シンプルなフローサイトメトリー法は、全血における単球亜集団のためのグルコース取り込みおよびグルコーストランスポーターの発現を測定するために

Immunology and Infection

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Palmer, C. S., Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., McCune, J. M., Crowe, S. M. A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood. J. Vis. Exp. (114), e54255, doi:10.3791/54255 (2016).

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Abstract

単球は、特定の慢性炎症性疾患に関連する病原体および炎症によって活性化することができる自然免疫細胞です。単球の活性化は、エフェクター機能と増加したグルコース輸送体発現によって達成される解糖代謝への酸化から付随シフトを誘導します。この増加した解糖代謝はまた、訓練を受けた単球の免疫、先天性免疫記憶の形態で観察されます。単球によるグルコーストランスポーターの発現とグルコース取り込みを調べるインビトロプロトコルが記載されているが、いずれも全血マルチパラメトリックフローサイトメトリーによって検討されていません。 (中間体(CD14 ++ CD16 +)および非古典-私たちは、総単球および古典(CD14 ++ CD16)によって全血における蛍光グルコースアナログ2-NBDGの取り込みを測定するためのマルチパラメトリックフローサイトメトリープロトコルを記述しますCD14 + CD16 ++)、単球亜集団。この方法は、恒常性および炎症性疾患の間の総単球及び単球亜集団のためのグルコーストランスポーターの発現及びグルコース取り込みを調べるために使用することができ、容易に血液中の他の白血球および白血球亜集団のためのグルコース取り込みを調べるために改変することができます。

Introduction

単球は、急速に感染し、炎症1の部位に動員されている人間の自然免疫系の主要な構成要素です。単球の活性化は、病原体による急性の損傷を制限するために重要であり、また、アテローム性動脈硬化症2、3、およびHIV 4,5を含むいくつかの慢性疾患の病因の中心です。

休止および活性化単球の代謝は休止単球は、解糖代謝(乳酸へのグルコースの、すなわち 、発酵)を利用した酸化的代謝および活性化単球を利用することで、劇的に異なる6。単球の活性化は、解糖系代謝7増加したグルコース取り込みを可能にするグルコース輸送体の発現を誘導します。単球のグルコーストランスポーター1(GLUT1)は、活性化の間にアップレギュレートさそのような輸送体であり、その発現は、Vにおける前炎症性サイトカインの産生をもたらすことが示されていますITROと肥満マウス8の脂肪組織インチカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスによって単球細胞株の感染はGLUT1 9の細胞のアップレギュレーションにつながる、と私たちは最近、慢性HIV感染の間にGLUT1を発現する単球の増加割合が未処理と併用抗レトロウイルス療法で処置した感染の10の間に存在していることを示しました。まとめると、これらの研究は、単球によるグルコース取り込み及び解糖代謝は、多くの炎症性疾患の重要な側面であることを示しています。従って、簡単な方法は、恒常性中単球GLUT1発現およびグルコース取り込みを測定し、炎症性疾患は、研究者の幅広い使用の可能性が高いです。

ヒト単球は、細胞表面マーカーCD14及びCD16 11,12の発現差によって調べることができる3つの別個のサブセットで構成され、不均一です。クラシック単球は、CD14の高いレベルを発現するが、CDを発現しません16(CD14 ++ CD16 - )、中間の単球は、CD14の高レベルおよびCD16(CD14 ++ CD16 +)の中間レベルを発現し、非古典的単球は、CD14の低レベルとCD16の高レベル(CD14を発現し+ CD16 ++)。 CD16を発現する単球は、CD16に比べCD16 +単球を、と呼ばれる-単球は、高い炎症性サイトカインの発現とをより効果的に存在する抗原13,14能力を持っています。単球の約10%は、炎症15の間に観察されたより高い割合との恒常性の間にCD16を発現します。単球の亜集団は、特定の疾患状態と関連していると、病気や疾患の進行16の有用な生物学的マーカーである可能性があります。

私たちの目標は、PHYに近い条件でのヒト単球と単球亜集団によるグルコーストランスポーターの発現とグルコースの取り込みを測定することができる方法を同定することでしたできるだけsiological条件。これらの方法は、生理学的条件19に比べてタンパク質の発現が変化していることができ、単離された単球を検討しても以前の研究では、単球のグルコース輸送体の発現とグルコースの取り込み17,18を測定し、以前の研究では、ヒト単球亜集団を検討していません。フローサイトメトリーのマルチパラメトリックフローを使用して、我々は全体の未操作の血の中に(CD14およびCD16の発現に基づく)総単球及び単球亜集団によるグルコーストランスポーターの発現と蛍光グルコースアナログ2-NBDGの取り込みを調べるための方法を説明します。

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Protocol

注:HIV感染およびHIV非感染被験者は、メルボルンのアルフレッド病院で感染症のユニットから募集した、VIC、オーストラリア、そして地域社会から、それぞれ。インフォームドコンセントは、全ての参加者から入手した、と研究はアルフレッド病院研究倫理委員会によって承認されました。

単球及び単球亜集団1. GLUT1細胞表面検出

  1. クエン酸ACD-B抗凝固剤チューブに血液を収集し、収集の1時間以内に生物学的安全キャビネット内で実験を開始します。
  2. ポリプロピレンチューブに血液の100μLを加えます。氷の上で、ピペッティングを穏やかに混合する一方でソリューションを溶解1×2 mlを加え、チューブに( 材料表を参照てください)。氷上で15分間インキュベートします。 5分間、220×gで遠心分離します。
  3. デカントし、約2〜4ミリリットルの洗浄溶液(1×PBS中0.5%BSA)のを添加し、5分間220×gで遠心分離することによって、二回洗います。
  4. パイプを使用してください慎重にできるだけ洗浄液の限りを削除します。場所チューブは氷の上に洗浄溶液100μlに再懸濁します。
  5. 5μlの抗CD3-PE、5μlの抗CD14-APC、5μlの抗CD16-PECy7、5μlのGLUT1:特定の単球の亜集団は、ステップ1.4で調製した100μlの細胞懸濁液あたりの抗体の以下の容量で細胞を染色同定するために、 -FITCまたはIgG2bの-FITC(アイソタイプコントロールチューブ)。
  6. 暗所で30分間氷上に置きます。洗浄溶液で2回洗浄します。 1×PBSで行われた0.5%ホルムアルデヒドの200から300μlの修正。
  7. FITC(488、530)、PE(488、575)、PECy7(488、780)、APC(633、660)10:以下、励起および発光波長内に24時間以内に4色を検出することが可能なフローサイトメーターで分析します。

単球2.グルコース取り込み

  1. ポリプロピレンチューブにステップ1.1で採取した血液のピペットを90μl。 14.60μM2-NBDGワーキング溶液10μlに追加血液90μlの(1.46 mMの最終濃度)と混合するために穏やかにフリック。アルミホイルでチューブを被覆することにより光2- NBDGの露出を制限することが重要です。
  2. 15〜30分間、暗所で37℃でインキュベートし、その後直ちに氷上に置きます。氷の上ながら、チューブへの解決策を溶解1X FACSの4ミリリットルを追加します。 4で220×gで遠心分離 5分間°C。
  3. 洗浄溶液4ml(1×PBS中0.5%BSA)を添加することにより1回洗浄。 4で220×gで遠心分離 5分間°C。デカントし、氷の上の場所。
  4. 抗体を用いた染色細胞:5μlの抗CD3-PE、5μlの抗CD14-APCおよび5μlの抗CD16-PECy7。混合し、暗所で30分間氷上に置きます。
    注:この期間中は、フローサイトメーターは、即時分析のための準備ができていることを確認してください。以下の励起および発光波長内の細胞を買収:2-NBDG(488、530)、PE(488、575)、PECy7(488、780)、APC(633、660)。
  5. チューブに氷冷洗浄緩衝液(1×PBS中0.5%BSA)の4ミリリットルを追加します。4で220×gで遠心分離することによって1回洗浄 5分間°C。デカントし、氷古いPBSの200から300μlを添加し、暗所で氷(アルミ箔で覆われた)に保ちます。ステップ2.4​​のように励起および発光波長設定を使用して10分以内にフローサイトメーターで分析します。

3.データ収集と分析

注:フローサイトメトリーデータ分析の知識が仮定されます。

  1. 染色されていない個別染色したサンプルを使用して補正を設定し、少なくとも4色の分析が可能なフローサイトメーターを使用して。
    注:FITC標識CD4及びCD14を使用して単一の染色はGLUT1及び2-NBDGの補償のために使用することができます。
  2. 設定し、サンプルを取得する前に、適切なウィンドウにラベルを付けます。単球集団の周りにゲートを描き、中速度でサンプル100,000 300,000イベントを取得します。補償サンプルあたり50,000イベントで十分です。
    注:補正前の試料に行ってもよいです標準的な手順に従って取得又は単一細胞解析ソフトウェアで、。
  3. 適切な場所にデータをエクスポートし、保存します。指定されたように、単一のそのようなFlowJoソフトや他の解析ソフトウェアなどの細胞解析ソフトウェア( 補足図1)とドラッグ&ドロップのサンプルを開きます( 補足図2)。
  4. ファイルを開くにはダブルクリックして( 補足図3)。 図1Aおよび補足図4に示すように、ゲート順に基づいて、単球および側方散乱特性をに円を描く。単球集団をダブルクリックします。 CD3の周りにボックスを確認し、描く-人口( 補足図4)。
  5. ダブルCD3をクリックします-人口を。単球亜集団を観察するには、 'X'軸上のCD14-APCを選択し、CD16-PECy7 'Y'軸上、及び( 補足図5)に応じてラベルを付けます。
  6. 明確な存在しない場合には正と負の集団は、特定の単球亜集団におけるGLUT1の発現または2-NBDGの取り込みを測定します。アイソタイプなし2-NBDGの背景( 補足図6)を引いGLUT1と2-NBDGの平均蛍光強度(MFI)を決定します。
  7. ここで定義された集団は、ゲートを設定し、パーセント陽性細胞( 図3)を決定するためのIgG2b-FITCを使用し、存在します。
    注:総CD14 +単球を分析するために、この手順を使用します。 2-NBDGの取り込みは、通常、蛍光のシフトによってマークされているので、データは最高のMFIとヒストグラムで表される強度。

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Representative Results

補償は、蛍光波及を防ぐために、個々の蛍光色素のために実行する必要があります。単球は、最初の前方および側方散乱に基づいてゲートすることによって濃縮されます。以前に10を報告したように提示したプロットは、6人以上の参加者からの全血で行われ、少なくとも6つの独立した実験の代表で、図1Aは、CD3以内ゲーティングによるT細胞の細胞散乱及び排除による単球の初期ゲーティング示している- 。人口。単球は、次いで、 図1B及び図1Cに示すように、それぞれ、総単球又は単球亜集団を同定するために、単独で、またはCD16と組み合わせて、CD14発現についてゲートされます。約100倍高いCDを表現しなければならない-古典的な単球(CD14 ++ CD16):前回12に記載されているよう 、単球亜集団の分析のために、次の命名法が適用されるべきです14アイソタイプ対照よりもMFIとCD16 MFIは、アイソタイプ対照のようになります。中間単球(CD14 ++ CD16 +)は 、アイソタイプ対照よりも約100倍高いCD14 MFIを表現し、約アイソタイプ対照と比較して、より大きなCD16 MFIを10倍する必要があります。非古典的な単球(CD14 + CD16 ++)は、CD14およびアイソタイプコントロールに対して同様のMFIを持ち、約アイソタイプ対照よりもCD16 MFI大きい100倍必要があります。 CD14およびCD16の発現のない細胞は、単球とはみなされず、ゲーティングに含まれるべきではありません。ゲーテッド単球又は単球の亜集団は、その後、グルコース輸送体発現について調べることができます。図2に示されるように、CD14 + GLUT1 +単球の異なる集団は、感染は、炎症の慢性状態によって特徴づけられるHIV +個体から得られた細胞において最も顕著に観察することができます。似ていますが、まれCD14 + GLUT1 +細胞はOBSであってもよいですHIV非感染者( 図3A)に特定の単球サブセット内ervedが、HIV +の個体( 図3B)でより顕著です。注目すべき、異なる集団の非存在下では、それを考慮にGLUT1細胞表面発現の累積増加をとる、平均値または中央値蛍光強度として結果を表すのに適切であり得ます。

グルコース取り込みは、ゲーテッド単球又は単球亜集団のための2-NBDGまたはビヒクル対照とインキュベートした全血を比較することによって評価することができます。我々は以前、単球の約50%が、15分間のインキュベーション後に10 2-NBDG陽性であったことを示しました。 2-NBDGの取り込み単球の差はもはや存在しない可能性がある場合、この取り込みレベルは、到達飽和することなく、2-NBDGの検出を可能にします。 HIV非感染とHIV +人物からの単球による2-NBDGの取り込みの分析は、HIV +人物からの細胞による高い取り込みを明らかにしています( - 5、図4)、GLUT1発現データと一致します。全体として、これらの結果は、ここに記載されるアッセイは、潜在的に、糖尿病、心血管疾患、およびウイルスおよび細菌感染症などの炎症状態を誘発する生物学的状況において単球の代謝活性を研究するために使用することができることを示します。

図1
図1:代表的なHIV-およびHIV +血液サンプルからの総単球及び単球亜集団を分析するために使用される戦略ゲーティング全血の試料は、収集の1時間以内に、単球細胞表面GLUT1発現についてフローサイトメトリーにより分析しました。 (A)細胞を、前方および側方散乱特性およびCD3の発現に基づいてゲーティングしました。総単球を調べるために(B)、CD3 -細胞は、その後CD14発現のためにゲーティングしました。 (Cは この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2:代表的なHIV-からの総単球上の細胞表面GLUT1発現の分析およびHIV +血液サンプル CD14 +単球ナイーブ者は、FITC標識アイソタイプコントロールまたはGLUT1抗体で染色したHIV非感染またはHIV感染の治療から。 こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。


図3:代表HIV-およびHIV +血液試料から単球亜集団の細胞表面GLUT1発現の分析単球亜集団は、ナイーブ(A)HIV非感染または(B)HIV感染の治療のためのFITC標識アイソタイプ対照またはGLUT1抗体で染色しました。血液サンプル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4:代表HIV-およびHIVからの総CD14 +単球+血液サンプル HIV非感染またはHIV感染治療ナイーブ者からの血液による2-NBDGの取り込みは 、最終濃度で、車両または2-NBDGとインキュベートしました1.46μM洗浄前の15分間及び図1で説明したように、ゲート単球への細胞表面抗体とともにインキュベートこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5:代表HIV-およびHIV +全血サンプルから単球亜集団による2-NBDGの取り込みナイーブ者が15のために1.46ミリモルの最終濃度で車両または2-NBDGとインキュベートしたHIV非感染またはHIV感染の治療から血洗浄前の分と、図1で説明したように、ゲートの単球亜集団に細胞表面の抗体とインキュベートこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

together.within-ページ= "1"> SUPP。図1
補足図1:細胞解析ソフトウェアフローサイトメトリーのためのワークスペース]ウィンドウこの補足図を表示またはダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

SUPP。図2
補足図2:サンプル・データをドラッグし、このワークスペースにドロップされ、この補足図を表示またはダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

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補足図3:ワークスペース内のサンプルは、データ085がダブルクリックされた、第二のウィンドウが新鮮な全前方に基づいて、血液試料(FSC)および側方散乱(SSC)内の三つの主要な細胞集団(リンパ球、単球及び好中球)を示す登場。 この補足図を表示またはダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

SUPP。図4
補足図4:単球は前方(FSC)および側方散乱(SSC)に基づいてゲートされます。人口は二重の新しいウィンドウを育てているクリックされました。 CD3はsであった(リンパ球をゲーティング) 'X'軸とCD3陰性集団に対して選択されています選出された。 この補足図を表示またはダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

SUPP。図5
補足図5:CD3 -単球集団は、二重単球の亜集団は、CD16およびCD14の発現に基づいて定義することができる新しいウィンドウを育てているクリックされた。 この補足図を表示またはダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

SUPP。図6
補足図6:Monocyte亜集団が選択され、GLUT1の細胞表面発現は、(蛍光強度平均:MFI) 'を追加統計情報」ウィンドウから、ヒストグラムウィンドウに'平均 ''統計」を選択し、「パラメータ」からGLUT1を選択することによって得られるドロップダウンメニュー。 この補足図を表示またはダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

ここで説明するプロトコルは、全血における単球及び単球亜集団によるグルコーストランスポーターの発現と蛍光グルコースアナログの取り込みを調べるための簡単​​な方法を詳しく説明します。全血中の2-NBDG取り込みを評価することにより、この技術は、 インビボでのものと同様の条件を可能にします。以前の研究では、密度遠心分離17によって、全血から分離した単球で6-NBDGの取り込みを調べました。しかし、この研究は、単球の亜集団を検査せず、全血からの単球の分離は、潜在的に、特定の細胞表面分子19の発現を変化させることができます。重要な安全措置を必要とする放射性グルコースのトレーサーは、グルコース20,21の単球の取り込みを測定するために使用されてきたが、単球は、以前に放射能のこの方法と使用のために分離する必要があります。私たちのプロトコルは、日常バイオセーフティ手順を使用するため、2-NBDGのフローサイトメトリー測定を可能にする、最小限の操作的です生体内条件で模倣単球および単球の亜集団による取り込み。

2-NBDGは解糖系に入ると、非蛍光分子22への細胞によって代謝されることが示されています。したがって、4℃で冷却し、細胞を維持することによって2-NBDGのインキュベーション後に代謝を制限することが重要です。 6-NBDGを使用することができます別の蛍光グルコースアナログであるが、それは解糖系に入らないので、正確に細胞23の生体エネルギー状態を反映していないとして、それはあまり有用です。

スペクトルが重複する蛍光色素を利用する場合、補償が蛍光色素溢出を防止するために重要となります。このプロトコルでは、補正パラメータを設定するためにCD14とCD16と個別に染色した単球を使用したが、細胞表面マーカーの補償も補償ビーズを用いて行うことができます。

顆粒球はCD16を発現することができるが、うちゲートすることによって排除することができますCD15発現細胞。しかし、光散乱特性に基づいて、単球の厳しいゲーティングは、分析に含ま顆粒球の数を制限することができます。フローサイトメーターは、複数のチャネルで利用可能である場合、顆粒球マーカーCD66bも分析から顆粒球を排除するために使用することができます。

本研究で使用しGLUT1抗体は、細胞表面エピトープに結合し、従って、細胞内GLUT1に結合しません。細胞内GLUT1エピトープに特異的に結合する抗体は、全GLUT1の単球の発現を測定するために使用することができるが、細胞は10を染色前に透過処理されなければなりません。単球に加えて、この技術は、血液内に見られる他の白血球におけるグルコースの取り込みおよび代謝を調べるために使用することができます。我々は広く、ここで説明した方法を用いて、2-NBDGのT細胞の取り込みを検討し、また、NK細胞24によって2 NBDG取り込みを調べました。成功GLUT1発現の検出および2- NBDG取り込みのために、制限することが不可欠ですプロトコルに応じて過剰な洗浄緩衝液で細胞を洗浄することにより、赤血球溶解緩衝液の痕跡、我々はFITCまたはAPC標識GLUT1抗体は、PEまたはPerCPをコンジュゲートよりも優れたシグナルを与えることを見出しました。我々は、この理由を調査していません。

細胞は、低温でも代謝的に活性であるので、重要である37で2 NBDGのインキュベーション後 チューブを4℃で行っ氷および遠心分離に直接保持されることを、C°。不在強力な2-NBDG信号では、適切なときにホイルで部屋や安全キャビネット、カバーチューブに露光を減らし、正確な濃度が使用されていることを確認してください。最適化は、5、15、20、30、60、および90分間の時間経過2-NBDG取り込み実験を設定することによって要求され得ます。一般的に、最適な時間は、細胞の種類とそれらの活性化状態に応じて、10から60分でなければなりません。

2-NBDG取り込みアッセイでの主な制限は、光SENSですそれは細胞によって利用されているという事実と一緒にitivity。したがって、最後のサンプルは、最初の30分以内に分析されることを確実にするためにサンプルの数を制限することが重要です。生物学的な制限は、非古典的単球上のGLUT1を発現する非古典的な単球を、およびGLUT1の発現頻度は、古典的な単球よりも有意に大きかったにもかかわらず、何の違いは、2つの部分集団10の間に2-NBDGの取り込みに存在しない、ということです。これは、GLUT3やGLUT4のような他のGlutsは、単球上に発現している可能性が別の病気の設定でグルコース代謝に関与している可能性が発生します。 GLUT1の活性はまた、翻訳後に調節され得ることもまた可能です。

放射性同位元素標識の上に私たちのフローサイトメトリーグルコース取り込みプロトコルの主な利点は、Smalの中の免疫細胞の特定の亜集団を特定し、研究するための免疫表現型分析と技術を組み合わせる能力であります血液のリットルの容積。加えて、APC結合抗GLUT1同時にGLUT1細胞表面発現および2- NBDG取り込みを分析するために適用されてもよいです。 2-NBDGの取り込みによるGLUT1発現の変化は、以前に実証されていないが、この可能性は排除できません。

免疫細胞による増加したグルコースの取り込みおよび代謝は、活性化T細胞および単球25-27の特徴です。これらの細胞は、狼瘡30-32、ならびに肥満および糖尿病8,33などの自己免疫疾患のような状態で感染28,29、および炎症性シグナルを病原体に応答して活性化することができます。増加したグルコース代謝はまた、癌細胞の生存、増殖および転移34に必要とされます。特に、免疫細胞における代謝調節不全は、HIV感染の顕著な特徴として浮上している、および免疫活性化24、炎症10、及びCD4 + T細胞の感染35〜37に関連しています。そのため、この方法は、炎症性媒介性疾患、癌、感染症、免疫学およびimmunometabolism 38に関心を有するものを含む多様な聴衆を対象としています。

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Acknowledgements

この研究は、サポートされている賞番号AI027757の下エイズ研究のためのワシントン大学のセンター(CFAR)、NIH資 ​​金提供プログラムからHIVや肝炎ウイルス学研究(ACH 2)オーストラリアセンター、2010発達グラント(CNIHR)によって賄われていました以下のNIH研究所およびセンター(NIAID、NCI、NIMH、NIDA、NICHD、NHLBI、NIA)によります。 CSPはCNIHRとACH 2助成金の受取人です。 SMCは、オーストラリア国立保健医療研究評議会(NHMRC)主な研究フェローシップの受領者です。作者は感謝しバーネット研究所によって受信されたビクトリア朝の運用インフラ支援プログラムのこの作業への貢献を認めます。私たちは訓練と技術的なアドバイス、フローサイトメトリーのためのAMREPフローサイトメトリーコアファシリティから下座PaukovicとエヴァOrlowski - オリバーの支援を認めます。私たちは、メディアのコーチングやビデオ撮影の組織のためのアンガス・モーガンに感謝します。私たちの感謝の気持ちジェシーマッソンとジハード・アブドゥルアジーズK. Alzahraniにビデオ撮影時のラボの支援のために。我々は重要な方法論的なアドバイスを提供した医学研究科で博士デビッドSimar、UNSW、オーストラリアの努力に感謝します。 CSPは感謝したいと思いwww.nice-consultants.comをグラフィック協議するため。

レビューアの貢献:

CSPは、設計と実験を行い、分析し、データを解釈し、プロジェクトを考案し、原稿を書きました。 JJAは、データを解釈し、原稿を書きました。 TRBは、原稿を書きました。 JMMは、データを解釈し、重要な知的な提案を行い、原稿をレビューしました。 SMCは、データを解釈し、重要な知的提案を行い、原稿をレビューしました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes Greiner Bio-One GmbH 455094
5 ml sterile polypropylene tubes BD Biosciences 352063
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906
16% formaldehyde solution Electron Microscopy Science 15710
BD FACS lysing solution (10x) BD Biosciences 349202 Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4 °C)
anti-CD3-PE BD Biosciences 555340
anti CD14-APC BD Biosciences 555399
anti-CD16-PECy7 BD Biosciences 557744
anti-Glut1-FITC R & D Systems FAB1418F
IgG2b-FITC R & D Systems IC0041F
2-NBDG Life technologies N13195 Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4 °C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1x DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4 °C)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x) Life technologies 14190-144 To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4 °C)

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References

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