En enkel Flödescytometriska metod för att mäta glukosupptag och glukostransportör uttryck för monocyt Subpopulationer i helblod

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Palmer, C. S., Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., McCune, J. M., Crowe, S. M. A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood. J. Vis. Exp. (114), e54255, doi:10.3791/54255 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Monocyter är medfödda immunceller som kan aktiveras av patogener och inflammation i samband med vissa kroniska inflammatoriska sjukdomar. Aktivering av monocyter inducerar effektorfunktioner och en åtföljande övergång från oxidativ till glykolytiska metabolismen som är förenad med ökad glukostransportör uttryck. Denna ökade glykolytiska metabolismen observeras även för utbildad immunitet monocyter, en form av medfödd immunologiskt minne. Även in vitro protokoll undersöker glukostransportör uttryck och glukosupptag av monocyter har beskrivits, har ingen granskats av flera parametrisk flödescytometri i helblod. Vi beskriver en multi-parametrisk flödescytometrisk protokoll för mätning av fluorescerande glukos analog 2-NBDG upptag i helblod med totala monocyter och den klassiska (CD14 ++ CD16 -), mellan (CD14 ++ CD16 +) och icke-klassiska ( CD14 + CD16 ++) monocytsubpopulationer. Denna metod kan användas för att undersöka glukostransportör uttryck och glukosupptag för total monocyter och monocyt subpopulationer under homeostas och inflammatorisk sjukdom, och kan lätt modifieras för att undersöka glukosupptag för andra leukocyter och leukocyter subpopulationer inom blod.

Introduction

Monocyter är en viktig del av människans medfödda immunförsvaret som snabbt mobiliseras till ställen för infektion och inflammation en. Aktivering av monocyter är avgörande för att begränsa akut skada av patogener och är också centralt för patogenesen av flera kroniska sjukdomar, inklusive åderförkalkning 2, cancer 3, och HIV 4,5.

Metabolismen av vilande och aktiverade monocyter skiljer sig drastiskt, med vilande monocyter utnyttjar oxidativ metabolism och aktiverade monocyter använder glykolytiska metabolismen (dvs. jäsning av glukos till laktat) 6. Aktivering av monocyter inducerar uttryck av glukostransportörer som möjliggör ökad glukosupptag för glykolytiska metabolismen 7. Monocyt glukostransportör 1 (glut1) är en sådan transportör uppregleras under aktivering och dess uttryck har visat sig leda till produktion av proinflammatoriska cytokiner i vitro och i fettvävnad av feta möss 8. Infektion av en monocytisk cellinje genom Kaposis sarkom i samband herpesvirus leder till cellulär uppreglering av glut1 9, och vi visade nyligen att en ökad andel av glut1-uttryckande monocyter under kronisk HIV-infektion är närvarande under obehandlade och antiretroviral kombinationsbehandling behandlad infektion 10. Sammantaget visar dessa studier visar att glukosupptag och glykolytiska metabolismen av monocyter är viktiga aspekter av många inflammatoriska sjukdomar. Således, till en enkel metod för att mäta monocyt glut1 uttryck och glukosupptag under homeostas och inflammatorisk sjukdom kommer sannolikt att vara till nytta för ett brett spektrum av forskare.

Humana monocyter är heterogena, som består av tre olika undergrupper som kan granskas av differentiellt uttryck av cellytmarkörer CD14 och CD16 11,12. Klassiska monocyter uttrycker en hög nivå av CD14 men uttrycker inte CD16 (CD14 ++ CD16 -), mellan monocyter uttrycker en hög nivå av CD14 och en mellannivå av CD16 (CD14 ++ CD16 +), och icke-klassiska monocyter uttrycker en låg nivå av CD14 och en hög nivå av CD16 (CD14 + CD16 ++). Monocyter som uttrycker CD16 betecknas CD16 + monocyter, som jämfört med CD16 - monocyter har hög expression av inflammatoriska cytokiner och förmågan att mer effektivt presentera antigener 13,14. Ungefär 10% av monocyter uttrycker CD16 under homeostas med högre procenttal som observerats under inflammation 15. Monocyt subpopulationer är förknippade med vissa sjukdomstillstånd och kan vara användbara biologiska markörer för sjukdom och sjukdomsutveckling 16.

Vårt mål var att identifiera en metod som kan mäta glukostransportör uttryck och glukosupptag av humana monocyter och monocyt subpopulationer under förhållanden så nära physiological förhållanden som möjligt. Tidigare studier mätt monocyt glukostransportör uttryck och glukosupptag 17,18, men dessa metoder undersökte isolerade monocyter som kan ha förändrat proteinuttryck jämfört med fysiologiska betingelser 19, och ingen tidigare studie har undersökt humana monocyt subpopulationer. Med hjälp av multi-parametrisk flödescytometri, beskriver vi en metod för att undersöka glukostransportör uttryck och upptag av fluorescerande glukos analog 2-NBDG med totala monocyter och monocyt subpopulationer (baserat på CD14 och CD16 uttryck) inom hela omanipulerat blod.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: HIV-infekterade och HIV-infekterade patienter rekryterades från enheten infektionssjukdomar vid Alfred Hospital i Melbourne, VIC, Australien, och från det lokala samhället, respektive. Informerat samtycke erhölls från alla deltagare, och forskning godkändes av Forsknings- och etikkommittén Alfred Hospital.

1. glut1 cellytan Detection på monocyter och monocyt Subpopulationer

  1. Samla blod i citrat ACD-B antikoagulerande rör och börja experimenten i ett biologiskt säkerhetsskåp inom en timme av samlingen.
  2. Tillsätt 100 pl av blod till polypropylenrör. Tillsätt 2 ml 1x lyseringslösning (se Material tabell) till rör samtidigt på is, pipettering försiktigt för att blanda. Inkubera under 15 min på is. Centrifugera vid 220 x g under 5 min.
  3. Dekantera och tvätta två gånger genom att tillsätta ca 2-4 ml tvättlösning (0,5% BSA i 1 x PBS) och centrifugering vid 220 xg under 5 min.
  4. Använd ett rörtte att försiktigt ta bort så mycket av tvättlösningen som möjligt. Placera rören på is och återsuspendera i 100 pl tvättlösning.
  5. Att identifiera specifika monocyt- subpopulationer fläckar celler med följande volym av antikroppar per 100 mikroliter cellsuspension som framställts i steg 1,4: 5 pl anti-CD3-PE, 5 pl anti-CD14-APC, 5 pl anti-CD16-PECy7, 5 pl glut1 -FITC eller IgG2b-FITC (isotypkontroll rör).
  6. Placera på is under 30 minuter i mörker. Tvätta 2 gånger med tvättlösning. Fixa med 200-300 pl av 0,5% formaldehyd gjordes i 1 x PBS.
  7. Analysera på en flödescytometer kan detektera 4 färger inom 24 timmar inom följande excitation och emissionsvåglängd: FITC (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660) 10.

2. Glukos Upptag av monocyter

  1. Pipettera 90 pl blod samlas i steg 1,1 i polypropenrör. Tillsätt 10 pl av en 14,60 iM 2-NBDG arbetslösning till90 | il av blodet (1,46 mM slutlig koncentration) och stiletter försiktigt för att blanda. Det är kritiskt att begränsa 2-NBDG exponering för ljus genom att täcka rör med aluminiumfolie.
  2. Inkubera vid 37 ° C i mörker under 15-30 min och sedan placera omedelbart på is. Tillsätt 4 ml 1x FACS lyseringslösning till rören medan på is. Centrifugera vid 220 xg vid 4 ° C under 5 min.
  3. Tvätta en gång genom tillsats av 4 ml tvättlösning (0,5% BSA i 1 x PBS). Centrifugera vid 220 xg vid 4 ° C under 5 min. Dekantera och lägg på is.
  4. Stain celler med antikroppar: 5 pl anti-CD3-PE, 5 pl anti-CD14-APC och 5 pl anti-CD16-PECy7. Blanda och placera på is i 30 minuter i mörker.
    OBS: Under denna period ser till flödescytometern är klar för omedelbar analys. Förvärva celler inom följande excitation och emissionsvåglängd: 2-NBDG (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660).
  5. Tillsätt 4 ml iskall tvättbuffert (0,5% BSA i 1 x PBS) till rör.Tvätta en gång genom centrifugering vid 220 xg vid 4 ° C under 5 min. Dekantera och lägga 200-300 pl is gamla PBS och hålla på is i mörker (täckt med aluminiumfolie). Analysera på en flödescytometer inom 10 min med hjälp av excitation och emissionsvåglängdsinställningen som i steg 2,4.

3. Datainsamling och analys

OBS: Kunskap om flödescytometri och dataanalys förutsätts.

  1. Med hjälp av en flödescytometer kan åtminstone fyra-färg analys, med hjälp av ofärgade och individuellt färgade prover in ersättning.
    OBS: Singel färgning med användning av en FITC-märkt CD4 och CD14 kan användas för glut1 och 2-NBDG ersättning.
  2. Ställ upp och märka lämpliga fönster innan förvärva prover. Rita en grind runt monocyt befolkningen, och förvärva 100.000 till 300.000 händelser per prov vid medelhastighet. 50.000 händelser per prov ersättning är tillräcklig.
    OBS: Ersättning kan utföras före provförvärv eller i enskild cell analysprogram, enligt standardförfaranden.
  3. Exportera och spara data till en lämplig plats. Öppna enda cellanalys program som FlowJo eller annan analysmjukvara (Supplemental figur 1) och dra och släpp prover som anges (Supplemental figur 2).
  4. Dubbelklicka för att öppna filen (Supplemental Figur 3). Rita en cirkel till gate monocyter baserat på framåt och sidospridningsegenskaper som visas i figur 1A och Kompletterande Figur 4. Dubbelklicka på monocyt befolkningen. Observera och rita en ruta runt CD3 - populationen (Supplemental Figur 4).
  5. Dubbelklicka på CD3 - befolkningen. Att observera monocyt subpopulationer väljer CD14-APC på "x-axeln, och CD16-PECy7 om" y'- axeln, och märka i enlighet med (Supplemental figur 5).
  6. Om det inte finns någon tydligpositiva och negativa populationer, mäta uttrycket av glut1 eller 2-NBDG upptag i de specifika monocyt subpopulationer. Bestämma de genomsnittliga fluorescensintensiteterna (MFI) av glut1 och 2-NBDG genom subtraktion av isotyp och nr 2-NBDG bakgrund (Supplemental Figur 6).
  7. Där definierade populationer finns, använder IgG2b-FITC för att ställa in porten och bestämma procentuella positiva celler (Figur 3).
    OBS: Använd denna procedur för att analysera den totala CD14 + monocyter. Sedan två-NBDG upptag vanligtvis präglas av en förskjutning i fluorescensintensiteter data representeras bäst av MFI och histogram.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ersättning måste utföras för enskilda fluorokromer för att förhindra fluorescens spridningseffekter. Monocyter först berikas av grindning baserat på framåt och sidospridning. Tomterna presenteras är representanter för minst sex oberoende experiment som utförts på helblod från sex eller flera deltagare som tidigare rapporterats Figur 1A 10 visar den initiala grind av monocyter genom cellspridning och uteslutning av T-celler genom grind inom CD3 -. Befolkningen. Monocyter därefter gated för sig eller i kombination med CD16 för att identifiera totala monocyter eller monocyt subpopulationer CD14-uttryck som visas i figur 1B och figur 1C, respektive. För analys av monocyt subpopulationer bör följande nomenklatur användas som tidigare beskrivits 12: klassiska monocyter (CD14 ++ CD16 -) bör uttrycka ungefär 100 gånger högre CD14 MFI än isotypkontroll och CD16 MFI bör likna den isotypkontroll; mellanliggande monocyter (CD14 ++ CD16 +) bör uttrycka approximativt 100-faldigt större CD14 MFI än isotypkontroll och cirka 10-faldigt större CD16 MFI i jämförelse med isotypkontroll; icke-klassiska monocyter (CD14 + CD16 ++) bör ha liknande MFI för CD14 och isotypkontroll och cirka 100 gånger större CD16 MFI än isotypkontroll. Celler utan uttryck av CD14 och CD16 anses inte monocyter och bör inte ingå i grind. kan undersökas gated monocyter eller monocyt subpopulationer sedan för glukostransportör uttryck. Som visas i figur 2, kan observeras distinkta populationer av CD14 + glut1 + monocyter, framför allt i celler som erhållits från HIV + individer, där infektion kännetecknas av ett kroniskt tillstånd av inflammation. Liknande men sällsynt CD14 + glut1 + celler kan vara observed inom specifika monocyt grupper i HIV infekterade personer (Figur 3A), men är mer uttalad hos HIV + individer (Figur 3B). Anmärkningsvärt, i avsaknad av distinkta populationer, kan det vara lämpligt att representera resultaten som medel- eller median fluorescens intensiteter, som tar hänsyn till den ackumulerade ökningen i glut1 cellytan uttryck.

Glukosupptag kan bedömas genom att jämföra helblod inkuberas med 2-NBDG eller vehikelkontroll för gated monocyter eller monocyt subpopulationer. Vi tidigare visade att cirka 50% av monocyter var 2-NBDG positiv efter en 15 minuters inkubering 10. Detta upptag nivå medger detektering av två-NBDG utan att nå mättnad, när skillnader i monocyt 2-NBDG upptag kan inte längre existerar. Analys av två-NBDG upptag av monocyter från HIV oinfekterade och HIV + personer visade en högre upptag av celler från HIV + personer, somär i överensstämmelse med de glut1 expressionsdata (Figur 4-5). Sammantaget Dessa resultat visar att de analyser som beskrivs här kan användas för att potentiellt studera monocyt metaboliska aktiviteter i biologiska sammanhang som framkallar ett inflammatoriskt tillstånd som diabetes, hjärt-kärlsjukdomar, och virus- och bakterieinfektioner.

Figur 1
Figur 1:. Gating strategi som används för att analysera den totala monocyter och monocyt subpopulationer från representativa HIV och HIV + blodprov Prover av helblod analyserades med flödescytometri för monocyt cellytan glut1 uttryck inom en h från insamling. (A) Celler gated baserat på framåt och sidospridningsegenskaper och CD3 uttryck. (B) För att undersöka den totala monocyter, CD3 - cellerna sedan gated för CD14 uttryck. (C klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2:.. Analys av cellytan glut1 uttryck på den totala monocyter från representativa HIV och HIV + blodprov CD14 + monocyter från HIV-oinfekterade eller HIV-infekterade behandlingsnaiva personer färgades med FITC-märkt isotypisk kontroll eller glut1 antikropp Klicka här att se en större version av denna siffra.


Figur 3:. Analys av cellytan glut1 uttryck på monocyt subpopulationer från representativa HIV och HIV + blodprov monocyt subpopulationer färgades med FITC-märkt isotypkontroll eller glut1 antikropp för (A) HIV-oinfekterade eller (B) HIV-infekterade behandlingsnaiva blodprov. klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4:. Upptag av 2-NBDG med totala CD14 + monocyter från representativa HIV och HIV + blodprover Blod från HIV-oinfekterade eller HIV-infekterade behandlingsnaiva personer inkuberades med vehikel eller 2-NBDG vid en slutlig koncentration av1,46 | iM i 15 minuter innan tvätt och inkubation med cellytan antikroppar mot grind monocyter som beskrivs i Figur 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5:. Upptag av 2-NBDG genom monocyt subpopulationer från representativa HIV och HIV + helblodsprover Blod från HIV-oinfekterade eller HIV-infekterade behandlingsnaiva personer inkuberades med vehikel eller 2-NBDG vid en slutlig koncentration av 1,46 mM för 15 min före tvättning och inkubering med cellytan antikroppar mot grind monocyt populationer som beskrivs i Figur 1. klicka här för att se en större version av denna siffra.

together.within-page = "1"> Supp. Figur 1
Kompletterande Figur 1:. Workspace fönster för flödescytometri cellanalys programvara Klicka här för att se eller ladda ner tilläggs siffra.

Supp. figur 2
Kompletterande Figur 2. Prov data dras och släppas in i detta arbetsytan Klicka här för att se eller ladda ner tilläggs siffra.

55 / Supp_Figure_3_Double_Click_to_open_file_Small.jpg "/>
Kompletterande Figur 3: Prov i arbetsyta data 085 är dubbelklickats och ett andra fönster dök visar de tre stora cellpopulationer (lymfocyter, monocyter och neutrofiler) inom färskt prov helblod baserat på framåt (FSC) och sidospridning (SSC) . klicka här för att se eller ladda ner tilläggs siffra.

Supp. figur 4
Supplementär Figur 4: Monocyter grindas baserat på framåt (FSC) och sidospridning (SSC). Befolkningen dubbelklickats som förde upp ett nytt fönster. CD3 är vald på "x-axeln och CD3-negativa populationen (grind ut lymfocyter) var svald. Klicka här för att se eller ladda ner tilläggs siffra.

Supp. figur 5
Kompletterande Figur 5: CD3 - monocyter befolkningen dubbelklickats som förde upp ett nytt fönster där monocyt subpopulation kan definieras baserat på CD16 och CD14 uttryck. Klicka här för att se eller ladda ner tilläggs siffra.

Supp. figur 6
Kompletterande Figur 6: Monocyte subpopulationer väljs och glut1 cellytan uttryck (medelfluorescensintensitet: MFI) erhålls genom att välja "statistik" på histogrammet fönstret "betyder" från "lägga statistik" fönster, och välja glut1 från parametern "drop down menyn. klicka här för att se eller ladda ner tilläggs siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet som beskrivs här detaljer en enkel metod för att undersöka glukostransportör uttryck och fluorescerande glukos analog upptag av monocyter och monocyter subpopulationer i helblod. Genom att bedöma 2-NBDG upptag i helblod, tillåter denna teknik för förhållanden liknande dem in vivo. En tidigare studie undersökte 6-NBDG upptag i monocyter separerade från helblod genom densitetscentrifugering 17. Men denna studie undersöker inte monocyt subpopulationer och separation av monocyter från helblod kan potentiellt ändra uttrycket av vissa cellytemolekyler 19. Radioaktiva glukosspårämnen har också använts för att mäta monocyter glukosupptaget 20,21, men monocyter måste tidigare isolerade för denna metod och användning av radioaktivitet kräver betydande säkerhetsåtgärder. Vår protokoll använder rutin biosäkerhet rutiner och är minimalt manipulativ, vilket möjliggör för flödescytometrisk mätning av två-NBDGupptag av monocyter och monocyt subpopulationer härma in vivo-förhållanden.

2-NBDG in i glykolytiska vägen och har visat sig metaboliseras av celler till icke-fluorescerande molekyler 22. Därför är det viktigt att begränsa metabolism efter två-NBDG inkubation genom att hålla celler kylda vid 4 ° C. 6-NBDG är en annan fluorescerande glukos analog som kan användas, men det är mindre användbart eftersom det inte in i glykolytiska vägen och därför återspeglar inte bioenergetiska status av cellerna 23.

Om fluorokromer med överlappande spektra utnyttjas, blir ersättning kritisk för att förhindra fluorokrom spillover. I detta protokoll använder vi monocyter färgas individuellt med CD14 och CD16 för att ställa in kompensationsparametrar, men ersättning av cellytemarkörer kan också utföras med hjälp av ersättnings pärlor.

Granulocyter kan uttrycka CD16 men kan uteslutas genom grind utCD15-uttryckande celler. Men stränga grind av monocyter baserade på ljusspridning egenskaper kan begränsa antalet granulocyter inkluderas i analysen. Om en flödescytometer är en tillgänglig med fler kanaler kan granulocyt markör CD66b också användas för att utesluta granulocyter från analysen.

Den glut1 antikropp som används i denna studie binder till en cellyta epitop och därför inte binder till intracellulära glut1. En antikropp som binder till en intracellulär glut1 epitop kan användas för att mäta total glut1 monocyt uttryck, men celler skall permeabiliseras före färgning 10. Förutom monocyter, kan denna metod användas för att undersöka glukosupptag och metabolism i andra leukocyter som finns inom blod. Vi har noggrant undersökt T-cellupptag av 2-NBDG använder den här beskrivna metoden, och har också undersökt två-NBDG upptag av NK-celler 24. För framgångsrik detektering av glut1 uttryck och 2-NBDG upptag är det absolut nödvändigt att begränsaspår av röda blodkroppar lysbuffert genom att tvätta celler med överskott tvättbuffert enligt protokollet, och vi fann att FITC eller APC-märkt glut1 antikropp ge bättre signaler än PE eller PerCP konjugat. Vi har inte undersökt orsakerna till detta.

Eftersom cellerna är metaboliskt aktiva även vid låga temperaturer, är det kritiskt att efter 2-NBDG inkubation vid 37 ° C, att rör hålls direkt på is och centrifugering utfördes vid 4 ° C. I avsaknad stark 2-NBDG signal, kontrollera att rätt koncentration används, minska ljusexponering i rummet och biosäkerhet skåpet och täckrören med folie när så är lämpligt. Optimering kan krävas genom att inrätta ett tidsförlopp 2-NBDG upptag experiment för 5, 15, 20, 30, 60, och 90 minuter. Normalt bör optimala tiden vara 10-60 minuter, beroende på celltyper och deras aktiveringsstatus.

En stor begränsning med 2-NBDG upptag analysen är lätta sensitivity tillsammans med det faktum att den håller på att utnyttjas av cellerna. Således är det viktigt att begränsa antalet prover för att säkerställa att det sista provet analyseras inom 30 min av den första. En biologisk begränsning är att, även om frekvensen av glut1-uttryck nonclassical monocyter, och glut1 expression på nonclassical monocyter var signifikant större än klassiska monocyter, existerade inga skillnader i 2-NBDG upptagning mellan de två subpopulationer 10. Detta ökar möjligheten att andra gluts, såsom Glut3 och Glut4 uttryckt på monocyter kan vara inblandade i glukosmetabolism i olika miljöer sjukdoms. Det är också möjligt att aktiviteten hos glut1 också kan regleras posttranslationellt.

En stor fördel med vår flödescytometrisk glukosupptag protokoll över radioisotop märkning är möjligheten att kombinera tekniken med immunophenotypic analys för att identifiera och studera specifika subpopulationer av immunceller i small volym blod. Dessutom APC-konjugerad anti-glut1 kan appliceras för att samtidigt analysera glut1 cellyteexpression och 2-NBDG upptag. En förändring i glut1 uttryck på grund av två-NBDG upptag har inte tidigare visats, men denna möjlighet kan inte uteslutas.

Ökad glukosupptag och metabolism av immunceller är ett kännetecken för aktiverade T-celler och monocyter 25-27. Dessa celler kan aktiveras som svar på patogen infektion 28,29, och inflammatoriska signaler i tillstånd såsom autoimmuna sjukdomar som lupus 30-32, och fetma och diabetes 8,33. Ökad glukosmetabolismen krävs också för cancercellernas överlevnad, tillväxt och metastaser 34. Anmärkningsvärt, har metabolic dysreglering i immunceller vuxit fram som ett kännetecken för HIV-infektion, och är associerad med immunaktivering 24, inflammation 10, och smittsamhet av CD4 + T-celler 35-37. Därför,Denna metod kommer att vara av intresse för en bred målgrupp inklusive de med ett intresse för inflammatoriska medierade sjukdomar, cancer, infektionssjukdomar, immunologi och immunometabolism 38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Denna forskning har finansierats av den australiensiska Centre for HIV och Hepatit Virology Research (ACH 2) och en 2010 utvecklings bidrag (CNIHR) från University of Washington Center for AIDS Research (CFAR), en NIH finansierat program under tilldelning nummer AI027757 som stöds med följande NIH institut och Centers (NIAID, NCI, NIMH, NIDA, NICHD, NHLBI, NIA). CSP är en mottagare av CNIHR och ACH två bidrag. SMC är en mottagare av en National Health och Medical Research Council of Australia (NHMRC) Principal Research Fellowship. Författarna erkänner tacksamt bidrag till detta arbete av den viktorianska operativa Infrastruktur Support Program emot av Burnet Institute. Vi erkänner hjälp av Geza Paukovic och Eva Orlowski-Oliver från Amrep Flow Cytometry Core Facility för flödescytometri utbildning och teknisk rådgivning. Vi tackar Angus Morgan för media coaching och organisation av videoinspelning. vår tacksamhetJesse Masson och Jehad Abdulaziz K. Alzahrani för lab bistånd under videoinspelning. Vi tackar ansträngningar Dr David Simar vid Institutionen för medicinska vetenskaper, UNSW, Australien som erbjuder kritisk metodrådgivning. CSP vill tacka www.nice-consultants.com för grafiska samråd.

Författarnas BIDRAG:

CSP tänkt projektet utformas och utfört experiment, analyseras och tolkas data och skrev manus. JJA tolkade uppgifter och skrev manuskriptet. TRB skrev manuskriptet. JMM tolkade data gjorde kritiska intellektuella förslag, och granskade manuskriptet. SMC tolkade data gjorde kritiska intellektuella förslag och granskade manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes Greiner Bio-One GmbH 455094
5 ml sterile polypropylene tubes BD Biosciences 352063
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906
16% formaldehyde solution Electron Microscopy Science 15710
BD FACS lysing solution (10x) BD Biosciences 349202 Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4 °C)
anti-CD3-PE BD Biosciences 555340
anti CD14-APC BD Biosciences 555399
anti-CD16-PECy7 BD Biosciences 557744
anti-Glut1-FITC R & D Systems FAB1418F
IgG2b-FITC R & D Systems IC0041F
2-NBDG Life technologies N13195 Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4 °C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1x DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4 °C)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x) Life technologies 14190-144 To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4 °C)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat Rev Immunol. 11, 762-774 (2011).
  2. Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7, 77-86 (2010).
  3. Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and macrophages in cancer: development and functions. Cancer Microenviron. 6, 179-191 (2013).
  4. Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., Angelovich, T. A., Crowe, S. M., Palmer, C. S. Monocytes as regulators of inflammation and HIV-related comorbidities during cART. J Immunol Res. 2014, 569819 (2014).
  5. Palmer, C., Cherry, C. L., Sada-Ovalle, I. Glucose Metabolism in T Cells and Monocytes: New Perspectives in HIV Pathogenesis. EBioMedicine. (2016).
  6. Cheng, S. C., et al. mTOR- and HIF-1alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity. Science. 345, 1250684 (2014).
  7. Maratou, E., et al. Glucose transporter expression on the plasma membrane of resting and activated white blood cells. Eur J Clin Invest. 37, 282-290 (2007).
  8. Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages: glucose transporter 1 (GLUT1)-mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. J Biol Chem. 289, 7884-7896 (2014).
  9. Gonnella, R., et al. Kaposi sarcoma associated herpesvirus (KSHV) induces AKT hyperphosphorylation, bortezomib-resistance and GLUT-1 plasma membrane exposure in THP-1 monocytic cell line. J Exp Clin Cancer Res. 32, 79 (2013).
  10. Palmer, C. S., et al. Glucose transporter 1-expressing proinflammatory monocytes are elevated in combination antiretroviral therapy-treated and untreated HIV+ subjects. J Immunol. 193, 5595-5603 (2014).
  11. Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118, e16-e31 (2011).
  12. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116, e74-e80 (2010).
  13. Belge, K. U., et al. The proinflammatory CD14+CD16+DR++ monocytes are a major source of TNF. J Immunol. 168, 3536-3542 (2002).
  14. Frankenberger, M., Sternsdorf, T., Pechumer, H., Pforte, A., Ziegler-Heitbrock, H. W. Differential cytokine expression in human blood monocyte subpopulations: a polymerase chain reaction analysis. Blood. 87, 373-377 (1996).
  15. Ziegler-Heitbrock, L. The CD14+ CD16+ blood monocytes: their role in infection and inflammation. J Leukoc Biol. 81, 584-592 (2007).
  16. Ziegler-Heitbrock, L. Macrophages: Biology and Role in the Pathology of Diseases. Springer. 3-36 (2014).
  17. Dimitriadis, G., et al. Evaluation of glucose transport and its regulation by insulin in human monocytes using flow cytometry. Cytometry A. 64, 27-33 (2005).
  18. Fu, Y., Maianu, L., Melbert, B. R., Garvey, W. T. Facilitative glucose transporter gene expression in human lymphocytes, monocytes, and macrophages: a role for GLUT isoforms 1, 3, and 5 in the immune response and foam cell formation. Blood Cells Mol Dis. 32, 182-190 (2004).
  19. Stibenz, D., Buhrer, C. Down-regulation of L-selectin surface expression by various leukocyte isolation procedures. Scand J Immunol. 39, 59-63 (1994).
  20. Ahmed, N., Kansara, M., Berridge, M. V. Acute regulation of glucose transport in a monocyte-macrophage cell line: Glut-3 affinity for glucose is enhanced during the respiratory burst. Biochem J. 327 (Pt 2), 369-375 (1997).
  21. Cutfield, W. S., Luk, W., Skinner, S. J., Robinson, E. M. Impaired insulin-mediated glucose uptake in monocytes of short children with intrauterine growth retardation). Pediatr Diabetes. 1, 186-192 (2000).
  22. Yoshioka, K., et al. A novel fluorescent derivative of glucose applicable to the assessment of glucose uptake activity of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1289, 5-9 (1996).
  23. Speizer, L., Haugland, R., Kutchai, H. Asymmetric transport of a fluorescent glucose analogue by human erythrocytes. Biochim Biophys Acta. 815, 75-84 (1985).
  24. Palmer, C. S., et al. Increased glucose metabolic activity is associated with CD4+ T-cell activation and depletion during chronic HIV infection. AIDS. 28, 297-309 (2014).
  25. Palmer, C. S., Ostrowski, M., Balderson, B., Christian, N., Crowe, S. M. Glucose metabolism regulates T cell activation, differentiation, and functions. Frontiers in immunology. 6, (2015).
  26. Palmer, C. S., et al. Regulators of glucose metabolism in CD4 and CD8 T cells. International reviews of immunology. 1-12 (2015).
  27. Palmer, C. S., Crowe, S. M. How does monocyte metabolism impact inflammation and aging during chronic HIV infection? AIDS research and human retroviruses. 30, 335-336 (2014).
  28. McFadden, K., et al. Metabolic stress is a barrier to Epstein-Barr virus-mediated B-cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E782-E790 (2016).
  29. Gamelli, R. L., Liu, H., He, L. K., Hofmann, C. A. Augmentations of glucose uptake and glucose transporter-1 in macrophages following thermal injury and sepsis in mice. Journal of leukocyte biology. 59, 639-647 (1996).
  30. Yin, Y., et al. Glucose Oxidation Is Critical for CD4+ T Cell Activation in a Mouse Model of Systemic Lupus Erythematosus. Journal of immunology. 80-90 (2016).
  31. Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis research & therapy. 17, 29 (2015).
  32. Yin, Y., et al. Normalization of CD4+ T cell metabolism reverses lupus. Science translational medicine. 7, 274ra218 (2015).
  33. Barbera Betancourt, A., et al. Inhibition of Phosphoinositide 3-Kinase p110delta Does Not Affect T Cell Driven Development of Type 1 Diabetes Despite Significant Effects on Cytokine Production. PloS one. 11, e0146516 (2016).
  34. Barron, C. C., Bilan, P. J., Tsakiridis, T., Tsiani, E. Facilitative glucose transporters: Implications for cancer detection, prognosis and treatment. Metabolism: clinical and experimental. 65, 124-139 (2016).
  35. Hegedus, A., Kavanagh Williamson, M., Huthoff, H. HIV-1 pathogenicity and virion production are dependent on the metabolic phenotype of activated CD4+ T cells. Retrovirology. 11, 98 (2014).
  36. Taylor, H. E., et al. Phospholipase D1 Couples CD4+ T Cell Activation to c-Myc-Dependent Deoxyribonucleotide Pool Expansion and HIV-1 Replication. PLoS Pathog. 11, e1004864 (2015).
  37. Loisel-Meyer, S., et al. Glut1-mediated glucose transport regulates HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2549-2554 (2012).
  38. Palmer, C. S., et al. Emerging Role and Characterization of Immunometabolism: Relevance to HIV Pathogenesis, Serious Non-AIDS Events, and a Cure. J Immunol. 196, (11), 4437-4444 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics