Tissue elasticity properties as biomarkers for prostate cancer. Cancer Biomark. 4, (4-5), 213-225 (2008).
  25. Krouskop, T. A., Wheeler, T. M., Kallel, F., Garra, B. S., Hall, T. Elastic moduli of breast and prostate tissues under compression. Ultrason Imaging. 20, (4), 260-274 (1998).
  26. Zhang, M., et al. Quantitative characterization of viscoelastic properties of human prostate correlated with histology. Ultrasound Med Biol. 34, (7), 1033-1042 (2008).
  27. Corona, G., et al. Benign prostatic hyperplasia: a new metabolic disease of the aging male and its correlation with sexual dysfunctions. Int J Endocrinol. Article ID:329456 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics