Die Verwendung einer Batterie von chemischen und ökotoxikologischen Methoden zur Beurteilung der Wirksamkeit von Abwasserbehandlungsprozesse zu entfernen Estrogenic Potency

1Institute of Environment Health and Societies, Brunel University London, 2Department of Chemistry, Carnegie Mellon University
Published 9/11/2016
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Summary

Endokrin wirksame Stoffe (EDC) stellen ein erhebliches Risiko für die aquatische Umwelt. Kommunale Kläranlagen leisten einen wesentlichen Beitrag zur östrogene Potenz von Oberflächengewässern. Die Methodik in diesem Papier geliefert wird, ermöglicht eine Beurteilung der Wirksamkeit und Eignung von Abwasserbehandlungsverfahren in Bezug auf EDC Entfernung.

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Beresford, N., Baynes, A., Kanda, R., Mills, M. R., Arias-Salazar, K., Collins, T. J., et al. Use of a Battery of Chemical and Ecotoxicological Methods for the Assessment of the Efficacy of Wastewater Treatment Processes to Remove Estrogenic Potency. J. Vis. Exp. (115), e54243, doi:10.3791/54243 (2016).

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Abstract

Introduction

Bedenken in Bezug auf die negativen Auswirkungen der endokrinen Verbindungen auf die Tierwelt der reproduktiven Gesundheit hat die Europäische Union führte zwei östrogene Substanzen zu platzieren (Estradiol und Ethinylestradiol) auf eine "Watchlist" im Rahmen der Wasserrahmenrichtlinie (WRRL). EDC eine Vielzahl von chemischen Klassen umfassen, einschließlich natürlicher und synthetischer Steroidöstrogene, Medikamente, Pestizide und Industriechemikalien und Bestandteile von Konsumgütern mit bekannten negativen Auswirkungen auf die Tierwelt. Einige dieser Verbindungen können möglicherweise die menschliche Gesundheit auswirken 1.

Die Forschung hat gezeigt , dass die Abwässer aus Kläranlagen sind östrogene 2 zu fischen , und als Folge viele Vorfluter sind auch Östrogene zu Fisch 3. Dies wurde zum ersten Mal im Vereinigten Königreich durch nationale Erhebungen zeigten , dass erhöhte Konzentrationen vitellogenin zeigte (eine weibliche spezifischen Dotterproteinvorläufer 4) im Blut von wilden männlichen Fischen und einem hohen PreWertigkeit von Intersex in der Regel gonochoristic Fischarten 5,6 (Eier und / oder weiblichen Fortpflanzungskanäle in den Hoden von männlichen Fischen zu entwickeln).

Konventionelle Abwasserbehandlung ist in der Regel ein dreistufiger Prozess einer Vorprüfung durch primäre und sekundäre Behandlung gefolgt besteht, die beide gelöst entnimmt und organischen Stoffen ausgesetzt. Die Wirksamkeit der Entfernung einzelner EDC ist abhängig von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der Substanzen und auf die Wirksamkeit des angewendeten Behandlungsverfahren. Für viele EDC Entfernung durch Adsorption und biologischen Abbau kann signifikant, aber unvollständig. Tertiäre Behandlung, wie Sandfiltration, kann auf eine Erhöhung EDC Entfernung 7 während erweiterte Behandlung mit Advanced Oxidation (zum Beispiel Ozon) oder Aktivkohle wirksam sein kann bei der Erreichung nahezu vollständige Entfernung 7 wirksam.

Die Beurteilung einer neuen Technologie für die Abwasserbehandlung needs die Wirksamkeit des vorgeschlagenen Verfahrens in EDC Entfernung zu bestimmen. Eine Batterie von Tests, einschließlich gezielte chemische Analyse neben Ökotoxikologie Tests, unter Verwendung von in vivo und in vitro Biotests, liefert umfassende Daten für diesen Zweck. Obwohl sehr nützlich für regulatorische Zwecke, können gezielte chemische Analyse liefern nur Daten über die Verbindungen (und spezifische Metaboliten) überwacht. Biotests erlauben zusätzlich die "Erkennung" von schädlichen Wirkungen von Metaboliten und behandlungsAbwasser Umwandlung von Nebenprodukten , die sonst 8,9 unentdeckt bleiben würden. Dieses Papier beschreibt die Verwendung einer Batterie von chemischen und Ökotoxizität Labor-Tests die Wirksamkeit einer Reihe von neuen und fortgeschrittenen Abwasserbehandlungsverfahren bei der Entfernung der östrogene Potenz von rohem und gereinigtem Abwasser und Vorfluter zu beurteilen.

Protocol

Ethik-Anweisung: Protokolle für endokrine Beurteilung störende Aktivität Stoffe / Gemische in Fisch wurden von der Brunel University in London Tierschutz und ethische Überprüfung zuständige Gremium (AWERB) und von der britischen Home Office im Rahmen der Tiere (Scientific Procedures) Act 1986 genehmigt.

1. Wasserprobenentnahme, Konservierung und Extraktion

  1. Probensammlung und Konservierung
    1. Vor dem Gebrauch reinigen Sie die Flaschen mit einem geeigneten oberflächenaktiven Reinigungsmittel. Nach der Reinigung spülen Sie die Flaschen mit Wasser, abtropfen lassen und trocken.
    2. Proben werden in Glasflaschen von 2-L Kapazität ein Konservierungsmittel, bestehend aus 0,5 g Kupfer (II) -nitrat und 6 ml 3.6 M Salzsäure-Lösung enthält. Lagern Sie die Proben unter 10 ° C. Extrahieren und analysieren so bald wie möglich nach der Entnahme und Konservierung.
  2. Probenextraktion und clean-up (für Steroid - Östrogen - Analyse) 10
    1. Festphasenextraktion (SPE)
      1. Vor der Extraktion zu reduzieren Schwebstoffe, Filterwasserproben unter Verwendung von 1 & mgr; m-Filterpapier Porengröße.
        1. Sobald gefiltert, Spike - Proben mit internem Standard durch Zugabe von 100 & mgr; l von deuterierten internen Standard - Stammlösung Spick enthält 2,4,16,16-d 4 -estrone: 2,4,16,16-d 4 -17β-Estradiol (E2) : und 2,4,16,16-d 4 -17α-Ethinylestradiol (EE2) (alle bei 40 ug / l in Methanol) auf 1000 ml Abwasser (oder 100 ml Zufluß) für Abwasser in interne Spitze von 2 ng / L resultierende Abwasserproben und 20 ng / l für Abwasser einfließenden Proben.
      2. Bringen Sie Einwegventil Liner, Styroldivinylbenzol SPE-Kartuschen und Kartuschenreservoirs auf die SPE Vorrichtung. Schalten Sie Vakuumpumpe, das Gerät zu testen, ist ausreichend abgedichtet.
      3. Pipette 5 ml Ethylacetat in jedem Behälter, die Patronen zu konditionieren. Einschalten der Vakuumpumpe (unter 10 inHg eine Strömungsrate von weniger als 10 ml pro Minute zu ermöglichen)und ziehen durch die Flüssigkeit. Nicht die SPE-Kartuschen austrocknen lassen. Wiederholen Sie den Vorgang mit 5 ml Methanol von 5 ml Wasser.
      4. Top jede Patrone Behälter mit Wasser und verbinden 1/8 "PTFE-Schläuche zwischen den Patronenbehälter und Glasprobenflaschen. Schalten Sie das Vakuum mit einer Strömungsgeschwindigkeit von weniger als 10 ml pro Minute und damit die gesamte Probe durch die Kartusche zu passieren. leeren der Abfallflasche wie nötig.
      5. Gründlich trocknen Sie die SPE - Kartuschen unter Vakuum (oder durch die Luft oder Stickstoff) , bis die Kartuscheninhalt Farbe ändern (zB von dunkelbraun bis hellbraun).
      6. Setzen Sie sauberen, trockenen 10-ml-Glasfläschchen Sammlung in Rack- und Platz innerhalb des Abzuges vielfältig. Überprüfen Sie, dass jeder Liner über ein Fläschchen ist. Pipette 8 ml Dichlormethan in jeden Probenbehälter, Schalter an der Vakuumpumpe (Durchflussrate von weniger als 10 ml pro Minute) und ziehen Sie die Flüssigkeit, die durch in die Sammelfläschchen.
      7. Entfernen Sie 10 ml Fläschchen aus der SPE-Verteilerund verwenden Sie einen Konzentrator das Volumen auf 1 ml zu reduzieren. Bringen Sie jede Probe in Autosampler Fläschchen und konzentrieren sich weiter auf 100 & mgr; l unter Verwendung von Stickstoff umfallen Ausrüstung.
    2. Gelpermeationschromatographie (GPC) clean-up
      1. Injizieren 95 & mgr; l der eluierten Probenextrakt in die GPC ausgestattet HPLC unter Verwendung der Bedingungen , die in Tabelle 1. Konzentrieren Sie die GPC bis 200 & mgr; l Extrakt unten unter Verwendung eines Konzentrators und Stickstoffapparat umfallen und dann auf 2,0 ml mit Hexan bilden.
    3. SPE clean-up
      1. Bringen Sie Einwegventil Liner, Aminopropyl Patronen und Patronen Stauseen auf die SPE vielfältig. Setzen Sie sauberen, trockenen 10-ml-Glasfläschchen Sammlung in Rack- und Platz innerhalb des Abzuges vielfältig. Pipette 2 ml Hexan in jedem Behälter, die Patronen zu konditionieren. Lassen Sie die Flüssigkeit durch die Patronen zu passieren.
      2. Pipette, um die GPC Probenextrakt in den Behälter und lassen wieder die Flüssigkeit zuPass durch die Patrone. Sammeln Sie die Probeneluattröpfchens in dem Fläschchen und entfernen Sie aus dem Verteiler. Nicht Eluat verwerfen.
      3. Setzen Sie einen neuen sauberen, trockenen 10 ml Sammelgefäß in Rack und legen innerhalb Extraktion vielfältig. Um die Patrone zu waschen, 2 ml Ethylacetat in Hexan (30% v / v) zu dem Vorratsbehälter und ziehen die Flüssigkeit durch die Kartusche. Wiederholen mit weiteren 2 ml Ethylacetat in Hexan, verwirft alle Waschungen.
      4. Legen Sie das Original 10 ml Sammelgefäß (Schritt 1.2.3.2) zurück in Rack innerhalb des Abzuges vielfältig. Pipette 2 ml Ethylacetat in Aceton (50% v / v) in den Vorratsbehälter, einschalten der Vakuumpumpe (unter 2 inHg eine Strömungsrate von weniger als 2 ml pro Minute zu ermöglichen), und ziehen die Flüssigkeit durch in das Fläschchen . Wiederholen den Vorgang mit weiteren 2 ml Ethylacetat.
      5. Entfernen Sie das Probenfläschchen und verwenden Sie einen Konzentrator den Extrakt Volumen auf 1 ml zu reduzieren. Übertragen Sie die Probe in eine kleinere Glasfläschchen und verwenden Stickstoff umfallen Ausrüstung, verdunsten ter bis zur beginnenden Trockenheit extrahieren.
      6. 100 l Methanol und gut mischen. Übertragen Sie den Extrakt zu einem Autosampler Fläschchen (mit 0,3 ml Einsatz) und das Fläschchen verschließen. Analysieren Sie die Proben unter Verwendung von LCMS / MS (siehe Abschnitt 2).
Spalte: PL-Gel, 50 A, 300 x 7,5 mm, 5 & mgr; m
Schutzsäule: PL-Gel, 50 x 7,5 mm, 5 & mgr; m
Mobile Phase: Dichloromethane
Fließrate: 1 ml pro min
Säulentemperatur: 25 ° C
UV - Detektor: 210 nm
Injektionsvolumen: 95 & mgr; l
Einspritzmodus: Standard
Zeichnen Sie Geschwindigkeit: 500 ml pro min
Auswerfen Geschwindigkeit: 500 ml pro min
Zeichnen Position: 3 mm
Fraktion gesammelt: 3 ml-Fraktion (7 bis 10 min) in 10 ml Vials

Tabelle 1. Bedingungen und Parameter für die Gelpermeationschromatographie (GPC) Sanierung von Abwasserproben extrahiert. Tabelle Details GPC - Säule, mobile Phase, Temperatur, Injektionsvolumen und Detektor Wellenlänge.

  1. Probenextraktion (für Hefe-Estrogen Screen)
    1. Filterproben wie in Abschnitt 1.2.1.1. Bringen Sie Einwegventil-Liner, C18 SPE-Kartuschen und Kartuschenreservoirs auf die SPE Vorrichtung. Schalten Sie die Vakuumpumpe, das Gerät zu testen, ist ausreichend abgedichtet.
    2. Pipette 5 ml Methanol in jedem Behälter, die C zu konditionieren18 Patronen. Schalten Sie Vakuum (bis etwa 5 inHg einen Strom von etwa 5 ml pro Minute zu ermöglichen), und lassen Sie die Flüssigkeit durchlaufen, eine Pause für 1 min auf halbem Weg durch. Lassen Sie sich nicht die Patronen trocken laufen. Wiederholen Sie den Vorgang entweder mit HPLC - Qualität oder doppelt destilliertem Wasser (ddH 2 O). Auch hier laufen nicht trocken.
    3. Extrahieren von Wasserproben, wie in Abschnitt 1.2.1.4 beschrieben. Weiter das Vakuum mindestens 30 min für die Patronen gründlich trocknen.
    4. Legen Sie sauberen, trockenen 10 ml Fläschchen Sammlung in ein Rack in der Extraktions vielfältig. Überprüfen Sie, dass jeder Liner über ein Fläschchen ist. 5 ml Methanol wurden zu jedem Reservoir. Schalten Sie das Vakuum (maximalen Durchfluss von 5 ml / min) und die Flüssigkeit durch die Kartusche in das Fläschchen zu passieren, pausiert für 2 Minuten auf halbem Weg durch.
    5. Vor der Analyse der JA-Bildschirm verwenden, um den Extrakt bis zur beginnenden Trockenheit unter Verwendung von Stickstoff zu reduzieren und mit 500-1.000 & mgr; l Ethanol wiederherzustellen. Verschließen Sie die Deckel der Probengefäße Verdunstung zu vermeiden und halten bei 4 ° C (in einem funkenfreiKühlschrank).

2. Chemische Analyse Mit LCMS / MS

  1. Optimieren Sie die Betriebsbedingungen des LCMS / MS-System Verwendung der Herstelleranweisungen.
  2. Analysieren Sie Kalibrierstandardlösungen, die Probenextrakte, Leer- und analytischen Qualitätskontrolle (AQC) Proben , die die Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie Bedingungen verwendet, und überwachen die Ionenübergänge , wie in Tabelle 2 aufgeführt. Man bestimmt die Konzentration von Steroid Östrogene im Probenextrakt mit internen Standards 10.
LCMS
Liquid Chromatography
Spalte: C18 (2), 150 x 4,6 mm, 5 & mgr; m.
Injektionsvolumen: 20 ul
Fließen: 0,5 ml pro Minute.
Mobile Phase: Lösungsmittel A: Wasser mit 0,1% Ammoniak.
Lösungsmittel B: Acetonitril.
Gradient-Programm:
Zeit (min) 0 10 18 24 28
A: B-Lösungsmittel-Verhältnis 90:10:00 50:50:00 0.479167 0.479167 90:10:00
Massenspektrometer
Quelle: Elektro (negative Ionen)
Gas und Quelle: CUR: 20 psi, GS1: 70 psi, GS2: 30 psi
TEM: 600 ° C, CAD Gas 5 und Ionensprayspannung -900
MRM-Übergänge:
E1: 269/145 & 269/143
E2: 271/145 & 271/143
EE2: 295/145 & 295/143
E1-D4: 273/147
E2-D4: 275/147
EE2-D4: 299/145

Tabelle 2. Details Parameter und Bedingungen für LCMS / MS - Analyse von Steroid Östrogene in Abwasserextrakten. Tabelle gibt Probeninjektionsvolumen und Durchflussrate, mobile Phase Bedingungen einnd Steigung.

Mit 3. östrogene Aktivität in vitro - Yeast Estrogen Screen (JA) Assay 8

  1. Bereiten Sie und speichern Minimalmedium und Medium - Komponenten gemäß Tabelle 3 (a) bis (g).
(a) Minimal Medium (pH 7,1):
Bereiten einer Fe 2 (SO 4) 3 -Lösung durch Zugabe von 40 mg Fe 2 (SO 4) 3 bis 50 ml doppelt destilliertem Wasser (ddH 2 O)
1 L ddH 2 O in einen 2 l Glasbecher
Fügen Sie die folgenden Komponenten in den Becher:
13,61 g KH 2 PO 4
1,98 g (NH 4) 2 SO 4
4,2 g KOH
0,2 g MgSO 4
1 ml des Fe 2 (SO 4)
50 mg L-Leucin
50 mg L-Histidin
50 mg Adenin
20 mg L-Arginin-HCl
20 mg L-Methionin
30 mg L-Tyrosin
30 mg L-Isoleucin
30 mg L-Lysin-HCl
25 mg L-Phenylalanin
100 mg L-Glutaminsäure
150 mg L-Valin
375 mg L-Serin
Das Becherglas auf beheizten Rührer mit einem magnetischen Floh und rühren, bis alles gelöst ist,
Überprüfen Sie, dass der pH-Wert 7,1 und bei Bedarf einstellen
Unter Verwendung einer 50 ml sterile Spritze 45 ml Aliquots verzichtet werden in Glasflaschen mit Metall Schraubverschluss Deckel
Sterilisieren des Minimal Medium bei 121 ° C für 10 min in einem Autoklaven
Bei Raumtemperatur lagern
(b) D - (+) - Glucose:
Bereiten Sie eine 20% w / v Lösung in ddH 2 O
Dispense 20 ml Aliquoten in Glasfläschchen mit Metall Schraubverschluss Deckel
Sterilisieren der Glukoselösung bei 121 ° C für 10 min in einem Autoklaven
Bei Raumtemperatur lagern
(c) L-Asparaginsäure:
Machen Sie eine Stammlösung von 4 mg / ml in ddH 2 O
Dispense 20 ml Aliquoten in Glasfläschchen mit Metall Schraubverschluss Deckel
Sterilisieren des L-Asparaginsäure-Lösung bei 121 ° C für 10 min in einem Autoklaven
Bei Raumtemperatur lagern
(d) Vitamin Lösung:
Vorbereiten eines Biotin - Lösung durch Zugabe von 2 mg Biotin zu 100 ml ddH 2 O
Man wiegt 8 mg Thiamin, 8 mg Pyridoxin, 8 mg Pantothensäure, 40 mg Inositol. Fügen Sie alle trockenen Komponenten und 20 ml der Biotin - Lösung auf 180 ml ​​ddH 2 O
Machen Sie 10 ml sterilen Aliquots durch Filtrieren durch einen 0,2-um Porengröße Einwegfilter in sterile Glasflaschen, in einem laminaren Luftstrom Kabinett
Lagerung bei 4 ° C
(e) L-Threonine:
Herstellung von 100 ml von 24 mg / ml L-Threonin in ddH 2 O
Dispense 10 ml Aliquoten in Glasfläschchen mit Metall Schraubverschluss Deckel
Sterilisieren der L-Threonin-Lösung bei 121 ° C für 10 min in einem Autoklaven
Bei Raumtemperatur lagern
Vorbereitung 25 ml einer 20 mM Kupfer (II) -sulfatlösung in ddH 2 O
Bilden 5 ml sterile Aliquots durch Filtrieren durch einen 0,2-um Porengrße Filter in sterile Glasflaschen, in einer laminaren Strömung Schrank
Bei Raumtemperatur lagern
(g) Chlorphenolrot-β-D-galactopyranosid (CPRG):
Vorbereitung 25 ml einer 10 mg / ml Lösung von CPRG in ddH 2 O
Bilden 5 ml sterile Aliquots durch Filtrieren durch einen 0,2-um Porengrße Filter in sterile Glasflaschen, in einer laminaren Strömung Schrank
Lagerung bei 4 ° C

Tabelle 3. Hefe Estrogen Screen - Assay; Herstellung und Lagerung von Minimalmedium und Medium - Komponenten.

  1. Vorbereitung und storage von 10x konzentrierter Hefekultur
    1. Am Tag 1 vorbereiten Wachstumsmedium (wie in 3.4.1 beschrieben) und in einen sterilen Erlenmeyerkolben gießen. Hinzufügen 125 ul 10fach konzentrierten Hefe aus Kryoröhrchen bei -20 ° C gelagert. Inkubieren des beimpften Medien bei 28 ° C für etwa 24 Stunden auf einem Rundschüttler.
    2. Am Tag 2 machen zwei Flaschen Wachstumsmedium (~ 50 ml) und gießen Sie in separate sterile Erlenmeyerkolben. 1 ml der 24-Stunden-Reinzuchthefe in jedem Kolben Wachstumsmedium. Inkubieren des beimpften Medien bei 28 ° C für etwa 24 Stunden auf einem Rundschüttler.
    3. Am Tag 3 gießen jede 24-Stunden-Kultur in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugation der 50-ml-Röhrchen bei 4 ° C für 10 min bei 2.000 x g. Gießen Sie den Überstand ab und resuspendieren jedes Pellet in 5 ml Minimalmedium mit 15% Glycerin. Machen Sie 0,5 ml Aliquots der 10-fach konzentrierter Hefekultur in 1,2 ml sterile Kryoröhrchen und bei -20 ° C für maximal 4 Monate.
  2. PrepaRation und Lagerung von chemischen Bestände für Standardkurven
    1. Spülen Sie alle Gläser und Spachteln zweimal mit absolutem Ethanol und lassen Sie vor dem Gebrauch trocknen alle Spuren von Verunreinigungen zu entfernen.
    2. Wiegen E2 direkt in ein Glasfläschchen in einem Pulver Wägekabine und stellen Volumenkonzentration in absolutem Ethanol. Verdünnt auf eine Konzentration von 2x10 -7 M (54,48 & mgr; g / L). Seal Deckel und lagern bei 4 ° C (in einem funkenfreien Kühlschrank).
  3. Assay Produzent
    1. Am Tag 0 Wachstumsmedium herzustellen. Die 45 ml Flasche Minimalmedium 5 ml Glucose-Lösung, 1,25 ml L-Asparaginsäure-Lösung, 0,5 ml Vitaminlösung, 0,4 ml L-Threonin-Lösung und 125 & mgr; l Kupfer (II) sulfat-Lösung. Gießen Wachstumsmedium in einen sterilen Erlenmeyerkolben.
      1. Hinzufügen 125 ul 10fach konzentrierte Stamm (abgetaut von -20 ° C Lagerung) in den Kolben und Inkubieren der inokulierten Medien bei 28 ° C für etwa 24 Stunden auf einem Rundschüttler.
    2. Am Tag 1 beschriften eine sterile 96-Well 'Verdünnungsplatte' und Reihenverdünnungen (100 ul - Volumina in Ethanol) von E2 Standardkurve und Testchemikalie (n) / Abwasser - Extrakt (s) (zB EE2) machen.
    3. Label-sterile 96-Well-optisch flachen Boden Mikrotiterplatte 'Assayplatte (n)'. Auf jeder Platte sind Rohlinge (plus / minus Lösungsmittel) und eine E2 Standardkurve, zusätzlich zu den Reihen der Testchemikalie (n) / Abwasser-Extrakt (n).
    4. Je 10 ul jeder Konzentration (E2, chemischen oder Extrakt) in die entsprechende Vertiefung der Testplatte. Je 10 ul Ethanol in jedem 'Lösungsmittel leer' Vertiefung der Testplatte. Lassen Testplatte mit dem Deckel aus bis zur Trockenheit verdampft.
    5. Machen Sie eine Flasche Wachstumsmedium (~ 50 ml) und mit 0,5 ml Chlorphenolrots-β-D-galactopyranosid (CPRG) -Lösung pro Flasche. Bestimme die Dichte der Hefezellen in der 24-Stunden-Kultur durch Trübung der Kultur bei 620 nm in einem Plattenlesegerät gemessen wird. Impfen die einssay Medium mit 4x10 7 Hefezellen aus dem 24 - Stunden - Kultur.
    6. Gießen geimpften Testmedium in einen sterilen Trog. Mit fügen Sie eine Mehrkanalpipette 200 ul geimpften Testmedium zu jeder Vertiefung der 96-Well-Assayplatte.
    7. Setzen Sie den Deckel auf der 96-Well-Assayplatte und die Ränder mit Klebeband. Schütteln Sie die Testplatte (n) 2 Minuten lang kräftig auf einer Titerplatte Schüttler und Inkubation bei 32 ° C in einem natürlich belüfteten Wärmeschrank.
    8. Am Tag 2, schütteln Sie die Testplatte (n) kräftig auf einer Titerplatte Schüttler für 2 min. Zurück zu 32 ° C Inkubator.
    9. Am Tag 4, schütteln Sie die Testplatte (n) 2 Minuten lang kräftig auf einer Titerplatte Schüttler. Lassen Sie die Platte (n) für ca. 1 Stunde ruhen lassen, dann lesen Sie die Testplatte (n) bei einer Absorption von 540 nm (optimale Absorption für CPRG ~ 575 nm) und 620 nm (für Trübung) einen Plattenleser. Lassen Sie Platte (n) bei Raumtemperatur und bei Bedarf später zu lesen.
  4. Östrogene Aktivität Berechnungen <ol>
  5. Korrekte Teststände für die Trübung der folgenden Gleichung: Korrekturwert = Probe oder Standard (E2) Absorption bei 540 nm - [Probe oder Standard (E2) Absorption bei 620 nm - leere Absorption bei 620 nm]. Plot E2 Standardkurve mit entsprechenden Rohlingen (für Kontamination zu überprüfen) 8.
  6. Verwenden Sie die korrigierten Probe (Extrakt oder chemisch) 'Estradiol-Äquivalente "zu berechnen. Verwenden Sie die aufgetragen E2 Standardkurve Werte und Regressionsgleichung (3-Parameter Polynom oder linear in Abhängigkeit von fit), um die Probe zu interpolieren / extrahieren Absorptionswerte zu E2 äquivalente Werte. Verwenden Konzentrationsfaktor (dh Wasser extrahiert und das Volumen von Ethanol der Extrakt wird erneut suspendiert in) östrogene Aktivität in der Probe vorextrahiertem zu berechnen.

4. Labor Based Assessment von östrogene Aktivität Mit In - vivo - Vitellogenin Induction in Male Elritze

  1. Verwenden männlich Elritze (Pimephalespromelas)> 4 Monate alt, die sekundären Geschlechtsmerkmale angezeigt werden (dh die Entwicklung von hochzeitlich Tuberkel und ein Rückenfettpolster), der männlichen Geschlechtsbestimmung.
    1. Zur Laichaktivität, getrennte reife Männchen 3 Wochen (± 3 Tage) vor dem Beginn des Tests zu verhindern. mindestens zwei 45-l-Glasaquarien mit einer maximalen Belastung von 3 g / l ein. Um eine ausreichende Anzahl von gesunden Fisch für den Test zu gewährleisten, verwenden ein Minimum von 100 Männern.
    2. Halten Sie die männlichen Fische unter gleichen Umweltbedingungen wie im Test erfahren werden (dh Wassertemperatur von 25 ± 1 ° C und einem 16: 8 Stunden Licht: Dunkel Lichtperiode). Aufrechterhaltung der Verdünnungswasserströmungsrate zu jedem Tank eine 95% Austauschzeit von 6 bis 8 Stunden mindestens alle zu gewährleisten, das heißt, 330 ml / min für eine 45 - Liter - Behälter.
  2. Prüfeinrichtung und experimentelles Design
    1. Verwenden Sie große Glasbehälter eine Beladung von bis zu 3 g Fisch aufzunehmen pro Liter water. Für 8 erwachsene Männer (nominell 4,5 g pro Stück), verwenden Sie einen 10 bis 20 L Tank.
      1. Verwenden Sie zwei Wiederholungstanks für jede Behandlung und schützen jeden Tank von unnötigen Sehstörungen (dh, verwenden Sie laminierte Karte Bildschirme zwischen den Tanks). Kennzeichnen Sie jeden Behälter mit einer Studie Nummer, eine Expositionskonzentration und einem Behälter-Identifikationsnummer.
    2. Für Abwasser anfällt, Studien
      1. Bei der Ankunft Transfer sofort Abwasser in einen Lagertank bei 10 ± 1 ° C. Beginnen Sie innerhalb von zwei Stunden nach Erhalt des Abwassers Dosierung Abwasser.
      2. Führen Sie das Abwasser über peristaltische Pumpe, aus dem 10 ° C Lagertank zu einem Akklimatisierung Gefäß. Erhitzen Sie das Abwasser in der Akklimatisierung Gefäß auf 18 ± 2 ° C. Pumpe den beheizten Ausfluß aus dem Gefäß Akklimatisierung an die Dosier- / Mischgefäße und dann auf den Testaquarien (die den Fisch hält). Erhitzen Sie die Aquarien auf eine Temperatur von 25 ± 1 ° C.
    3. Für die chemische Dosierung Studien
      1. Wiegen Testchemikalien in einem Pulver Wägekabine. Bereiten konzentrierten chemischen Bestände in ddH 2 O vorzugsweise ohne die Verwendung von Lösungsmitteln.
        Hinweis: Falls Lösungsmittel erforderlich sind, um Testverbindungen löslich zu machen, verwenden Lösungsmittelkontrollen zusätzlich zu der Verdünnungswasserregelung.
      2. Schwerkraftzufuhr oder Pumpe Verdünnungswasser von einer Temperatur gesteuert Verteilerbehälter über die Strömungssteuervorrichtung (en) zum Dosier- / Mischbehälter. Pumpe konzentrierte chemische Lager (n) eine peristaltische Pumpsystem zur Dosierung mit / Mischgefäße. Steuern Sie die Pumprate (von Lager chemisch) und Wasserdurchflussmenge (Verdünnungswasser), um die gewünschte Belichtungs Konzentration zu erreichen.
        Hinweis: Verwenden Sie Silikonschlauch Wasser / Test-Chemikalie zu jedem Testgefäß von der Dosier- / Mischbehälter zuzuführen. Verwenden , um eine Durchflussrate , die eine 75% Gefäßersatz in mindestens 24 Stunden zu liefern ausreichend ist, das heißt, 20 ml / min für eine 20 l - Tank. Pflegen Sie die Durchflussrate bei ± 10% des angegebenen Nennwert.
      Aufrechterhaltung Belichtungstank Wassertemperatur bei 25 ± 1 ° C, gelöstem Sauerstoff über 70% des Luftsättigungswert (5,8 mg L -1 bei 25 ° C) und ± 0,5 pH - Einheiten (Ausgangs - pH zwischen 6,5 und 8,5) im gesamten Studie. Stellen Sie Lichtbedingungen Photoperiode von 16 Stunden Licht: 8 Stunden Dunkelheit, mit Morgen- / Abenddämmerung Übergangszeiten von 20 min.
    4. Füttern Sie die Fische zweimal täglich mit frisch aufgetauten gefrorenen erwachsenen Artemia (Artemia) bei 2,5 (± 0,1) g pro Behälter pro Feed. Auch die Fische zu füttern einmal täglich mit einer kleinen Menge (zwei Fingerklemm) eines tropischen Flocke Fischfutter. Lassen Sie mindestens 3 Stunden zwischen jedem Feed.
      1. Halten Sie eine tägliche Fütterung Aufzeichnung der Fütterung Antwort / Verhalten (gut, mittel oder schlecht, im Vergleich zu den Kontrollen) zu überwachen. Siphon die Tanks mindestens zweimal in der Woche (am besten täglich) alle Futterreste und Kot zu entfernen. Reinigen Sie die Seiten und Böden der Testgefäße mindestens einmal pro Woche.
    5. Nehmen Sie wöchentliche Wasserprobes aus jedem Tank östrogene Aktivität zu bestätigen (über Hefe-Bildschirm) und die chemische Zusammensetzung (über analytische Chemie). Siehe Abschnitte 1-3 Einzelheiten zur Wasserentnahme, Extraktion und Analyse.
      Anmerkung: Für jedes Experiment verwenden Verdünnungswasserregelung (negative Kontrolle), Positivkontrolle (E2 oder EE2) plus mindestens drei Verdünnungen von Abwasser (100, 50 und 25%) oder Prüfsubstanz Dosis-Reaktion zu überwachen. Wenn neue Technologien getestet werden, verwenden Verbindung / Abwasser mit oder ohne Behandlung (zB EE2 ohne Behandlung, EE2 mit TAML / Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) Behandlung 12; Abbildung 1).

Abbildung 1
Abbildung 1. Diagramm darstellen experimentelle Gestaltung eines in vivo Dickkopfelritze vitellogenin Bioassay Entfernung von Ökotoxizität von 17α-Ethinylestradiol mit TAML / Peroxid - Wasserbehandlung zu bestimmen. Die experimental eingerichtet besteht aus acht 11-l-Glasaquarien jeweils gefüttert mit kontinuierlichen Fluss von Wasser. Einzelne chemische Stammlösungen und Wasser (gefiltert de-chlorierten) an die Mischkammern geliefert. Nominal - Konzentrationen (ohne Reaktion) in den Mischbehälter sind 2 ng / L EE2, 80 nM TAML und 0,16 g / LH 2 O 2. Chemische Stammlösungen (EE2, H 2 O 2 und TAML) hergestellt und separat dosiert , so dass die Reaktionen in den Mischbehälter beginnen. Fisch (8 männlich Elritze pro Tank) werden dem Gemisch ausgesetzt (n) nach einer Reaktionskontaktzeit von ca. 45 Minuten. Wasserproben werden von den Belichtungstanks wöchentlich genommen. Die Plasmaproben werden von Elritzen getroffen, um die östrogene Biomarkers vitellogenin (VTG) von einer Basisgruppe zu messen, zu Beginn der Studie und alle anderen Fische nach 21 Tagen nach der Exposition. Die spezifischen Behandlungen sind: '-C'; Negativkontrolle (Verdünnungswasser), '+'; positive Kontrolle von EE2,'+ H'; EE2 plus H 2 O 2, '+ T'; EE2 plus H 2 O 2 plus TAML. Diese Zahl wurde von Mills et al modifiziert. 2015 12. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Testprozedur
    1. Akklimatisierungszeit
      1. Messen Sie Nassgewicht (g) jeder geschlechtsreifen männlichen Fische, und weisen nach dem Zufallsprinzip zu jedem Tank (8 Männer pro Tank).
      2. Halten Sie nicht zugeordneten Fisch aus der gleichen Charge und halten sie unter den gleichen Testbedingungen. Verwenden Sie diese Fische keine Personen zu ersetzen, die während des Zeitraums von 7 Tagen Akklimatisierung Anzeichen von körperlichen Schäden oder fehlenden Zustand zeigen. Stellen Sie sicher, am Ende der Eingewöhnungszeit jeder Behandlungstank hat 8 Männer, die auf den Testbedingungen vollständig akklimatisiert haben.
      3. Nehmen Sie 'Baseline' Plasmaproben von zusätzlichen 8 männlichen Patienten aus der gleichen batch von männlichen Fischen. Folgen Sie der Blutentnahme Verfahren in Abschnitt 4.4 und die Vitellogenin (VTG) Analyseverfahren 4.5.
    2. Nach der Eingewöhnungszeit, liefern Abwasser oder Chemikaliendosierung Beständen an die Belichtungstanks für 21 Tage unter 4.2.2 oder 4.2.3 beschrieben. Monitor Mortalität, Verhalten und Aussehen der Fische in jedem replizieren Tank täglich vor der ersten Einspeisung des Tages. Nehmen Sie jeden anormales Verhalten oder Vorfälle.
      Hinweis: Stellen Sie sicher, Umgebungsbedingungen und Fütterung Raten Erhaltung der Gesundheit der Fische (Abschnitte 4.2.4 und 4.2.5).
  2. Fisch-Probenahme nach 21 Tagen Expositionszeit
    1. 12 Stunden vor der Probenahme, stoppen Sie die Fische füttern.
    2. Label-Mikrozentrifugenröhrchen für die Entnahme von Blutproben, fügen ~ 5 ul Aprotinin (ein Protease-Inhibitor) und legen sie auf Eis.
    3. Machen Sie eine 500 mg / l-Lösung von MS222 (Betäubungsmittel) durch Auflösen von 500 mg MS222 pro 1 l de-gechlortes Wasser (vorher akklimatisiertauf 25 ± 1 ° C). Neutralisieren des MS222 auf pH 7,4 ± 0,4 unter Verwendung von 1 M NaOH.
    4. Bewegen jeder Fisch aus dem Tank in die gepufferte MS222. Halten Sie in der Lösung bis zur Einstellung aller operculum Bewegung (in der Regel 5 ± 1 min).
    5. Messen Sie und die Gabellänge (mm) unter dem Terminal Anästhetikum aufzunehmen. Verwenden Sie eine Einweg - Skalpell den Schwanz amputiert werden , und die Verwendung einer heparinisierten hemocrit Rohr das Blut aus der Schwanzarterie (Abbildung 2) zu sammeln. verzichten Sie vorsichtig das Blut in den voretikettierten Mikrozentrifugenröhrchen und auf Eis halten.
    6. Töten Sie den Fisch sofort nach der Blutentnahme. Bestätigen Sie den Tod durch die endgültige Einstellung der Zirkulation und / oder die Zerstörung des Gehirns. Zu messen und aufzuzeichnen Gewicht Gesamt Fisch (bis nächsten 0,01 g) und sezieren Gewebe nach Bedarf.
    7. Zentrifugieren Sie das Blut (7000 × g für 5 Minuten bei 4 ° C) innerhalb von 2 Stunden der Sammlung. Übertragen Sie die Plasmaüberstand mit einer Pipette in neue markierten 0,4 ml Reaktionsgefäße mites und auf Eis lagern. Frieren Sie die Röhrchen mit Plasma auf Trockeneis innerhalb von 30 min Zentrifugation und bei -80 ° C vor der Analyse von Plasma-VTG-Konzentrationen.

Figur 2
Abbildung 2. Fotos zeigt männliche Dickkopfelritze (Pimephales promelas), Plasma - Sammlung und Lage der Hoden. Am Ende der Belichtung von 21 Tagen alle Fische sollten Blutproben zu sammeln getötet werden. Sobald unter diesem Anschluss Anästhetikum Fischlänge (Gabellänge, mm) gemessen werden sollte, schnell gefolgt von der Blutentnahme aus der Schwanzarterie Photo-A: Rot . Gepunktete Linie zeigt Lage für Schwanz Amputation (ein Einweg - Skalpell verwendet werden sollte , den Schwanz amputieren ). Foto-B zeigt ein heparinisiertes hemocrit Rohr verwendet , um das Blut zu sammeln. Jeder Fisch sollte dann sofort getötet werden, nachdem seine Blutprobe in diesem Fall getroffen wurde, der ganze Kopfwurde aus dem Körper (Photo-C) abgetrennt. Sobald der Fisch getötet wurde, kann der Körperhöhle, die inneren Organe zu offenbaren geöffnet werden. Foto-C zeigt die Lage des Hodens (Gonaden) in Bezug auf die Schwimmblase (SB) in Cypriniden, zB Dickkopfelritze, Rotauge, Karpfen usw. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Messen Sie Plasma VTG-Konzentrationen mit einer homologen VTG Enzyme Linked Immuno Assay (ELISA) Kit speziell für Elritze entworfen.
    1. Bereiten VTG Standards und Puffer wie im Protokoll des Herstellers beschrieben. Verdünnte Plasmaprobe 01.50, 1: 5000 und 1: 500.000 und testen sie in zweifacher Ausfertigung zu erhalten Lesungen des VTG-Standardkurvenbereich nach Herstellerangaben. Folgen Sie Herstellerrichtlinien vitellogenin Konzentrationen zu berechnen.

    5. Feldprüfungen von Advanced / Neuartige Abwasserreinigung Technologien zur Milderung östrogene Aktivität Mit In - vivo - Vitellogenin und Intersex Induction in Roach (Rutilus rutilus)

    1. Erfassung von wilden Rotauge leben stromabwärts Kläranlage Vorfluter
      Hinweis: Verwenden Sie Plötze (Rutilus rutilus) oder andere reichlich Süßwasser oder Brackfischarten, die gonochoristic und bekannt sind empfindlich gegen östrogene Störungen des Hormonsystems zu sein.
      1. Fische fangen mit electro, Netting, Trapping oder anderen anerkannten Fangmethoden je nach Situation 13. Transportieren Sie den Fisch in belüfteten Tanks zurück zu Labor für Probenahme.
      2. Bereiten Mikrozentrifugenröhrchen, wie in 4.4.2 beschrieben. Prepare MS222 gepuffert, wie in 4.4.3 beschrieben. Anesthetize Fisch wie in 4.4.4 beschrieben.
      3. Messen Sie Fisch Länge und Gewicht unter Klemme Narkose.
      4. Sammeln Sie Blut aus der Schwanzarterie mit dispoZobel heparinisierten Spritze. Töten Sie jeden Fisch unmittelbar nach der Blutentnahme. verzichten Sie vorsichtig das Blut in vormarkiert Mikrozentrifugenröhrchen und auf Eis halten. Bereiten Sie Plasma, wie in Schritt 4.4.7 und messen die VTG durch ELISA (4.5) beschrieben.
      5. Mit einer Pinzette 2-3 Fischschuppen von jedem Fisch entfernen und einzeln beschriftet kleine Papierumschläge platzieren. Bewahren Sie Umschläge bei Raumtemperatur unter trockenen Bedingungen für eine spätere Fischaltersbestimmung und Wachstumsanalyse.
      6. Offene Körperhöhle mit einem Skalpell die inneren Organe zu offenbaren. Nehmen Sie den Darm, um die Schwimmblase mit einem Gonaden auf beiden Seiten (Abbildung 2) zu offenbaren. Entfernen Sie vorsichtig die paarigen Gonaden mit feinen nosed Zange aufnehmen und in ein Glasfläschchen. Decken Sie die Gonaden mit Bouin-Fixiermittel in einem Verhältnis von 1:10 Gewebe: Fixativ.
      7. Lassen Sie das Gewebe in Bouin-6-24 h in Abhängigkeit von der Größe des Gewebes (Fixiermittel bei 1 mm pro Stunde durchdringt). Einmal festgelegt, gießen Sie die Bouin-Fixiermittel ein Offd mit 70% technischem Brennspiritus (IMS) zu ersetzen. Lagern Sie das fixiertem Gewebe bei Raumtemperatur bis Gewebe für die Histopathologie (Abschnitt 5.3) verarbeitet werden.
    2. Feldbasierte Bewertung von östrogene Aktivität unter Verwendung von in vivo vitellogenin und Intersex - Induktion in Rotauge
      1. Experimentelles Design und Aufbau
        Hinweis: die Tanks und Pilotanlage im Vorfeld der in - vivo - Arbeitsbeginn ein. Starten Sie die Tanks 3-4 Wochen vor jeder Zugabe von Fisch in das System fließt. Monitor - Wasserdurchflussraten, Wasserqualität und Bedingungen (pH - Wert, Temperatur, gelöster Sauerstoff, etc.) regelmäßig sicher , dass Parameter zu machen aufrechterhalten werden kann.
        1. Construct großen Tanks (zB 300-1000 L) vor Ort an der Pilotanlage, die erhalten können "Kontrolle" de-chloriertem Leitungswasser, Standard behandelte Abwasser (n) und Advanced behandelte Abwasser (s) parallel. Bringen Sie Luftpumpe / Belüfter in die Tanks. Set Wasserdurchflussraten von mindestens 6 Tank v zu erreichenolume Austausch pro Tag.
          Hinweis: Stellen Sie sicher, dass Tanks gut isoliert sind und im Schatten zu hohe tägliche Temperaturschwankungen zu verhindern. Design tanks Beobachtung der Fische, für Verhaltensänderungen (mangelnde Ernährung, etc.), Krankheitsanzeichen und Mortalität zu ermöglichen.
      2. Starten Sie die Belichtung durch die Taschen von Rotaugen schwimmend (von der Fischfarm) in den jeweiligen Tanks für 1 Stunde. In Tank Wasser in die Taschen nach und nach, bis die Wassertemperatur und Bedingungen sind Umgebungs. Lassen Sie die Fische in ihre Tanks.
      3. Feed-Erwachsenen Rotauge täglich auf Fischfutter (Größe 0,5-0,8). Feed - juvenile Rotauge täglich auf kleinen pelletiert (Pelletgrößen 100-300) nicht-östrogene Futter 14 ad libitum, auf der Grundlage von uneaten Futter angepasst. Halten Sie eine tägliche Fütterung Aufzeichnung Dokumentieren Fütterung Antwort / Verhalten (gut, mittel oder schlecht, im Vergleich zu den Kontrollen).
      4. Nehmen Sie wöchentliche Wasserproben aus jedem Tank östrogene Aktivität und chemische Zusammensetzung zu bestätigen. See Abschnitte 1-3 für Details von Wasser Probenahme- und Analyseverfahren.
    3. Histopathologie der Fisch Gonaden 15
      1. Entfernen Sie vorsichtig die seziert und fixiert Gonaden aus dem Behälter mit einer Pinzette und auf einem Schneidebrett (5.1.6 und 5.1.7 in den Schritten beschrieben).
      2. Verwenden Sie ein Mikrotom-Klinge jedes Gonaden in 3 Teile zu schneiden (anterior, Mitte und posterior) und von jedem Teil geschnitten, um eine 3-5 mm dicken Querschnitt. Vorsichtig alle sechs Stücke in eine Plastik Biopsie Kassette markiert, aufnehmen und in Gewebeprozessor die Zeiten in der Tabelle 4 aufgeführt werden.
      3. Wax einbetten Gewebe und Abschnitt auf Rotationsmikrotom (3-5 & mgr; m). Transferabschnitte an markiertes bioadhäsiven beschichteten Glasobjektträger und die Objektträger auf einer erhitzten Platte (eingestellt auf 45 ° C) für 24 Stunden zu trocknen.
      4. Stain die Folien, entweder manuell oder ein automatisiertes stainer verwenden, mit Hilfe der detaillierten Timings in Tabelle 5. Geben Sie einen Tropfen Befestigungsmittel auf dem gefärbten Gewebe und lay Deckglas ein Glas mit der Montagemittel über das Gewebe zu schützen.
      5. Zunächst untersuchen jede Folie bei geringer Vergrößerung (20X, dh 2x Objektiv mit 10fach Auge Linien Vergrößerung) Geschlecht und die Anzahl der Punkte von Anlagen zur Körperhöhle 15 zu bestimmen. Notieren Sie alle Abweichungen für jeden Fisch.
      6. Bei einer höheren Vergrößerung (100X oder 400X), untersuchen das Gewebe gametogenesis Stadien, Anomalien und die Anwesenheit von Eizellen in Hodengewebe zu beurteilen. Notieren Sie sich die Schwere der Intersex das folgende Bewertungssystem unter Verwendung von 0 (normale männliche Gewebe) bis 7 (100% Ovargewebe) 6 (siehe Tabelle 6).
    Schrittnummer Behandlung Zweck Zeit (hr)
    1 70% IMS Entwässerung 3
    2 90% IMS Entwässerung 2.5
    3 95% IMS Entwässerung 1.5
    4 100% IMS Entwässerung 1.5
    5 100% IMS Entwässerung 1.5
    6 100% IMS Entwässerung 1.5
    7 100% IMS Entwässerung 1.5
    8 Histologie der Clearingstelle, Clearing 1.5
    9 Histologie der Clearingstelle, Clearing 1.5
    10 Histologie der Clearingstelle, Clearing 1.5
    11 WACHS Wachs-Infiltration 1,25
    12 WACHS Wachs-Infiltration 1,25
    20 Stunden TOTAL

    Tabelle 4. Verarbeitungssystem für Wachs Gewebe für die Histopathologie imprägniert wird . Die Gewebe sollte in einem automatischen Gewebeprozessor verarbeitet werden. Gewebe sind in den Lösungen für die Zeitdauer angegeben detailliert eingetaucht werden.

    Stain - Nr. Fleck Zweck Zeit (min)
    1 Histologie Clearing Agent Löst Wachs 15
    2 Trink 2
    3 90% IMS Trink 2
    4 70% IMS Trink 2
    5 TAP WATER (RUNNING) Spülen 2
    6 Hämotoxylin Stains Zellkerne blau 10
    7 TAP WATER (RUNNING) überschüssiges 10
    8 Aufgesäuerte IMS Entchlorung 20 sec
    9 TAP WATER (RUNNING) Spülen 20 sec
    10 LiCO 3 Salz 20 sec
    11 TAP WATER (RUNNING) Spülen 20 sec
    12 1% Eosin (wässerig) Stains Zytoplasma rosa 20 sec
    13 TAP WATER (RUNNING) überschüssiges 5
    14 70% IMS Entwässerung 2
    15 90% IMS Entwässerung 2
    16 100% IMS Entwässerung 5
    17 Histologie Clearing Agent Entfernen IMS, Bindemittel 5

    Tabelle 5. Lösungen und Eintauchzeiten für Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung von Fisch Gonaden - Gewebe. Die Objektträger sollten in jedem Bad für die alloc platziert werdenATED Mal in Folge. H & E-Färbung von Gewebe erforderlich ist auf Fisch Gonaden Entwicklungs- oder organisatorischen Auswirkungen von östrogene Abwässern zu bestimmen.

    Ergebnis Abschnitt Beschreibung
    0 Normale männliche Hoden
    1 Multifocal Ovotestis mit 1-5 Oozyten (in der Regel einzeln) unter dem Hodengewebe verstreut
    2 Multifocal Ovotestis, 6-20 Eizellen oft in kleinen Gruppen unter dem Hodengewebe verstreut
    3 Multifocal Ovotestis, 21-50 Oozyten in Clustern
    4 > 50 und <100 Oozyten. Abschnitt ist in der Regel multifokale und hat das Aussehen eines Mosaiks von Testicular und Eierstockgewebe.
    5 > 100 Eizellen, in der Regel multifokale aber auch mit deutlich erkennbaren Zonen von Eierstock- und Hodengewebe getrennt aus dem Hodengewebe Schwerpunkt sein könnte.
    6 > 50 Prozent des Gonadengewebe auf dem Abschnitt ist Eierstock- und eindeutig aus dem Hodengewebe von Epithelzellen und phagozytischen Gewebe getrennt ist.
    7 100 Prozent der Gonadengewebe auf dem Abschnitt ist ovarian.

    Tabelle 6. Scoring - System Schwere der Intersex - Zustand in Rotauge zu beurteilen. Histologisch Präparate von Gonadengewebe sollte unter dem Lichtmikroskop untersucht werden, bei 20X, 100X und 400 - facher Vergrößerung, Anomalien und die Anwesenheit von Eizellen in Hodengewebe zu beurteilen. Diese Tabelle wird von Iobling modifiziert <em> et al. 2006 6.

Representative Results

Versuche, die Auswirkungen von Verbesserungen an Abwasserbehandlungsprozesse zu verstehen, oder die am besten geeignete Technologie nachzurüsten Ausrüstung als tertiäre Behandlung bei bestehenden Kläranlage in Bezug auf die Wirksamkeit der Entfernung von endokrinen Aktivität der abgeführten Abwässer, um zu bestimmen, bedarf es nicht nur um die Messung von chemischen Schlüssel Komponenten, die die Werke, sondern erfordert die Analyse der Abbauprodukte, die endokrine Wirkung haben können auch eingeben. In häuslichem Abwasser Abwässer, die meisten östrogene Substanzen sind die Steroidhormone, Östron (E1), 17β-Estradiol (E2) und 17α-Ethinylestradiol (EE2) 5,8. Steroidöstrogene werden in erster Linie aus dem Körper als ein Gemisch von inaktiven Konjugaten 16,17 ausgeschieden. Diese konjugierten Östrogenen sind in der Kanalisation durch bakterielle Aktivität und einen weiteren Abbau erfolgt in der Kläranlage im Wesentlichen dekonjugiert. Die dekonjugiert Steroide are aus dem Abwasserstrom durch Adsorption entfernt Schlamm oder während sekundären Behandlungs biologisch abgebaut in der Formation führt, zunächst Transformationsnebenprodukte und schließlich vollständige Mineralisierung der anfänglichen aktiven Komponente auftreten. Die chemische Analyse aller Einzelverbindungen im Austragsstrom wäre schwierig, zeitaufwendig und kostspielig und würde nicht unbekannten aktiven Komponenten in einer Probe vorhanden bedecken. Darüber hinaus wird eine Summe der östrogenen Beitrag jeder Komponente nur einen Hinweis auf die kumulative östrogene Potenz einer Probe der untersuchten Verbindungen bereitzustellen. Dies ist ein Risiko, wo Transformationsprozesse erzeugen unbekannte östrogene Substanzen oder wo das einfließende ist industrieller Herkunft. Chemische Analyse kombiniert mit in vivo und in vitro Bioassays ökotoxikologische stellt eine Lösung für das Vorhandensein von unbekannten östrogenen Komponenten in Mischungen , wie beispielsweise behandelte Abwasser. In - vitro - Assays wie den Yeast Estrogen Screen (YES) wurden in behandelten Proben 8,18,19 ausgiebig zu bestimmen , die östrogene Aktivität von Abwässern und zur Identifizierung der aktiven Komponenten verwendet. Doch Vergleiche zwischen in vivo und in - vitro - Tests können 11 und eine umfassende Beurteilung neuer Prozesse in Bezug auf die Behandlung von endokrin wirksame Potenz von Bedeutung sein erfordert eine Batterie von chemischen und ökotoxikologischen Tests.

Eine Bestimmung, ob einzelne Behandlungsanlagen oder Prozesse entfernen Wirkstoffe aus dem Abwasserstrom erreicht werden kann, die chemische Analyse unter Verwendung der Probenextraktion, Konzentration und clean-up des Extraktes vor der Analyse, meist folgt mit LCMS (/ MS) durchgeführt oder GCMS (/ MS) Methoden. Die Daten aus der chemischen Analyse erhalten wird, kann verwendet werden , die Einhaltung zu bestimmen , mit individuellen keine Wirkung Konzentrationen vorhergesagt (PNEC) 20 oder Umweltqualitätsnorms (EQS) 21 spezifischer Einzelverbindungen und deshalb sind solche Verfahren für die Einhaltung gesetzlicher Vorschriften Daten von entscheidender Bedeutung. Darüber hinaus gezielt oder nicht gezielte chemische Analyseverfahren ermöglichen die Identifizierung und Quantifizierung von einzelnen Verbindungen oder Isomere im Vergleich zu biologischen Verfahren, die eine Gesamtantwort bereitzustellen. Chemische Analyseverfahren erlauben daher die Bewertung von diskreten Verbindungen hergestellt werden gerecht zu werden und diese Abwasserbehandlung Herausforderungen auf einer individuellen Behandlung pflanzlicher Basis zu adressieren. Studien haben gezeigt , dass herkömmliche Abwasserbehandlung (beispielsweise Belebungsanlagen) in der Entfernung von natürlichen Steroidhormone hochwirksam sein , obwohl die Entfernung des synthetischen Hormon EE2 weniger wirksam zu sein tendiert. Feldstudien erweiterte Behandlung unter Verwendung von Techniken wie Ozon verwendet, granulierter Aktivkohle (GAC) und Membranen haben gezeigt, wenn auch zu hohen Kosten, dass sie als End-of-pipe-Lösung verwendet werden EE2 zu entfernen, um unter predicted Wirkungsebenen und unterhalb der Nachweisgrenzen. Abbildung 3 zeigt die Entfernung von EE2 GAC Skala kommunalen Kläranlage in einem Pilot verwenden. Studien im Pilotmaßstab bei kommunalen Kläranlagen durchgeführt unter Verwendung von Rohrende GAC Behandlung zeigen auch die Reduktion der östrogene Potenz folgenden GAC gemessen , um die Hefe Estrogen Screen mit (JA) , wie in Abbildung 4 zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Beispiel Felddaten die Entfernung von Ethinylestradiol folgenden erweiterten tertiären Behandlung zeigt. (A) werden Proben aus der Kläranlage gesammelt herkömmlichen folgenden (Belebtschlammanlage) Behandlung nach den Verfahren zur Konservierung der Proben beschrieben. (B) Die Proben werden extrahiert unter Verwendung von Festphasenextraktion, aufgeräumte Störstoffe SPE mit normalen Phase zu entfernen undGelpermeationschromatographie. (C) Die saubere konzentrierte Extrakt wird auf ein niedriges Volumen konzentriert und analysiert unter Verwendung von Negativ - Ionen - Elektrospray - LCMS / MS in MRM - Modus. Die Ergebnisse werden mit internen Standardisierung berechnet isotopenmarkierten internen Standards. In dem gezeigten Beispiel ist EE2 in der endgültigen ASP Abwasser in einer Konzentration über dem vorhergesagten no effect level (PNEC) von 0,1 ng / L und wird unter Verwendung von GAC und Ozon entfernt (O 3) auf eine umweltverträgliche Konzentration. Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Foto eines Yeast Estrogen Screen (YES) Assayplatte (A) zeigt Farbwechsel von gelb bis rot, in Bezug auf östrogene Aktivität der Proben. Stücke aus der JA - Testplatte zeigt erstellt korrigierte Absorption (540nm) des Östradiol - Standard (B), Belebtschlammverfahren Abwasser (ASP) und körnige Aktivkohle (GAC) behandelte Abwasser Abwasserproben (C). Jede Probe wurde doppelt getestet. ASP und GAC Abwässer wurden extrahiert und konzentriert , um die SPE Methoden im Abschnitt 1. Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Ozonierung ist auch effizient in Steroid Östrogene und östrogene Aktivität von konventionell behandelten Kläranlagen zu entfernen. Ozon ist in der Lage eine Vielzahl von organischen Verunreinigungen und gelösten organischen Substanzen in Abwasserproben zu oxidieren und Desinfektionseigenschaften bietet. Die Wirksamkeit der Ozonisierung hängt von der Wasser Eigenschaften wie pH, der Menge an organischer Substanz und der applizierten Dosis von Ozon. Östrogene, die durch konventionelle Behandlung schlecht entfernt werden kannentfernt von Abwasser mit Dosen zwischen 0,8 und 2 mg O 3 / mg DOC. Ozon ist ein selektiver Oxidationsmittel, die mit reichen Standorten Elektron reagiert (ungesättigte Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen, aromatische Verbindungen, einschließlich aromatische Alkohole), die Ozon anwendbar für den Abbau einer Reihe von EDC macht. Allerdings ist die Eliminierung von Einzelverbindungen nicht notwendigerweise auf die vollständige Mineralisierung der ursprünglichen Verbindung führen. Organischen Substanzen folgende Ozonisierung Erzeugungs transformiert werden können Zwischenprodukte oder Transformation Oxidationsnebenprodukte, die eine Anzahl von niedrigem Molekulargewicht umfassen polare Klassen von Verbindungen, wie Aldehyde, Ketone, Carbonsäuren, Ketosäuren und bromierte Verbindungen. Beispiele umfassen, Bromat, Formaldehyd, Acetaldehyd und Carbonsäuren. Mit In - vivo und in - vitro - Biotests hat sich gezeigt, dass , obwohl Ozon die resultierenden Haupttransformationsprodukte eine geringere estrog nur zum Teil einige chemische Substanzen oxydiert, habenENIC Wirksamkeit und damit die Anwendung von Ozon bei einer geeigneten Dosis einen hohe Entfernung von östrogene Aktivität.

Einer der wichtigsten Vorteile der zusätzlichen Behandlung von Abwässern ist die Verringerung der Verweiblichung männlicher Fischgewässer in Empfang; eine nachteilige Wirkung , die 3 zu einer verminderten Fruchtbarkeit führen kann. In - vivo - Studien Fisch (zB, Rotauge oder Dickkopfelritze) ausgesetzt Abwasser zeigen weibliche Keimzellen oder Eizellen in den Hoden der männlichen Fische (zB wie in Abbildung 5 zu sehen ist ). Intersex oder männlich VTG fehlt oder erheblich in Fisch folgenden erweiterten Behandlung wie GAC 7 oder Ozon verringert 22. Diese Studien zeigen, dass die Umwandlungsprodukte bei der Ozonisierung hergestellt sind nicht östrogene, was jedoch nicht die Toxizität des Abwassers nicht adressieren erzeugt. Dieses Problem wurde in anderen Studien, zum Beispiel eine Studie von Magdeburg et al gerichtet.

Abbildung 5
Abbildung 5. Mikroskopische Aufnahmen eines normalen männlichen (A) und Intersex (B, C) ​​Gonaden aus adulten Plötze (Rutilus rutilus) ausgesetzt Abwässer in einem Feld basierte Bewertung. Mikroskopische Aufnahme-A, zeigt einen histologischen Schnitt von normalen männlichen Hoden. Mikroskopische Aufnahme-B und -C, zeigt histologische Schnitte eines intersex männlichen Fische, für sechs Monate zu Belebtschlammverfahren Abwasser anfällt, ausgesetzt wurde. Die Pfeile zeigen die Eizellen in dem Hodengewebe. Maßstabsbalken entspricht 100 & mgr; m in jedem Mikrobild . Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

12,24 zu katalysieren - 26. TAML Aktivatoren mit H 2 O 2 effektiv EE2 abbauen und andere Steroide Östrogene in reinem Laborwasser sowie in den Abwässern aus kommunalen Kläranlagen und in Stachelurinproben 12. Laboruntersuchungen, zeigt TAML / H 2 O 2 -Behandlung hohe Steroid Östrogen Entfernung einschließlich EE2 Entfernung liefert und reduziert wesentlich östrogene Aktivität in vitro gemessen mit dem JA - Bioassay und Substantially nimmt in vivo Fisch Feminisierung der VTG - Bioassay gemessen (Abbildung 1 und Abbildung 6).

Figur 6
Abbildung 6. Durchschnittliche EE2 - Konzentration und östrogene Aktivität in behandelten und unbehandelten Tankwasser (A) und Plasma - Vitellogenin in der Basislinie und exponierten männlichen Fischen (B). A) EE2 - Konzentration (ng / L, dunkelblaue Balken) wurde gemessen durch LCMS / MS , östrogene Aktivität (EE2 Äquivalent ng / L, dunkelgrün Balken) wurde gemessen durch in vitro Yeast Estrogen Screen (JA). B) Plasma vitellogenin (ng / ml, hellblaue Balken) Konzentration bei männlichen Elritze wurden über eine quantitative Enzym gemessen -verknüpften immunosorbent assay (ELISA). EE2 chemischen Analyseergebnisse als <0,03 ng / L EE2 (dh unter der Nachweisgrenze (LOD)) wurden als mit Halb LOD (dh behandelt, 2 O 2 + TAML, EE2 + H 2 O 2 und EE2 geschützt. Die Fehlerbalken in Graph-A stellen die Standardfehler des Mittelwerts, Fehlerbalken in Graph-B stellen die Standardabweichung. Briefe über Balken in der Grafik-B stellen statistische Ähnlichkeit. Diese Zahl wurde von Mills modifizierte et al. 12 Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Kläranlagen sind die Hauptroute von Oberflächenwasser kontaminiert mit EDC. Eine Bewertung der Wirksamkeit der Entfernung von endokrinen Aktivität von herkömmlichen, fortgeschrittenen oder neuen Behandlungsverfahren erfordert die Verwendung einer Vielzahl von chemischen und biologischen Assays. Die chemische Analyse unter Verwendung von nicht-zielgerichtete und gezielte Analyse liefert qualitative oder quantitative Daten über die Wirksamkeit der Entfernung der einzelnen Komponenten und erlaubt somit eine Beurteilung gegen Umweltqualitätsnormen getroffen werden oder vorhergesagt keine Wirkung Konzentrationen für die Verbindungen oder Mischungen von Verbindungen analysiert.

Die Erzeugung von Umwandlungsprodukten aus der unvollständigen Mineralisation von Stoffen allein nach der Behandlung und das Vorhandensein von unbekannten biologisch aktiven Komponenten im Abwasser begrenzt die Nützlichkeit von chemischen Tests. Eine Kombination von in vivo und in vitro Bioassays in Kombination mit analytischen Chemikerry-Screening stellt ein nützliches Tool-Box von den Schwellenabwasserbehandlungsverfahren, die Wirksamkeit von EDC Entfernung zu bestimmen. Diese Tests, wenn neben der traditionellen Wasserqualitätsparameter durchgeführt und andere toxikologische und mikrobiologische Endpunkte ermöglichen, eine kritische Bewertung der aktuellen und neuen Abwasserbehandlungstechnologien.

Es ist wichtig , dass Hefe basiert Östrogen Bildschirme (beispielsweise YES) sind nicht die einzige in vitro - Assays zur Bestimmung östrogene Potenz von Chemikalien und Abwässern zu beachten. Eine Anzahl von stabil transfizierten Säugerzelle basierenden Assays wurden auch entwickelt, beispielsweise die ER-CALUX 27 und hER & agr;-HeLa-9903 28 mit menschlichen Brustkrebszellen oder zervikalen Tumorzellen sind. Die JA hat auf ähnliche Säugetierzelle basierte Assays verglichen worden und wurde eine vergleichbare hohe Reproduzierbarkeit, richtig positiv und negativ wahr östrogene Erkennungsraten 29, altho gefunden zu habenigitt wird es manchmal als etwas weniger empfindlich 27 zu sein. Ein Vorteil von Hefe-basierten Reporter-Assays ist, dass in den Labors ohne große Erfahrung mit Säugetier-Zellkultur kann die JA leichter angenommen werden, da es erfordert weniger strengen Bio-Kontrollmaßnahmen und sterile Techniken (JA kann auf der Tischplatte bei Bedarf durchgeführt werden) . Die menschlichen Zellen basierenden Assays erfordern auch CO 2 Inkubatoren und Luminometer im Vergleich zu den Standard - Inkubator und Mikroplatten - Reader in der YES verwendet. Zwei Hefe basiert Östrogen Reporter - Assays (JA, Saccharomyces cerevisiae und A-YES, Arxula adeninivorans) sind derzeit in der Interlabor - Trails für die Validierung von ISO 19040 "Wasserbeschaffenheit - Bestimmung des östrogene Potential von Wasser und Abwasser" Hervorhebung der Industrie Interesse an dieser Techniken.

Es gibt eine Reihe von Einschränkungen der Verfahren beschrieben, die die potentielle Kontamination umfassenvon Proben während der Probenahme, Probenlagerung und Analysen mit östrogene Substanzen aus dem Feld oder im Labor Umwelt oder durch menschliche Verschmutzung Ursprung (zB Weichmacher, Tenside, Körperpflegeprodukte). Diese Art der Kontamination in der JA-Assays (oder anderen zellbasierten Reporterassays) den Hintergrund erhöhen, und die Verwendung des Assays beeinflussen. Die Wasserproben oder in Plastikflaschen aufbewahrt Lösungsmittel können leicht Fehlalarme verursachen. Falsch negativ sind auch von Belang, da beide LCMS / MS und die YES-Test SPE erfordern Östrogene zu nachweisbaren Mengen zu konzentrieren. Die Matrix, die Wahl der SPE Sorbens und Elutionslösungsmittel kann die Extraktionseffizienz beeinflussen, und die Arten von Verbindungen eluiert. Mit C18 SPE-Kartuschen für die Extraktion unter Verwendung der in diesem Protokoll beschriebenen Bedingungen kann eine negative Vorspannung erzeugen, wie stark polare und basischen Verbindungen würden schlecht vom Sorbens zurückgehalten werden. Darüber hinaus erfordert dieses Protokoll Rekonstitution des eluierten JA Eluent aus methanol durch Verdampfung zu Ethanol funder Stickstoff in dem Verlust von flüchtigen Verbindungen ergeb zur Trockne ein. Als Ergebnis konnte das Protokoll östrogene Aktivität der getesteten Proben unterschätzt bieten. Diese Einschränkungen sind besonders wichtig, wenn die YES-Test als unbekannte oder unerwartete Verbindungen unter Berücksichtigung könnte verpasst werden, weil sie nicht extrahiert wurden, oder sie werden durch Verdunstung verloren. Außerdem macht die LCMS / MS-Technik Verwendung von markierten internen Standards für die Wiederherstellung zu korrigieren; Dieser Ansatz kann nicht mit dem YES-Assay verwendet werden.

Wesentliche Einschränkungen in - vivo - Tests von Abwässern sind hohe Kosten und die Zeit für die Bewertung erforderlich im Vergleich zu In - vitro - Methoden. Derzeit ist die Verwendung von Fischembryotests östrogene Aktivität zu erkennen ist begrenzt. Jedoch hat es einige Erfolg mit Östrogen reagierende transgenen Herstellung glühenden Fischembryonen 30, die zukünftige Anwendungen haben könnte. Elritze (in diesem Protoc verwendetol) sind ein gemeinsames Labortieren und dem VTG - Induktion in männlichen Fischen ist eine gut dokumentierte Bio-Marker von östrogene Exposition und ein quantifizierbares Maß für Abwasser anfällt , östrogene 22 oder andere östrogene Verbindungen oder Mischungen 31. OECD - Prüfrichtlinien für endokrin wirksame Substanzen wurden mit adulten Dickkopfelritze, japanischen Medaka und Zebrabärbling 32,33 validiert, mit VTG ein empfindlicher Biomarker von Östrogen Exposition in allen drei Arten erfolgen soll. Allerdings ist die VTG Induktion nicht direkt an Fortpflanzungsschäden korrelieren und damit die ökologischen Folgen von Abwasserrisiko, da in stark intersex Rotauge 3 zu sehen. Auf der anderen Seite, Rotaugen sind kein klassisches "Labortieren" für die ökotoxikologischen Forschung aufgrund ihrer großen Größe, lange Generationszeit, reproduktive Stil (2-3 Jahre die Geschlechtsreife zu erreichen); Gruppe Laich (Zucht) findet einmal im Jahr, und die Schwierigkeit, Männer von Frauen (andere zu identifizieren, als währenddie Laichzeit). Doch diese normalerweise gonochoristic Spezies sehr gut ist in Großbritannien aufgrund der Entdeckung , dass hinter östrogene Abwässern, männlichen Fische Störungen ihrer Endokrinologie zeigten studiert (zB Anwesenheit von spezifisch weiblichen vitellogenin im Blut) und Histopathologie (Ovotestes - Eier in den Hoden und / oder weiblichen Fortpflanzungskanälen) 5,6 entwickeln. Daher ist, wie eine zukünftige Anwendung dieser Protokolle, Rotauge (oder ähnliche Arten) könnte eine nützliche Wild Sentinel-Arten zu zeigen, wenn reale Verbesserungen der Abwasserqualität (und reduzierte östrogene) in Flüssen gesehen fortgeschritten behandelt Abwässer zu empfangen. Sie können auch in Ende von Rohrsystemen eingesetzt werden technologisch verbesserten Abströme aus Pflanzen Pilotmaßstab 7 zu überwachen. Wenn die Arten unter Berücksichtigung dort zu verwenden , bei in vivo Abwasser Assessments ist ein Kompromiss zwischen relativ schnell und Tests mit Labortieren im Vergleich zu den gesteuertenmehr Feld basiert, aber umweltrelevanten, Tests mit einheimischen Arten. Jedoch sind solche in vivo Beurteilungen hohen Kosten und sollten nur als letzte Satz von Tests in Betracht gezogen werden nachstehenden Bewertungen chemische Analyse unter Verwendung von und in vitro - Assays.

Kritische Schritte im Rahmen der beschriebenen Protokolle umfassen die Herstellung und Handhabung von Proben und Glaswaren (dh Flaschen und Probenahmegeräte sollten mit geeigneten oberflächenaktiven Reinigungsmittel vorbehandelt werden) Kontamination der Proben von Umweltverunreinigungen zu vermeiden , einschließlich Grenzkontakt von Proben mit Kunststoffen und andere Materialien, die Fehlalarme produzieren kann. Dies ist ebenso wichtig bei der Gestaltung und dem Aufbau Aquarien und Fischbelichtungssysteme. Idealerweise Aquarien (Wohnungsbestände und bei Aufnahmen) sollten aus Materialien mit geringer Adsorption 32 mit minimalem Kontaminationsrisiko gebaut werden. Edelstahl kann für Abwasser oder Wasserhaltetanks verwendet werden.Während Tanks einer Glaskonstruktion für Aquarien bevorzugt werden (da dies auch eine einfache Beobachtung der Fische). Die Verwendung von minderwertigen Kunststoffrohre oder Schläuche sollten 32, 34 und ABS PVC kann , wenn "richtig gewürzt 'verwendet werden , vermieden werden, dh nach links alle Verunreinigungen auszuwaschen in Laufverdünnungswasser für mindestens 12 Stunden vor der Verwendung. Medical Grade Silikonschlauch wurde für peristaltische Pumpe Lieferung von Chemikalien und Abwasser / Verdünnungswasser zu Tanks erfolgreich in unserer Einrichtung beschäftigt. Sowie östrogene Kontamination in Bau und angesichts des Schwimmsystem ausgeführt wird, ist es auch wichtig, über die Nahrung der Fische zu denken; viele Anstand Fischfutter haben sich als östrogene zu Fisch. Deshalb ist es wichtig , alle Lebensmittel , die für Aktivität zu testen (beispielsweise in dem Yeast Estrogen Bildschirm finden Beresford et al. 14) , bevor sie in diesen Arten von Studien verwenden.

Fehlerbehebungder chemischen Analyse oder JA Testprotokolle vereinfacht beschrieben wird, wenn die Qualitätssicherung Proben mehrere Reise einschließlich, Labor-und Lösungsmittel-Rohlinge werden neben positiven Kontrollen und realen Proben zu eliminieren falsch positive und falsch negative Ergebnisse analysiert. Positive (zB EE2) und negativen (Verdünnungswasser) Kontrolle sollte auch immer in den in - vivo - Assays verwendet werden , die Empfindlichkeit der erwarteten biologischen Biomarker zu bestätigen oder Endpunkt (dh VTG oder Histopathologie) und erlauben unerwartete Verunreinigung festgestellt werden ( zum Beispiel von Versuchsaufbau, Diät oder Verdünnungswasser). Alle Änderungen im Protokoll sollte die Durchführung jede Studie vor validiert werden.

Mit strengeren Regulierung der östrogene Verbindungen, die die Umwelt über Abwässer der Kläranlage Eingabe ist es ins Auge fassen, dass eine effizientere Abwasserbehandlungstechnologien werden entwickelt werden müssen. Die Batterie von Tests in diesem Manuskript beschrieben Kompliment an dieökotoxikologische und chemische Tests zur Beurteilung normalerweise Kläranlage Abwassereinleitungen angewendet. Daher sollte die künftige Anwendung dieser Art von ganzheitlicher Batterie von Testabwassertechnik-Entwicklern ermöglichen, und Anlagenbetreiber, die ökologisch sicheren Designs zu implementieren, um die besten Methoden unter Berücksichtigung sowohl spezifisch geregelt östrogene Chemikalien und die allgemeine biologische Aktivität zu entfernen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wellwash Versa plate washer Thermo Scientific 5165010
Plate reader Molecular Devices SpectraMax 340PC
Incubator Memmert INB 400 37 °C incubation required for carp assay
Fisherbrand whirlimixer Fisher Scientific 13214789
Icemaker Scotsman AF80
12-Channel F1 digital multichannel pipette Thermo Scientific Finnpipette 4661070
ELISA kits Biosense Laboratories V01018401-096 (Fathead minnow)
V01003402-096 (Carp)
Microfuge tubes, 0.5 ml Alpha labs LW2372
Microfuge tubes, 1.5 ml Alpha labs LW2375
Sulphuric acid, 95-98% Sigma-Aldrich 258105
Histology
Tissue processor Leica Biosystems TP1020
Wax dispenser Thermo Scientific Raymond Lamb E66HC
Metal embedding mold Leica Biosystems Various
Hot plate Thermo Scientific Shandon 3120063
Cold plate (EG1150 C) Leica Biosystems 14038838037
Heated forceps (EG F) Leica Biosystems 14038835824
Microtome Leica Biosystems RM2235
Paraffin section floatation  bath Electrothermal MH8517
Slide drying bench Electrothermal MH6616
Stainmate automated stainer Thermo Scientific Shandon E103/S10L
Cassettes, Histosette II, biopsy Simport M493
Paraffin wax Thermo Scientific Raymond Lamb W1
Histo-Clear II National Diagnostics HS-202
IMS (ethanol mix), IDA99 Tennants ID440
Polysine adhesion slides Thermo Scientific Gerhard Menzel J2800AMNZ
Cover slips, 22x50 mm VWR 631-0137
Histomount National Diagnostics HS-103
Haematoxylin Harris GURR VWR 351945S
Eosin, 1%, aqueous Pyramid Inovation S20007-E
Fisherbrand slide boxes Fisher Scientific 11701486
Microtome blades, MB35 Thermo Scientific Shandon 3050835
Bouin’s solution Sigma Aldrich HT10132-1L
Yeast screen
Flow cabinet Labcaire Systems Ltd SC12R
Cooled incubator LMS Cooled Incubator 303
Incubator Memmert INB 400
Shaker Grant PSU-10i
Fisherbrand whirlimixer Fisher Scientific 13214789
Plate shaker Heidolph Titramax 100 544-11200-00
12-Channel F1 digital multichannel pipette Thermo Scientific Finnpipette 4661070
12-channel pipette, electronic Sartorius 735441
96-well flat-bottom microplates MP Biomedicals
Thermo Scientific Nunc
Sarstedt
76-232-05
260860
82.1581.001
We have found that these multiwell plates all produce low backgrounds
HPLC grade water Rathburn RH1020
Absolute ethanol Hayman Kimia F200238
Potassium phosphate monobasic anhydrous Sigma-Aldrich P-5655
Ammonium sulphate Sigma-Aldrich A-2939
Potassium hydroxide, pellets Sigma-Aldrich P-1767
Magnesium sulfate, anhydrous Sigma-Aldrich M-2643
Iron(III) sulfate Sigma-Aldrich 307718
L-Leucine Sigma-Aldrich L-8912
L-Histidine Sigma-Aldrich H-6034
Adenine Sigma-Aldrich A-2786
L-Argenine, hydrochloride Sigma-Aldrich A-6969
L-Methionine Sigma-Aldrich M-5308
L-Tyrosine Sigma-Aldrich T-8566
L-Isoleucine Sigma-Aldrich I-7403
L-Lysine, hydrochloride Sigma-Aldrich L-8662
L-Phenylalanine Sigma-Aldrich P-5482
L-Glutamic acid Sigma-Aldrich G-8415
L-Valine Sigma-Aldrich V-0513
L-Serine Sigma-Aldrich S-4311
Thiamine, hydrochloride Sigma-Aldrich T-1270
Pyridoxine Sigma-Aldrich P-5669
D-Pantothenic acid, hemicalcium salt Sigma-Aldrich P-5155
Inositol Sigma-Aldrich I-5125
D-Biotin Sigma-Aldrich B-4639
D-(+)-Glucose anhydrous; mixed anomers Sigma-Aldrich G-7021
L-Aspartic acid Sigma-Aldrich A-4534
L-Threonine Sigma-Aldrich T-8441
Copper(II) sulfate, anhydrous Sigma-Aldrich C-1297
Chlorophenolred-β-D galactopyranoside (CPRG) Sigma-Aldrich 10884308001
Glycerol Sigma-Aldrich G-2025
17 β-Estradiol Sigma-Aldrich E-8875
Steroids
Acetone Rathburn
Acetonitrile Rathburn
Ammonia solution Rathburn
Ethylacetate Rathburn
Copper(II) nitrate Sigma-Aldrich
Acetone Rathburn
Dichloromethane Rathburn
2,4,16,16-d4-17β-estradiol CDN Isotopes
2,4,16,16-d4-estrone CDN Isotopes
2,4,16,16-d4-17α-ethynyl oestradiol CDN Isotopes
17β-estradiol Sigma-Aldrich
Estrone Sigma-Aldrich
17α-ethynyl oestradiol Sigma-Aldrich
Hexane Rathburn
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich
Methanol Sigma-Aldrich
Sodium hydrogen carbonate Sigma-Aldrich
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich
Styrene divinyl benzene cartridge (Isolute ENV+) solid phase extraction cartridge (200 mg/6 ml) Biotage
Isolute aminopropyl solid phase extraction cartridge (500 mg/6 ml) Biotage
Fish study
orange-white silicon manifold tubing 0.63 bore pk 6 Watson Marlow 982.0063.000
straight connectors for 0.5/0.8 bore pk 20 Watson Marlow 999.2008.000
pumsil silicon tubing 0.8 bore 15 m Watson Marlow 913.A008.016
200 series multi-channel persitaltic pump Watson Marlow 205CA
Silicone tubing x 15 m (dosing tanks) VWR SFM1-3250
silicone tubing x 15 m (large for inflow/outflow) VWR SFM1-5450
2.5 L glass winchester pk 4 Fisher Scienctific BTF-505-050B
magnetic stir bar 51 x 8 mm pk 10 Fisher Scienctific FB55595 
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222) Sigma Aldrich E10521-10G
17α-Ethynylestradiol Sigma Aldrich E4876-100MG
Absolute ethanol Hayman Kimia F200238
SPE
1/8 inch PTFE tubes 'straws' colour coded pk 4 Sigma Aldrich 57276
disposable liners for manifold Sigma Aldrich 57059
filtration tubes without frits 6 ml pk 30 Sigma Aldrich 57242
reservior adaptors pk 12 Sigma Aldrich 57020-U
stainless steel weight for manifold pk 4 Sigma Aldrich 57278
male Luer plug for manifold pk 12 Sigma Aldrich 504351
SPE Vacuum Manifold Sigma Aldrich 57265
stop cocks for extraction mainfold (supelco) pk 12 Waters WAT054806
Sep-Pak Plus C18 cartridge box 50  Waters WAT020515
Methanol HPLC grade 2.5 L Fisher Scientific M/4056/17
7 ml glass vials with lids (58 x 17 mm) pk 399 Fisher Scientific TUL-520-031K
Absolute ethanol Hayman Kimia F200238
vacuum pump, e.g., VP Series Vacuum Pump Camlab 1136915

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References

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