Une cytométrie en flux simple méthode pour mesurer l'absorption du glucose et de glucose Expression Transporter pour monocytes dans les sous-populations de sang total

Immunology and Infection

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Palmer, C. S., Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., McCune, J. M., Crowe, S. M. A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood. J. Vis. Exp. (114), e54255, doi:10.3791/54255 (2016).

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Abstract

Les monocytes sont des cellules immunitaires innées qui peuvent être activées par des agents pathogènes et l'inflammation associées à certaines maladies inflammatoires chroniques. L'activation des monocytes induit des fonctions effectrices et un déplacement concomitant de l'oxydation du métabolisme glycolytique qui est accompagnée par une expression accrue de glucose dans le transporteur. Ce métabolisme glycolytique augmentation est également observée pour l'immunité formé des monocytes, une forme de mémoire immunologique innée. Bien que les protocoles in vitro examinant l' expression du transporteur du glucose et de l' absorption du glucose par les monocytes ont été décrits, aucun n'a été examiné par un flux multi-paramétrique cytométrie sur sang total. Nous décrivons un protocole de cytométrie de flux multi-paramétrique pour la mesure de la fluorescence du glucose analogique à 2 NBDG l' absorption dans le sang total par les monocytes total et le classique (CD14 ++ CD16 -), intermédiaire (CD14 ++ CD16 +) et non classique ( cellules CD14 + CD16 ++) monocytesous-populations. Cette méthode peut être utilisée pour examiner l'expression du transporteur de glucose et l'absorption du glucose pour les monocytes totaux et les sous-populations de monocytes pendant homéostase et de la maladie inflammatoire, et peut être facilement modifié pour examiner l'absorption du glucose pour d'autres leucocytes et des sous- populations de leucocytes au sein du sang.

Introduction

Les monocytes sont un composant majeur du système immunitaire inné humain qui sont rapidement mobilisée vers les sites d'infection et d' inflammation 1. L' activation des monocytes est essentielle pour limiter les dommages aigus par des agents pathogènes et est également au centre de la pathogenèse de plusieurs maladies chroniques, y compris l' athérosclérose 2, le cancer 3, et le VIH 4,5.

Le métabolisme de repos et des monocytes activés diffère de façon spectaculaire, avec des monocytes au repos en utilisant le métabolisme oxydatif et les monocytes activés en utilisant le métabolisme glycolytique (ie, la fermentation du glucose en lactate) 6. L' activation des monocytes induit l' expression des transporteurs de glucose qui permet d'accroître l' absorption de glucose pour le métabolisme glycolytique 7. Monocyte transporteur de glucose 1 (Glut1) est un tel transporteur upregulated lors de l'activation et son expression a été démontré que conduire à la production de cytokines pro-inflammatoires dans vitro et dans le tissu adipeux des souris obèses 8. L' infection d'une lignée cellulaire monocytaire par Kaposi associé herpèsvirus conduit à une régulation positive cellulaire Glut1 9, et nous avons récemment montré qu'au cours de l' infection chronique par le VIH d' une augmentation du pourcentage de monocytes de Glut1 exprimant sont présents au cours de l' infection par le traitement traité par antirétroviraux non traitée et la combinaison 10. Pris ensemble, ces études montrent que l'absorption du glucose et du métabolisme glycolytique par les monocytes sont des aspects importants de nombreuses maladies inflammatoires. Ainsi, une méthode simple pour mesurer l'expression des monocytes Glut1 et l'absorption du glucose au cours de l'homéostasie et la maladie inflammatoire est susceptible d'être utile à un large éventail de chercheurs.

Les monocytes humains sont hétérogènes, étant constitué de trois sous - ensembles distincts qui peuvent être examinés par l' expression différentielle des marqueurs de la surface cellulaire CD14 et CD16 11,12. monocytes classiques expriment un niveau élevé de CD14, mais n'expriment CD16 (CD14 ++ CD16 -), monocytes intermédiaires expriment un niveau élevé de CD14 et un niveau intermédiaire de CD16 (CD14 ++ CD16 +) et non-classique monocytes expriment un faible niveau de CD14 et un niveau élevé de CD16 (CD14 + CD16 ++). Monocytes exprimant CD16 sont appelées CD16 +, des monocytes qui ont comparé au CD16 - les monocytes ont une forte expression de cytokines inflammatoires et de la capacité de manière plus efficace des antigènes présents 13,14. Environ 10% des monocytes expriment CD16 au cours de l' homéostasie avec des pourcentages plus élevés observés au cours de l' inflammation 15. Sous - populations de monocytes sont associés à certains états pathologiques et pourraient être des marqueurs biologiques utiles de la maladie et progression de la maladie 16.

Notre objectif était d'identifier une méthode qui permet de mesurer l'expression du transporteur de glucose et de l'absorption du glucose par les monocytes humains et des sous-populations de monocytes dans des conditions aussi proches phyconditions siologique que possible. Des études antérieures mesurées monocytes glucose expression du transporteur et de l' absorption du glucose 17,18, bien que ces méthodes examinées monocytes isolés qui peuvent avoir modifié l' expression des protéines par rapport à des conditions physiologiques 19, et aucune étude précédente a examiné les sous - populations de monocytes humains. En utilisant un écoulement multi-paramétrique cytométrie, nous décrivons une méthode pour étudier l'expression du transporteur de glucose et de l'absorption du glucose analogue fluorescent 2-NBDG par les monocytes totaux et les sous-populations de monocytes (basé sur l'expression de CD14 et CD16) dans le sang entier non manipulée.

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Protocol

NOTE: infectés par le VIH et les sujets séronégatifs ont été recrutés dans l'Unité des maladies infectieuses à l'Hôpital Alfred à Melbourne, VIC, Australie, et de la communauté locale, respectivement. Le consentement éclairé a été obtenu à partir de tous les participants, ainsi que la recherche a été approuvé par le Comité de la recherche et de l'éthique Alfred Hospital.

1. Glut1 Détection de surface cellulaire sur les monocytes et monocytes sous-populations

  1. Recueillir le sang dans des tubes anticoagulants ACD-B citrate et de commencer les expériences dans une enceinte de sécurité biologique dans les 1 h de collection.
  2. Ajouter 100 pi de sang dans des tubes en polypropylène. Ajouter 2 ml de solution 1x lyse (voir tableau des matériaux) à des tubes tandis que sur la glace, pipetage doucement pour mélanger. Incuber pendant 15 min sur la glace. Centrifuger à 220 g pendant 5 min.
  3. Décanter et laver deux fois par addition d'environ 2-4 ml de solution de lavage (0,5% de BSA dans du PBS 1X), et en centrifugeant à 220 g pendant 5 min.
  4. Utilisez un tuyauTTE pour enlever soigneusement autant de la solution de lavage que possible. Placer les tubes sur la glace et remettre en suspension dans 100 pi de solution de lavage.
  5. Pour identifier les sous-populations de monocytes spécifiques colorent les cellules avec le volume suivant d'anticorps par 100 ul de suspension cellulaire préparée à l'étape 1.4: 5 ul anti-CD3-PE, 5 ul anti-CD14-APC, 5 ul anti-CD16-PECy7, 5 pi Glut1 FITC ou IgG2b-FITC (tube de contrôle isotypique).
  6. Placer sur la glace pendant 30 min dans l'obscurité. Laver 2 fois avec une solution de lavage. Fixer avec 200-300 pi de 0,5% de formaldéhyde réalisés dans PBS 1x.
  7. Analyser sur un cytomètre en flux capable de détecter 4 couleurs dans les 24 heures au sein de l'excitation et l' émission de longueur d' onde suivantes: FITC (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660) 10.

2. l'absorption du glucose par les monocytes

  1. Pipette 90 ul de sang recueillies à l'étape 1.1 dans des tubes en polypropylène. Ajouter 10 ul d'une solution de travail de 14,60 pM 2 à NBDGles 90 ul de sang (1,46 mM de concentration finale) et flick doucement pour mélanger. Il est essentiel de limiter 2-NBDG exposition à la lumière, en recouvrant les tubes de papier d'aluminium.
  2. Incuber à 37 ° C dans l'obscurité pendant 15-30 min, puis placer immédiatement sur la glace. Ajouter 4 ml de FACS 1x solution à tubes lysants tandis que sur la glace. Centrifuger à 220 xg à 4 ° C pendant 5 min.
  3. Laver une fois en ajoutant 4 ml d'une solution de lavage (0,5% de BSA dans 1 x PBS). Centrifuger à 220 xg à 4 ° C pendant 5 min. Décanter et placer sur la glace.
  4. cellules Stain avec des anticorps: 5 ul anti-CD3-PE, 5 ul anti-CD14-APC et 5 pi anti-CD16-PECy7. Mélanger et placer sur de la glace pendant 30 minutes dans l'obscurité.
    NOTE: Au cours de cette période, assurez-vous que le flux est cytomètre prêt pour l'analyse immédiate. Acquérir des cellules dans la longueur d'onde d'excitation et d'émission suivantes: 2-NBDG (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660).
  5. Ajouter 4 ml de tampon de lavage à froid glace (0,5% de BSA dans PBS 1x) à tubes.Laver une fois par centrifugation à 220 xg à 4 ° C pendant 5 min. Décanter et ajouter 200-300 pi de vieille glace PBS et garder sur la glace dans l'obscurité (recouverts d'une feuille d'aluminium). Analyser un cytomètre à écoulement à moins de 10 min en utilisant l'excitation et le réglage d'émission de longueur d'onde comme dans l'étape 2.4.

Acquisition de données et analyse 3.

NOTE: Une connaissance de cytométrie en flux et l'analyse des données est supposé.

  1. L'utilisation d'un cytomètre de flux capable d'analyser au moins 4 couleurs, compensation en utilisant des échantillons non colorés et colorées individuellement.
    REMARQUE: coloration unique en utilisant un CD4 marqué au FITC et CD14 peut être utilisé pour Glut1 et de compensation 2-NBDG.
  2. Mettre en place et étiqueter les fenêtres appropriées avant d'acquérir des échantillons. Dessiner une grille autour de la population de monocytes, et d'acquérir 100.000 à 300.000 événements par échantillon au taux moyen. 50.000 événements par échantillon de rémunération est suffisante.
    NOTE: La compensation peut être effectuée avant de goûteracquisition ou logiciel unique d'analyse de cellules, en suivant les procédures standard.
  3. Exporter et enregistrer des données dans un endroit approprié. Ouvrez simple logiciel d'analyse de cellules telles que FlowJo ou un autre logiciel d'analyse (Figure 1 supplémentaire) et des échantillons de glisser-déposer comme indiqué (Figure supplémentaire 2).
  4. Double - cliquez pour ouvrir le fichier (figure supplémentaire 3). Tracez un cercle de monocytes basé sur l' avant et les propriétés de dispersion de côté comme le montre la Figure 1A et supplémentaire Figure 4 porte. Double cliquez sur la population de monocytes. Observer et dessiner une zone autour de la CD3 - population (figure supplémentaire 4).
  5. Double cliquez sur le CD3 - population. Pour observer les sous - populations de monocytes sélectionner CD14-APC sur le 'x' axe, et CD16-PECy7 sur le 'axe Y'-, et étiqueter en conséquence (figure supplémentaire 5).
  6. Là où il n'y a pas distinctepopulations positives et négatives, de mesurer l'expression de Glut 1 ou 2 NBDG absorption dans les sous-populations de monocytes spécifiques. Déterminer les intensités de fluorescence moyenne (IFM) de Glut 1 et 2 NBDG en soustrayant l'isotype et n ° 2 NBDG-fond (figure 6 Supplement).
  7. Lorsque les populations définies existent, utilisez le IgG2b-FITC pour régler la porte, et de déterminer les cellules positives de pourcentage (figure 3).
    REMARQUE: Utilisez cette procédure pour analyser CD14 + monocytes totales. Depuis le 2-NBDG absorption est généralement marquée par un changement de fluorescence intensités les données sont mieux représentées par des IMF et des histogrammes.

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Representative Results

La rémunération doit être effectuée pour fluorochromes individuels pour prévenir les fuites de fluorescence. Les monocytes sont d'abord enrichis par gating sur la base de l'avant et la diffusion latérale. Les parcelles présentées sont des représentants d'au moins six expériences indépendantes réalisées sur sang total de six participants ou plus comme précédemment rapporté 10 Figure 1A montre le déclenchement initial de monocytes par la dispersion des cellules et de l' exclusion des cellules T par gating dans le CD3 -. Population. Les monocytes sont ensuite déclenchés pour l' expression de CD14 seul ou en combinaison avec CD16 pour identifier les monocytes totaux ou des sous - populations de monocytes , comme illustré sur la figure 1B et figure 1C, respectivement. Pour l' analyse des sous - populations de monocytes, la nomenclature suivante doit être appliquée comme décrit précédemment 12: monocytes classiques (CD14 ++ CD16 -) doit exprimer environ 100 fois plus de CD14 MFI que le contrôle isotypique et CD16 MFI devrait être similaire au contrôle isotypique; monocytes intermédiaires (CD14 ++ CD16 +) devraient exprimer environ 100 fois plus grande que le CD14 MFI contrôle isotypique et environ 10 fois plus grande CD16 IMF par rapport au contrôle isotype; les monocytes non classiques (cellules CD14 + CD16 ++) doivent avoir la même MFI CD14 et le contrôle isotypique et environ 100 fois plus CD16 IFM que le témoin d'isotype. Les cellules sans expression de CD14 et CD16 ne sont pas considérés comme des monocytes et ne doivent pas être inclus dans gating. monocytes Gated ou sous-populations de monocytes peuvent alors être examinés pour l'expression du transporteur de glucose. Comme cela est indiqué sur la figure 2, les populations distinctes de cellules CD14 + Glut1 + monocytes peuvent être observées, en particulier dans les cellules obtenues à partir d' individus VIH +, où l' infection est caractérisée par un état ​​chronique de l' inflammation. Semblable mais rare CD14 + Glut1 cellules + peut être obsdé- laissées à l'intérieur des sous - ensembles spécifiques de monocytes du VIH des personnes non infectées (figure 3A), mais sont plus prononcés dans les individus VIH + (figure 3B). Il convient de noter, en l'absence de populations distinctes, il peut être approprié pour représenter les résultats sous forme de moyenne ou intensités médianes de florescence, qui prend en compte l'augmentation cumulative de Glut1 expression de surface cellulaire.

l'absorption du glucose peut être évaluée en comparant le sang total incubé avec 2 NBDG ou du véhicule pour les monocytes gated ou sous-populations de monocytes. Nous avons précédemment montré que environ 50% des monocytes étaient 2-NBDG positif après 15 minutes d' incubation 10. Ce niveau d'absorption permet la détection de 2-NBDG sans saturation atteint, lorsque les différences de monocytes 2-NBDG absorption ne peut plus exister. Analyse des 2-NBDG absorption par les monocytes du VIH et non infectés VIH + personnes a révélé une absorption plus élevée par les cellules de personnes séropositives, quiest en accord avec les données d'expression Glut1 (Figure 4-5). Dans l'ensemble, ces résultats montrent que les dosages décrits ici peuvent être utilisés pour étudier les activités potentiellement monocyte métaboliques dans des contextes biologiques qui provoquent un état inflammatoire comme le diabète, les maladies cardiovasculaires et les infections virales et bactériennes.

Figure 1
Figure 1:. Gating stratégie utilisée pour analyser les monocytes totaux et les sous - populations de monocytes du VIH représentatifs et des échantillons séropositifs dans le sang Des échantillons de sang total ont été analysés par cytométrie de flux pour l' expression de Glut1 de surface cellulaire monocytaire en 1 h de la collecte. (A) Les cellules ont été bloqués sur la base de l' avant et de dispersion latérale caractéristiques et expression CD3. (B) Pour examiner les monocytes totaux, CD3 - cellules ont ensuite été déclenchés pour l' expression de CD14. (C S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2:.. L' analyse de l' expression de Glut1 de surface cellulaire sur le total des monocytes du VIH représentatifs et des échantillons séropositifs dans le sang monocytes CD14 + à partir séronégatifs pour le VIH ou le traitement des personnes naïves ont été colorées avec un contrôle isotypique marqué au FITC ou l' anticorps Glut1 infectés par le VIH S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


Figure 3:. L' analyse de l' expression de Glut1 de surface cellulaire sur des sous - populations de monocytes provenant VIH- représentatifs et les échantillons + de VIH dans le sang des sous - populations de monocytes ont été colorées avec un contrôle isotypique marqué au FITC ou l' anticorps Glut1 pour (B) le traitement infectés par le VIH (A) séronégatifs ou naïves des échantillons de sang. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4:. Uptake de 2-NBDG par CD14 + au total monocytes du VIH représentatifs du VIH et des échantillons de sang + de sang provenant du traitement des personnes naïves séronégatifs ou séropositifs a été mis en incubation avec un véhicule ou 2 NBDG à une concentration finale de1,46 uM pendant 15 minutes avant le lavage et l' incubation avec des anticorps de surface cellulaire à grille monocytes comme décrit dans la figure 1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5:. L' absorption de 2-NBDG par les sous - populations de monocytes du représentant du VIH et VIH + des échantillons de sang de sang total provenant du traitement des personnes naïves séronégatifs ou séropositifs a été mis en incubation avec un véhicule ou 2 NBDG à une concentration finale de 1,46 mM pour 15 min avant le lavage et l' incubation avec des anticorps de surface cellulaire à porte des sous - populations de monocytes comme décrit dans la figure 1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

together.within-page = "1"> Supp. Figure 1
Figure 1 supplémentaire:. Fenêtre d'espace de travail pour cytométrie en flux logiciel d'analyse de cellules S'il vous plaît cliquer ici pour voir ou télécharger ce chiffre supplémentaire.

Supp. Figure 2
Figure supplémentaire 2:. Les données des échantillons sont glissés et déposés dans cet espace de travail S'il vous plaît cliquer ici pour voir ou télécharger ce chiffre supplémentaire.

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Figure supplémentaire 3: Les échantillons dans l' espace de travail, les données 085 est double - cliqué, et une seconde fenêtre est apparue montrant les trois principales populations de cellules (lymphocytes, monocytes et neutrophiles) dans le nouvel échantillon de sang total sur la base de l' avant (FSC) et de diffusion latérale (SSC) . S'il vous plaît cliquer ici pour voir ou télécharger ce chiffre supplémentaire.

Supp. Figure 4
Figure supplémentaire 4: monocytes sont gated basées sur l' avant (FSC) et de diffusion latérale (SSC). La population a été double-cliqué qui a fait monter une nouvelle fenêtre. CD3 est sélectionné sur le 'x' axe et CD3 négatif population (gating sur les lymphocytes) a été sélu. S'il vous plaît cliquer ici pour voir ou télécharger ce chiffre supplémentaire.

Supp. Figure 5
Figure supplémentaire 5: Le CD3 - population de monocytes a été double - cliqué qui a fait monter une nouvelle fenêtre où monocytes sous - population pourrait être définie sur la base de CD16 et de l' expression de CD14. S'il vous plaît cliquer ici pour voir ou télécharger ce chiffre supplémentaire.

Supp. Figure 6
Figure supplémentaire 6: Msous-populations onocyte sont sélectionnés, et l'expression de surface cellulaire Glut1 (intensité moyenne de fluorescence: MFI) est obtenue en sélectionnant «statistiques» sur la fenêtre de l'histogramme, «moyenne» de la «ajouter des statistiques" fenêtre, et en sélectionnant Glut1 du 'paramètre' drop down menu. S'il vous plaît , cliquez ici pour voir ou télécharger ce chiffre supplémentaire.

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Discussion

Le protocole décrit ici en détail une méthode simple pour étudier l'expression du transporteur de glucose et fluorescent absorption d'analogue du glucose par les monocytes et les sous-populations de monocytes dans le sang entier. En évaluant 2 NBDG l' absorption dans le sang entier, cette technique permet des conditions similaires à celles in vivo. Une précédente étude a examiné 6-NBDG absorption dans les monocytes séparés du sang total par la densité centrifugation 17. Cependant, cette étude n'a pas examiné les sous - populations de monocytes et la séparation des monocytes du sang total peut potentiellement modifier l' expression de certaines molécules de surface cellulaire 19. Les traceurs radioactifs de glucose ont également été utilisés pour mesurer monocytes absorption du glucose 20,21, mais monocytes doivent être préalablement isolé pour cette méthode et l' utilisation de la radioactivité exige des mesures de sécurité importantes. Notre protocole utilise les procédures de biosécurité de routine et est peu manipulatrice, permettant ainsi la mesure de la cytométrie de flux de 2-NBDGl'absorption par les monocytes et les sous-populations de monocytes mimant les conditions in vivo.

2-NBDG pénètre dans la voie glycolytique et a été montré être métabolisé par les cellules dans les molécules non fluorescentes 22. Par conséquent, il est essentiel de limiter le métabolisme après 2-NBDG incubation en gardant les cellules réfrigérées à 4 ° C. 6-NBDG est un autre analogue du glucose fluorescent qui peut être utilisé , mais il est moins utile , car elle ne pénètre pas dans la voie glycolytique et ne reflète donc pas avec précision l'état bioénergétique des cellules 23.

Si fluorochromes avec chevauchement des spectres sont utilisés, la compensation devient critique pour éviter des retombées fluorochrome. Dans ce protocole, nous utilisons les monocytes colorées individuellement avec CD14 et CD16 pour définir les paramètres de compensation, mais la rémunération des marqueurs de surface cellulaire peut également être effectuée en utilisant des billes de compensation.

Les granulocytes peuvent exprimer CD16 mais peuvent être exclus par gating outCD15 exprimant des cellules. Cependant, gating rigoureuse des monocytes basées sur les propriétés de diffusion de la lumière peut limiter le nombre de granulocytes inclus dans l'analyse. Si le débit est disponible avec un cytomètre à plusieurs canaux, le marqueur de granulocytes CD66b peut également être utilisé pour exclure de l'analyse des granulocytes.

L'anticorps Glut1 utilisée dans cette étude se lie à un épitope de surface cellulaire et par conséquent ne se lie pas à Glut1 intracellulaire. Un anticorps qui se lie à un épitope intracellulaire Glut1 peut être utilisé pour mesurer l' expression totale Glut1 monocytaire, mais les cellules doivent être perméabilisées avant la coloration 10. En outre, les monocytes, cette technique peut être utilisée pour examiner l'absorption du glucose et le métabolisme des autres leucocytes trouvés dans le sang. Nous avons étudié en détail l' absorption des lymphocytes T de 2-NBDG en utilisant le procédé décrit ici, et nous avons également examiné NBDG 2-absorption par les cellules NK 24. Pour la détection réussie d'expression Glut1 et 2-NBDG absorption, il est impératif de limitertraces de la mémoire tampon de lyse des globules rouges par lavage des cellules avec un tampon de lavage en excès selon le protocole, et nous avons constaté que FITC ou anticorps Glut1 APC marqués donnent de meilleurs signaux que PE ou PerCP conjugués. On n'a pas étudié les raisons pour cela.

Puisque les cellules sont métaboliquement actives, même à basses températures, il est essentiel que la suite de l'incubation de 2 à 37 NBDG ° C, que les tubes sont maintenus directement sur la glace et la centrifugation réalisée à 4 ° C. Dans le signal fort 2-NBDG absence, vérifier que la concentration correcte est utilisé, réduire l'exposition de la lumière dans la pièce et l'armoire et couverture tubes biosécurité avec du papier, le cas échéant. L'optimisation peut être exigée par la mise en place d'un cours de temps 2-NBDG expérience de fixation pour 5, 15, 20, 30, 60 et 90 min. En règle générale, le temps optimal devrait être 10-60 min, en fonction des types de cellules et de leur état d'activation.

Une limitation majeure avec le dosage absorption 2-NBDG est léger sensibilité ainsi que le fait qu'elle est utilisée par les cellules. Il est donc important de limiter le nombre d'échantillons pour s'assurer que le dernier échantillon est analysé dans les 30 minutes de la première. Une limitation biologique est que, même si la fréquence de Glut1 exprimant les monocytes non classiques, et l' expression sur les monocytes Glut1 non classiques étaient significativement plus grande que les monocytes classiques, aucune différence n'a existé dans NBDG 2-absorption entre les deux sous - populations 10. Cela soulève la possibilité que d'autres Gluts, comme GLUT3 et Glut4 exprimé sur les monocytes peuvent être impliqués dans le métabolisme du glucose dans des contextes différents de la maladie. Il est également possible que l'activité de Glut1 peut également être régulée après traductionnelle.

Un avantage majeur de notre cytométrie de flux de protocole de glucose d'absorption sur l'étiquetage des radioisotopes est la possibilité de combiner la technique de l'analyse immunophénotypique pour identifier et étudier les sous-populations spécifiques de cellules immunitaires dans small volume de sang. En outre, l'APC conjugué anti Glut1 peut être appliquée pour analyser simultanément Glut1 l'expression de surface cellulaire et le 2-NBDG absorption. Un changement dans l'expression Glut1 en raison de 2-NBDG absorption n'a pas été démontré précédemment, mais cette possibilité ne peut être exclue.

L' absorption accrue de glucose et le métabolisme par les cellules immunitaires est une caractéristique des cellules T et les monocytes activés 25-27. Ces cellules peuvent être activées en réponse à une infection par un agent pathogène 28,29 et les signaux inflammatoires , dans des conditions telles que les maladies auto - immunes comme le lupus 30-32 et l' obésité et le diabète 8,33. L' augmentation du métabolisme du glucose est également nécessaire pour la survie des cellules cancéreuses, la croissance et les métastases 34. Notamment, la dysrégulation métabolique dans les cellules immunitaires a émergé comme une caractéristique de l' infection à VIH, et est associée à l' activation immunitaire 24, l' inflammation 10, et l' infectivité des cellules T CD4 + 35-37. Donc,cette méthode sera d'intérêt pour un public diversifié , y compris ceux qui ont un intérêt pour les maladies médiées inflammatoires, le cancer, les maladies infectieuses, l' immunologie et immunometabolism 38.

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Acknowledgements

Cette recherche a été financée par le Centre australien pour le VIH et l' hépatite Virology Research (ACH 2) et une subvention de développement 2010 (CNIHR) de l'Université de Washington Center for AIDS Research (CFAR), un programme financé par le NIH sous le numéro attribution AI027757 qui est soutenu par le NIH Instituts suivants et les centres (NIAID, NCI, NIMH, NIDA, NICHD, NHLBI, NIA). CSP est un bénéficiaire de la CNIHR et ACH 2 subvention. SMC est récipiendaire d'un Conseil de recherche en santé et médicale nationale d'Australie (NHMRC) Principal Research Fellowship. Les auteurs remercient la contribution à ce travail du Programme opérationnel d'appui aux infrastructures victorienne reçue par l'Institut Burnet. Nous reconnaissons l'aide de Geza Paukovic et Eva Orlowski-Oliver de la Facilité AMREP cytométrie de flux de base pour cytométrie en flux de formation et des conseils techniques. Nous remercions Angus Morgan pour le coaching et l'organisation du tournage du clip média. Notre gratitudeJesse Masson et Jehad Abdulaziz K. Alzahrani d'assistance laboratoire pendant le tournage vidéo. Nous remercions les efforts du Dr David Simar à l'École des sciences médicales, UNSW, Australie qui ont offert des conseils méthodologiques critique. CSP tient à remercier www.nice-consultants.com des consultations graphiques.

CONTRIBUTION AUTEURS:

CSP a conçu le projet, conçu et mené des expériences, analysé et interprété les données, et a écrit le manuscrit. JJA interprété les données et a écrit le manuscrit. TRB a écrit le manuscrit. JMM interprété les données, a fait des suggestions intellectuelles critiques, et a examiné le manuscrit. SMC a interprété les données, a fait des suggestions intellectuelles critiques et a examiné le manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes Greiner Bio-One GmbH 455094
5 ml sterile polypropylene tubes BD Biosciences 352063
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906
16% formaldehyde solution Electron Microscopy Science 15710
BD FACS lysing solution (10x) BD Biosciences 349202 Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4 °C)
anti-CD3-PE BD Biosciences 555340
anti CD14-APC BD Biosciences 555399
anti-CD16-PECy7 BD Biosciences 557744
anti-Glut1-FITC R & D Systems FAB1418F
IgG2b-FITC R & D Systems IC0041F
2-NBDG Life technologies N13195 Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4 °C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1x DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4 °C)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x) Life technologies 14190-144 To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4 °C)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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