Простой проточной цитометрии метод измерения глюкозы и глюкозы Transporter выражение для моноцитов субпопуляциях в цельной крови

1Centre for Biomedical Research, Macfarlane Burnet Institute for Medical Research and Public Health, 2Department of Infectious Diseases, Monash University, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Melbourne, 4Department of Microbiology, The University of the West Indies, 5Division of Experimental Medicine, Department of Medicine, University of California, San Francisco, 6Department of Medicine, Monash University
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Palmer, C. S., Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., McCune, J. M., Crowe, S. M. A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood. J. Vis. Exp. (114), e54255, doi:10.3791/54255 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Моноциты врожденные иммунные клетки, которые могут быть активированы патогенами и воспаления, связанные с некоторыми хроническими воспалительными заболеваниями. Активация моноцитов индуцирует эффекторные функции и сопутствующий сдвиг от окислительного к гликолитического метаболизма, что сопровождается повышением экспрессии переносчика глюкозы. Этот повышенный метаболизм гликолиза наблюдается также для обученного иммунитета моноцитов, форма врожденной иммунологической памяти. Хотя пробирке протоколы изучения экспрессии переносчика глюкозы и поглощение глюкозы моноцитов были описаны, ни один не был рассмотрен многопараметрического проточной цитометрии в цельной крови. Мы опишем многопараметрических протокол проточной цитометрии для измерения флуоресцентного аналогового поглощения глюкозы 2-NBDG в цельной крови на общее число моноцитов и классической (CD14 ++ CD16 -) промежуточное соединение (CD14 ++ CD16 +) и неклассической ( CD14 + CD16 ++) моноцитовсубпопуляции. Этот метод может быть использован для изучения экспрессии глюкозы транспортерные и поглощение глюкозы для общего количества моноцитов и моноцитов субпопуляции во время гомеостаза и воспалительного заболевания, и может быть легко изменен, чтобы исследовать поглощение глюкозы для других лейкоцитов и субпопуляций лейкоцитов в пределах крови.

Introduction

Моноциты являются одним из основных компонентов человеческого врожденной иммунной системы, которые быстро мобилизован к очагов инфекции и воспаления 1. Активация моноцитов имеет решающее значение для ограничения острое поражение патогенами и также играет центральную роль в патогенезе некоторых хронических заболеваний, в том числе атеросклероза , 2, 3, рака и ВИЧ 4,5.

Метаболизм отдыха и активированных моноцитов резко отличается, с покоящихся моноцитов с использованием окислительного метаболизма и активированных моноцитов с использованием гликолиза метаболизм (т.е. ферментации глюкозы в лактат) 6. Активация моноцитов индуцирует экспрессию переносчиков глюкозы , что позволяет увеличить поглощение глюкозы для гликолитического метаболизма 7. Транспортер моноцитов глюкозы 1 (GLUT1) является одним из таких Транспортер активируется во время активации и его выражение было показано, что приведет к созданию провоспалительных цитокинов в VITRO и в жировой ткани мышей с ожирением 8. Заражение клеточной линии моноцитов по саркома Капоши , связанный герпесвирусов приводит к клеточной повышающей регуляции GLUT1 9, и мы недавно показали , что при хронической ВИЧ - инфекции повышенный процент GLUT1-экспрессирующих моноцитов присутствуют во время необработанной и комбинированной антиретровирусной терапии лечение инфекции 10. Взятые вместе, эти исследования показывают, что потребление глюкозы и гликолиза метаболизм моноциты являются важными аспектами многих воспалительных заболеваний. Таким образом, простой способ для измерения экспрессии GLUT1 моноцитов и поглощение глюкозы во время гомеостаза и воспалительное заболевание, вероятно, будет полезным для широкого круга исследователей.

Человеческие моноциты являются гетерогенными, которые состоят из трех различных подмножеств , которые могут быть исследованы с помощью дифференциальной экспрессии CD14 маркеров клеточной поверхности и CD16 11,12. Классические моноциты экспрессируют высокий уровень CD14, но не экспрессируют CD16 (CD14 ++ CD16 -), промежуточные моноциты экспрессируют высокий уровень CD14 и промежуточный уровень CD16 (CD14 ++ CD16 +), и неклассический моноциты экспрессируют низкий уровень CD14 и высокий уровень CD16 (CD14 + CD16 ++). Моноциты , которые выражают CD16 называются CD16 + моноциты, которые по сравнению с CD16 - моноциты имеют высокую экспрессию воспалительных цитокинов и способность более эффективно представляют антигены 13,14. Примерно 10% моноциты экспрессируют CD16 в течение гомеостаза с более высокими процентами , наблюдаемых во время воспаления 15. Моноцитов субпопуляции связаны с определенными болезненными состояниями и могут быть полезными биологическими маркерами прогрессирования заболевания и заболевания 16.

Наша цель состояла в том, чтобы определить метод, который может измерять глюкозы экспрессию транспортеров и поглощение глюкозы человеческих моноцитов и моноцитов субпопуляций в условиях, близких к PHYsiological условия, как это возможно. Предыдущие исследования измеряли экспрессию переносчика глюкозы моноцитов и поглощение глюкозы 17,18, хотя эти методы рассмотрены отдельные моноциты , которые могут иметь измененную экспрессию белка по сравнению с физиологических условиях 19, и никакое предыдущее исследование не исследовал субпопуляции моноцитов человека. Использование многопараметрических проточной цитометрии, мы опишем метод для изучения глюкозы выражение транспортерные и поглощение флуоресцентного аналога глюкозы 2-NBDG по общему объему моноцитов и моноцитов субпопуляций (на основе CD14 и CD16 экспрессии) в течение всей unmanipulated крови.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: ВИЧ-инфицированных и ВИЧ-неинфицированных субъекты были набраны из группы инфекционных заболеваний на Альфреда больницы в Мельбурне, VIC, Австралия, и от местного сообщества, соответственно. Информированное согласие было получено от всех участников, и исследование было одобрено Научно-исследовательский и Комитета по этике Альфреда больницы.

1. GLUT1 поверхности клеток Обнаружение на моноцитах и ​​моноцитов субпопуляциях

  1. Собрать кровь в цитрата ДСА-B антикоагулянтов трубок и начать эксперименты в кабинете биологической безопасности в течение 1 ч сбора.
  2. Добавьте 100 мкл крови в полипропиленовые пробирки. Добавляют 2 мл 1x лизирующий раствор (см Материалы таблицу) в пробирки , в то время как на льду, пипеткой осторожно перемешать. Выдержите в течение 15 мин на льду. Центрифуга при 220 мкг в течение 5 мин.
  3. Декантируют и мыть два раза путем добавления приблизительно 2-4 мл промывочного раствора (0,5% БСА в PBS 1x) и центрифугирование при 220 х г в течение 5 мин.
  4. Используйте трубуTTE тщательно удалить как можно больше промывочного раствора, как это возможно. Место труб на льду и вновь приостановить в 100 мкл промывочного раствора.
  5. Для того, чтобы определить конкретные моноцитов субпопуляции окрасить клетки со следующим объемом антител на 100 мкл клеточной суспензии, приготовленной на стадии 1,4: 5 мкл анти-CD3-PE, 5 мкл анти-CD14-APC, 5 мкл анти-CD16-PECy7, 5 мкл GLUT1 -FITC или IgG2b-FITC (управляющая трубка изотипа).
  6. Место на льду в течение 30 мин в темноте. Промыть 2 раза промывочным раствором. Закрепить с 200-300 мкл 0,5% формальдегида, сделанные в 1x PBS.
  7. Анализ на проточном цитометре позволяет обнаруживать 4 цвета в течение 24 часов в течение следующего возбуждения и эмиссии длины волны: FITC (488, 530), ПЭ (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660) 10.

2. Глюкоза Усвоение моноцитами

  1. Пипеток 90 мкл крови собирали на стадии 1.1 в полипропиленовые пробирки. Добавьте 10 мкл рабочего раствора 14,60 мкМ 2-NBDG в90-мкл крови (1,46 мМ конечная концентрация) и вылить осторожно перемешать. Крайне важно, чтобы ограничить 2-NBDG воздействия света путем покрытия труб с алюминиевой фольгой.
  2. Инкубируют при 37 ° С в темноте в течение 15-30 мин, а затем сразу же место на льду. Добавить 4 мл 1x FACS лизиса раствора в пробирки, в то время как на льду. Центрифуга при 220 мкг при 4 ° С в течение 5 мин.
  3. Промыть один раз путем добавления 4 мл промывочного раствора (0,5% БСА в 1X PBS). Центрифуга при 220 мкг при 4 ° С в течение 5 мин. Слейте и место на льду.
  4. Пятно клеток с антителами: 5 мкл анти-CD3-PE, 5 мкл анти-CD14-APC и 5 мкл анти-CD16-PECy7. Смешайте и место на льду в течение 30 мин в темноте.
    Примечание: В течение этого периода убедитесь, что поток цитометр готов к немедленному анализу. Приобретать клеток в следующем возбуждения и длина волны излучения: 2-NBDG (488, 530), ПЭ (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660).
  5. Добавляют 4 мл охлажденного льдом промывочного буфера (0,5% БСА в 1x PBS) в пробирки.Вымойте один раз путем центрифугирования при 220 мкг при 4 ° С в течение 5 мин. Слейте и добавьте 200-300 мкл ледяной старой PBS и держать на льду в темноте (покрытый алюминиевой фольгой). Анализ на проточном цитометре в течение 10 мин с использованием возбуждения и установки длины волны эмиссии, как в шаге 2.4.

3. Приобретение и анализ данных

Примечание: Знание проточной цитометрии и анализа данных предполагается.

  1. С использованием проточного цитометра позволяет проводить анализ по крайней мере, 4-цвета, установить компенсацию с использованием неокрашенных и индивидуально окрашенных образцов.
    Примечание: Одно окрашивание с использованием FITC-меченного CD4 и CD14 могут быть использованы для GLUT1 и компенсации 2-NBDG.
  2. Настройка и пометить соответствующие окна перед получением образцов. Нарисуйте ворота вокруг населения моноцитов, и приобрести 100 000 до 300 000 событий в выборке на средней скорости. 50000 событий в образце компенсации достаточно.
    Примечание: Компенсация может быть проведена до образцаприобретение или в одном программного обеспечения для анализа клеток, в соответствии со стандартными процедурами.
  3. Экспорт и сохранить данные в нужное место. Открывают одного программного обеспечения для анализа клеток , таких как FlowJo или другого программного обеспечения для анализа (Справочная Рисунок 1) и перетаскивание образцов , как указано (Дополнительное Рисунок 2).
  4. Дважды щелкните , чтобы открыть файл (Дополнительный рисунок 3). Нарисуйте круг для ворот моноциты на основе вперед и свойства бокового рассеяния , как показано на рисунке 1А и Дополнительной Рисунок 4. Дважды щелкните население моноцитов. Наблюдайте и нарисуйте рамку вокруг CD3 - население (Справочная рисунок 4).
  5. Дважды щелкните на CD3 - население. Для наблюдения моноцитов субпопуляции выберите CD14-APC на "х" оси, и CD16-PECy7 на «y'- оси, и соответствующим образом маркировать (Supplemental рисунок 5).
  6. Там, где нет четкихположительные и отрицательные популяции, измеряют экспрессию GLUT1 или поглощение 2-NBDG в конкретных моноцитов подгруппах. Определить средние интенсивности флуоресценции (MFI) из GLUT1 и 2-NBDG путем вычитания изотип и отсутствие фона 2-NBDG (Справочная рисунок 6).
  7. Там , где существуют определенные группы населения, использовать IgG2b-FITC , чтобы установить ворота, и определить процент положительных клеток (рисунок 3).
    Примечание: Эта процедура используется для анализа общих CD14 + моноцитов. Поскольку поглощение 2-NBDG обычно отмечается сдвиг в интенсивности флуоресценции данные лучше всего представлены MFI и гистограмм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Компенсация должна быть выполнена для отдельных флюорохромами для предотвращения флуоресценции перелива. Моноциты сначала обогащается стробирования на основе передней и боковой разброс. Графики , представленные представители по крайней мере , шесть независимых экспериментов , проведенных на цельной крови из шести или более участников , как сообщалось ранее 10 Рисунок 1А показывает начальное стробирования моноцитов клеток разбросом и исключения Т - клеток путем стробирования в CD3 -. Населения. Моноциты затем закрытого типа для одного или в комбинации с CD16 для определения суммарного моноциты или моноцитов субпопуляции CD14 экспрессии , как это показано на рисунке 1В и фиг.1С, соответственно. Для анализа моноцитов субпопуляции, следующая номенклатура должна быть применена , как описано выше 12: классические моноциты (CD14 ++ CD16 -) должен выразить примерно в 100 раз больше CD14 MFI, чем контроль изотипа и CD16 MFI должен быть похож на контроль изотипа; промежуточные моноциты (CD14 ++ CD16 +) должна выразить приблизительно в 100 раз больший , чем CD14 MFI контроль изотипа и приблизительно в 10 раз больше , CD16 MFI , по сравнению с контролем изотипа; неклассические моноциты (CD14 + CD16 ++) должны иметь аналогичную MFI для CD14 и контроля изотипа и примерно в 100 раз больше , чем CD16 MFI контроль изотипа. Клетки без экспрессии CD14 и CD16 не считаются моноциты и не должны быть включены в стробирования. Gated моноциты или моноцитов субпопуляции затем могут быть проверены на предмет глюкозы экспрессии переносчика. Как показано на рисунке 2, можно наблюдать отдельные популяции CD14 + GLUT1 + моноцитов, особенно в клетках , полученных от ВИЧ + лиц, где инфекция характеризуется хроническим состоянием воспаления. Аналогичные , но редкие CD14 + GLUT1 + клетки могут быть наблerved в рамках конкретных моноцитов подмножеств ВИЧ неинфицированных лиц (Рисунок 3A), но более выражены у ВИЧ + лиц (Рисунок 3B). Стоит отметить, что в отсутствие различных популяций, может быть целесообразным, чтобы представить результаты в виде среднего значения или медианной интенсивности цветении, который принимает во внимание совокупное увеличение экспрессии на клеточной поверхности GLUT1.

Захват глюкозы можно оценить путем сравнения цельной крови инкубировали с 2-NBDG или управления транспортным средством для закрытого типа моноциты или моноцитов субпопуляций. Ранее мы показали , что примерно 50% Моноциты 2-NBDG положительными после 15 мин инкубации 10 с. Этот уровень поглощения позволяет обнаруживать 2-NBDG не достигая насыщения, когда различия в моноциты 2-NBDG поглощение больше не может существовать. Анализ поглощения 2-NBDG моноциты от ВИЧ неинфицированных и ВИЧ + людей показали более высокий поглощение клетками от ВИЧ + людей, которыенаходится в согласии с данными экспрессии GLUT1 (рисунок 4 - 5). В целом, эти результаты показывают, что анализы, описанные здесь, могут быть использованы для изучения потенциально деятельности моноцитов метаболические в биологических контекстах, которые вызывают воспалительные состояния, такие как диабет, сердечно-сосудистые заболевания, и вирусных и бактериальных инфекций.

Рисунок 1
Рисунок 1:. Стробирования стратегия , использованная для анализа общих моноциты и моноцитов субпопуляции из репрезентативной ВИЧ и образцов ВИЧ + крови Образцы цельной крови анализировали с помощью проточной цитометрии для экспрессии GLUT1 моноцитов клеточной поверхности в течение 1 ч сбора. (А) Клетки закрытого типа основаны на передней и боковой разброс характеристик и экспрессии CD3. (B) Для изучения всего моноциты, CD3 - клетки затем закрытого типа для экспрессии CD14. (C Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2:.. Анализ экспрессии на клеточной поверхности GLUT1 на общих моноцитов из репрезентативной ВИЧ и образцов ВИЧ + крови CD14 + моноциты от ВИЧ-неинфицированных или ВИЧ-инфицированных лечение наивные лица , окрашивали FITC-меченого контролем изотипа или GLUT1 антитела Пожалуйста , нажмите здесь для просмотра увеличенной версии этой фигуры.


Рисунок 3:. Анализ экспрессии GLUT1 клеточной поверхности на моноцитарно субпопуляций репрезентативных ВИЧ и образцов + ВИЧ крови моноцитов субпопуляции окрашивали FITC-меченного контролем изотипа или GLUT1 антитела по отношению к (А) ВИЧ-неинфицированных или (В) , ВИЧ-инфицированной лечения наивных образцы крови. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
На рис . 4: Усвоение 2-NBDG от общего числа CD14 + моноцитов репрезентативной ВИЧ и ВИЧ образцов крови + кровь от ВИЧ-неинфицированных или ВИЧ-инфицированных лечение наивных лиц , инкубировали с транспортного средства или 2-NBDG при конечной концентрации1,46 мкМ в течение 15 мин перед промывкой и инкубацией с клеточной поверхности антителами к затворных моноцитов , как описано на рисунке 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5:. Усвоение 2-NBDG моноцитов субпопуляций из репрезентативной ВИЧ и ВИЧ + образцы цельной крови в крови от ВИЧ-неинфицированных или ВИЧ-инфицированных лечение наивных лиц , инкубировали с транспортного средства или 2-NBDG при конечной концентрации 1,46 мМ в течение 15 мин до мытья и инкубации с клеточной поверхности антителами к затворных моноцитов субпопуляций , как описано на рисунке 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

together.within-страница = "1"> Supp. Рисунок 1
Справочная Рисунок 1:. Рабочая область окна для проточной цитометрии программного обеспечения для анализа клеток Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы просмотреть или скачать этот дополнительный рисунок.

Supp. фигура 2
Справочная Рис . 2: Пример данных перетаскивании в эту рабочую область Пожалуйста , нажмите сюда , чтобы просмотреть или скачать этот дополнительный рисунок.

55 / Supp_Figure_3_Double_Click_to_open_file_Small.jpg "/>
Справочная Рисунок 3: Образцы в рабочем пространстве, данные 085 двойном щелчке, а второе окно появилось , показывающий три основных клеточных популяций (лимфоциты, моноциты и нейтрофилы) в пределах свежей пробы цельной крови на основе вперед (FSC) и бокового рассеяния (SSC) . Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы просмотреть или скачать этот дополнительный рисунок.

Supp. Рисунок 4
Справочная Рисунок 4: Моноциты стробируются основаны на прямом (FSC) и бокового рассеяния (SSC). Население дважды щелкнул принесший новое окно. CD3 выбирается на 'х' оси и CD3-отрицательной популяции (стробирования из лимфоцитов) была секизбран. Пожалуйста , нажмите сюда , чтобы просмотреть или скачать этот дополнительный рисунок.

Supp. Рисунок 5
Справочная Рисунок 5: CD3 - моноцитов население было дважды щелкнул , который воспитывается новое окно , в котором моноцитов субпопуляции может быть определена на основе CD16 и CD14 выражения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы просмотреть или скачать этот дополнительный рисунок.

Supp. Рисунок 6
Справочная Рисунок 6: Monocyte субпопуляции выбраны, и экспрессия GLUT1 клеточной поверхности (средняя интенсивность флуоресценции: MFI) получают путем выбора "Статистика" в окне гистограммы, 'средний' от 'Добавить статистику "окна, и выбрав GLUT1 из параметра' 'падение вниз меню. нажмите здесь , чтобы просмотреть или скачать этот дополнительный рисунок.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Протокол, описанный здесь подробно описан простой метод для изучения глюкозы экспрессии переносчика и люминесцентную глюкозы аналоговый поглощение моноцитов и моноцитов субпопуляций в цельной крови. Оценивая поглощение 2-NBDG в цельной крови, эта методика позволяет условиях , аналогичных тем , в естественных условиях. В предыдущем исследовании изучались 6-NBDG поглощение в моноцитах , выделенных из цельной крови путем центрифугирования плотности 17. Тем не менее, данное исследование не исследовал моноцитов субпопуляции и разделение моноцитов из цельной крови потенциально может изменить экспрессию определенных молекул клеточной поверхности 19. Радиоактивные индикаторы глюкозы также использовались для измерения поглощения моноцитов глюкозы 20,21, но моноциты должен быть предварительно выделен для этого метода и использования радиоактивности требует значительных мер предосторожности. Наш протокол использует стандартные процедуры по биологической безопасности и минимально манипулятивная, что позволяет для измерения потока цитометрии 2-NBDGпоглощение моноцитами и моноцитов субпопуляции, имитирующих в условиях естественных условиях.

2-NBDG входит в гликолитического пути , и было показано, что метаболизируются клетками в нефлуоресцирующих молекул 22. Поэтому крайне важно, чтобы ограничить метаболизм после 2-NBDG инкубации, сохраняя клетки в охлажденном при 4 ° С. 6-NBDG еще один флуоресцентный аналоговый глюкозы , который может быть использован , но он менее полезен , поскольку он не входит в гликолитического пути и , следовательно , не точно отражает биоэнергетического статуса клеток 23.

Если флуорохромы с перекрывающимися спектрами используются, компенсация становится критическим для предотвращения Флуорохром перелива. В этом протоколе мы используем моноциты окрашивали по отдельности с CD14 и CD16, чтобы установить параметры компенсации, но компенсация маркеров клеточной поверхности также может быть выполнена с использованием компенсации бусинки.

Гранулоцитов может выразить CD16, но могут быть исключены из стробированияCD15-экспрессирующих клеток. Тем не менее, жесткие стробирования моноцитов на основе световых свойств разброс может ограничить количество гранулоцитов, включенных в анализ. Если поток цитометра является доступны с большим количеством каналов, Гранулоцита маркер CD66b также может быть использован для исключения гранулоциты из анализа.

Антитело GLUT1 используемый в данном исследовании, связывается с клеточной поверхности эпитоп и, следовательно, не связывается с внутриклеточным GLUT1. Антитело , которое связывается с внутриклеточным GLUT1 эпитоп , может быть использован для измерения общей экспрессии GLUT1 моноцитов, но клетки должны быть проницаемыми до того окрашивания 10. В дополнение к моноцитов, этот метод может быть использован для изучения усвоения глюкозы и обмен веществ в других лейкоцитов, обнаруженных в крови. Мы широко исследовали поглощение Т - клеток 2-NBDG с использованием метода , описанного здесь, а также исследовали 2-NBDG поглощение клетками NK 24. Для успешного обнаружения экспрессии GLUT1 и поглощения 2-NBDG крайне важно, чтобы ограничитьследы красной буфера для лизиса клеток крови путем промывания клеток с избытком промывочного буфера в соответствии с протоколом, и мы обнаружили, что FITC или APC-меченого антитела GLUT1 дают лучшие сигналы, чем PE или PerCP конъюгатов. Мы не исследовали причины этого.

Поскольку клетки метаболически активны даже при низких температурах, очень важно, что после инкубации 2-NBDG при 37 ° С, что трубки удерживаются непосредственно на льду и центрифугирования проводили при 4 ° С. В отсутствие сильного сигнала 2-NBDG, проверьте, что правильная концентрация используется, снижают освещенность в помещении и биозащитой и покровных труб с фольгой, когда это необходимо. Оптимизация может потребоваться путем создания временного хода 2-NBDG поглощения эксперимент в течение 5, 15, 20, 30, 60 и 90 мин. Как правило, оптимальное время должно быть 10-60 мин, в зависимости от типов клеток и их состояние активации.

Основным ограничением при анализе поглощения 2-NBDG световых Сенсitivity вместе с тем фактом, что оно утилизируется клетками. При этом важно, чтобы ограничить количество образцов, чтобы гарантировать, что последний образец анализировали в течение 30 мин от первого. Биологический ограничение состоит в том, даже если частота GLUT1-экспрессирующих неклассические моноциты, и выражение GLUT1 на неклассических моноцитах были значительно больше , чем классические моноцитов, никаких различий не существовало в поглощении 2-NBDG между двумя субпопуляций 10. Это повышает вероятность того, что другие излишкам, такие как Glut3 и GLUT4, выраженные на моноциты могут быть вовлечены в метаболизм глюкозы в различных условиях болезни. Также возможно, что активность GLUT1 также может регулироваться пост поступательно.

Одним из главных преимуществ нашего потока цитометрии протокола поглощения глюкозы по маркировке радиоизотопов является возможность сочетать технику с иммунофенотипическая анализа для выявления и изучения конкретных субпопуляции иммунных клеток в Смальл объем крови. Кроме АРС-конъюгированные анти-GLUT1 могут быть применены одновременно анализировать экспрессию клеточной поверхности GLUT1 и поглощение 2-NBDG. Изменение экспрессии GLUT1 из-за 2-NBDG поглощения не было ранее продемонстрировано, но эта возможность не может быть исключена.

Увеличение поглощения глюкозы и метаболизм иммунными клетками является отличительной чертой активированных Т - клеток и моноцитов 25-27. Эти клетки могут быть активированы в ответ на инфекцию патогена 28,29 и воспалительных сигналов в условиях , таких как аутоиммунные заболевания , такие как волчанка , 30-32, а также ожирение и диабет 8,33. Повышенный метаболизм глюкозы также необходим для выживания раковых клеток, роста и метастазирования 34. Следует отметить, что метаболический дисрегуляция в иммунных клетках возникла как признак ВИЧ - инфекции, и связано с активацией иммунной системы 24, 10, воспаление и инфекционности CD4 + Т - клеток 35-37. Следовательно,этот метод будет представлять интерес для широкой аудитории , включая тех , кто заинтересован в воспалительных опосредованных заболеваний, рака, инфекционных болезней, иммунологии и immunometabolism 38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Это исследование было профинансировано Австралийским центром по борьбе с ВИЧ и гепатита вирусологии исследований (ACH 2) и 2010 грант развития (CNIHR) из Университета штата Вашингтон Центра исследований СПИДа (CFAR), в NIH ​​финансируемой программы под удостоенный номером AI027757 , которая поддерживается следующим NIH институтов и центров (NIAID, NCI, NiMH-, NIDA, NICHD, NHLBI, NIA). СНТ является получателем гранта 2 CNIHR и ACH. SMC является получателем национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии (NHMRC) Основные научные стипендии. Авторы выражают признательность за вклад в эту работу викторианской Оперативной программы инфраструктуры поддержки, полученной Бернет институтом. Мы признаем помощь Геза Paukovic и Ева орловского-Оливер из AMREP проточной цитометрии основной комплекс для проточной цитометрии подготовки и технических консультаций. Мы благодарим Angus Морган для тренерской медиа и организации съемок клипа. Наша благодарностьДжесси Массона и Джихад Абдулазиз К. Alzahrani для лабораторной помощи во время видеосъемки. Мы благодарим усилия д-ра Дэвида Simar в школе медицинских наук, UNSW, Австралия, которые предложили критические методологические рекомендации. СКП хотел бы поблагодарить www.nice-consultants.com для графических консультаций.

ВКЛАД Авторов:

СНТ задумал проект, разработанный и провели эксперименты, анализ и интерпретация данных, и написал рукопись. JJA интерпретировать данные и написал рукопись. TRB написал рукопись. JMM интерпретировать данные, сделал критические интеллектуальные предложения, и рассмотрел рукопись. SMC интерпретировать данные, сделанные критические интеллектуальные предложения и рассмотрел рукопись.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes Greiner Bio-One GmbH 455094
5 ml sterile polypropylene tubes BD Biosciences 352063
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906
16% formaldehyde solution Electron Microscopy Science 15710
BD FACS lysing solution (10x) BD Biosciences 349202 Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4 °C)
anti-CD3-PE BD Biosciences 555340
anti CD14-APC BD Biosciences 555399
anti-CD16-PECy7 BD Biosciences 557744
anti-Glut1-FITC R & D Systems FAB1418F
IgG2b-FITC R & D Systems IC0041F
2-NBDG Life technologies N13195 Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4 °C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1x DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4 °C)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x) Life technologies 14190-144 To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4 °C)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat Rev Immunol. 11, 762-774 (2011).
  2. Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7, 77-86 (2010).
  3. Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and macrophages in cancer: development and functions. Cancer Microenviron. 6, 179-191 (2013).
  4. Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., Angelovich, T. A., Crowe, S. M., Palmer, C. S. Monocytes as regulators of inflammation and HIV-related comorbidities during cART. J Immunol Res. 2014, 569819 (2014).
  5. Palmer, C., Cherry, C. L., Sada-Ovalle, I. Glucose Metabolism in T Cells and Monocytes: New Perspectives in HIV Pathogenesis. EBioMedicine. (2016).
  6. Cheng, S. C., et al. mTOR- and HIF-1alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity. Science. 345, 1250684 (2014).
  7. Maratou, E., et al. Glucose transporter expression on the plasma membrane of resting and activated white blood cells. Eur J Clin Invest. 37, 282-290 (2007).
  8. Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages: glucose transporter 1 (GLUT1)-mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. J Biol Chem. 289, 7884-7896 (2014).
  9. Gonnella, R., et al. Kaposi sarcoma associated herpesvirus (KSHV) induces AKT hyperphosphorylation, bortezomib-resistance and GLUT-1 plasma membrane exposure in THP-1 monocytic cell line. J Exp Clin Cancer Res. 32, 79 (2013).
  10. Palmer, C. S., et al. Glucose transporter 1-expressing proinflammatory monocytes are elevated in combination antiretroviral therapy-treated and untreated HIV+ subjects. J Immunol. 193, 5595-5603 (2014).
  11. Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118, e16-e31 (2011).
  12. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116, e74-e80 (2010).
  13. Belge, K. U., et al. The proinflammatory CD14+CD16+DR++ monocytes are a major source of TNF. J Immunol. 168, 3536-3542 (2002).
  14. Frankenberger, M., Sternsdorf, T., Pechumer, H., Pforte, A., Ziegler-Heitbrock, H. W. Differential cytokine expression in human blood monocyte subpopulations: a polymerase chain reaction analysis. Blood. 87, 373-377 (1996).
  15. Ziegler-Heitbrock, L. The CD14+ CD16+ blood monocytes: their role in infection and inflammation. J Leukoc Biol. 81, 584-592 (2007).
  16. Ziegler-Heitbrock, L. Macrophages: Biology and Role in the Pathology of Diseases. Springer. 3-36 (2014).
  17. Dimitriadis, G., et al. Evaluation of glucose transport and its regulation by insulin in human monocytes using flow cytometry. Cytometry A. 64, 27-33 (2005).
  18. Fu, Y., Maianu, L., Melbert, B. R., Garvey, W. T. Facilitative glucose transporter gene expression in human lymphocytes, monocytes, and macrophages: a role for GLUT isoforms 1, 3, and 5 in the immune response and foam cell formation. Blood Cells Mol Dis. 32, 182-190 (2004).
  19. Stibenz, D., Buhrer, C. Down-regulation of L-selectin surface expression by various leukocyte isolation procedures. Scand J Immunol. 39, 59-63 (1994).
  20. Ahmed, N., Kansara, M., Berridge, M. V. Acute regulation of glucose transport in a monocyte-macrophage cell line: Glut-3 affinity for glucose is enhanced during the respiratory burst. Biochem J. 327 (Pt 2), 369-375 (1997).
  21. Cutfield, W. S., Luk, W., Skinner, S. J., Robinson, E. M. Impaired insulin-mediated glucose uptake in monocytes of short children with intrauterine growth retardation). Pediatr Diabetes. 1, 186-192 (2000).
  22. Yoshioka, K., et al. A novel fluorescent derivative of glucose applicable to the assessment of glucose uptake activity of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1289, 5-9 (1996).
  23. Speizer, L., Haugland, R., Kutchai, H. Asymmetric transport of a fluorescent glucose analogue by human erythrocytes. Biochim Biophys Acta. 815, 75-84 (1985).
  24. Palmer, C. S., et al. Increased glucose metabolic activity is associated with CD4+ T-cell activation and depletion during chronic HIV infection. AIDS. 28, 297-309 (2014).
  25. Palmer, C. S., Ostrowski, M., Balderson, B., Christian, N., Crowe, S. M. Glucose metabolism regulates T cell activation, differentiation, and functions. Frontiers in immunology. 6, (2015).
  26. Palmer, C. S., et al. Regulators of glucose metabolism in CD4 and CD8 T cells. International reviews of immunology. 1-12 (2015).
  27. Palmer, C. S., Crowe, S. M. How does monocyte metabolism impact inflammation and aging during chronic HIV infection? AIDS research and human retroviruses. 30, 335-336 (2014).
  28. McFadden, K., et al. Metabolic stress is a barrier to Epstein-Barr virus-mediated B-cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E782-E790 (2016).
  29. Gamelli, R. L., Liu, H., He, L. K., Hofmann, C. A. Augmentations of glucose uptake and glucose transporter-1 in macrophages following thermal injury and sepsis in mice. Journal of leukocyte biology. 59, 639-647 (1996).
  30. Yin, Y., et al. Glucose Oxidation Is Critical for CD4+ T Cell Activation in a Mouse Model of Systemic Lupus Erythematosus. Journal of immunology. 80-90 (2016).
  31. Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis research & therapy. 17, 29 (2015).
  32. Yin, Y., et al. Normalization of CD4+ T cell metabolism reverses lupus. Science translational medicine. 7, 274ra218 (2015).
  33. Barbera Betancourt, A., et al. Inhibition of Phosphoinositide 3-Kinase p110delta Does Not Affect T Cell Driven Development of Type 1 Diabetes Despite Significant Effects on Cytokine Production. PloS one. 11, e0146516 (2016).
  34. Barron, C. C., Bilan, P. J., Tsakiridis, T., Tsiani, E. Facilitative glucose transporters: Implications for cancer detection, prognosis and treatment. Metabolism: clinical and experimental. 65, 124-139 (2016).
  35. Hegedus, A., Kavanagh Williamson, M., Huthoff, H. HIV-1 pathogenicity and virion production are dependent on the metabolic phenotype of activated CD4+ T cells. Retrovirology. 11, 98 (2014).
  36. Taylor, H. E., et al. Phospholipase D1 Couples CD4+ T Cell Activation to c-Myc-Dependent Deoxyribonucleotide Pool Expansion and HIV-1 Replication. PLoS Pathog. 11, e1004864 (2015).
  37. Loisel-Meyer, S., et al. Glut1-mediated glucose transport regulates HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2549-2554 (2012).
  38. Palmer, C. S., et al. Emerging Role and Characterization of Immunometabolism: Relevance to HIV Pathogenesis, Serious Non-AIDS Events, and a Cure. J Immunol. 196, (11), 4437-4444 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics