En enkel Flowcytometriske metode for å måle glukoseopptak og Glukose Transporter Expression for Monocyttnivåene subpopulasjoner i fullblod

1Centre for Biomedical Research, Macfarlane Burnet Institute for Medical Research and Public Health, 2Department of Infectious Diseases, Monash University, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Melbourne, 4Department of Microbiology, The University of the West Indies, 5Division of Experimental Medicine, Department of Medicine, University of California, San Francisco, 6Department of Medicine, Monash University
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Palmer, C. S., Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., McCune, J. M., Crowe, S. M. A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood. J. Vis. Exp. (114), e54255, doi:10.3791/54255 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Monocytter er medfødte immunceller som kan aktiveres av patogener og betennelse forbundet med visse kroniske inflammatoriske sykdommer. Aktivering av monocytter induserer effektorfunksjoner og samtidig skifte fra oksidativ til glycolytic metabolisme som er ledsaget av økt glukosetransportør uttrykk. Denne økte glykolytisk metabolisme er også observert for trent immunitet av monocytter, en form for medfødt immunologisk hukommelse. Selv om in vitro-protokoller som undersøker glukosetransportør ekspresjon og glukoseopptak ved hjelp av monocytter er blitt beskrevet, har ingen vært undersøkt ved hjelp av multi-parametriske flowcytometri i fullblod. Vi beskriver en multiparametrisk flowcytometrisk protokoll for måling av fluorescerende glukoseanalogen 2-NBDG opptak i fullblod ved å totale monocytter og den klassiske (CD14 CD16 ++ -), intermediat (CD14 ++ CD16 +) og ikke-klassiske ( CD14 + CD16 ++) monocyttersubpopulasjoner. Denne fremgangsmåten kan brukes til å undersøke glukosetransportør ekspresjon og glukoseopptak for de totale monocytter og monocytt-subpopulasjoner i løpet av homeostase og inflammatorisk sykdom, og kan lett modifiseres for å undersøke glukoseopptak av andre leukocytter og leukocytt-subpopulasjoner i blod.

Introduction

Monocytter er en hovedkomponent av det humane medfødte immunsystem som er raskt mobiliseres til områder for infeksjon og inflammasjon 1. Aktivering av monocytter er kritisk for å begrense akutt skade av patogener og er også sentralt til patogenesen av en rekke kroniske sykdommer, blant annet aterosklerose 2, 3 kreft, HIV og 4,5.

Metabolismen av hvile og aktiverte monocytter skiller seg dramatisk, med hvile monocytter utnytte oksidativ metabolisme og aktiverte monocytter utnytte glycolytic metabolisme (dvs. gjæring av glukose til laktat) 6. Aktivering av monocytter induserer uttrykk for glukosetransportører som gjør det mulig for økt glukoseopptak for glycolytic metabolisme 7. Monocytt glukosetransportør 1 (Glut1) er en slik transportør oppregulert under aktivering, og dets ekspresjon har vist seg å føre til produksjon av proinflammatoriske cytokiner i vitro og i fettvev av overvektige mus åtte. Infeksjon av en monocyttisk cellelinje ved Kaposis sarkom assosiert herpesvirus fører til cellulær oppregulering av Glut1 9, og vi nylig viste at ved kronisk HIV-infeksjon en økt andel av Glut1-uttrykke monocytter er til stede under ubehandlet og antiviral kombinasjonsbehandling behandlet infeksjon 10. Samlet utgjør disse studiene viser at glukoseopptak og glycolytic metabolismen av monocytter er viktige aspekter av mange inflammatoriske sykdommer. Således, til en enkel fremgangsmåte måle monocytt- Glut1 ekspresjon og glukoseopptak i løpet av homeostase og inflammatorisk sykdom er sannsynlig å være til nytte for en lang rekke forskere.

Humane monocytter er heterogen, idet består av tre distinkte undergrupper som kan bli undersøkt ved differensiell ekspresjon av det celleoverflatemarkører CD14 og CD16 11,12. Klassiske monocytter uttrykker et høyt nivå av CD14, men uttrykker ikke CD16 (CD14 CD16 ++ -), mellomliggende monocytter uttrykker et høyt nivå av CD14 og et mellomliggende nivå av CD16 (CD14 + CD16 ++), og ikke-klassiske monocytter uttrykker et lavt nivå av CD14 og et høyt nivå av CD16 (CD14 + CD16 ++). Monocytter som uttrykker CD16 er betegnet CD16 + monocytter, som sammenlignet med CD16 - monocytter har høy ekspresjon av inflammatoriske cytokiner og evnen til mer effektivt å presentere antigener 13,14. Omtrent 10% av monocytter uttrykker CD16 under homeostase med høyere prosenter observert under betennelse 15. Monocytter subpopulasjoner er forbundet med visse sykdomstilstander og kan være nyttige biologiske markører for sykdom og sykdomsutvikling 16.

Vårt mål var å identifisere en metode som kan måle glukosetransportør uttrykk og glukoseopptak av humane monocytter og monocytter subpopulasjoner i forhold så nær grafisiological betingelser som mulig. Tidligere studier målt monocytter glukosetransportør uttrykk og glukoseopptak 17,18, selv om disse metodene undersøkt isolerte monocytter som kan ha endret protein uttrykk i forhold til fysiologiske forhold 19, og ingen tidligere studie har undersøkt menneskelige monocytter subpopulasjoner. Ved hjelp av multi-parametrisk flowcytometri, beskriver vi en metode for å undersøke glukosetransportør uttrykk og opptak av fluorescerende glukoseanalogen 2-NBDG av totalt monocytter og monocytter subpopulasjoner (basert på CD14 og CD16 uttrykk) i hele umanipulerte blod.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: HIV-smittet og HIV-infiserte pasienter ble rekruttert fra Infectious Diseases Unit ved The Alfred Hospital i Melbourne, VIC, Australia, og fra lokalsamfunnet, henholdsvis. Informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne, og forskningen ble godkjent av The Alfred Hospital Research and Ethics Committee.

1. Glut1 Cell Surface Detection på monocytter og Monocyttnivåene subpopulasjoner

  1. Samle blod i citrate ACD-B antikoagulerende rør og begynne eksperimentene i et biologisk sikkerhetskabinett innen 1 time av samlingen.
  2. Tilsett 100 ul blod til polypropylenrør. Tilsett 2 ml 1x lyserende løsning (se Materialer tabell) til rør mens på is, pipettering forsiktig for å blande. Inkuber i 15 minutter på is. Sentrifuger ved 220 xg i 5 minutter.
  3. Dekanter og vask to ganger ved tilsetning av ca. 2-4 ml vaskeoppløsning (0,5% BSA i 1 x PBS) og sentrifugering ved 220 xg i 5 minutter.
  4. Bruk et rørTTE å forsiktig fjerne så mye av vaskeløsningen som mulig. Plasser rørene på is, og re-suspendere i 100 ul vaskeløsning.
  5. For å identifisere spesifikke monocytt subpopulasjoner flekker celler med følgende volum av antistoffer per 100 mL cellesuspensjon utarbeidet i trinn 1.4: 5 ul anti-CD3-PE, 5 pl anti-CD14-APC, 5 pl anti-CD16-PECy7, 5 pl Glut1 -FITC eller IgG2b-FITC (isotypekontrollantistoff tube).
  6. Plasser på is i 30 min i mørket. Vask 2 ganger med vaskeløsning. Fest med 200-300 pl av 0,5% formaldehyd tatt opp i 1 x PBS.
  7. Analyser på et flowcytometer stand til å oppdage 4 farger innen 24 timer innenfor følgende eksitasjon og emisjon bølgelengde: FITC (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660) 10.

2. glukoseopptak ved Monocytter

  1. Pipetter 90 ul blod oppsamlet i trinn 1,1 i polypropylenrør. Tilsett 10 mL av en 14,60 mM 2-NBDG arbeidsløsning til90 mL av blod (1,46 mM sluttkonsentrasjon) og flick forsiktig for å blande. Det er viktig å begrense 2-NBDG eksponering for lys ved å dekke rør med aluminiumsfolie.
  2. Inkuber ved 37 ° C i mørket i 15-30 min og deretter umiddelbart plassere på is. Tilsett 4 ml 1x FACS lyserende løsning til rør mens på is. Sentrifuger ved 220 xg ved 4 ° C i 5 minutter.
  3. Vask en gang ved tilsetning av 4 ml vaskeoppløsning (0,5% BSA i 1 x PBS). Sentrifuger ved 220 xg ved 4 ° C i 5 minutter. Dekanter og legg på is.
  4. Flekke celler med antistoffer: 5 mL anti-CD3-PE, 5 pl anti-CD14-APC og 5 mL anti-CD16-PECy7. Bland og legg på is i 30 min i mørket.
    MERK: I denne perioden må du kontrollere flowcytometeret er klar for umiddelbar analyse. Erverve celler i følgende eksitasjon og emisjon bølgelengde: 2-NBDG (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660).
  5. Tilsett 4 ml iskald vaskebuffer (0,5% BSA i 1 x PBS) til rør.Vask en gang ved sentrifugering ved 220 x g ved 4 ° C i 5 minutter. Dekanter og legge 200-300 mL av is gammel PBS og holde på is i mørket (dekket med aluminiumsfolie). Analyser på et strømningscytometer i løpet av 10 minutter ved hjelp av eksitasjon og setting emisjonsbølgelengden som i trinn 2.4.

3. Datainnsamling og analyse

MERK: Kunnskap om flowcytometri og dataanalyse er antatt.

  1. Ved hjelp av en flowcytometer kapasitet på minst fire-farge analyse, satt kompensasjon ved hjelp ufargede og individuelt farget prøver.
    MERK: En farging ved hjelp av et FITC-merket CD4 og CD14 kan brukes for Glut1 og 2-NBDG kompensasjon.
  2. Sett opp og merke riktige vinduene før du henter prøver. Tegn en gate rundt monocytt befolkningen, og skaffe 100 000 til 300 000 hendelser per prøve på middels hastighet. 50.000 hendelser per kompensasjon prøven er tilstrekkelig.
    MERK: Erstatning kan gjennomføres før prøveoppkjøp eller i enkelt celle analyse programvare, etter standard prosedyrer.
  3. Eksport og lagre data i et egnet sted. Åpne opp enkelt celle analyse programvare som FlowJo eller annen programvare for analyse (Supplemental Figur 1) og dra og slipp prøver som spesifisert (Supplemental Figur 2).
  4. Dobbeltklikk for å åpne filen (Supplemental Figur 3). Tegn en sirkel for å gate monocytter basert på fremover og side scatter egenskaper som vist i figur 1A og Supplemental Figur 4. Dobbeltklikk på monocytt befolkningen. Observere og tegne en boks rundt CD3 - befolkningen (Supplemental Figur 4).
  5. Dobbeltklikk på CD3 - befolkningen. Å observere monocytter subpopulasjoner velge CD14-APC på 'x-aksen, og CD16-PECy7 på' y'- aksen, og etiketten deretter (Supplemental Figur 5).
  6. Der det er ingen tydeligpositive og negative populasjoner, måle uttrykket av Glut1 eller to-NBDG opptaket i de spesifikke monocytter subpopulasjoner. Bestemme middel fluorescensstyrkene (MFI) av Glut1 og 2-NBDG ved å subtrahere isotype og ingen 2-NBDG bakgrunn (Supplemental figur 6).
  7. Hvor definerte populasjoner finnes, bruker IgG2b-FITC å sette porten, og bestemme prosent positive celler (figur 3).
    MERK: Bruk denne prosedyren til å analysere totale CD14 + monocytter. Siden 2-NBDG opptak er vanligvis preget av et skifte i fluorescensstyrkene dataene er best representert ved MFI og histogrammer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kompensasjon må utføres for enkelte fluorokromer å hindre fluorescenslekkasjer. Monocytter er først beriket av gating basert på fremover og sidespredning. Tomtene som presenteres er representanter for minst seks uavhengige eksperimenter utført på fullblod fra seks eller flere deltakere som tidligere rapportert 10 Figur 1A viser innledende gating av monocytter på cellen scatter og utelukkelse av T-celler ved gating innenfor CD3 -. Befolkningen. Monocytter blir deretter gated for CD14 ekspresjon alene eller i kombinasjon med CD16 for å identifisere de totale monocytter eller monocytter subpopulasjoner som vist i figur 1B og figur 1C, respektivt. For analyse av monocytt subpopulasjoner, bør den følgende nomenklatur bli anvendt som tidligere beskrevet 12: klassiske monocytter (CD14 CD16 ++ -) skal uttrykke omtrent 100 ganger høyere CD14 MFI enn isotypekontroll og CD16 MFI bør være lik den isotype kontroll; mellomliggende monocytter (CD14 CD16 + ++) skal uttrykke omtrent 100 ganger høyere CD14 MFI enn isotypekontroll og omtrent 10 ganger høyere MFI CD16 sammenlignet med isotype kontroll; ikke-klassiske monocytter (CD14 + CD16 ++) bør ha lignende MFI for CD14 og isotypekontroll og omtrent 100 ganger høyere CD16 MFI enn isotypekontroll. Celler uten uttrykk for CD14 og CD16 er ikke ansett monocytter og skal ikke inngå i gating. Lukket monocytter eller monocytter subpopulasjoner kan deretter undersøkes for glukosetransportør uttrykk. Som indikert i figur 2, kan distinkte populasjoner av CD14 + Glut1 + monocytter observeres, spesielt i celler oppnådd fra HIV + individer, hvor infeksjonen er karakterisert ved en kronisk tilstand av inflammasjon. Lignende, men sjelden CD14 + Glut1 + celler kan være observed innenfor bestemte monocytter undergrupper i HIV-infiserte personer (figur 3A), men er mer uttalt hos HIV + individer (Figur 3B). Verdt å merke seg, i fravær av distinkte populasjoner kan det være hensiktsmessig å representere resultatene i midlere eller median florescence intensiteter, som tar hensyn til den kumulative økning i Glut1 celleoverflate-ekspresjon.

Glukoseopptak kan vurderes ved å sammenligne fullblod inkubert med 2-NBDG eller bærerkontroll for gated monocytter eller monocytter subpopulasjoner. Vi har tidligere vist at ca. 50% av monocytter ble 2-NBDG positiv etter en 15 minutters inkubasjon 10. Dette opptaket nivå åpner for påvisning av to-NBDG uten å nå metning når forskjeller i monocytt 2-NBDG opptak kan ikke lenger eksisterer. Analyse av to-NBDG opptak av monocytter fra HIV ikke-infiserte og HIV + personer avslørte et høyere opptak av celler fra HIV + personer, hvilkener i overensstemmelse med Glut1 ekspresjonsdata (figur 4-5). Samlet viser disse resultater illustrerer at analysene beskrevet her kan anvendes for å studere potensielt monocytt metabolske aktiviteter i biologiske sammenhenger som utløser en inflammatorisk tilstand, slik som diabetes, kardiovaskulære sykdommer og virale og bakterielle infeksjoner.

Figur 1
Fig. 1: Avblending strategi som brukes for å analysere de totale monocytter og monocytt-subpopulasjoner fra representative HIV HIV + og blodprøver Prøver av helt blod ble analysert ved strømningscytometri for monocytt- celleoverflate Glut1 ekspresjon innen en time fra samlingen. (A) Celler ble gated basert på termin og side scatter egenskaper og CD3 uttrykk. (B) For å undersøke totale monocytter, CD3 - Cellene ble deretter gated for CD14 ekspresjon. (C klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2:.. Analyse av celleoverflaten Glut1 uttrykk på total monocytter fra representant HIV og HIV + blodprøver CD14 + monocytter fra HIV-infisert eller HIV-smittet behandling naive personer ble farget med FITC-merket isotypekontrollantistoff eller Glut1 antistoff Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


Fig. 3: Analyse av celleoverflate Glut1 ekspresjon på monocytt subpopulasjoner fra representative HIV og HIV + blodprøver Monocyttnivåene subpopulasjoner ble farget med FITC-merket isotype kontroll eller Glut1-antistoff for (A) HIV-ikke-infiserte eller (b) HIV-infiserte behandlingsnaive blodprøver. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4:. Opptak av 2-NBDG av totale CD14 + monocytter fra representative HIV HIV + og blodprøver i blod fra HIV-infiserte eller HIV-infiserte behandlingsnaive personer ble inkubert med bærer eller 2-NBDG ved en sluttkonsentrasjon på1,46 mikrometer i 15 minutter før vask og ruger med celleoverflate antistoffer mot gate monocytter, som beskrevet i Figur 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5:. Opptak av 2-NBDG av monocytt-subpopulasjoner fra representative HIV og HIV + helblodprøver blod fra HIV-infiserte eller HIV-infiserte behandlingsnaive personer ble inkubert med bærer eller 2-NBDG ved en sluttkonsentrasjon på 1,46 mM til 15 min før vask og ruger med celleoverflate antistoffer mot gate monocytter subpopulasjoner som beskrevet i figur 1. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

together.within-page = "1"> Supp. Figur 1
Supplemental Figur 1:. Arbeidsområde vindu for flowcytometri celle analyse programvare Klikk her for å se eller laste ned denne tilleggs figuren.

Supp. Figur 2
Supplemental Figur 2:. Eksempeldata blir dras og slippes inn i dette arbeidsområdet Klikk her for å se eller laste ned denne tilleggs figuren.

55 / Supp_Figure_3_Double_Click_to_open_file_Small.jpg "/>
Supplemental Figur 3: Prøver i arbeidsområdet, data 085 er dobbelt klikket, og et annet vindu dukket opp som viser de tre store cellepopulasjoner (lymfocytter, monocytter og nøytrofile) innenfor fersk hel blodprøve basert på fremover (FSC) og side scatter (SSC) . klikk her for å se eller laste ned denne tilleggs figuren.

Supp. Figur 4
Supplemental Figur 4: Monocytter er gated basert på fremover (FSC) og side scatter (SSC). Befolkningen ble dobbeltklikket som tok opp et nytt vindu. CD3 er valgt på 'x-aksen og CD3-negativ befolknings (gating ut lymfocytter) ble svalgt. Klikk her for å se eller laste ned denne tilleggs figuren.

Supp. Figur 5
Supplemental Figur 5: CD3 - monocytter befolkningen ble dobbeltklikket som brakte opp et nytt vindu der monocytter undergruppe kunne defineres basert på CD16 og CD14 uttrykk. Klikk her for å se eller laste ned denne tilleggs figuren.

Supp. Figur 6
Supplemental Figur 6: Monocyte subpopulasjoner er valgt, og Glut1 celleoverflaten uttrykk (gjennomsnittlig fluorescens intensitet: MFI) oppnås ved å velge 'statistikk' på histogrammet vinduet, "mener" fra "legge statistikken 'vinduet, og velge Glut1 fra" parameteren "drop down menyen. klikk her for å se eller laste ned denne tilleggs figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen er beskrevet her detaljer en enkel metode for å undersøke glukosetransportør ekspresjon og fluoriserende analog glukoseopptak av monocytt og monocytt subpopulasjoner i helblod. Ved å vurdere 2-NBDG opptak i fullblod, kan denne teknikken for forhold som ligner de som in vivo. En tidligere studie undersøkte 6-NBDG opptak i monocytter separert fra fullblod ved sentrifugering tetthet 17. Men denne studien ikke undersøke monocytt subpopulasjoner og separering av monocytter fra helblod potensielt kan forandre ekspresjonen av visse celleoverflatemolekyler 19. Radioaktive tracere glukose har også blitt brukt til å måle monocytt- opptak av glukose 20,21, men monocytter må først isoleres for denne fremgangsmåte og bruken av radioaktivitet krever betydelige sikkerhetsforanstaltninger. Vår protokollen bruker rutine biologisk prosedyrer og er minimalt manipulerende, og dermed gir for flowcytometrisk måling av to-NBDGopptak av monocytter og monocytter subpopulasjoner ligne in vivo forhold.

2-NBDG kommer inn i glykolysen og er blitt vist å bli metabolisert av celler til ikke-fluorescerende molekyler 22. Derfor er det viktig å begrense forbrenningen etter to-NBDG inkubasjon ved å holde cellene kjølt ved 4 ° C. 6-NBDG er en annen fluorescerende glukoseanalogen som kan brukes, men det er mindre nyttig som det ikke kommer inn i glykolysen og derfor ikke nøyaktig gjenspeiler bioenergetisk status av cellene 23.

Hvis fluorokromer med overlappende spektra blir benyttet, blir kompensasjonen kritisk for å forhindre fluorokrom spillover. I denne protokollen bruker vi monocytter farget individuelt med CD14 og CD16 å sette kompensasjon parametere, men kompensasjon av celleoverflatemarkører kan også utføres ved hjelp av kompensasjon perler.

Granulocytter kan uttrykke CD16 men kan utelukkes ved gating utCD15-uttrykke celler. Men strenge gating av monocytter basert på lette scatter egenskaper kan begrense antall granulocytter inkludert i analysen. Hvis et strømningscytometer er et tilgjengelig med flere kanaler, kan den granulocytt markør CD66b også brukes til å ekskludere granulocytter fra analysen.

Den Glut1 antistoffet anvendt i denne studien binder til en celleoverflate-epitop og derfor ikke binder seg til intracellulært Glut1. Et antistoff som binder til et intracellulært Glut1 epitop kan brukes til å måle total Glut1 monocyt ekspresjon, men cellene må være permeabilisert før farging 10. I tillegg til monocytter, kan denne teknikken bli anvendt for å undersøke glukoseopptak og metabolisme i andre leukocytter innenfor blod. Vi har i stor utstrekning kontrollert T-celle-opptak av to-NBDG ved å bruke metoden som er beskrevet her, og har også undersøkt 2-NBDG opptak ved hjelp av NK-celler 24. For vellykket påvisning av Glut1 uttrykk og 2-NBDG opptak er det viktig å begrensespor av røde blodcellelyse buffer ved å vaske cellene med overflødig vaskebuffer i henhold til protokollen, og vi fant ut at FITC eller APC-merket Glut1 antistoff gi bedre signaler enn PE eller PerCP konjugater. Vi har ikke undersøkt årsakene til dette.

Siden cellene er metabolsk aktiv selv ved lave temperaturer, er det avgjørende at etter to-NBDG inkubering ved 37 ° C, at rørene holdes direkte på is og sentrifugering utført ved 4 ° C. I fravær sterk to-NBDG signal, kontroller at riktig konsentrasjon blir brukt, redusere lyseksponering i rommet og biosikkerhet skap og dekker rør med folie når det passer. Optimalisering kan være nødvendig ved å sette opp et tidsforløp 2-NBDG opptak eksperiment for 5, 15, 20, 30, 60, og 90 min. Vanligvis bør optimale tid være 10-60 min, avhengig av celletyper og deres aktiveringstilstand.

En viktig begrensning med 2-NBDG opptaksanalyse er lette sensitivity sammen med det faktum at det blir utnyttet av cellene. Derfor er det viktig å begrense det antall prøver for å sikre at den siste prøven analyseres i løpet av 30 min fra den første. En biologisk begrensning er at selv om frekvensen av Glut1-uttrykkende nonclassical monocytter, og Glut1 uttrykk på nonclassical monocytter var signifikant større enn klassiske monocytter, ingen forskjeller eksisterte i 2-NBDG opptak mellom de to subpopulasjoner 10. Dette øker muligheten for at andre gluts, slik som Glut3 og GLUT4 uttrykt på monocytter kan være involvert i glukosemetabolisme i forskjellige sykdoms innstillinger. Det er også mulig at aktiviteten til Glut1 kan også være regulert stolpe translatorisk.

En stor fordel ved vår strømningscytometrisk glukoseopptak protokollen over radioisotop merking er evnen til å kombinere teknikken med immunophenotypic analyse for å identifisere og studere spesifikke subpopulasjoner av immunceller i small volumet av blod. I tillegg APC-konjugert anti-Glut1 kan anvendes for samtidig å analysere Glut1 celleoverflate-ekspresjon og 2-NBDG opptak. En endring i Glut1 uttrykk på grunn av to-NBDG opptak har ikke tidligere blitt påvist, men denne muligheten kan ikke utelukkes.

Økt glukoseopptak og metabolisme av immunceller er et kjennetegn på aktiverte T-celler og monocytter 25-27. Disse cellene kan bli aktivert i respons på patogen infeksjon 28,29, og inflammatoriske signaler i tilstander slik som autoimmunsykdommer som lupus 30-32, og fedme og diabetes 8,33. Økt glukosemetabolismen er også nødvendig for kreft celle overlevelse, vekst og metastase 34. Spesielt, har metabolske feilregulering i immunceller dukket opp som et kjennetegn på HIV-infeksjon, og er forbundet med aktivering av immunsystemet 24, betennelse 10 og smittsomhet av CD4 + T-celler 35-37. Derfor,denne metoden vil være av interesse for et mangfoldig publikum inkludert de med interesse for inflammatorisk medierte sykdommer, kreft, infeksjonssykdommer, immunologi og immunometabolism 38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Denne forskningen ble finansiert av den australske Senter for HIV og hepatitt Virology forskning (ACH 2) og en 2010 utviklingsstipend (CNIHR) fra University of Washington Senter for AIDS forskning (CFAR), en NIH finansiert program under award nummer AI027757 som støttes ved følgende NIH Institutes og Centers (NIAID, NCI, NIMH, NIDA, NICHD, NHLBI, NIA). CSP er en mottaker av CNIHR og ACH to stipend. SMC er en mottaker av et National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC) Principal stipend. Forfatterne ønsker å takke for bidraget til dette arbeidet av den viktorianske Operational Infrastructure Support Program mottatt av Burnet Institute. Vi erkjenner hjelp av Geza Paukovic og Eva Orlowski-Oliver fra AMREP flowcytometrisystemer Kjerne Facility for flowcytometri opplæring og teknisk rådgivning. Vi takker Angus Morgan for media coaching og organisering av video skyte. vår takknemlighetJesse Masson og Jehad Abdulaziz K. Alzahrani for lab assistanse under videoen skyte. Vi takker for innsatsen til Dr David Simar ved School of Medical Sciences, UNSW, Australia som tilbød kritisk metodiske råd. SSP vil takke www.nice-consultants.com for grafiske konsultasjoner.

Forfatter BIDRAG:

CSP unnfanget prosjektet, utviklet og gjennomført eksperimenter, analysert og tolket data, og skrev manuskriptet. JJA tolket data og skrev manuskriptet. TRB skrev manuskriptet. JMM tolket data, gjort kritiske intellektuelle forslag, og anmeldt manuskriptet. SMC tolket data, gjort kritiske intellektuelle forslag og anmeldt manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes Greiner Bio-One GmbH 455094
5 ml sterile polypropylene tubes BD Biosciences 352063
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906
16% formaldehyde solution Electron Microscopy Science 15710
BD FACS lysing solution (10x) BD Biosciences 349202 Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4 °C)
anti-CD3-PE BD Biosciences 555340
anti CD14-APC BD Biosciences 555399
anti-CD16-PECy7 BD Biosciences 557744
anti-Glut1-FITC R & D Systems FAB1418F
IgG2b-FITC R & D Systems IC0041F
2-NBDG Life technologies N13195 Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4 °C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1x DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4 °C)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x) Life technologies 14190-144 To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4 °C)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat Rev Immunol. 11, 762-774 (2011).
  2. Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7, 77-86 (2010).
  3. Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and macrophages in cancer: development and functions. Cancer Microenviron. 6, 179-191 (2013).
  4. Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., Angelovich, T. A., Crowe, S. M., Palmer, C. S. Monocytes as regulators of inflammation and HIV-related comorbidities during cART. J Immunol Res. 2014, 569819 (2014).
  5. Palmer, C., Cherry, C. L., Sada-Ovalle, I. Glucose Metabolism in T Cells and Monocytes: New Perspectives in HIV Pathogenesis. EBioMedicine. (2016).
  6. Cheng, S. C., et al. mTOR- and HIF-1alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity. Science. 345, 1250684 (2014).
  7. Maratou, E., et al. Glucose transporter expression on the plasma membrane of resting and activated white blood cells. Eur J Clin Invest. 37, 282-290 (2007).
  8. Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages: glucose transporter 1 (GLUT1)-mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. J Biol Chem. 289, 7884-7896 (2014).
  9. Gonnella, R., et al. Kaposi sarcoma associated herpesvirus (KSHV) induces AKT hyperphosphorylation, bortezomib-resistance and GLUT-1 plasma membrane exposure in THP-1 monocytic cell line. J Exp Clin Cancer Res. 32, 79 (2013).
  10. Palmer, C. S., et al. Glucose transporter 1-expressing proinflammatory monocytes are elevated in combination antiretroviral therapy-treated and untreated HIV+ subjects. J Immunol. 193, 5595-5603 (2014).
  11. Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118, e16-e31 (2011).
  12. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116, e74-e80 (2010).
  13. Belge, K. U., et al. The proinflammatory CD14+CD16+DR++ monocytes are a major source of TNF. J Immunol. 168, 3536-3542 (2002).
  14. Frankenberger, M., Sternsdorf, T., Pechumer, H., Pforte, A., Ziegler-Heitbrock, H. W. Differential cytokine expression in human blood monocyte subpopulations: a polymerase chain reaction analysis. Blood. 87, 373-377 (1996).
  15. Ziegler-Heitbrock, L. The CD14+ CD16+ blood monocytes: their role in infection and inflammation. J Leukoc Biol. 81, 584-592 (2007).
  16. Ziegler-Heitbrock, L. Macrophages: Biology and Role in the Pathology of Diseases. Springer. 3-36 (2014).
  17. Dimitriadis, G., et al. Evaluation of glucose transport and its regulation by insulin in human monocytes using flow cytometry. Cytometry A. 64, 27-33 (2005).
  18. Fu, Y., Maianu, L., Melbert, B. R., Garvey, W. T. Facilitative glucose transporter gene expression in human lymphocytes, monocytes, and macrophages: a role for GLUT isoforms 1, 3, and 5 in the immune response and foam cell formation. Blood Cells Mol Dis. 32, 182-190 (2004).
  19. Stibenz, D., Buhrer, C. Down-regulation of L-selectin surface expression by various leukocyte isolation procedures. Scand J Immunol. 39, 59-63 (1994).
  20. Ahmed, N., Kansara, M., Berridge, M. V. Acute regulation of glucose transport in a monocyte-macrophage cell line: Glut-3 affinity for glucose is enhanced during the respiratory burst. Biochem J. 327 (Pt 2), 369-375 (1997).
  21. Cutfield, W. S., Luk, W., Skinner, S. J., Robinson, E. M. Impaired insulin-mediated glucose uptake in monocytes of short children with intrauterine growth retardation). Pediatr Diabetes. 1, 186-192 (2000).
  22. Yoshioka, K., et al. A novel fluorescent derivative of glucose applicable to the assessment of glucose uptake activity of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1289, 5-9 (1996).
  23. Speizer, L., Haugland, R., Kutchai, H. Asymmetric transport of a fluorescent glucose analogue by human erythrocytes. Biochim Biophys Acta. 815, 75-84 (1985).
  24. Palmer, C. S., et al. Increased glucose metabolic activity is associated with CD4+ T-cell activation and depletion during chronic HIV infection. AIDS. 28, 297-309 (2014).
  25. Palmer, C. S., Ostrowski, M., Balderson, B., Christian, N., Crowe, S. M. Glucose metabolism regulates T cell activation, differentiation, and functions. Frontiers in immunology. 6, (2015).
  26. Palmer, C. S., et al. Regulators of glucose metabolism in CD4 and CD8 T cells. International reviews of immunology. 1-12 (2015).
  27. Palmer, C. S., Crowe, S. M. How does monocyte metabolism impact inflammation and aging during chronic HIV infection? AIDS research and human retroviruses. 30, 335-336 (2014).
  28. McFadden, K., et al. Metabolic stress is a barrier to Epstein-Barr virus-mediated B-cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E782-E790 (2016).
  29. Gamelli, R. L., Liu, H., He, L. K., Hofmann, C. A. Augmentations of glucose uptake and glucose transporter-1 in macrophages following thermal injury and sepsis in mice. Journal of leukocyte biology. 59, 639-647 (1996).
  30. Yin, Y., et al. Glucose Oxidation Is Critical for CD4+ T Cell Activation in a Mouse Model of Systemic Lupus Erythematosus. Journal of immunology. 80-90 (2016).
  31. Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis research & therapy. 17, 29 (2015).
  32. Yin, Y., et al. Normalization of CD4+ T cell metabolism reverses lupus. Science translational medicine. 7, 274ra218 (2015).
  33. Barbera Betancourt, A., et al. Inhibition of Phosphoinositide 3-Kinase p110delta Does Not Affect T Cell Driven Development of Type 1 Diabetes Despite Significant Effects on Cytokine Production. PloS one. 11, e0146516 (2016).
  34. Barron, C. C., Bilan, P. J., Tsakiridis, T., Tsiani, E. Facilitative glucose transporters: Implications for cancer detection, prognosis and treatment. Metabolism: clinical and experimental. 65, 124-139 (2016).
  35. Hegedus, A., Kavanagh Williamson, M., Huthoff, H. HIV-1 pathogenicity and virion production are dependent on the metabolic phenotype of activated CD4+ T cells. Retrovirology. 11, 98 (2014).
  36. Taylor, H. E., et al. Phospholipase D1 Couples CD4+ T Cell Activation to c-Myc-Dependent Deoxyribonucleotide Pool Expansion and HIV-1 Replication. PLoS Pathog. 11, e1004864 (2015).
  37. Loisel-Meyer, S., et al. Glut1-mediated glucose transport regulates HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2549-2554 (2012).
  38. Palmer, C. S., et al. Emerging Role and Characterization of Immunometabolism: Relevance to HIV Pathogenesis, Serious Non-AIDS Events, and a Cure. J Immunol. 196, (11), 4437-4444 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics