Basit Akım Sitometrisi Yöntemi Tüm Kan Monosit subpopulations için glikoz alımını ve Glikoz Transporter Anlatım Tedbir

1Centre for Biomedical Research, Macfarlane Burnet Institute for Medical Research and Public Health, 2Department of Infectious Diseases, Monash University, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Melbourne, 4Department of Microbiology, The University of the West Indies, 5Division of Experimental Medicine, Department of Medicine, University of California, San Francisco, 6Department of Medicine, Monash University
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Palmer, C. S., Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., McCune, J. M., Crowe, S. M. A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood. J. Vis. Exp. (114), e54255, doi:10.3791/54255 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Monositler, belirli kronik iltihaplı hastalıklar ile ilişkili hastalık ve iltihabı ile aktive edilebilir doğal immün hücrelerdir. monositlerin aktive efektör fonksiyonlarını ve artan glükoz taşıyıcı ekspresyonu eşlik glikolitik metabolizma oksidatif bir eşlik kaymasını teşvik eder. Bu artan glikolitik metabolizması da eğitim monositlerin bağışıklık, doğuştan gelen bağışıklık bellek form için gözlenmektedir. Monositler tarafından glükoz taşıyıcı ekspresyonu ve glukoz alımını incelemek in vitro protokol tarif edilmiş olmasına rağmen, hiçbiri tam kandaki sitometrisi çok parametre akışı ile incelenmiştir. (Ara-madde (CD14 ++ CD16 +) ve klasik olmayan - total monositler ve klasik (CD14 ++ CD16) tam kan floresan glikoz benzeri 2-NBDG alımının ölçümü için bir çok parametre akış sitometrik protokol açıklar CD14 + CD16 ++), monositsubpopülasyonunun. Bu yöntem, homeostaz ve enflamatuar hastalıkta toplam monositler ve monosit alt popülasyonlarının için glikoz taşıyıcısının ekspresyonunu ve glukoz alımını incelemek için kullanılabilir ve kolayca kan içindeki diğer lökositler ve lökosit alt popülasyonları için glükoz alımını incelemek için modifiye edilebilir.

Introduction

Monositler hızla enfeksiyon ve enflamasyonun 1 sitelere seferber insan doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir bileşenidir. Monosit aktivasyonu patojenler ile akut zararın sınırlandırılması için çok önemlidir ve aynı zamanda ateroskleroz 2, kanser 3 ve HIV 4,5 dahil olmak üzere çeşitli kronik hastalıkların patojenezine merkezi.

Dinlenme ve aktive monosit metabolizması glikolitik metabolizmasını (yani glikoz fermantasyon laktat) kullanarak oksidatif metabolizmayı kullanan dinlenme monositler ve aktive edilmiş monositler ile, dramatik farklılık 6. Monosit aktivasyonu glikolitik metabolizması 7, artan glukoz alımına olanak glükoz taşıyıcıları ekspresyonunu indükler. Monosit glikoz taşıyıcısının 1 (GLUT1) aktivasyon sırasında yukarı düzenlenen böyle bir taşıyıcı ve sentezlenmesi v pro-enflamatuar sitokinlerin üretimine yol gösterilmiştiritro ve obez farelerin 8 adipoz dokusunda. Kaposi sarkomu ilişkili Herpes bir monositik hücre hattı enfeksiyonu GLUT1 9 hücresel upregülasyonu yol açar, ve en son, kronik HIV infeksiyonu sırasında GLUT1 eksprese eden monosit artan oranı, işlemden geçirilmemiş ve kombine antiretroviral tedavi ile tedavi edilen enfeksiyona 10 sırasında mevcut olduğunu göstermiştir. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar glukoz alımını ve monositler tarafından glikolitik metabolizması birçok enflamatuar hastalıkların önemli yönleri göstermektedir. Bu nedenle, basit bir yöntem homeostazı sırasında monosit GLUT1 ekspresyonunu ve glukoz alımını ölçmek ve enflamatuar hastalık araştırmacılar geniş bir kullanım için olasıdır.

İnsan monositler hücre yüzey belirteçleri CD14 ve CD16 11,12 diferansiyel ifadesi ile muayene edilebilir üç ayrı alt oluşan varlık, heterojen. Klasik monositler CD14 yüksek düzeyde ifade ama CD'yi ifade etmezler16 (CD14 ++ CD16 -), orta monositler CD14 yüksek düzeyde ve CD16 (CD14 ++ CD16 +) orta düzeyde ve monositler CD14 düşük bir seviyede ve CD16 yüksek seviyede ifade eden klasik olmayan (CD14 ifade + CD16 ++). CD16 ifade monositler CD16 ile karşılaştırıldığında CD16 + monositler, denir - monositler yüksek inflamatuvar sitokinlerin ekspresyonunu ve yeteneğini daha etkin mevcut antijenlerin 13,14 gerekiyor. Monositler yaklaşık% 10'unda iltihap 15 gözlenen yüksek yüzdelerle homeostasis sırasında CD16 ifade eder. Monosit subpopülasyonunun Belirli hastalık durumları ile ilişkili hastalık ve hastalık ilerlemesinin 16 yararlı biyolojik göstergeler olabilir.

Amacımız PHY yakın koşullarda insan monositlerinde ve monosit alt populasyonları tarafından glikoz taşıyıcısının ekspresyonunu ve glukoz alımını ölçebilen bir yöntem belirlemektirmümkün olduğu siological koşullar. Bu yöntemler fizyolojik koşullar 19 ile karşılaştırıldığında protein ekspresyonunu değişmiş olabilir izole monositler incelendiğinde olsa Önceki çalışmalar, monosit glukoz transporter ekspresyonunu ve glukoz alımını 17,18 ölçüldü ve hiçbir önceki çalışma insan monosit subpopülasyonunun incelemiştir. sitometri çok parametrik akışını kullanarak, toplam monositler ve monosit alt popülasyonlar tarafından floresan glikoz analog 2-NBDG glukoz transporter ekspresyonunu ve alımını incelemek için bir yöntem açıklanmaktadır tam unmanipulated kan içinde (CD14 ve CD16 ifade dayanarak).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: HIV ile enfekte ve HIV ile enfekte olmayan konular Melbourne, VIC, Avustralya Alfred Hastanesi Enfeksiyon Hastalıkları Birimi işe, sırasıyla, yerel toplumdan bulundu. Aydınlatılmış onam tüm katılımcılar elde edildi ve araştırma Alfred Hastanesi Araştırma ve Etik Komitesi tarafından onaylandı.

Monositler ve Monosit alt popülasyonlar 1. GLUT1 Hücre Yüzey Algılama

  1. sitrat ACD-B antikoagülan tüplerde kan toplayın ve toplama 1 saat içinde biyolojik güvenlik kabini deneyleri başlar.
  2. polipropilen tüplere kan 100 ul ekle. Buz üzerinde, pipet yavaşça karıştırın iken çözüm parçalama 1x 2 ml ekleyin tüpleri (Malzeme Tablo). Buz üzerinde 15 dakika süreyle inkübe edin. 5 dakika boyunca 220 x g'de santrifüjleyin.
  3. Süzün ve yaklaşık 2-4 ml yıkama çözeltisi (1 x PBS içinde% 0.5 BSA) ilave edildikten ve 5 dakika boyunca 220 x g'de santrifüj ile iki kere yıkayın.
  4. Bir boru kullanıntte dikkatle mümkün olduğunca yıkama solüsyonu olarak çok kaldırmak için. Yeri tüpleri buz üzerinde yıkama solüsyonu 100 ul yeniden askıya.
  5. 5 ul anti-CD3-PE, 5 ul anti-CD14-APC, 5 ul anti-CD16-PECy7, 5 ul GLUT1: Belirli bir monosit alt-popülasyonları bulunduğunu aşama 1.4'te hazırlanan hücre süspansiyonu ul her 100 antikorların aşağıdaki hacmi ile hücrelerin leke belirlemek için -FITC veya IgG2b-FITC (izotip kontrol tüpü).
  6. Karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin. yıkama solüsyonu ile 2 kez yıkayın. 1x PBS içinde yapılan% 0,5 formaldehit 200-300 ul sabitleyin.
  7. Aşağıdaki eksitasyon ve emisyon dalga mesafedeki 24 saat içinde 4 renk saptayabilen bir akış sitometresi üzerinde analiz: (633, 660), 10 FITC (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC.

Monositler tarafından 2. Glükoz alınması

  1. kan pipetle 90 ul polipropilen tüpler içinde aşama 1.1 içinde toplanmıştır. Bir 14.60 uM 2-NBDG çalışma çözeltisinin 10 ul ekle90 kan ul (1.46 mM son konsantrasyon) ve itme yavaşça karıştırın. Alüminyum folyo ile tüpler kapsayan ışığına 2-NBDG maruz kalma sınırı için kritik öneme sahiptir.
  2. 15-30 dakika süreyle karanlıkta 37 ° C'de inkübe edilir ve sonra hemen buz üzerine yerleştirin. buz üzerinde iken tüplere çözüm parçalama 1x FACS 4 ml ekleyin. 4 ° C'de 220 x g'de santrifüj 5 dakika boyunca ° C.
  3. yıkama çözeltisi (1 x PBS içinde% 0.5 BSA) içinde 4 ml ekleyerek kez yıkayın. 4 ° C'de 220 x g'de santrifüj 5 dakika boyunca ° C. Durusu ve buz üzerinde yer.
  4. antikorlar ile Leke hücreleri: 5 ul anti-CD3-PE, 5 ul anti-CD14-APC ve 5 ul anti-CD16-PECy7. Karıştırın ve karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin.
    NOT: Bu dönemde flowsitometri derhal analiz için hazır olduğundan emin olun. Aşağıdaki uyarma ve emisyon dalga içinde hücreleri Edinme: 2-NBDG (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660).
  5. tüplere buz gibi soğuk yıkama tamponu (1 x PBS içinde% 0.5 BSA) içinde 4 ml.4 ° C'de 220 x g'de santrifüj ile bir kez yıkayın 5 dakika boyunca ° C. Durusu ve buz eski PBS 200-300 ul ekleyin ve karanlık buz (alüminyum folyo ile kaplanmış) devam ediyor. sitometresi adım 2.4 gibi uyarılma ve emisyon dalga boyu ayarını kullanarak 10 dakika içinde bir akış analiz edin.

3. Veri Toplama ve Analizi

NOT: flow sitometri ve veri analizi hakkında bilgi sahibi olduğu varsayılır.

  1. lekesiz ve bireysel boyanmış örnekler kullanılarak tazminat ayarlamak, en az 4 renk analizi yapabilen bir akış sitometresinin kullanarak.
    NOT: FITC etiketli CD4 ve CD14 ile tek boyama GLUT1 ve 2-NBDG telafisi için kullanılabilir.
  2. kurmak ve örnekleri almadan önce uygun etiket pencereler. monosit nüfus etrafında bir kapı çizin ve orta hızda örnek başına 100.000 300.000 olayları kazanır. tazminat örnek başına 50.000 olayları yeterlidir.
    NOT: Tazminat örnek öncesinde yapılabilirstandart prosedürler aşağıdaki edinimi veya tek hücre analizi yazılımı.
  3. İhracat ve uygun bir konuma verileri kaydetmek. Böyle FlowJo veya diğer analiz yazılımı belirtilmiş (İlave Şekil 2) olarak (İlave Şekil 1) ve sürükle ve bırak örnekleri olarak tek hücre analiz yazılımı açın.
  4. Çift dosya (İlave Şekil 3) açmak için tıklayın. . Kapı ileri dayalı monositler ve Şekil 1A ve Ek Şekil 4'te gösterildiği gibi yan dağılım özelliklerini bir daire çizin çift monosit nüfusu tıklayın. Gözlemlemek ve CD3 etrafında bir kutu çizin - Nüfus (Company Şekil 4).
  5. Çift CD3 tıklayın - nüfusu. Monosit subpopülasyonunun 'x' ekseni üzerinde CD14-APC seçeneğini gözlemlemek ve ''in eksen üzerinde CD16-PECy7 ve buna göre (İlave Şekil 5) etiket.
  6. Hiçbir belirgin olduğu yerlerdepozitif ve negatif popülasyonları, belirli monosit alt popülasyonlar GLUT1 ifadesini ya da 2-NBDG alımını ölçün. Izotipini ve hiçbir 2-NBDG arka plan (Company Şekil 6) çıkarılarak GLUT1 ve 2-NBDG ortalama floresan yoğunlukları (MFI) belirleyin.
  7. Tanımlanmış popülasyonlar olduğu yerlerde, yüzde pozitif hücreler (Şekil 3) kapısı ayarlamak ve belirlemek için IgG2b-FITC kullanın.
    NOT: Toplam CD14 + monositler analiz etmek için bu prosedürü kullanın. 2-NBDG alımı genellikle floresan bir değişiklik ile işaretlenir yana veri en MFI ve histogramlar tarafından temsil edilmektedir şiddetleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dengeleme floresans yayılma etkileri önlemek için tek tek fluorochromes için gerçekleştirilmelidir. Monositler ilk ileri ve yan dağılım dayalı yolluk ile zenginleştirilmiştir. . Nüfusunu - Daha önce 10 Şekil 1A CD3 içinde yolluk hücre yayılımı ve T hücrelerinin dışlanması ile monositlerin ilk yolluk gösterir rapor olarak sunulan araziler altı veya daha fazla katılımcılardan tam kan üzerinde yapılan en az altı bağımsız deneyler temsilcileridir. Sırasıyla Şekil 1B ve Şekil 1C 'de gösterildiği gibi Monositler, CD14 ekspresyonu, tek başına ya da toplam monositler veya monosit alt-popülasyonunu tespit etmek CD16 ile birlikte en çok kapılı. Yaklaşık büyük CD 100 kat ifade etmelidir - klasik monositler (CD14 ++ CD16): Daha önce 12 açıklandığı gibi monosit alt popülasyonlarının analizi için, aşağıdaki isimlendirme uygulanmalıdırizotip kontrolü ve CD16 MFI daha 14 MFI izotip kontrolü benzer olmalıdır; ara madde monositler (CD14 ++ CD16 +) yaklaşık izotip kontrolü daha fazla CD14 MFI 100 kat ve 10 kat daha fazla ifade etmelidir izotip kontrol ile karşılaştırıldığında CD16 MFI; klasik olmayan monositler (CD14 + CD16 ++) CD14 ve izotip kontrolü için benzer MFI olmalı ve yaklaşık izotip kontrolü daha fazla CD16 MFI 100 kat. CD14 ve CD16 ifadesi olmadan Hücreler kabul monositler değildir ve yolluk dahil edilmemelidir. Güvenlikli monositler veya monosit alt-popülasyonları bulunduğunu daha sonra glikoz taşıyıcısının ekspresyonu için kontrol edilebilir. Şekil 2'de gösterildiği gibi, CD14 + GLUT1 + monositlerin ayrı nüfus iltihap kronik durum ile karakterizedir HIV pozitif bireyler, elde edilen hücrelerde özellikle, gözlenebilir. Benzer ama nadir CD14 + GLUT1 + hücreleri obs olabilirHIV bulaşmamış kişiler (Şekil 3A) belirli monosit alt grupları içinde erved, ancak HIV + bireyler (Şekil 3B) daha belirgindir. Dikkate değer, farklı toplumlarda yokluğunda, dikkate GLUT1 hücre yüzey ifadesi kümülatif artış alır ortalama veya medyan floresans şiddetleri, gibi sonuçları temsil etmek uygun olabilir.

Glukoz alımını 2-NBDG veya kapı, monositler veya monosit alt popülasyonlarının için araç kontrolü ile inkübe tam kan karşılaştırarak değerlendirilebilir. Daha önce monosit yaklaşık olarak% 50, 15 dakika inkübasyondan 10 sonra 2-NBDG pozitif olduğunu göstermiştir. 2-NBDG alımı monosit farklılıklar artık var olabilir, bu alım seviyesi ulaşan doygunluk olmadan 2-NBDG tespiti için izin verir. HIV bulaşmamış ve HIV + kişilerden monositler tarafından 2-NBDG alımı analizi, HIV + kişiler, gelen hücreler tarafından daha yüksek bir alımı ortaya hangiGLUT1 ifade verileri (- 5 Şekil 4) ile uyum içindedir. Genel olarak, bu sonuçlar burada açıklanan tahlilleri potansiyel diyabet, kalp-damar hastalıkları ve viral ve bakteriyel enfeksiyonlar gibi bir enflamatuar durum ortaya biyolojik bağlamlarda monosit metabolik faaliyetleri incelemek için kullanılabileceğini göstermektedir.

Şekil 1
Şekil 1:. Örnek HIV ve HIV pozitif kan örnekleri toplam monositler ve monosit alt-popülasyonunu analiz etmek için kullanılan bir strateji yolluk tam kan numuneleri, toplama 1 saat içinde monosit hücre yüzeyi GLUT1 ifadesi için akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. (A) Hücreler ileri ve yan dağılım özellikleri ve CD3 ifadesine dayalı kapı bulundu. (B) CD3, toplam monositleri incelemek için - hücreler daha sonra CD14 ifadesi için kapı bulundu. (Cı Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2:.. Örnek HIV ve HIV pozitif kan örnekleri toplam monosit hücre yüzey GLUT1 ekspresyonunun analizi HIV ile enfekte olmayan ya da saf kişiler FITC etiketli izotip kontrolü veya GLUT1 antikor ile boyandı tedavi, HIV ile enfekte gelen CD14 + monositleri burada tıklayın Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.


Şekil 3:. Örnek HIV ve HIV pozitif kan örneklerinden monosit alt popülasyonları üzerinde hücre yüzeyi GLUT1 ekspresyonunun analizi Monosit subpopülasyonunun saf (A) HIV ile enfekte olmayan ya da (B) HIV ile enfekte tedavisi için FITC etiketli izotip kontrolü veya GLUT1 antikor ile boyandı kan örnekleri. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4:. Örnek HIV ve HIV toplam CD14 + monositleri + kan örnekleri HIV ile enfekte olmayan ya da HIV ile enfekte olmuş bir tedavi görmemiş kişilerden kan 2-NBDG yükselişi gösteren bir nihai konsantrasyonda, araç ya da 2-NBDG inkübe edildi1.46 uM yıkamadan önce 15 dakika ve Şekil 1'de açıklandığı gibi kapı monosit hücre yüzeyi antikorlar ile kuluçkaya bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5:. Örnek HIV ve HIV + monosit alt popülasyonlarının 2-NBDG alımı, tam kan örnekleri HIV ile enfekte olmayan ya da HIV ile enfekte olmuş bir tedavi görmemiş kişilerin kan 15 için 1.46 mM'lik bir son konsantrasyonda bir araç ya da 2-NBDG inkübe edildi dk yıkamadan önce ve Şekil 1'de açıklandığı gibi kapı monosit alt popülasyonlar için hücre yüzey antikorları ile kuluçka bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

together.within-page = "1"> Dest. Şekil 1
Yan Şekil 1:. Hücre analizi yazılımı flow sitometri için Workspace penceresi görüntülemek veya bu ek rakamı indirmek için tıklayınız.

Dest. şekil 2
Yan Şekil 2:. Örnek veri sürükledi ve bu çalışma alanına bırakılan görüntülemek veya bu ek rakamı indirmek için tıklayınız.

55 / Supp_Figure_3_Double_Click_to_open_file_Small.jpg "/>
Yan Şekil 3: Çalışma alanında örnekler, veri 085 çift tıklandığında, ve ikinci bir pencere taze ileri dayalı tam kan numunesi (FSC) ve yan dağılım içinde üç büyük hücre popülasyonu (lenfositler, monositler ve nötrofiller) gösteren çıktı (SSC) . görüntülemek veya bu ek rakamı indirmek için tıklayınız.

Dest. Şekil 4,
Yan Şekil 4: Monositler ileri (FSC) ve yan dağılım (SSC) dayalı Geçitli. nüfus çift yeni bir pencere getirdi tıklandığını. CD3 'x' ekseni ve CD3-negatif nüfus seçilir s oldu (lenfositler dışarı yolluk)seçilmiş. görüntülemek veya bu ek rakamı indirmek için tıklayınız.

Dest. Şekil 5,
Yan Şekil 5: CD3 - monosit nüfus çift monosit subpopülasyonu CD16 ve CD14 ifade dayalı tanımlanabilir yeni bir pencere getirdi tıklandığı. Tıklayınız görüntülemek veya bu ek rakam indirmek için lütfen.

Dest. Şekil 6,
Yan Şekil 6: Monocyte alt popülasyonlar seçilir ve GLUT1 hücre yüzey ifadesi (floresan yoğunluğu ortalama: MFI) 'ekleyin istatistikleri' penceresinden, histogram penceresinde 'ortalama' 'istatistiklerini' seçerek ve 'parametre' dan GLUT1 seçerek elde edilir açılır menü. tıklayınız görüntülemek veya bu ek rakam indirmek için lütfen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada açıklanan protokol tam kan monosit ve monosit alt popülasyonlar glukoz transporter ifade ve floresan glikoz analog alımını incelemek için basit bir yöntem ayrıntıları. Tam kan içinde bir 2-NBDG alımını değerlendirerek, bu teknik, in vivo benzer koşullar sağlar. Önceki bir çalışmada, yoğunluk santrifüj 17 kandan ayrılmış monositler 6-NBDG alımını incelenmiştir. Bununla birlikte, bu çalışmada potansiyel olarak belirli bir hücre yüzey molekülleri 19 ekspresyonunu değiştirebilir monosit alt-popülasyonunu ve bütün kandan monositlerin ayrılması incelemek vermedi. Radyoaktif glukoz izleyiciler glukoz 20,21 monosit alınmasının ölçümü için kullanılmıştır, fakat monositlerle daha önce önemli bir güvenlik önlemleri gerektirir, bu yöntem ve radyoaktivite kullanım için izole edilmelidir. Bizim protokol rutin biyogüvenlik prosedürleri kullanır ve bu yüzden 2-NBDG akış sitometri ölçümü için izin minimal manipülatifin vivo koşullarda taklit eden monositler ve monosit alt popülasyonlar tarafından alımı.

2-NBDG glikolitik yoluna giren ve floresan olmayan moleküller 22 hücreler tarafından metabolize olduğu gösterilmiştir. Nedenle, 4 ° C'de soğutulmuş hücreleri tutarak metabolizması 2-NBDG sonra inkübasyon sınırlamak için çok önemlidir. 6-NBDG kullanılabilen başka bir fluoresan glikoz benzeri ancak glikolitik yolun girmediği ve dolayısıyla doğru hücre 23 bioenergetic durumu yansıtmadığı için daha az kullanışlıdır.

spektrumları örtüşen fluorochromes kullanılmaktadır varsa, tazminat florokrom taşkınlığın önlenmesi için kritik hale gelir. Bu protokolde tazminat parametrelerini ayarlamak için CD14 ve CD16 ile ayrı ayrı boyanmış monositler kullanır, ancak hücre yüzey belirteçlerinin tazminat da tazminat boncuklar kullanılarak yapılabilir.

Granülositler CD16 ifade edebilir ama dışarı yolluk dışı bırakılabilirCD15-eksprese eden hücreler. Ancak, granülosit sayısını kısıtlamak ışık yayılımı özelliklerine göre monositlerin sıkı yolluk analizine dahil. Bir flowsitometri daha fazla kanal ile bir varsa, granülosit işaretleyici CD66b da analizinden granülositler dışlamak için kullanılabilir.

Bu çalışmada kullanılan GLUT1 antikor hücre içi GLUT1 bağlanmaz, bu nedenle, bir hücre yüzeyi epitopa bağlanır ve. Bir hücre içi GLUT1 epitopa bağlanan bir antikor, toplam GLUT1 monosit ekspresyonunu ölçmek için kullanılabilir, ancak hücreler 10 boyamadan önce permeabilize gerekir. monositler ek olarak, bu teknik, kan içinde bulunan diğer lökositler glukoz alımını ve metabolizmayı incelemek için kullanılabilir. Biz burada kapsamlı tarif edilen yöntem kullanılarak 2-NBDG T hücre alımını inceledik ve NK hücreleri 24 ile 2-NBDG alımını inceledik. GLUT1 ekspresyonu ve 2-NBDG alımı başarıyla saptanması için sınırlamak zorunludurprotokole göre aşırı yıkama tamponu ile hücrelerin yıkanarak kırmızı kan hücresi lizis tamponu izleri ve biz FITC veya APC etiketli GLUT1 antikor PE veya PerCP konjugatları daha iyi sinyaller verdiğini gördük. Bunun için nedenleri araştırıldı değil.

Hücreler, düşük sıcaklıklarda bile, metabolik olarak aktif olduğu için, çok önemli olduğunu, 37 ° C'de 2-NBDG inkübasyonun ardından C, tüpler buz ve santrifüj doğrudan tutulmasını 4 ° C'de gerçekleştirilmiştir. olmaması güçlü 2-NBDG sinyali, doğru konsantrasyon kullanıldığını kontrol ederken uygun folyo ile odası ve Biyogüvenlik kabini ve kapak tüpleri ışık maruziyeti azaltmak. Optimizasyon 5, 15, 20, 30, 60, ve 90 dakika bir zaman kursu 2-NBDG alımı deney kurarak gerekli olabilir. Tipik olarak, en uygun zaman hücre tipleri ve bunların aktivasyon durumuna bağlı olarak, 10-60 dakika olmalıdır.

2-NBDG alım testi ile önemli bir sınırlama ışık sens olduğunuBirlikte bu hücreler tarafından kullanılmaktadır gerçeği ile iTivity. Bu nedenle, son örnek ilk bir 30 dakika içinde analiz edilir sağlamak için örneklerin sayısını sınırlamak için önemlidir. Bir biyolojik sınırlama klasik olmayan Monositlerdeki GLUT1 ifade eden klasik olmayan monositler ve GLUT1 ifade sıklığı klasik monositler belirgin olarak daha fazla olmalarına rağmen, hiçbir fark iki alt popülasyonlar 10 arasında 2-NBDG alımındaki var olmasıdır. Bu monositler farklı hastalık ayarlarında glikoz metabolizmasında rol olabilir böyle Glut3 ve GLUT4 gibi diğer Gluts ifade ihtimalini yükseltir. GLUT1 aktivitesi translasyon yayını düzenlenir olması da mümkündür.

radyoizotop etiketleme üzerinde bizim akım sitometri glukoz alımı protokolü önemli bir avantajı smal bağışıklık hücrelerinin belirli alt popülasyonlar tespit etmek ve incelemek için immünfenotipik analizi ile teknik birleştirmek yeteneğikan l hacmi. Buna ek olarak, APC-konjuge anti-GLUT1 eşzamanlı GLUT1 hücre yüzey ekspresyonunu ve 2-NBDG alımını analiz etmek için tatbik edilebilir. 2-NBDG için alımı nedeniyle GLUT1 ifadesinde bir değişiklik, daha önce örneğine rastlanmamıştır, ancak bu olasılığı göz ardı edilemez.

Bağışıklık hücreleri tarafından artan glikoz alımı ve metabolizma aktive T hücreleri ve monositler 25-27 bir özelliğidir. Bu hücreler, deri veremi 30-32, obezite ve diyabet 8,33 gibi otoimmün hastalıklar gibi durumların enfeksiyonu 28,29 ve inflamasyonun Patojene karşılık olarak aktive edilebilir. Artmış glukoz metabolizması, aynı zamanda kanser hücre hayatta kalma, büyümesi ve metastaz 34 için gereklidir. Özellikle, bağışıklık hücrelerinde metabolik bozukluklar HIV enfeksiyonu ayırt edici niteliği olarak ortaya çıkmıştır ve CD4 + T hücrelerinin 35-37 immün aktivasyon 24, inflamasyon 10 ve enfeksiyon ile ilişkilidir. Bu nedenle,Bu yöntem inflamatuvar aracılı hastalıklar, kanser, enfeksiyon hastalıkları, immünoloji ve immunometabolism 38 bir ilgi olanlar da dahil olmak üzere çeşitli kitleler için ilgi olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Bu araştırma, HIV ve Hepatit Viroloji Araştırma AIDS Araştırma Washington Merkezi'nin Üniversitesi (SYAO), desteklenen ödül numarası AI027757 altında NIH tarafından finanse edilen programdan (ACH 2) ve 2010 gelişimsel hibe (CNIHR) Avustralya Merkezi tarafından finanse edildi aşağıdaki NIH Enstitüleri ve Merkezleri (NIAID, NCI, NIMH, NIDA, NICHD, NHLBI, NIA) tarafından. CSP CNIHR ve ACH 2 hibe bir alıcı. SMC Avustralya (NHMRC) Anapara Araştırma Bursu bir Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi bir alıcı. Yazarlar minnetle Burnet Enstitüsü tarafından alınan Victoria Operasyonel Altyapısının Desteklenmesi Programı bu işe katkı kabul ediyorum. Biz eğitim ve teknik danışmanlık flow sitometri için AMREP Sitometrisi Core Tesisleri'nde gelen Geza Paukovic ve Eva Orlowski-Oliver yardım kabul. Biz medya koçluk ve video çekimi organizasyonu için Angus Morgan teşekkür ederiz. bizim şükranJesse Masson ve Jehad Abdülaziz K. alzahrani video çekimi sırasında laboratuvar yardım için. Biz kritik metodolojik öğütleri Tıp Bilimleri, UNSW, Avustralya Okulu'nda Dr. David Simar çabalarını teşekkür ederim. CSP teşekkür etmek istiyorum www.nice-consultants.com grafik istişareler için.

YAZARLARIN KATKISI:

CSP, projeyi gebe tasarlanmış ve deneyler yürüttüler, analiz ve veri yorumlanır ve el yazması yazdı. JJA verileri yorumlanır ve el yazması yazdı. TRB yazının yazdı. JMM, veri yorumlanır kritik entelektüel öneri yaptı ve el yazması gözden geçirilmiştir. SMC, veri yorumlanır kritik entelektüel öneriler yapılmış ve el yazması gözden geçirilmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes Greiner Bio-One GmbH 455094
5 ml sterile polypropylene tubes BD Biosciences 352063
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906
16% formaldehyde solution Electron Microscopy Science 15710
BD FACS lysing solution (10x) BD Biosciences 349202 Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4 °C)
anti-CD3-PE BD Biosciences 555340
anti CD14-APC BD Biosciences 555399
anti-CD16-PECy7 BD Biosciences 557744
anti-Glut1-FITC R & D Systems FAB1418F
IgG2b-FITC R & D Systems IC0041F
2-NBDG Life technologies N13195 Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4 °C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1x DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4 °C)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x) Life technologies 14190-144 To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4 °C)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat Rev Immunol. 11, 762-774 (2011).
  2. Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7, 77-86 (2010).
  3. Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and macrophages in cancer: development and functions. Cancer Microenviron. 6, 179-191 (2013).
  4. Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., Angelovich, T. A., Crowe, S. M., Palmer, C. S. Monocytes as regulators of inflammation and HIV-related comorbidities during cART. J Immunol Res. 2014, 569819 (2014).
  5. Palmer, C., Cherry, C. L., Sada-Ovalle, I. Glucose Metabolism in T Cells and Monocytes: New Perspectives in HIV Pathogenesis. EBioMedicine. (2016).
  6. Cheng, S. C., et al. mTOR- and HIF-1alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity. Science. 345, 1250684 (2014).
  7. Maratou, E., et al. Glucose transporter expression on the plasma membrane of resting and activated white blood cells. Eur J Clin Invest. 37, 282-290 (2007).
  8. Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages: glucose transporter 1 (GLUT1)-mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. J Biol Chem. 289, 7884-7896 (2014).
  9. Gonnella, R., et al. Kaposi sarcoma associated herpesvirus (KSHV) induces AKT hyperphosphorylation, bortezomib-resistance and GLUT-1 plasma membrane exposure in THP-1 monocytic cell line. J Exp Clin Cancer Res. 32, 79 (2013).
  10. Palmer, C. S., et al. Glucose transporter 1-expressing proinflammatory monocytes are elevated in combination antiretroviral therapy-treated and untreated HIV+ subjects. J Immunol. 193, 5595-5603 (2014).
  11. Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118, e16-e31 (2011).
  12. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116, e74-e80 (2010).
  13. Belge, K. U., et al. The proinflammatory CD14+CD16+DR++ monocytes are a major source of TNF. J Immunol. 168, 3536-3542 (2002).
  14. Frankenberger, M., Sternsdorf, T., Pechumer, H., Pforte, A., Ziegler-Heitbrock, H. W. Differential cytokine expression in human blood monocyte subpopulations: a polymerase chain reaction analysis. Blood. 87, 373-377 (1996).
  15. Ziegler-Heitbrock, L. The CD14+ CD16+ blood monocytes: their role in infection and inflammation. J Leukoc Biol. 81, 584-592 (2007).
  16. Ziegler-Heitbrock, L. Macrophages: Biology and Role in the Pathology of Diseases. Springer. 3-36 (2014).
  17. Dimitriadis, G., et al. Evaluation of glucose transport and its regulation by insulin in human monocytes using flow cytometry. Cytometry A. 64, 27-33 (2005).
  18. Fu, Y., Maianu, L., Melbert, B. R., Garvey, W. T. Facilitative glucose transporter gene expression in human lymphocytes, monocytes, and macrophages: a role for GLUT isoforms 1, 3, and 5 in the immune response and foam cell formation. Blood Cells Mol Dis. 32, 182-190 (2004).
  19. Stibenz, D., Buhrer, C. Down-regulation of L-selectin surface expression by various leukocyte isolation procedures. Scand J Immunol. 39, 59-63 (1994).
  20. Ahmed, N., Kansara, M., Berridge, M. V. Acute regulation of glucose transport in a monocyte-macrophage cell line: Glut-3 affinity for glucose is enhanced during the respiratory burst. Biochem J. 327 (Pt 2), 369-375 (1997).
  21. Cutfield, W. S., Luk, W., Skinner, S. J., Robinson, E. M. Impaired insulin-mediated glucose uptake in monocytes of short children with intrauterine growth retardation). Pediatr Diabetes. 1, 186-192 (2000).
  22. Yoshioka, K., et al. A novel fluorescent derivative of glucose applicable to the assessment of glucose uptake activity of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1289, 5-9 (1996).
  23. Speizer, L., Haugland, R., Kutchai, H. Asymmetric transport of a fluorescent glucose analogue by human erythrocytes. Biochim Biophys Acta. 815, 75-84 (1985).
  24. Palmer, C. S., et al. Increased glucose metabolic activity is associated with CD4+ T-cell activation and depletion during chronic HIV infection. AIDS. 28, 297-309 (2014).
  25. Palmer, C. S., Ostrowski, M., Balderson, B., Christian, N., Crowe, S. M. Glucose metabolism regulates T cell activation, differentiation, and functions. Frontiers in immunology. 6, (2015).
  26. Palmer, C. S., et al. Regulators of glucose metabolism in CD4 and CD8 T cells. International reviews of immunology. 1-12 (2015).
  27. Palmer, C. S., Crowe, S. M. How does monocyte metabolism impact inflammation and aging during chronic HIV infection? AIDS research and human retroviruses. 30, 335-336 (2014).
  28. McFadden, K., et al. Metabolic stress is a barrier to Epstein-Barr virus-mediated B-cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E782-E790 (2016).
  29. Gamelli, R. L., Liu, H., He, L. K., Hofmann, C. A. Augmentations of glucose uptake and glucose transporter-1 in macrophages following thermal injury and sepsis in mice. Journal of leukocyte biology. 59, 639-647 (1996).
  30. Yin, Y., et al. Glucose Oxidation Is Critical for CD4+ T Cell Activation in a Mouse Model of Systemic Lupus Erythematosus. Journal of immunology. 80-90 (2016).
  31. Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis research & therapy. 17, 29 (2015).
  32. Yin, Y., et al. Normalization of CD4+ T cell metabolism reverses lupus. Science translational medicine. 7, 274ra218 (2015).
  33. Barbera Betancourt, A., et al. Inhibition of Phosphoinositide 3-Kinase p110delta Does Not Affect T Cell Driven Development of Type 1 Diabetes Despite Significant Effects on Cytokine Production. PloS one. 11, e0146516 (2016).
  34. Barron, C. C., Bilan, P. J., Tsakiridis, T., Tsiani, E. Facilitative glucose transporters: Implications for cancer detection, prognosis and treatment. Metabolism: clinical and experimental. 65, 124-139 (2016).
  35. Hegedus, A., Kavanagh Williamson, M., Huthoff, H. HIV-1 pathogenicity and virion production are dependent on the metabolic phenotype of activated CD4+ T cells. Retrovirology. 11, 98 (2014).
  36. Taylor, H. E., et al. Phospholipase D1 Couples CD4+ T Cell Activation to c-Myc-Dependent Deoxyribonucleotide Pool Expansion and HIV-1 Replication. PLoS Pathog. 11, e1004864 (2015).
  37. Loisel-Meyer, S., et al. Glut1-mediated glucose transport regulates HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2549-2554 (2012).
  38. Palmer, C. S., et al. Emerging Role and Characterization of Immunometabolism: Relevance to HIV Pathogenesis, Serious Non-AIDS Events, and a Cure. J Immunol. 196, (11), 4437-4444 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics