Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)를 결합 하 여 유전자 모델 골 틈새에 조 혈 모 세포의 Engraftment 역학을 공부 하

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Developmental Biology

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Summary

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)는 calvarium의 유도 및 조 혈 모 세포의 골 수 (BM) 틈새로 engraftment 연구 유전 동물 모델에 적용 됩니다.

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Wang, L., Kamocka, M. M., Zollman, A., Carlesso, N. Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches. J. Vis. Exp. (121), e54253, doi:10.3791/54253 (2017).

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Abstract

증거를 증가 일반 조 전문된 세포 벽 중요 한 조 혈 줄기 세포 (HSC) 기능1,2변조를 포함 하는 BM, 뚜렷한 microenvironmental 신호에 의해 규제 됩니다 나타냅니다. 실제로, 조 혈 microenvironment의 더 상세한 그림은 이제 신흥에 endosteal와 내 피 틈새 형성 정상 HSC와 그들의 자손3,4,5의 규칙에 대 한 기능 단위 . 새로운 연구는 adipocytes, 유지 하 고 HSC 기능6,,78조절에 신경 세포, 혈관 주위 세포의 중요성을 계시 했다. 또한, 다른 계보, 골수성과 림프 성 세포, 가정에서 세포 및 BM microenvironment 내의 특정 틈새에 있는 증거가 있다. 그러나, BM microenvironment 및 그것의 거주자의 완전 한 매핑 진행 중에서입니다.

계보 특정 형광 표식 또는 부족 BM 틈새의 특정 셀에 선택한 분자 유전자 조작 생쥐를 표현 하는 유전자 변형 마우스 긴장 지금 사용할 수 있습니다. 노크 아웃 및 혈통 추적 모델, 이식 방법, 함께에서 제공 기회 "틈새" 특정의 역할에 대 한 지식을 구체화를 세포 HSC, 같은 정의 된 조 혈 인구에 대 한 B-세포, T 세포, 골수성 세포와 erythroid 셀입니다. 이 전략은 calvarium의 2 광자 현미경의 사용을 병합 하 여 더 potentiated 될 수 있습니다. 제공 함으로써 고해상도 이미징 vivo에서 및 BM calvarium의 3 차원 렌더링, 우리가 지금 정확 하 게 위치 특정 조 혈 하위 집합은 BM에 가정과 평가 시간이 지남에 그들의 확장의 활동을 확인할 수 있습니다. 여기, 리스-GFP 유전자 변형 마우스 (골수성 세포 표시)9 , RBPJ (정식 노치 신호 부족 한) 녹아웃 쥐10 사용 됩니다 IVFM와 함께에서 노치 결함이 BM microenvironment 골수성 세포 engraftment 결정 하.

Introduction

Intravital multiphoton 형광 현미경 검사 법 (IVFM)는 강력한 이미징 기술을 고해상도, 실시간 이미징 조직 깊이의 최대 허용 하는 조직에 따라 1 mm. 마우스 calvarium에 적용 하면, 그것은 60-100 μ m11을 비-침략 적 방법으로 BM 내의 조 혈 모 세포의 행동을 관찰을 허용. 이 방법은 여기 engraftment 정식 노치 신호 부족 BM의 RBPJ 녹아웃 쥐에 있는 정상적인 골수성 창시자의의 활동을 결정 하기 위해 사용 됩니다.

우리 그룹에서 최근 작품 그 결함이 정식 노치 신호 myeloproliferative 같은 질병12BM microenvironment 리드에서 설명 했다. 노치 신호 손실 RBPJ, 하류 신호, 재결합10유도 Mx1-Cre를 사용 하 여 정식 노치의 중요 한 녹음 방송 요인의 DNA 묶는 도메인의 조건부 삭제에 의해 얻은. 이 연구에서는 Mx1-Cre/RBPJlox/lox 마우스 모델 사용 되었다. RBPJ의 DNA 묶는 주제의 조건부 삭제에서 모든 노치 수용 체 신호 손실 발생 합니다. Mx1-Cre 모델, Cre 식 polyI:C 여러 기관의 stromal 구성 요소에서 뿐만 아니라 혈액 세포에서 타겟된 유전자 삭제의 유도에 결과의 관리에 따라 활성화 Mx1 발기인에 의해 구동 됩니다 포함 한 BM, 비장 및 간.

Mx1-Cre+/RBPJlox/lox ,lox/lox 마우스 Mx1-Cre-/RBPJ polyI:C (hereon 표시 된 RBPJKO와 RBPJWT, 각각)와 유도 방사능 치명적 이었고 정상, 야생 타입 조 혈 모 세포 이식. 이식 후 4 주부터 시작 해 서, RBPJKO 받는 사람 상당한 leukocytosis로 선행 개발. RBPJKO 마우스 골수성 창시자의 증가 비율에에서 제시는 BM 주 8에서 이식 후 고 나중 시간 지점에서 비록 4-6 주에 BM의 분석 그들의 골수성 세포 콘텐츠 제어 RBPJWT에 비해 눈에 띄는 차이 공개 하지 않았다 받는 사람. BM microenvironment myeloproliferative 표현 형의 개시에 직접적인 영향을 미쳤다 Mx1-Cre 다른 조 혈 기관, 표현 된다 사실 함께이 관찰, 질문을 발생 합니다.

BM 질병 개발의 중요 한 초기 사이트 였는 지 여부를 확인 하려면 마우스 calvarium의 IVFM와 BM 이식 (BMT), RBPJ 노크 아웃 모델 계보 추적 시스템 조합에 사용 되었다. 유전자 변형 마우스 특정 lysozyme 발기인 (리스-GFP)9 의 통제 EGFP 표현 BM BMT 후 이미징 동안 구상 될 수 있는 기증자 세포를 얻기 위해 사용 되었다. Lysozyme 식이 골수성 세포 특정 고 리스-GFP 성숙한 granulocyte13일반적인 골수성 조상 (CMP)에서 셀을 표시 합니다.

다른 시간 지점에서 BM의 IVFM는 리스 GFP 셀 BM의 RBPJWT 및 RBPJKO 받는 사람에 게 마찬가지로 홈 하지만 확장 및 BM의 RBPJKO 받는 사람에서 빨리 engrafted 시연 했다. 이 차이 이전 시간 시점 (주 2) 극적인 되었고 시간이 지남에 따라 감소 (주 4 및 6). 그러나, 이러한 나중 시간 지점에서 동일한 받는 사람에 조 혈 구획의 평가 골수성 세포는 샌드위치에 순환 수에 꾸준히 증가 보였다 고 셀의 증가 출력을 나타내는 RBPJKO 마우스의 비장에 순환에 BM. 리스-GFP 셀 지역화는 BM에 이식된 생쥐의 6 주에의 분석 컨트롤에서 보다 RBPJKO microenvironment에 골수성 세포는 맥 관 구조에서 거주 했다 밝혔다.

샨 다, 이러한 특정 동물 모델 IVFM의 조합 RBPJKO BM microenvironment 골수성 세포의 engraftment 역학에서 통찰력 제공. 실험 설계 및 여기서 설명 하는 양적 접근 비슷한 질문을 해결 하기 위해 적용할 수 있는 패러다임으로 제시 된다. 예를 들어 모델, RAG1 GFP14 또는 Gata1 GFP15 마우스 추적 다른 셀 특정 계보를 사용 하 여 림프의 동작에 따라 수 또는 erythroid 창시자는 BM에 각각.

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Protocol

동물의 사용을 포함 하는 모든 절차는 동물 관리 및 사용 위원회의 인디애나 대학의과의 인증 수행 했다. 확인 작업을 수행 하는 국가의 동물 실험에 법안을 준수 합니다.

1. Mx1CreRBPJ-/- 받는 사람 마우스의 준비

  1. Mx1-Cre+ RBPJlox/lox 10 Mx1-Cre를 얻을 마우스를 크로스 RBPJlox/lox12 양수와 Mx1-Cre 부정적인 RBPJlox/lox littermates 컨트롤로 사용 하. PCR10유전자 형을 확인 합니다.
  2. 6-8 주를 사용 하 여-오래 된 Mx1Cre+/RBPJlox/lox 및 Mx1Cre-/RBPJlox/lox 마우스 polyI:C 유도 수행 하려면.
  3. PolyI:C 200 µ g i.p. Cre+ 및 Cre- 마우스에 주사. 한 polyI:C 주사 3 일 첫 주 동안 매일 제공 합니다. 한 polyI:C 주사 두 번째 주, 이전 주입 (총에서 4 개의 주사) 후 7 일 제공 합니다.
    1. RBPJKO를 사용 하 여 (Mx1Cre 유도+/RBPJlox/lox)와 RBPJWT (유도 Mx1Cre-/RBPJlox/lox) 받는 마지막 polyI:C 주입 후 3 주 사람으로 쥐.
      참고: 그것은 주입 후 3 주 pI: pC에 의해 유도 된 마우스를 사용 하 여 권장. PolyI:C에 의해 발생 하는 IFNα 응답 BM, HSC의 immunophenotypic 확장 결과에 큰 변화를 유도 하 고 주변 혈액16,17에 성숙한 창시자의 출력을 감소. 조 혈 하위 집합의 표현은 정규화 된 3 주 후 주입 및 쥐 염증의 혼란 효과 없이 이용 될 수 있다. 이 유도 프로토콜은 RBPJ에 대 한 최적화 되었습니다. 유도 프로토콜 구문, 따라 달라질 수 있습니다 다른 유전자를 삭제 하 고 삭제를 확인 합니다. 우리는 총 4 개의 polyI:C 주사 후 RT-PCR에 의해 loxP 사이트 사이 RBPJ 영역의 ~ 100% 삭제 확인.

2. 리스 EGFP 기증자의 골 수 세포 이식에 대 한 준비

  1. 한 리스 EGFP 마우스 (이산화탄소 뒤에 자 궁 경부 전위)를 안락사 1 또는 2에 이식 하기 전에 h.
  2. 70% 에탄올과 동물 몸 표면 스프레이.
  3. 수술가 위를 사용 하 여 두 다리 발목 주위에 피부 절 개 하 고 수술 집게로 당겨 떨어져 피부와 함께 깨끗 한 근육 조직을 노출 하는 모피.
  4. 수술가 위를 사용 하 여 가능한 많은 근육 다리에서 제거. 한가 위를 사용 하 여 (무릎과 발목 관절)에서 뼈를 잘라 하 고 화관에서 tibias 거 즈 스폰지를 사용 하 여 모든 나머지 근육 조직의 청소. (2 개의 화관과 두 tibias) 뼈 포함 된 DMEM 10 %6 잘 플레이트에 배치 FBS.
  5. 10 mL 감기 2 mM EDTA PBS와 피펫으로 박격포에 뼈 골 셀을 단일 셀 서 스 펜 션으로 셀을가지고 크 러시. 또는, 1 mL 주사기 각 측에서 2 mM EDTA PBS 3 시간 뼈를 플러시.
  6. 15 mL 원심 분리기 관으로 70 µ m 필터를 사용 하 여 골 수 세포를 필터링 합니다. 2-3 mL PBS의 필터를 씻어. 460 x g에서 10 분 아래로 셀 회전, resuspend 10 ml 신선한 DMEM의 셀 10 %FBS.
  7. hemocytometer에 골 셀을 1.5 x 107 셀/mL IMDM에 없이 혈 청 농도 조정 합니다. 200 µ L의 양으로 동물 당 3 x 106 셀을 사용 합니다. 총 BM의 약 1/3 세포는 골수성 GFP + 셀. 주입에 대 한 준비까지 얼음에 셀을 둡니다. 105 셀 x 0.5를 사용 하 여 GFP 식을 FACS9에 의해 결정.

3. RBPJKO 쥐로 리스 GFP 셀 골 수 이식

  1. 받는 사람 마우스 원형에 제 지. 감마 방사선의 치명적인 복용량을 가진 쥐를 비추는 (1200 Rad) Cs 137 irradiator에. 분할 복용 프로토콜을 사용 하 여: 저녁에 900 래 드 300 래 드 뒤 다음날 아침 (16 h 떨어져).
  2. 치명적 방사능된 RBPJWT 및 RBPJKO 받는 사람 마우스 이식 방사선의 두 번째 투여 후 5-6 h. BM 주사 셀 리스 EGFP 쥐 꼬리 정 맥 주입 (수확 제 2에 있는 셀에 대 한 세부 정보 참조) 동물 을 통해 당 3 x 106 세포의 농도에서에서 수확.
  3. 다른 시간 지점에서 IVFM에 의해 이식된 생쥐의 독립적인 동료 이미지: 24 h, 그리고 2, 4, 6, 설명 대로 아래 주 (4 & 5 vivo에서 이미징 절차에 대 한 섹션 참조).

4. 수술 준비 Intravital 이미징

  1. 수술 기구를 소독. 두 집게 (한 직선, 각도 하나), 좋은 좋은 위과 바늘의 한 쌍의 한 쌍. 모든 공급 절차에 필요한 요원 영역을 준비 합니다.
  2. 마우스에 게 케 타 민 칵테일 마 취의 IP 주사 (Xylazine 2.5-5 m g/k g + acepromazine 1.0-2.5 m g/k g + 케 타 민 90-100 mg/kg) 26-28 G 바늘 주사기를 사용 하 여.  동물은 매 15 분 절차 동안 모니터링 될 것 이다 하 고 마 취 원래 복용량의 ¼에 필요에 따라 보완 될 것입니다.
  3. 적절 한 열 소스 (37 ° C가 열 패드가 열 패드와 직접적인 접촉에서 보호 동물)에 마우스를 놓고 시각적으로 호흡 속도 모니터링 합니다.
  4. 발가락을 사용 하 여 반사 꼬집어 응답을 확인 합니다. 동물 인지 확인 완전히 마 취 수술 절차를 시작 하기 전에.
  5. 26-28를 사용 하 여 주고 쥐 형광 혈관 마커 (Dextran, 20 mg/mL 해결책의 100 μ)의 꼬리 정 맥 주입 바늘 주사기 게이지.
  6. 두 눈에 수 의사 눈 연 고를 적용 합니다. 클립을 작은 전기 면도기와 동물의 머리의 등 쪽 표면. 제 모 크림을 제거 하 여 다음 식 염 수로 씻어 5 분 사용 거 즈 스폰지에 크림을 적용 합니다. 70% 알코올 면봉을 사용 하 여 깨끗 한 두 피를 준비.
  7. 기본 등 두개골 표면 노출로 두 피에 작은 중간 피부 절 개 (10-20 m m)을 잘 집게와가 위를 사용 합니다. 5-0 수술 실크를 사용 하 여 피부 절 개를 만드는 영상에 대 한 calvarium를 노출 하는 플랩의 각 측면에 두 개의 숙박 봉합 배치.
  8. 그들의 뒤에 쥐를 놓고 현미경 기름을 가득 유리 하단 접시에 노출 된 두 피를 잠수함. Mutiphoton 룸 이미징에 동물을 전송 합니다.
  9. 동물에 현미경 단계 목표 위에 유리 접시에 위치 하는 calvarium와 놓고는 37 다음 커버° C가 열 패드 (동물 열와 직접적인 접촉에서 보호 되어야 합니다).

5. Vivo에서 마우스 Calvarium의 고해상도 영상

  1. Multiphoton 이미징에 대 한 수정 하는 거꾸로 confocal 시스템을 사용 하 여 ( 자료 참조). 다음 제조업체의 지침 조정 830에 2 광자 레이저 nm, 20 장소 X W, 나 0.95 렌즈 현미경 코 조각에 레이저 빔 정렬 확인.
    참고: 똑바로 현미경 시스템은 가장 일반적으로 이러한 연구에 대 한 사용 하지만 거꾸로 multiphoton 시스템 또한 활용 될 수 있습니다. 본이 연구에서는 사용자 지정 설계 된 atraumatic stereotaxic 장치 사용 되었다. 똑바로 현미경 시스템에 대 한 몇 가지 상용 stereotaxic 장치 있지만 마우스 두개골 확보 겨냥 하는 거꾸로 한 현미경 시스템에 대 한 아무 상업적으로 이용 가능한 stereotaxic 장치가입니다. 사용자 지정 stereotaxic 장치에 대 안으로, 두개골 위의 안정성에 대 한 다양 한 테이프 또는 접착제 방법을 활용 하 고 목표 위치에 보안 수 있습니다.
  2. 이미지 수집 소프트웨어를 엽니다. "수집 설정"에서 패널 한 방향 스캐닝 모드 선택 됩니다 확인 합니다. 4 μ/픽셀, 512 x 512 픽셀 프레임 속도 스캔 속도를 설정 하 고 1.5로 확대. 20 X W 나 0.95 목표는 nosepiece에서 렌즈에 맞게 사용할 수 있는 렌즈의 목록에서 선택 합니다.
  3. "이미지 수집" 제어판에서 "염료" 목록에 액세스 하 고 "두 광자"를 선택 합니다. "빛 경로 & 염료" 창 열고 레이저 단위 2에서에서 확인란을 선택 하 여 DM690-980 여기 DM. 2 P 레이저 셔터 열기를 선택 합니다. "현미경 컨트롤러" 창에서 RDM690 미러를 선택 합니다.
  4. "피 램프"를 선택, B/G 피 필터 큐브를 선택 하 고 목표 혈관 흐름을 사용 하 여 참조로 중앙 정 맥 (a)와 (b) (그림 2A) 관상 봉합의 분기 calvarium 골 틈새를 시각화 하는 표본에 집중.
  5. 비 descanned 모드를 사용 하 여 이미지를 수집 합니다. 3 외부 감지기 선택: PMT detector1 콜라겐의 SHG 신호 수집 하 (방출 필터-430/100 nm), GaAsP detector2 수집 GFP 신호 (방출 필터-525/50) 및 GaAsP detector3 TRITC-dextran의 신호를 수집 하 (방출 필터-605/90 nm).
    1. 스캔 속도 4μs/phototoxicity를 최소화 하기 위해 아무 평균 픽셀에서 이미지를 수행 합니다. 최소한의 채도와 검출기의 전체 동적 범위를 사용 하도록 조정 일정 레이저 파워 및 검출기 이득에서 이미지를 수집 합니다.
    2. Calvarium 골 수의 6 지역에서 조직 (60 x 1 μ m Z-스택)의 깊이 통해 섹션의 시리즈를 수집 합니다. 1 μ m의 단계 크기 설정을 사용 하 여, 확대/축소 1.5 및 512 x 512 픽셀 프레임 크기 (423 µ m x 423 µ m).
      참고: 전체 한 마우스를 이미지 하는 데 필요한 총 시간 1-1.5 h입니다.

6입니다. 정량 분석

  1. 제조업체의 지침에 따라 전용된 3D/4d 이미지 정량 및 시각화 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 정량 및 3D 개조를 수행 ( 자료 표참조). Z-스택 최대 강렬 투 상 (MIP), 활용 하는 차원에서 알파 혼합 또는 그림자 투영 볼륨 렌더링 알고리즘을 대화식으로 시각화.
  2. 사용 하 여 GFP 셀 세그먼트는 "자리 개체 세그먼트화 모듈". 스택 산술 처리 (채널 빼기) 거짓 긍정적인 수 GFP 셀 (녹색 및 빨강 채널에서 강한 형광을 표시 하는 뼈 세포의 신호 제거)를 제거 하기 위해 적용 됩니다.
  3. 맥 관 구조와 뼈 표면 표면 세그먼트화 모듈을 사용 하 여의 세분화를 수행 합니다. 필요한 경우, "표면에 반점의 거리" 라고 하는 X-긴장 알고리즘을 적용 하 여 위의 표면에 세포의 거리를 계산 합니다.

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Representative Results

2 RBPJKO 및 2 RBPJWT 받는 사람의 동료 다른 시간 지점에서 개별 이미징 세션에 몇 군데 있었다: 24 h와 2, 4 및 6 주 (워크플로 그림 1A일러스트) BM 리스-GFP 세포의 이식 후.

각 마우스에서 이미지 (그림 2A,)중앙 정 맥 그리고 관상 봉합 (그림 2A, b)의 분기점에 관하여 그들의 위치에 의해 식별 된 BM calvarium의 6 표준 영역에서 인수 했다. 사출 Dextran 텍사스-레드의 이미징 이전 수 이러한 랜드마크의 식별 및 6 영역 (그림 2A)의 선택: 왼쪽 상단, 중간 및 오른쪽 (UL, UM, UR), 그리고 낮은, 중간 왼쪽과 오른쪽 (LL, LM, LR). 60 x 1 μ m z-더미는 각 지역에서 수집 하 고 렌더링으로 3 차원 최대 강도 프로젝션 (MIP), (그림 2B). 3 차원 그림자 투영, 프로 빙 콜라겐 조직 (그림 2C); 두 번째 고조파 생성 (SHG) 현미경에 의해 생성 된 뼈 구성 (회색)을 포함 하 그리고 마지막으로, 3 차원 세그먼트 이미지를, 세포의 정량 및 그들의 거리는 뼈와 혈관 (그림 2D)에서 측정을 수 있습니다.

이식 후 BM calvarium의 다른 지역에 있는 조 혈 모 세포의 유도 환경 설정에서 잠재적인 차이 이므로 각 마우스의 calvarium에서 여러 영역을 샘플링 하는 것이 중요. 그림 3 은 셀 유통 BMT (녹색-회색-뼈, 골수성 세포) 후 2 주에 한 RBPJWT 및 RBPJKO 받는 사람 분석 6 지역에서 그림자 투영 3 차원 렌더링 알고리즘을 사용 하 여. 258 RBPJWT 마우스에 64와 RBPJKO 마우스에 573에 265에서 원거리 지역 당 셀의 수입니다. 최종 결과 다음 평균 수가 6 지역 분석으로 표현: 지역 / 마우스 (RBPJWT vs 469 RBPJKO에 평균 135) 당 셀의 숫자. 이 대표적인 실험 RBPJKO 받는 사람에서 보다 RBPJWT에서 지역별 셀 유통에 큰 변화 임을 나타냅니다. 또한,는 일반적인 마우스에서 calvarium 지역에 있는 변이 이외에 동일한 그룹 내의 개별 마우스 중 변이가 있다. 따라서, 각 시간 점에 대 한 최소 4 쥐가 실험 조건 별로 분석을 총 24 ~ 30 지역 최소를 당 평가 중요 하다.

그림 4 는 이식 후 6 주 이상 제어에 비해 노치 결함이 BM microenvironment에 골수성 조상 확장의 역동성을 보여준다. 대표적인 실험에서 8 RBPJWT, 8 RBPJKO 마우스 이식 되었고 표시 시간 포인트 (2 RBPJWT 쥐 및 각 시간 지점에서 2 RBPJKO 쥐)에서 몇 군데. 그림 4A 인수 1 6 지역 대표 3 차원 재구성을 보여 줍니다. 6 영역의 각 셀을 계산 했다 하 고 셀/지역 (총 12 지역) 각 시간 점에서 두 쥐의 평균 수는 RBPJWT 및 RBPJKO 받는 사람 (그림 4C)에 대 한 계산 되었다. 이 분석 됨을 나타냅니다.: (i) 기증자 리스 GFP 셀 RBPJWT 및 RBPJKO에는 유사한 추적 효율성; ii) 셀 RBPJKO 받는 사람에 더 급속 하 게 확장 하 고 BMT; 후 주 2에 셀 RBPJWT 받는 사람 두 번 수 있습니다. iii) 셀 RBPJWT 받는 사람에 나중에 확장 되며 2-fold 셀 RBPJKO 받는 사람 보다 더 높은 BMT; 후 주 4 그리고 iv) 휴대폰 번호 RBPJWT 및 RBPJKO에 BMT 후 6 주에서 비슷한 될. 기증자는 샌드위치에 골수성 세포의 분석 주 4, RBPJKO의 BM 마우스 리스 GFP 셀의 낮은 콘텐츠를 보여 줬을 때 시간에 BM의 RBPJWT 받는 보다 BM의 RBPJKO 받는 골수성 세포의 더 높은 출력을 나타냅니다. 골수성 세포는 BM에서의 결합된 분석 골수성 세포는 샌드위치에 순환의 RBPJKO BM에 microenvironment 리스 GFP 셀 확장 및 보다 신속 하 게 동원 준비가 표시 합니다. 동일한 마우스에서 긴 뼈 BM에에서 리스 GFP 셀의 병렬 FACS 분석 IVFM;에 의해 관찰 하는 것과 비슷한 추세를 보였다 그러나, 조건 사이의 차이 (그림 4B) 덜 발음 했다.

뼈는 맥 관 구조에서 개별 리스 GFP 셀의 거리의 측정은 그림 5에 표시 됩니다. 이 대표적인 연구에서 BMT에서 6 주에 RBPJWT 및 RBPJKO calvarium의 LM 영역의 3 차원 세분화 분석 사용 되었다 (그림 5A). 뼈와 혈관에서 거리는 지역에 있는 각 셀에 대 한 계산 했다: 200 RBPJWT와 RBPJKO, 255 셀에 셀 하 고 따라서, 평균으로 표현. 분석 보여줍니다 리스 GFP 셀 RBPJWT 및 RBPJKO 쥐 (11 μ m), 뼈에서 비슷한 거리에서 지역화 하지만 그들은 RBPJWT 쥐에서 보다 RBPJKO 마우스에는 맥 관 구조에서 더 먼 거주 (15 μ m 5 μ m, 각각). 이 결과 RBPJKO에 마우스 리스 GFP 셀 RBJWT 마우스에 이상 순환으로 동원 하 고 따라서 혈관에 가까이 지역화 예상 대로 흥미로운,입니다. 그러나, 그것은 지역화에 차이 (RBPJWT 및 RBPJKO)에서이 두 집단의 분화의 다른 단계를 반영이 분석에 의해 해결할 수 없는 포인트. 이 결과의 의미 것 될 다음-최대 셀과 FACS 분석을 결합 하 여 모든 6 지역에서의 더 큰 수영장.

전반적으로, 차선의 결과 마우스 당 적은 수의 영역을 분석할 때 얻을 수 있습니다. 영상으로 치명적인 방사선 피해는 맥 관 구조 및 모세 혈관에서 dextran의 누설 감소 이미지 정의 BMT, 다음과 같은 초기 시간 포인트에서 특히 도전 이다. 따라서, 초기 시간 포인트에서 특히 많은 수의 반복, 하는 것이 중요 하다.

SHG은 콜라겐 섬유 조직 차원에서 조사를 위한 유용한 도구입니다. 그것은 비 centrosymmetry 및 높은 2 차 비선형 계수 콜라겐 섬유 같은 구조에서 유래는 2 차 비선형 광학 과정. 강렬한 입사광 같은 구조와 작용, 사고 주파수의 두 배 또는 절반 사건 파장에서 빛을 생성 됩니다. 따라서, 아무 라벨 2 광자 현미경 동안 SHG 신호를 캡처하기 위해 필요 하다. 830 nm 여기 파장, 우리 방출 필터 430/100 nm와 파랑 채널에 SHG 신호를 캡처.

Figure 1
그림 1: 실험 워크플로. (A) RBPJKO 및 RBPJWT 쥐 ~ 4 주 이전 이미징; 생성 하 유도의 Mx1-Cre/RBPJlox/lox 쥐 (B) 준비 BM 리스 GFP 유전자 변형 쥐;에서 세포 (C) 이식의 BM 리스-GFP 세포 치명적 방사능 RBPJKO 또는 RBPJWT로 받는 사람; 24 h, BMT, 안락사 및 FACS BM 분석 후 2, 4, 6 주에 마우스 calvarium의 (D) IVFM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: BM 혈관 틈새의 IVFM. 영상의 6 표준 영역을 보여주는 리스 EGFP 마우스 calvarium의 (A) 모자이크 다중 광자 이미지 (UL: 왼쪽, UM 위: 위 중간, UR: 오른쪽 상단, LL: 왼쪽, LM: 낮은 중간, LR: 오른쪽 아래) (녹색, 골수성 세포, 레드, 맥 관 구조, 회색, 뼈) 10 배 확대; (B-D) BM 틈새 세부 렌더링: MIP (B), (C) 3 차원 그림자 투영, (D) 3 차원 세분화 이미지. 이미지-전용된 3D/4d 이미지 정량 및 시각화 소프트웨어 (표 1)를 사용 하 여 처리 되었습니다. 스케일 바 B, C, D.에서 50 μ m = 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 주 2 골수성 세포 Engraftment. 리스-GFP 셀 (녹색)와 뼈의 이미지 한 RBPJWT와 1 개의 RBPJKO 마우스 (된 위, l: 왼쪽, r: 오른쪽, m: 중간)의 calvarium 뼈에서 6 BM 지역에서 (회색) 표면. 스케일 바 = 50 μ m. 각 지역 (RBPJWT 범위 64-258;에서 계산 하는 셀의 수를 표시 하는 막대 그래프 (오른쪽) RBPJKO 범위 265-573)와 그들의 평균 수 135 성병 73, 그리고 469 + 121 + 성병. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 골수성 세포 Engraftment 및 출력 다음 BMT의 활동. (A) 이미지의 리스-GFP 셀 (녹색)와 뼈 (회색) 한 대표적인 지역에서에서 표면 각 시간 포인트에서 한 RBPJWT 및 RBPJKO 마우스의 calvarium. 스케일 바 = 50 μ m; (B) 점 지우고 리스-GFP cytometry 내 긴 뼈 같은 마우스에서 수확의 BM에 의해 긍정적인 세포 (위) vivo에서 몇 군데의 표시 비율. (C) 막대 그래프 셀/지역 각 시간 지점에서 2 마우스 (총 12 지역)에서 평균 수, 경우 (D) 선 + 그래프로 같은 쥐의 PB에 호 중구 (셀 카운터에 의해 열거 된)의 총 수에 배 증가 보다 표시 된 시간 시점에 (A). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: BM 상대는 뼈에는 맥 관 구조에 골수성 세포의 지역화. (A) 맥 관 구조, 그리고 리스 GFP 셀 리스 GFP 셀 BMT에서 주 6에서 RBPJWT 및 RBPJKO 받는 사람 calvarium 뼈의 동일한 지역에서 뼈의 대표 3 차원 세그먼트 이미지. 스케일 바 = 50 μ m. (B) 막대 그래프 요약 뼈 표면 또는 맥 관 구조에서 SEM의 리스-GFP 셀 + μ m에 평균 거리. 셀 수에서 측정: RBPJWT n = 200 세포 및 RBPJKO n = 255 셀. 리스-GFP 세포는 맥 관 구조에서의 거리는 RBPJWT 마우스, p 보다 큰 RBPJKO < 0.001 (스튜던트 t-검정). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

이 프로토콜 Intravital 형광 현미경 검사 법에 의해 최적화 engraftment 조 혈 모 세포의 활동을 연구 하는 실험 설계를 설명 합니다. 이 연구에서는 골수성 조상 세포 WT BM 또는 노치 신호 결함이 있는 BM의 확장 했다 추적 뼈 calvarium에서 다음 리스 GFP 긍정적인 골수성 세포 BMT 후 받는 사람 RBPJWT 또는 RBPJKO로. 이 접근은 주소 비슷한 질문에 예를 들면 적용 될 수 있는 모델로 제안: 나) 확장과 다른 계보의 세포의 BM 틈새에서 지역화와 같은 결정을 림프, erythroid 또는 megakaryocytic 세포 기증자 세포로 사용 하 여 조 혈 모 세포 계보 특정 발기인 GFP 또는 토마토-레드; 운전을 들고 ii)를 받는 사람으로 다른 특정 코 또는 유전자 변형 쥐를 사용 하 여 다른 마이크로 환경 결정을 평가 합니다.

Calvarium 뼈에서 이미징이 프로토콜의 강도 BM 지역, 중앙 정 맥 그리고 관상 봉합의 분기점을 선택 하는 데 사용 하는 해부학 랜드마크 개인 간의 일관성을 허용 하는 모든 마우스 합리적으로 보존 자동화 된 무대의 요구를 forgoing 동안 실험. 또한, 조 혈 모 세포를 추적 하는 GFP 모델의 사용 GFP 방사선 조사 후와 같은 차선 조건에서 안정 되어 있는 신호를 제공 매우 효과적인 것으로 판명. 마지막으로, 크게 호흡 아티팩트 최소화는 거꾸로 한 현미경 및 마우스는 부정사 위치에 사용자 지정된 stereotaxic 장치를 사용 하 여 이미징 설정 설명 합니다.

이 실험적인 디자인의 두 가지 측면, 구현 하는 경우는 calvarium의 IVFM의 광범위 하 고 더 효과적인 사용을 발생할 수 있습니다. 첫째, 그것은 최적화와 경도 이미징 수 있도록 관찰 (몇 주에 주 2)에서 서로 다른 시간 지점에서 동일한 마우스의 개입 ( BMT 또는 치료) 후 사용 하는 대신의 프로토콜을 표준화 하는 것이 중요 될 것입니다. 쥐의 독립적인 동료입니다. 이 방법은 수술 후 회복과 염증, 감염, 중화와 대형 사이트에서 화상의 흉터의 사용에 대 한 적절 한 조건을 필요로, 그것의 응용 프로그램은 현재 제한. 둘째, 그것 추적 마우스 모델 BM 틈새의 특정 셀에 형광 단백질을 운반 하는 혈통의 배열을 개발 가치가 있을 것입니다 (혈관, endosteal, 혈관 주위 및 신경)와 결합 하 여 조 혈 세포 기능 관련 BM 틈새의 특성입니다.

뼈의 이미지는 여전히 몇 가지 도전과 다른 조직에 비해 제한 있다. 두 광자 현미경 100-1, 000 미크론에 깊은 조직 침투 수 있습니다, 하지만 여전히 calvarium 뼈의 전체 두께 통해 이미지를 도전 이다. 이미지 손실 그래서 여기 프로토콜 설명 60 미크론 두께 더미에서 BM 영역의 신뢰할 수 있는 분석 깊이 증가 함께 품질. 모순이 나 차선 영상에서 발생할 수 있는 또 다른 요인은 초점 이미지를 가져올 수 있는 calvarium 뼈의 곡선된 모양입니다. 그것은 위치가 완벽 하 게 목표, 위에 유리 접시에 아마도 stereotaxic 장치 두개골을 중요 합니다. 실제로, 두개골 크기는 중요 한: 너무 젊 거 나 너무 작은 쥐의 두개골 주어진된 stereotaxic 장치에 완벽 하 게 맞지 않을 수도 있습니다. 예를 들어, 여기에 활용 하는 장치는 6 주 미만 20 g 보다 젊은 쥐를 적합 하지 않습니다.

추가 제한은이 연구에 활용 하는 이미징 시스템 3 채널 제한입니다. 파랑 채널 자동으로 수집 하는 뼈의 콜라겐의 기반된 SHG 신호 라벨 비 할당로 2 채널 특정 형광 라벨에 대 한 사용할 수 있습니다. 또한,이 시스템은 2 μ s/픽셀에서 1 프레임/s의 속도 제한을 시간과 빠른 동적 프로세스 (예: 혈 류와 혈 류에서 세포 동원의 평가의 측정)에 적합 하지 않습니다 512 x 512 픽셀 프레임 크기 면만 있다.

중요 한 도전 방사선 BMT 타협에 대 한 맥 관 구조 무결성 수행입니다. 방사선 조사 후 BM에 혈관 누설 세분화/정량 정량 분석에 어려움을 제기할 수 있는 개별 구조와 어려움을 발생 합니다.

마지막으로, 그것을 고려해 야 한 마우스의 이미징 약 1 시간 걸리며 주어진된 하루에 몇 군데 수 있는 쥐의 수는 제한 (4 ~ 6 쥐). 따라서, 분석의 힘을 얻기 위해 샘플 크기 증가 다양성을 증가 시킬 수 있는 여러 개의 독립 실험 필요할 수 있습니다.

이 프로토콜에 따라 조 혈 모 셀 리스-GFP+ BMT에서 24 시간 ~ 30 셀/지역 및 그것 후에 IVFM는 BM에 의해 감지 수 셀 (3 x 106)의 초기 입력에 비해 매우 적은 수가입니다. 비록,이 문제의 일부 이며 때문에 폐에 트래핑 셀 선택 이외의 calvarium에서 지역 인지 탐험 남아 i.v. 주입 다음 BM 유도 하기 전에 간, 어디 이식된 세포 홈에서 높은 효율성입니다.

유도 및 BMT 후에 BM로 셀 engraftment 일반적으로 뒤에 cytometry 여 GFP, Carboxyfluorescein succinimidyl 에스테 르 (CFSE) 또는 계보 및 줄기 세포 표식의 조합 CD45.1/CD45.2 마커의 측정 됩니다. 특히 초기 시간 지점에서 IVFM, 사용 하면 사용할 수 있는 고유 정보 및 추가 정보를 cytometry에 의해 제공 될 수 없습니다. 예를 들어 자주 쉽지 않다 "셀" 이벤트 "유물", 특히 긍정적인 이벤트의 낮은 수를 수집 하는 때에서 FACS 이벤트에 의해 구별 하는 것 (즉, BMT에서 24 h). IVFM은 형태학에이 구별을 에이즈 셀의 지역화 정보를 제공 합니다. 마찬가지로, FACS 분석 홍 조 또는 뼈 충돌에 의해 수확 BM 조 혈 모 세포의 틈새에 거주 했다 세포 및 혈관 시스템에서 순환에 이미 있던 셀에 포함 됩니다. 실제로, IVFM는 구별 및 BM 틈새와 혈 류로 동원 된 셀 내에서 휴식 하는 셀의 평가 허용 합니다. 이 구별은 큰 가치 때 유도, 현지화, 차별화 및 동원 지정 된 모델에서의 활동을 공부. 중요 한 것은, IVFM는 microenvironment 세포를 구성 하는 특정 틈새 시장에 상대적으로 조 혈 모 세포의 위치에 고유 정보를 제공할 수 있습니다.

BM 틈새 같은 조직학 분석의 구성을 해결 하는 데 사용 하는 다른 방법이 사용 되었습니다. 비교는 BM의 intravital 현미경 검사 법 그리고 confocal 현미경 조직학 분석 철저 하 게 그리고 우아하게 논의 되었습니다 Lo 셀 소 외.18.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이미지는 닥터 켄 던 감독 하는 인디애나 대학에서 생물학 현미경에 대 한 인디애나 센터에서 실시 되었다. Stereotaxic 장치 설계 및 마크 Soonpaa, 웰 스 소아 연구 센터에 의해 만들어진 프로토 타입 이다. 이 작품은 NIH/R01DK097837-09 (NC)에 의해 지원 되었다, NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), MPN 연구 재단 (NC)와 CTSI 공동 프로젝트 IUSM/노 틀 담 (NC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine cocktail IU School of Medicine Ketamine 90-100 mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg
TRITC dextran Tdb Consultancy TD150-100mg Other color dextran may be used.
Andis hair trimmer Braintree Scientific CLP-323 75
Gauze sponge Med Vet International PK224 4-ply, 2 x 2
Nair depilatory cream Commercial store
Saline Med Vet International RXSAL-POD1LT 0.9% Sodium Chloride poly bottle
Insulin syringe Fisher Scientific 14-826-79 28 g, 1/2 cc
Fine Forceps Fine Science Tools 00108-11, 00109-11 straight forcep, angled forcep
Scissor Fine Science Tools 15018-10
Needle holder Fine Science Tools 12002-14
5-0 silk suture Fisher Scientific MV-682 Other non-absorbable suture may be used
WillCo- glass bottom dish WillCo GWSt-5040
Optical microscope oil Leica
Stereotaxic stage insert  IU School of Medicine Custom design
Olympus FV1000 confocal microscope system  Olympus
Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objective  Olympus
Small heating pad Commercial store Zoo Med reptile heating pad
Imaris 8.1 imaging software Bitplane 3/4 D Image Visualization and Analysis software

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