간단한 유세포 방법은 전체 혈액에서 단핵구 부분 집단에 대한 당 흡수 및 포도당 운송업자 발현을 측정하는

1Centre for Biomedical Research, Macfarlane Burnet Institute for Medical Research and Public Health, 2Department of Infectious Diseases, Monash University, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Melbourne, 4Department of Microbiology, The University of the West Indies, 5Division of Experimental Medicine, Department of Medicine, University of California, San Francisco, 6Department of Medicine, Monash University
Immunology and Infection

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Palmer, C. S., Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., McCune, J. M., Crowe, S. M. A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood. J. Vis. Exp. (114), e54255, doi:10.3791/54255 (2016).

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Abstract

단핵구 특정 만성 염증성 질환과 관련된 병원균과 염증에 의해 활성화 될 수있는 선천성 면역 세포이다. 단핵구의 활성화는 이펙터 기능과 향상된 글루코오스 트랜스 포터의 발현을 수반하는 산화 당분 해 대사에서 수반하는 변화를 유도한다. 이 증가 당분 대사는 훈련 된 단핵 세포의 면역 선천성 면역 메모리의 형태로 관찰된다. 단핵 세포에 의해 글루코스 수송 체 발현 및 당 흡수 검사 관내 프로토콜을 설명 하였지만, 없음은 전혈 세포 계측법 다중 파라미터 플로우에 의해 관찰되지 않았다. (중간체 (CD14 ++ CD16 +) 및 비 - 고전 - 우리는 전체 단핵구 및 고전 (CD14 ++ CD16)에 의해 전혈 형광 글루코오스 유사체 2-NBDG 흡수의 측정을위한 다중 파라미터 유세포 프로토콜을 설명 CD14 + CD16 ++) 단핵구소집단. 이 방법은 항상성 및 염증성 질환 중 총 단핵 세포 및 단핵 세포 개체군에 대한 글루코스 수송 체 발현 및 당 흡수를 조사하는데 사용될 수 쉽게 혈액 내의 다른 백혈구 및 백혈구 개체군에 대한 당 흡수를 조사하기 위해 수정 될 수있다.

Introduction

단핵구는 빠르게 감염과 염증 하나의 사이트로 동원 된 인간의 선천성 면역 시스템의 주요 구성 요소입니다. 단핵 세포의 활성화는 병원체에 의한 급성 손상을 제한하기위한 중요하며 또한 죽상 동맥 경화증 2,3, HIV 4,5 등 여러 가지 만성 질환의 발병 기전의 핵심입니다.

휴식 활성화 단핵 세포의 신진 대사는 당분 대사를 (즉, 포도당의 발효 락트합니다)를 이용 산화 대사를 이용하여 휴식 단핵 세포 활성화 단핵 세포와 크게 다르다 6. 단핵 세포의 활성화는 당분 대사 7 증가 포도당 흡수를 허용 포도당 수송 체의 발현을 유도한다. 단핵구 포도당 수송 1 (GLUT1)의 활성화 중에 상향 조절 하나의 수송과 그 표현은 절에서 염증성 사이토 카인의 생산으로 이어질 것으로 나타났다itro 비만 쥐 (8)의 지방 조직입니다. 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스에 의한 단핵구 세포 라인의 감염 GLUT1 9의 휴대 상향 조절로 연결, 우리는 최근에 만성 HIV 감염시 GLUT1 발현 단핵 세포의 증가 비율이 치료와 함께 항 레트로 바이러스 치료 처리 감염 10시 존재하는 것으로 나타났다. 함께 찍은, 이러한 연구는 포도당 흡수 및 단핵 세포에 의한 당분 대사가 많은 염증성 질환의 중요한 측면이라는 것을 보여줍니다. 따라서, 간단한 방법 항상성 동안 단핵구 GLUT1 발현 당 흡수를 측정하고 염증성 질환 연구의 광범위에 유용 할 것으로 예상된다.

인간 단핵구의 세포 표면 마커 CD14 및 CD16 발현 (11, 12)의 차동에 의해 검사 될 수있는 세 개의 서로 다른 서브 세트들로 구성되는 이종이다. 클래식 단핵 세포는 CD14 높은 수준의 표현하지만 CD를 표명하지 아니합니다16 (CD14 ++ CD16은 -), 중간 단핵구는 CD14의 높은 수준 및 CD16 (CD14 + CD16 +)의 중간 레벨 및 단핵구는 CD14의 로우 레벨과 CD16의 높은 레벨을 발현 비 고전적 (CD14을 발현 + CD16 ++). CD16을 표현 단핵구는 CD16에 비해 CD16 + 단핵 세포를 불린다 - 단핵구 높은 염증성 사이토 카인의 발현과 기능을보다 효율적으로 존재하는 항원 (13, 14)에 있습니다. 단핵 세포의 약 10 %는 염증 15 일 동안 관찰 높은 비율과 항상성 동안 CD16를 표현한다. 단핵 세포 개체군은 특정 질병 상태와 관련된 질병과 질병의 진행 (16)의 유용한 생물 마커 될 수 있습니다.

우리의 목표는 PHY에 가까운 조건에서 인간 단핵 세포와 단핵구 소집단에 의한 포도당 수송 체의 발현과 포도당 흡수를 측정 할 수있는 방법을 확인하는 것이 었습니다가능한 한 siological 조건. 이러한 방법은 생리적 조건 (19)에 비해 단백질 발현을 변경 한 수 절연 단핵구를 조사하더라도 이전의 연구는, 단구 글루코스 수송 체 발현 및 당 흡수 17,18을 측정하고, 더 이전의 연구는 인간 단핵 세포 개체군을 조사하지 않았다. 계측법 다중 파라미터의 흐름을 이용하여, 총 단핵 세포 및 단핵 세포 개체군에 의해 형광 글루코오스 유사체 2-NBDG 글루코오스 트랜스 포터의 발현 및 흡수를 검사하는 방법을 설명하는 전체 조작되지 혈액 내 (CD14 및 CD16의 발현에 기초하여).

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Protocol

참고 : HIV 감염과 HIV-감염되지 않은 과목은 멜버른, VIC, 호주에서 알프레드 병원에서 감염증 단위에서 모집하고, 각각 지역 사회에서했다. 동의서는 모든 참가자로부터 얻은 것, 그리고 연구는 알프레드 병원 연구 윤리위원회에 의해 승인되었다.

단핵구와 단핵구 부분 집단 1. GLUT1 세포 표면 감지

  1. 구연산 ACD-B 항 응고 튜브에 혈액을 수집하고 수집의 1 시간 내 생물 안전 캐비닛에 실험을 시작한다.
  2. 폴리 프로필렌 튜브에 혈액 100 μl를 추가합니다. 얼음에, 피펫 부드럽게 혼합하면서 솔루션을 용균 1 배 2 ㎖를 추가 튜브 (재료 표 참조). 얼음에 15 분 동안 품어. 5 분 동안 220 XG에 원심 분리기.
  3. 따르다 약 2-4 ml의 세척액 (1X PBS에서 0.5 % BSA)을 첨가하고 5 분 동안 220 × g으로 원심 분리하여 두 번 세척 하였다.
  4. 파이프를 사용하여TTE 신중 가능한 세정 용액만큼 제거한다. 장소 튜브는 얼음에 세척 용액 100 μL에 다시 일시 중지합니다.
  5. 5 ㎕를 항 CD3-PE, 5 ㎕의 항 CD14-APC, 5 ㎕의 항 CD16-PECy7, 5 μL의 GLUT1 : 특정 단핵 세포 개체군 단계 1.4에서 제조 된 세포 현탁액 μL에 100 개의 항체의 다음 볼륨 세포를 염색 확인하려면 -FITC 또는 IgG2b에-FITC (이소 제어 튜브).
  6. 어둠 속에서 30 분 동안 얼음에 놓습니다. 세척 용액으로 2 회 반복한다. 1X PBS에서 만든 0.5 %의 포름 알데히드 200 ~ 300 μL로 수정합니다.
  7. 다음 여기 및 방출 파장 내에서 24 시간 내에 4 가지 색상을 검출 할 수있는 사이토 흐름 분석 (633, 660) 10 FITC (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC를.

단핵구 2. 당 흡수

  1. 혈액의 피펫 90 μl의 폴리 프로필렌 튜브의 단계 1.1에서 수집. 14.60 μM 2 NBDG 작업 용액 10 μL에 추가90 혈액의 μL (1.46 mM의 최종 농도)와 영화는 가볍게 혼합한다. 이 알루미늄 호일로 피복함으로써 튜브 광 -2- NBDG 노출을 제한하는 것이 중요하다.
  2. 15 ~ 30 분 동안 어둠 속에서 37 ° C에서 품어 후 즉시 얼음에 놓습니다. 얼음 동안 튜브에 솔루션을 용균 1 배 FACS의 4 ML을 추가합니다. 4 220 XG에 원심 분리기 5 분 동안 C를 °.
  3. 세척액 (1X PBS에서 0.5 % BSA) 4 mL를 첨가 한 번 씻는다. 4 220 XG에 원심 분리기 5 분 동안 C를 °. 가만히 따르다과 얼음에 장소.
  4. 항체와 얼룩 세포 : 5 ㎕를 항 CD3-PE, 5 ㎕의 항 CD14-APC 5 ㎕의 항 CD16-PECy7. 믹스와 어둠 속에서 30 분 동안 얼음에 배치합니다.
    참고 :이 기간 동안 흐름이 사이토 즉각적인 분석을위한 준비가되어 있는지 확인합니다. 다음 여기 및 방출 파장 내에서 세포를 획득 : 2 NBDG (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660).
  5. 튜브에 얼음 차가운 세척 버퍼 (1X PBS에서 0.5 % BSA)의 4 ML을 추가합니다.4에서 220 XG에 원심 분리하여 한 번 씻으 5 분 동안 C를 °. 가만히 따르다과 얼음 오래 PBS의 200 ~ 300 μl를 추가하고 어둠 속에서 얼음 (알루미늄 호일로 덮여)에 보관하십시오. 사이토 단계 2.4에서와 같이 여기 및 발광 파장 설정을 사용하여 10 분 이내에 흐름 분석.

3. 데이터 수집 및 분석

주 : 유세포 분석 및 데이터 분석 기술이 가정된다.

  1. 흠 개별적으로 염색 된 샘플을 이용하여 보정을 설정 적어도 4 색 분석 할 수있는 유세포 사용.
    주 : FITC 표지 된 CD4 및 CD14을 사용하여 단일 염색 GLUT1 2-NBDG 보상에 사용될 수있다.
  2. 설정 및 샘플을 획득하기 전에 해당 창 레이블을 붙입니다. 단핵구 인구 주위에 게이트를 그리기, 중간 속도로 샘플 당 10 만 30 만에 이벤트를 취득. 보상 샘플 50,000 이벤트는 충분하다.
    참고 : 보상은 샘플링 이전에 수행 될 수있다표준 절차에 따라 획득 또는 단일 세포 분석 소프트웨어.
  3. 수출 및 적절한 위치에 데이터를 저장합니다. 이러한 FlowJo 또는 다른 분석 소프트웨어 지정 (보충 그림 2)로 (보충 그림 1)과 드래그 앤 드롭 샘플로 단일 세포 분석 소프트웨어를 엽니 다.
  4. 두 파일 (보충 그림 3)를 클릭하여 엽니 다. . 게이트 앞으로 기반 단핵구 그림 1A보충 그림 4와 같이 측면 산란 특성에 원을 그립니다 두 번 단핵 세포 인구를 클릭합니다. 관찰하고 CD3 주위에 상자를 그립니다 - 인구 (보충 그림 4).
  5. 더블 CD3을 클릭 - 인구. 단핵구의 소집단이 'X'축에 CD14-APC를 선택 관찰하고, 'y'- 축에 CD16-PECy7, 따라서 (보충 그림 5) 레이블을합니다.
  6. 뚜렷한이없는 경우양 및 음의 인구 특정 단핵 세포 소집단에서 GLUT1의 발현 또는 2-NBDG 흡수를 측정한다. 이소 타입없이 2 NBDG 배경 (보충 그림 6)를 뺀 GLUT1과 2 NBDG의 평균 형광 강도 (MFI)를 결정합니다.
  7. 정의 된 집단이 존재하는 경우, 비율 양성 세포 (그림 3) 게이트를 설정하고 결정하기 위해 IgG2b의-FITC를 사용합니다.
    참고 : 전체 CD14 + 단핵 세포를 분석하려면이 절차를 사용하십시오. 2-NBDG 흡수는 일반적으로 형광의 변화에​​ 의해 표시되기 때문에, 데이터가 가장 MFI 및 히스토그램으로 표현된다 강도.

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Representative Results

보상 형광 유출을 방지하기 위해 각각의 형광 색소에 대해 수행되어야한다. 단핵구 먼저 전방 및 측면 산란을 기반으로 게이팅에 의해 강화된다. . 인구 - 이전에 (10)는도 1a는 CD3 내 게이팅에 의해 세포 분산 및 T 세포의 배제에 의한 단핵구의 초기 게이팅을 보여줍니다보고 제시된 그래프는 6 개 이상 참가자 전체 혈액에서 수행 적어도 6 독립적 인 실험의 대표입니다. 각각,도 1b 및도 1c에 도시 된 바와 같이, 단핵구는 CD14 발현 단독 총 단핵구 또는 단핵 세포 개체군을 식별 CD16과 결합을 위해 게이팅된다. CD보다 대략 100 배 표현한다 - 고전 단핵구 (CD14 CD16 ++) 이전 12 바와 같이 단핵 세포 개체군의 분석을 위해, 다음의 명명법이 적용되어야이소 타입 제어 및 CD16 MFI보다 14 MFI는 아이소 타입 컨트롤과 비슷해야합니다; 중간 단핵 세포 (CD14 + CD16 +)이 약 아이소 타입 컨트롤보다 더 큰 CD14 MFI를 100 배 및 약 10 배 표현해야 더 큰 아이소 타입 컨트롤에 비해 CD16 MFI; 비 고전 단핵 세포 (CD14 + CD16는 ++) CD14과 이소 제어 유사한 MFI가 있어야하고 약 아이소 타입 컨트롤보다 더 큰 CD16 MFI (100)는 배. CD14 및 CD16의 발현이없는 세포는 고려 단핵구하지 않으며 게이팅에 포함되어서는 안된다. 정문 단핵구 또는 단핵 세포 개체군 후 글루코오스 트랜스 포터의 발현을 조사 할 수있다. 그림 2에 나타낸 바와 같이, CD14 + GLUT1 + 단핵 세포의 고유 한 인구는 감염이 염증의 만성 상태를 특징으로 HIV + 개인에서 얻은 세포에서 특히 관찰 할 수있다. 유사하지만 드문 CD14는 + GLUT1 + 세포는 OBS 할 수있다HIV 감염되지 않은 사람 (그림 3A)의 특정 단핵구 부분 집합 내에서 erved하지만 HIV + 개인 (그림 3B)에서 더 뚜렷하다. 주목할 별개 집단의 부재, 그것을 고려 GLUT1 세포 표면 발현의 누적 상승을 얻어 평균 또는 중앙값의 형광 강도 등의 결과를 표현하는 것이 적절할 수있다.

당 흡수 2- NBDG 또는 게이트 단핵구 또는 단핵 세포 개체군에 대한 차량 제어 배양 전혈을 비교하여 평가할 수있다. 우리는 이전에 단핵 세포의 약 50 %가 15 분 배양 10 후 2 NBDG이 긍정적 인 것으로 나타났다. 2 NBDG 흡수 단핵구의 차이가 더 이상 존재하지 않을 수 있습니다 때 이해 수준에 도달 포화없이 2 NBDG의 검출이 가능합니다. HIV 감염되지 않은 및 HIV + 명에서 단핵 세포에 의해 2 NBDG 흡수의 분석은 HIV + 명에서 세포에 의해 더 높은 흡수를 공개하는GLUT1의 발현 데이터 (- 5 그림 4)와 일치한다. 전반적으로, 이러한 결과는 여기에 설명 된 분석 잠재적 당뇨병, 심혈관 질환, 바이러스 성 및 세균성 감염으로 염증 상태를 유도 생물학적 상황에서 단핵 세포의 신진 대사 활동을 연구에 사용될 수 있음을 보여줍니다.

그림 1
그림 1. 대표적인 HIV- 및 HIV + 혈액 샘플로부터 총 단핵 세포 및 단핵 세포 개체군을 분석하기 위해 사용되는 전략 게이팅 전혈 시료를 수집 한 시간 이내에 단핵구 세포 표면 GLUT1 발현 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. (A) 세포를 전방 및 측면 산란 특성 및 CD3 식에 기초하여 게이팅 하였다. (B)는 CD3, 총 단핵구를 검토 - 다음 세포 CD14 발현 게이팅 하였다. (C 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 :.. 대표 HIV- 및 HIV + 혈액 샘플에서 총 단핵 세포에 세포 표면 GLUT1의 발현 분석 HIV-감염되지 않은 또는 순진한 사람이 FITC 표지 이소 제어 또는 GLUT1 항체로 염색 처리 HIV가 감염된에서 CD14 + 단핵 세포 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.


도 3. 대표적인 HIV- 및 HIV + 혈액 샘플로부터 단핵 세포 소집단에서 세포 표면 GLUT1 발현 분석 단핵 세포 개체군은 나이브 (A) HIV-비감염 또는 (B) HIV 감염 치료를 FITC 표지 된 아이소 타입 컨트롤 또는 GLUT1 항체로 염색 혈액 샘플. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 :. 대표 HIV- 에이즈에서 총 CD14 + 단핵 세포 + 혈액 샘플 HIV-감염되지 않은 또는 HIV 감염 치료 순진한 사람의 혈액에 의해 2 NBDG의 통풍 관의 최종 농도 차량 또는 2 NBDG로 배양 하였다1.46 μM 세척하기 전에 15 분 동안 그림 1에 설명 된 바와 같이 게이트 단핵 세포에 세포 표면 항체와 배양 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 :. 대표 HIV- 에이즈 +에서 단핵 세포 개체군에 의해 2 NBDG의 통풍 관 전체 혈액 샘플 HIV-감염되지 않은 또는 HIV 감염 치료 순진한 사람의 혈액은 15 1.46 mm의 최종 농도 차량 또는 2 NBDG로 배양 하였다 분 세척 전에 그림 1에 설명 된대로 게이트 단핵 세포 개체군에 세포 표면 항체와 배양 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

together.within 페이지 = "1"> SUPP. 그림 1
보충 그림 1. 세포 분석 소프트웨어 유동 세포 계측법에 대한 작업 창 보거나이 보충 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

SUPP. 그림 2
보충 그림 2 :. 샘플 데이터를 끌어와이 작업 공간으로 삭제됩니다 보거나이 보충 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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보충 그림 3 : 작업 영역의 샘플 데이터 085을 두 번 클릭하고, 두 번째 창은 신선한 앞으로 기반으로 전체 혈액 샘플 (FSC)와 사이드 분산 내에서 세 가지 주요 세포 집단 (림프구, 단핵구와 호중구)를 보여주는 나타났다 (SSC) . 보거나이 보충 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

SUPP. 그림 4
기업 그림 4 : 단핵구는 앞으로 (FSC)와 사이드 분산 형 (SSC)를 기반으로 정문이 있습니다. 인구는 두 번 새 창을 제기하는 클릭했다. CD3는 'X'축과 CD3 음성 인구에 선택의를 하였다 (림프구를 게이팅)선출했다. 보거나이 보충 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

SUPP. 그림 5
보충 그림 5 : CD3 - 단핵구 인구는 두 배 단핵 세포 하위 집단은 CD16 및 CD14의 발현에 기초하여 정의 될 수있는 새로운 창을 제기하는 클릭 한. 여기를 클릭 해 보거나이 보충 그림을 다운로드하시기 바랍니다.

SUPP. 그림 6
기업 도표 6 : Monocyte 개체군이 선택되고, GLUT1 세포 표면 발현 (형광 강도 의미 : MFI)를 '추가 통계'창에서 히스토그램 창 '평균'통계 '를 선택하고'파라미터 '에서 GLUT1을 선택함으로써 얻어진다 드롭 다운 메뉴를 선택합니다. 여기를 클릭 해 보거나이 보충 그림을 다운로드하시기 바랍니다.

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Discussion

여기에 설명 된 프로토콜은 전체 혈액의 단핵 세포 및 단핵 세포 개체군에 의해 글루코스 수송 식 형광 글루코오스 유사체 흡수를 조사하는 간단한 방법을 자세히. 전혈에서 2-NBDG 흡수를 평가하여,이 방법은 생체 내에서 유사한 조건을 허용한다. 이전의 연구는 밀도 원심 분리 (17)에 의해 전혈로부터 분리 된 단핵 세포에서 6 NBDG 흡수를 조사 하였다. 그러나,이 연구는 잠재적으로 특정 세포 표면 분자 (19)의 발현을 변경시킬 수 단핵 세포 개체군 및 전체 혈액 단핵 세포의 분리를 조사하지 않았다. 방사성 포도당 추적기는 포도당 (20, 21)의 단핵 세포 흡수를 측정하는 데 사용되었지만, 단핵 세포는 이전에 중요한 안전주의 사항을 필요로이 방법과 방사능의 사용을 위해 격리해야합니다. 우리의 일상 프로토콜 바이오 절차를 사용함으로써 2-NBDG의 유세포 측정을 허용 최소 조작이며생체 조건에서 모방 단핵 세포와 단핵구의 소집단으로의 흡수.

2-NBDG는 당분 해 통로를 입력하고 비 형광성 분자 (22)로 세포에 의해 대사되는 것으로 도시되었다. 따라서, 4 ℃에서 냉장 세포를 유지하여 신진 대사 2 NBDG 후 배양을 제한하는 것이 중요합니다. 6-NBDG 사용할 수있는 또 다른 형광 글루코오스 유사체이지만가 당분 해 통로를 입력하지 않으므로 정확하게 셀 (23)의 생체 에너지 상태를 반영하지 않기 때문에 덜 유용하다.

스펙트럼을 겹치는 형광 색소를 사용하는 경우, 보상은 형광 색소 유출을 방지하는 것이 중요하게된다. 이 프로토콜에서는 보정 파라미터를 설정하는 CD14 및 CD16 개별적 염색 단핵구를 사용하지만, 세포 표면 마커의 보상은 보상 비드를 사용하여 수행 될 수있다.

과립구는 CD16을 표현할 수 있지만 밖으로 게이팅에서 제외 될 수있다CD15 발현 세포를. 그러나, 과립구의 수를 제한 할 수있는 광 산란 특성에 기초하여 단핵구 엄격한 게이팅 분석에 포함. 플로우는 사이토 이상의 채널과 함께 사용할 경우, 과립구 마커 CD66b 또한 분석 과립구를 제외 할 수있다.

본 연구에 사용 된 항체는 GLUT1 GLUT1 세포에 결합하지 않기 때문에, 세포 표면 항원에 결합. GLUT1 세포 내 에피토프에 결합하는 항체 전체 GLUT1 단핵구 발현을 측정하기 위해 사용될 수 있지만, 세포를 10 염색 전에 투과성이되어야한다. 단핵구 이외에,이 기술은 혈액 내에있는 다른 백혈구에서 당 흡수 및 대사를 검토 할 수있다. 우리는 여기에 광범위하게 기술 된 방법을 사용하여 2-NBDG의 T 세포 흡수를 조사한, 또한 NK 세포 (24)에 의해 2 NBDG 흡수를 조사 하였다. GLUT1의 발현과 2 NBDG 흡수를 성공적으로 검출은 제한하는 것이 필수적입니다프로토콜에 따라 초과 세척 완충액으로 세포를 세척하여 적혈구 용해 버퍼의 흔적, 우리는 FITC 또는 APC 표지 GLUT1 항체가 PE 또는를 PerCP 접합체보다 더 나은 신호를주는 것으로 나타났습니다. 우리는이 이유를 조사하지 않았습니다.

세포가 저온에서도 활성 대사 때문에 중요하다는 37 2-NBDG 배양 따라 ° C는, 튜브는 얼음과 원심 분리에 직접 보관되어 4 ° C에서 실시했다. 없는 강한 2 NBDG 신호에서 정확한 농도를 사용하고 있는지 확인할 때 적절한 호일로 방 및 바이오 안전성 캐비닛과 커버 튜브 빛 노출을 줄일 수 있습니다. 최적화는 5, 15, 20, 30, 60, 및 90 분의 시간 과정 2-NBDG 흡수 실험 설정에 의해 요구 될 수있다. 일반적으로, 최적의 시간은 세포 형태 및 작동 상태에 따라, 10 내지 60 분이어야한다.

2 NBDG 흡수 분석과 주요 제한은 빛 SENS입니다함께 상기 세포에 의해 이용되고 있다는 사실과 itivity. 따라서, 마지막 샘플은 처음 30 분 이내에 분석되도록 샘플의 수를 제한하는 것이 중요하다. 생물학적 한계는 비 고전 단핵구에 GLUT1 발현 비 고전 단핵구를하고, GLUT1의 발현 빈도가 고전 단핵 세포보다 훨씬 더 컸다에도 차이가 두 개의 소집단 (10) 사이의 2 NBDG 흡수에 존재하지 것입니다. 이 단핵 세포를 다른 질병 설정 글루코스 대사에 관여 될 수있다 그러한 Glut3 GLUT4 및 기타가 과잉 발현 가능성을 제기한다. GLUT1의 활성 또한 병진 소식 조절 될 수 있다는 것도 가능하다.

방사성 동위 원소 표지 위에 우리 유세포 당 흡수 프로토콜의 주요한 장점에 작은 면역 세포의 특정 개체군을 식별 공부 immunophenotypic 분석 기술을 결합하는 능력혈액의 리터 볼륨. 더하여 APC 공액 안티 GLUT1 동시에 GLUT1 세포 표면 발현 및 2- NBDG 흡수를 분석하는데 적용될 수있다. 2-NBDG에 의한 흡수 GLUT1 발현의 변화는 이전에 증명되지 않았지만,이 가능성을 배제 할 수 없다.

면역 세포에 의해 증가 된 당 흡수 및 대사 활성화 된 T 세포 및 단핵구 (25-27)의 특징이다. 이들 세포는 30-32 루푸스, 당뇨병 및 비만과 같은자가 면역 질환 8,33 조건으로 감염 28, 29, 및 염증성 신호 병원균 응답하여 활성화 될 수있다. 향상된 글루코오스 대사는 암세포의 생존, 성장 및 전이 (34)에 대해 요구된다. 특히, 면역 세포 대사 조절 장애는 HIV 감염의 특징으로 등장하고 있으며, CD4 + T 세포의 면역 활성 ​​35-37 24 10 염증 및 감염과 관련된다. 따라서,이 방법은 염증 매개 질환, 암, 감염성 질환, 면역학 및 immunometabolism (38)에 관심이있는 사람들을 포함하여 다양한 고객의 관심이 될 것입니다.

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Acknowledgements

이 연구는 HIV와 간염 바이러스학 연구 AIDS 연구를위한 워싱턴 센터의 대학 (CFAR), 지원되는 보너스 번호 AI027757 아래 NIH 자금 지원 프로그램 (ACH 2), 2010 년 개발 보조금 (CNIHR)에 대한 호주 센터에 의해 투자되었다 다음 NIH 연구소 및 센터 (NIAID, NCI, NIMH, NIDA, NICHD, NHLBI, NIA)에 의해. CSP는 CNIHR 및 ACH 2 보조금받는 사람입니다. SMC는 호주 (NHMRC) 주요 연구 활동의 국립 보건 의료 연구위원회의받는 사람입니다. 저자는 기꺼이 버네 연구소에 의해 수신 된 빅토리아 운영 ​​인프라 지원 프로그램의이 작품에 대한 기여를 인정합니다. 우리는 교육 및 기술 자문 유동 세포 계측법에 대한 AMREP 유동 세포 계측법 핵심 시설에서 게자 Paukovic 에바 ORLOWSKI - 올리버의 도움을 인정합니다. 우리는 미디어 코칭 및 비디오 촬영 조직 앵거스 모건 감사합니다. 우리의 감사제시 메이슨과 뽑아 낸 압둘라지즈 K. Alzahrani에 비디오 촬영 중 실험실 지원. 우리는 중요한 방법론적인 조언을 제공하는 의료 과학, UNSW, 호주의 학교에서 박사 데이비드 SIMAR의 노력을 주셔서 감사합니다. CSP는 감사의 말씀을 www.nice-consultants.com를 그래픽 협의.

저자의 기여 :

CSP는 프로젝트를 구상 설계 및 실험을 실시, 분석 및 데이터를 해석하고, 원고를 썼다. JJA 데이터를 해석하고 원고를 썼다. TRB는 원고를 썼다. JMM는, 데이터를 해석 중요한 지적 제안을했고, 원고를 검토했다. SMC는, 데이터를 해석 중요한 지적 제안을했고 원고를 검토했다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes Greiner Bio-One GmbH 455094
5 ml sterile polypropylene tubes BD Biosciences 352063
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906
16% formaldehyde solution Electron Microscopy Science 15710
BD FACS lysing solution (10x) BD Biosciences 349202 Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4 °C)
anti-CD3-PE BD Biosciences 555340
anti CD14-APC BD Biosciences 555399
anti-CD16-PECy7 BD Biosciences 557744
anti-Glut1-FITC R & D Systems FAB1418F
IgG2b-FITC R & D Systems IC0041F
2-NBDG Life technologies N13195 Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4 °C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1x DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4 °C)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x) Life technologies 14190-144 To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4 °C)

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