高度に精製された高密度リポタンパク質からのmiRNAのハイスループット分離のための高速かつ簡便法

Biology

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Summary

マイクロRNAは、重要な調節的役割を果たし、様々なヒト疾患のための新規治療標的として浮上しています。 miRNAが、高密度リポタンパク質に運ばれることが示されています。私たちは、急速にヒト血漿からのmiRNA解析に適した精製されたHDLを分離するために簡略化された方法を開発しました。

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Seneshaw, M., Mirshahi, F., Min, H. K., Asgharpour, A., Mirshahi, S., Daita, K., Boyett, S., Santhekadur, P. K., Fuchs, M., Sanyal, A. J. Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein. J. Vis. Exp. (113), e54257, doi:10.3791/54257 (2016).

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Abstract

Protocol

血液試料の1コレクション

  1. 肘前窩の著名な静脈の標準的な静脈穿刺によって、(他の抗凝固剤に比べていくつかの利点を持っている)、抗凝固剤エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含有する10ミリリットルのプラスチックチューブに末梢静脈血サンプルを断食収集します。
  2. 遠心卓上遠心機で4℃で20分間、1,600×gでの血液サンプルは、赤血球及びRNAの少量の遊離血漿を得ました。
  3. 順次、それぞれ残りの細胞破片を除去するためにWBCおよび血小板その後さらに15分を除去するために10分間、スイングバケットローター3,000 G(4℃)、上清を集めます。
  4. 製造指示に従って、室温で濃度計を用いてプラズマの密度を測定します。
    注:0.9%食塩水(D = 1.023グラム/ ml)の濃度の調整は、エキソソームの除去後で前の密度勾配超遠心分離に必要とされ得ます。
  5. プラズマから2.エキソソームの取り外し

    1. HDLと同様の密度を持つ循環エキソソームを削除し、miRNAの3の量的重要な供給源を表します。
      1. 4℃で30分間インキュベートした1ミリリットルプラズマに252μlのエキソソーム沈殿溶液を添加することによってこれを行います。エキソソームをペレット化し、4℃で1500グラムで30分間、混合物を遠心分離。
      2. HDL、密度勾配超遠心分離によるさらなる処理のためにポリカーボネート厚肉超遠心管に得られた上清の転送1 mlで単離する(下記参照)。

    3.密度勾配超遠心分離(図1)。

    1. HDLを区切るために、それぞれ、448811のx Gと8℃で動作し、固定角ローターで床の超遠心機を用いて3段階のプロセスを使用します。
    2. 各単離するための3つの異なる密度のソリューションを順次、新鮮なを準備します。
      1. オートクレーブし、蒸留水1000mlに、0.1グラムEDTA2Naと1ミリリットルの1NのNaOH:11.4グラムのNaCl(0.195モルのNaCl)を溶解することにより溶液A(VLDLの単離、D = 1.006グラム/ミリリットル)を準備します。その後、オートクレーブし、蒸留水の追加の3ミリリットルを追加します。
      2. 100ミリリットルの溶液A(塩化ナトリウム0.195モル、NaBrを2.44モル)に25.2グラムのNaBrを追加することによって、溶液B(LDLの単離、D = 1.182グラム/ミリリットル)を準備します。
      3. A液(塩化ナトリウム0.195モル、NaBrを7.7モル)の100mlで78.8グラムのNaBrを混合して溶液C(HDLの単離、D = 1.470グラム/ミリリットル)を準備します。濃度計を用いて、室温で適切な密度を確認してください。さらに使用するまで4℃ですべてのソリューションをしてください。

    VLDLの4.絶縁

    1. 血漿の1ミリリットル(平均密度= 1.023グラム/ミリリットル)6.5ミリリットルポリカーボネート厚肉超遠心管で脂肪レッド7Bのヌクレアーゼフリーの200μLを混ぜます。
    2. 次いで注意深く混合物の上に溶液Aを5ml層。必要に応じて、溶液AをTの上に付加的な脂肪レッド7Bを追加O各チューブの重量のバランスをとります。 、(減速 - 7) - 2時間(5加速度)のための遠心分離機。
      注:遠心分離中に、リポタンパク質は、それらの平衡密度領域でのバンドとして蓄積されます。
    3. ランの終わりに2層を観察します。 4℃でのトップ層とストアを表すVLDL画分の1.5ミリリットルを削除します。
    4. 最後に、LDLを含むチューブの底部からピペット転送4 mlで使用し、HDL、LDLの単離のための新たポリカーボネートチューブにアルブミンと脂肪酸画分。

    LDLの5分離

    1. それぞれ、LDLとHDL画分(セクション4)を含むチューブに溶液B及び100μlのヌクレアーゼ無脂肪レッド7Bの2ミリリットルを混ぜます。
    2. その後、3時間(加速9、減速7)のために遠心分離。その後、最上層を表すLDL画分の1.5ミリリットルを除去し、-80℃で4°Cまたは店でおきます。最後に、HDLを含むチューブの底から4ミリリットルを転送新しいポリカーボネートチューブに分画。

    HDLの6の単離

    1. それぞれ、HDL画分を含むチューブにソリューションC、100μlのヌクレアーゼ無脂肪レッド7Bと98%のβメルカプトエタノール15μlのの2ミリリットルを混ぜます。
    2. 3時間(加速9、減速7)のための遠心分離機。その後、最上層を表すHDL画分の2ミリリットルを除去し、-80℃で4℃で維持するか、ストアのいずれか。

    7.脱塩およびリポタンパク質画分の濃縮

    1. その後のアガロースゲル電気泳動およびPCRとの干渉を回避するために、製造業者の説明書によって記載されるように適切な分子量カットオフ(LDL / HDLためVLDLおよび10K管用3Kチューブ)で遠心分離フィルター装置を用いた密度勾配超遠心分離の間に加え、過剰な塩を除去します。
      1. 簡単に言えば、2.5ミリリットルを添加した後、冷PBS(137mMの塩化ナトリウム、2.7mMのKCL、8 mMののNa 2 HPO 4、2mMのKH 2 PO 4; pH7.4)にcentrifuGE全体VLDL画分を集め、中密度勾配超遠心分離に4℃でスイングバケットローターを用いて60分間。
      2. 30分ごとに10ミリリットルの氷冷PBSで2回LDL画分を脱塩。次に、HDL画分を脱塩するために二回13ミリリットルの氷冷PBSを使用してください。高いPBSの体積を、アガロースゲル電気泳動で移動度を向上させる必要があります。遠心分離後、リポタンパク質を含有する溶質を除去し、4℃で保持するか、-80℃で保存しました。

    8.アガロースゲル電気泳動

    1. 次のように製造業者の使用説明書の軽微な変更でキットを使用するリポタンパク質のアガロースゲル電気泳動をPerfrom。
      注:この手順はちょうど濃厚リポタンパクサンプルの品質と純度を評価することです。
      1. 簡潔には、密度勾配超遠心分離を用いて脱塩リポタンパク質画分の6μLを取得し、プレキャストリポタンパク質ゲル上にロードします。人間lipopを使用してくださいサイズ参考としてVLDL、LDLとHDLの基準をrotein。担当準備緩衝液を用いて60分間、100Vで、室温で電気泳動を行います。
      2. 10分間ゲルを乾燥した後、脂肪レッド7BでRTで10分間染色します。メタノール - 水75:25(v / v)の混合物中でゲル脱色し、5分間再度乾燥させます。

    9. RNA抽出および精製

    1. 血清/血漿中のmiRNAの単離及び精製キットを用いて精製したヒトHDLによりmiRNAの単離をPerfrom。
      1. 簡単に言えば、ボルテックスで混合し、次いで核タンパク質複合体とのRNaseの不活性化の完全な解離を確実にするために、室温で5分間インキュベートし、精製されたHDLの200μlに、RNA溶解試薬の1ミリリットルを追加します。
      2. (; 1.6×10 8コピー/μlのCEL-のmiR-39)の混合物に続いて合成線虫Caenorhabditis elegansのマイクロRNAの3.5μLをスパイク。その後、製造者の指示に従ってRNA抽出を行います。
    2. purificatiを実行します製造元の指示に従って溶出スピンカラムを用いて抽出-miRNAの上。 spectrophorometerで精製したHDLからのmiRNAの濃度を測定します。
      注:スピンカラムからのmiRNAの溶出は、RNaseフリー水を16μLを採用しました。

    10.逆転写(RT-PCR)

    1. HDLからmiRNAの100 ngのを分離する合成miRNA(CEL-のmiR-39)、逆転写キットを用い、製造業者の指示に従って20μlの反応容量中で逆転写でスパイク。
    2. テンプレートのmiRNA(NTC)がなく、逆転写酵素ミ​​ックス(NRT)することなく、適切なコントロールを実行します。

    11.リアルタイムPCR(QRT-PCR)

    1. cDNAの2希釈、10μlのPCRミックス、2μlのユニバーサルプライマー、miRNAのプライマー2μlのと4μlのRNaseフリー水:1の2μlので全量20μlにリアルタイムPCRをPerfrom。
    2. Reactiを実行します。15秒、55℃30秒間および30 s.ec 70℃での伸長相は三連で全ての反応をPerfrom 94℃の45サイクル、続いて15分間95℃で、96ウェルプレート中に。
    3. 次に、製造者の指示に従って、合成ハウスキーピング遺伝子に対して正規化した後、2-ΔΔCt法を用いて、miRNAのCalcuate相対量。

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Representative Results

エキソソームを除去した後に高密度リポタンパク質の単離
高度に精製されたHDLからのmiRNAを得るために、miRNA汚染7のソースを表すエキソソームを除去する必要があります。これは、市販のキットを用いて密度勾配超遠心分離の前に行われました。実用的な目的のために営利企業が開発した3段階の標準的な密度勾配超遠心分離プロトコルは( 図1)変更されました。このプロトコルは、54,000 rpmで3、8、9、および10までの遠心力で一般的に使用されるプロトコルよりも大幅に高速である14万回転の速度で固定角ローターで遠心分離を必要とします。で広く利用可能なT-1270ローターを採用します7万回転の最大の力は、遠心分離は、最初に遠心力に耐えることができなかったポリアロマー管を用いて行きました。管の崩壊を回避するために、ポリカーボネート管を首尾よく使用しました。遠心分離時間は、リポタンパク質の酸化および潜在的なmiRNAの劣化11のために重要です。したがって、8の合計から96時間までの範囲の複数の異なる遠心分離時間は、試験しました。さらに、遠心分離を行った温度は、それぞれ、遠心分離時間および力に基づいて調整しました。

高密度リポタンパク質画分の純度
単離された高密度リポタンパク質画分の純度をアガロースゲル電気泳動で確認した。 図2は、勾配超遠心分離によって単離されたHDL減算のための典型的な電気泳動の結果を示します。これは明らかに、HDLはVLDLの汚染を欠いていたことを示した、典型的なα-移動度を示します。 VLDLおよびLDL画分中の任意のα-移行リポタンパク質の不在はultracent中にHDLからの完全な回復を示していますrifugationステップ。 HDL画分は、しかしながら、リポタンパク質(LP(a))は12で汚染によるβ-モビリティのいくつかのトレースは、公知の電気泳動バンドパターンを示しました。

単離されたHDLからのLp(a)の撤廃
HDLで運ばmiRNAを研究することは、最高純度のHDLの単離を必要とします。 Lpとの干渉は、(a)は、HDLと潜在的にLDLに運ばれるmiRNAとHDLの交差汚染に貢献しています。 HDLのこの汚染を最小限に抑えるために、βメルカプトエタノール1015μlのは、最後の遠心分離工程( 図1)の間に溶液Cを加えました。 βメルカプトエタノールの添加は、HDL密度特性10を変更しないことが示されています。 図3に表示されるように、βメルカプトエタノールの添加は、Lpの(a)は、非常に効果的な除去と一致する任意のB移行リポタンパク質の非存在下で得られました。

FO:HDLからのmiRNAのキープtogether.withinページ= "1"> 精製
miRNAの単離は、最初に、一般的に、血液からのRNA抽出のために使用される溶解試薬を用いて試みました。が、この方法は非常に良好なRNAの収量(91.45 ngの/μl)をもたらしたが、分光光度分析が不十分RNAの純度を示した後。フェノールを除去することによって単離されたRNAの追加の精製は、純度を向上させますが、RNAの収量は現在、大幅に低かったです。次に、別のキットは、許容可能なRNAの純度(1.7の260/280 nmの比)を示したが、RNAの収量は、溶解試薬 ​​(3.45 91.45 ngの/μL)と比較して26倍低いあった試験しました。良好な収率でも許容されるRNAの純度のための最良の結果はmiRNeasy血清/血漿キット(μlの48.2 ngの/; 1.6の260/280 nmの比)を用いて得られたため、この抽出手順は、その後、孤立からのmiRNAの検出のために使用しました。 HDLリポタンパク質画分。

3の貨物に同定され、HDLコレステロールの取り込み5を抑制することが示されたので、このmiRNAは選択されました図4(a)。 CEL-のmiR-39でスパイク-のmiR-223とのためのPCR反応の最適化後ベースラインの閾値と閾値サイクル値を比較増幅曲線の典型的な対数プロットを示しています。血漿中のmiRNAのための既知の正規化コントロールの報告が存在しないので、この合成遺伝子は、内部対照として使用しました。また、RNU6-2、RNU-48のようないくつかの潜在的な確立された内因性のハウスキーピング遺伝子では、HY3は検出できなかったとSNORD95は、精製されたHDLで検出することができた、しかし、のmiR-223およびSNORD95のCt値の差が5未満です(データ示さず)。 図5に示す融解曲線分析は、単一の別個示します前述のPCRにおける選択のmiRNAの増幅と一致してピーク。 図4(b)に示すように、のmiR-223および参照両方CEL-のmiR-39は、一貫して、すべての6のプロバンドに検出することができました。すべての個体の中でも比較的小さな変動は、miR-223と比較CEL-のmiR-39について観察しました。これらの知見は、miRNAの貨物の検出を可能にするために、高純度でHDLの分離をサポートしています。

精製されたHDLにおけるmiR-223の検出
リアルタイム定量PCR法は、一本鎖のmiRNA二重ヘアピン構造のmiRNA前駆体を定量しました。この方法は、フォワードが必要/遺伝子特異的プライマーおよびcDNAへのmiRNAのヘアピン構造を変換するための熱安定性逆転写酵素を逆。 cDNAを、その後増幅し、SYBRグリーン検出を利用してリアルタイム定量PCRを用いて定量しました。血清、血漿、精製HDL血漿からマイクロRNAを正確にプロフィールとすることができますEDは、miRNA RT PCRシステムを使用して。

平均のmiR-223遺伝子発現の我々の実験製品は、精製されたHDLで30.9のCt値を示し、それに対応するネガティブコントロールは、カットオフ35を超えていた(NTC = 38.1 Ct値、NRTおよびNACは増幅されませんでした)。この実験では、低融点(MIR-223およびCEL-のmiR-39で75.5℃、73℃)、特定のmiRNAアッセイよりも高いC tと、精製HDLサンプルにおけるプライマー-ダイマーの形成を見( 表1)。 表1のプライマーダイマーが原因溶液中のプライマーの高濃度のおそらく起こります。プライマー分子は30 PCRサイクル13の後にお互いに添付すると、これは主に発生します。これは、彼らが他のプライマー分子にアニールすることができますし、実際には、リニアミニテンプレートになり、それがより高いバックグラウンドの原因となりますし、40 NTCのC t値<(の世代になしtemplatをリードしなくてもよいですe制御)サンプル。

図1
図1. HDLの単離操作の概略図 。 HDLは、3つの遠心分離工程の一連の密度勾配超遠心分離によって調製しました。リポ蛋白質のバンドや密度勾配における中間留分の分布が示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
βメルカプトエタノールなしに分離されたリポタンパク質の 図2. アガロースゲル電気泳動。ソリューションC demonstにβメルカプトエタノールを加えることなく、密度勾配超遠心分離によって単離しVLDL、LDLおよびHDL画分HDL画分中のLp(a)の存在を評価します。レーン1、2、9、及び10それぞれは、サイズマーカーを表します。レーン3/4、5/6と7/8は、それぞれVLDL、LDLとHDLを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
βメルカプトエタノールを用いて分離された。最後の遠心分離工程の前に溶液Cにβメルカプトエタノールを追加HDLの 図3. アガロースゲル電気泳動は、HDL画分(a)からのLpの除去をもたらしました。レーンは、1、2、図9及び図10はそれぞれ、サイズマーカーを表します。レーン3-8は、HDLを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。


つの異なるmiRNAおよびCEL-のmiR-39およびmiR-223の発現の図4.増幅プロット。記載のように(A)リアルタイム定量的PCRは、単離されたHDL用いて行きました。 PCRは、45サイクルと曲線がしきい値がC T -Valueで交わる点のために実行されました。データはそれぞれCEL-のmiR-39(左パネル)およびmiR-223(右パネル)の発現を示します。水平線は、検出閾値を表します。 35のサイクル数は、正の増幅のためのカットオフとした6サンプルから得られた単離されたHDLから(B)の代表的なリアルタイムPCRのデータを示します。生は、Ct値は、その発現レベルが異なるドナーからの6つのサンプル、それぞれの間に精製されたHDLの血漿分画中の2未満のCt値を変化させるCEL-のmiR-39およびmiR-223、のために示されている意味します。発現プロファイリングは、PCRシステムおよびヒト血清&プラズマmiRNを用いて行きました定量RT-PCR。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
CEL-のmiR-39およびmiR-223については、図5の融解曲線。図示するように、単一のピークの存在が。CEL-のmiR-39(右パネル)及びmiR-223(左パネル)は、それぞれの特異的増幅を示してください。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

表1
負及び正の合成CEL-のmiR-39の制御及びmiR-223の血清、血漿、cDNAを特徴、および精製HDL画分の表1行のC t値。 NTC(なしtemplate制御)、NRT(無逆転写酵素)、NAC(無増幅制御、水だけおよび定量RT-PCRの試薬)。

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Discussion

血液由来の新規バイオマーカーの同定は、様々な疾患の臨床診断および予後に役立ちます。マイクロRNAは、バイオマーカーのすべての資質を有することが知られており、種々の研究14-17で示されています。本研究では、血漿HDLからのmiRNAを分離するために迅速かつ簡単な簡単な方法を示しました。 VLDL、LDLおよびHDLの分離の従来の密度勾配超遠心分離法は、プラズマの正確なサンプリング、緩衝液の正確な製剤、密度及び下部リポタンパク質画分8の定量的な転写の測定に依存します。 HDL 8 -11を単離するために記載されている多数の方法があります。これらの方法は、しばしば非常に面倒であるか、または脱塩単離されたリポタンパク質のための血漿および透析の大容量を必要とし、完全にmiRNAの3のソースとしてエキソソームおよびリポタンパク質を削除しないでください。私たちは、このSIを確立しているこれらの欠点に対処するために、mpleと血漿HDLからのmiRNAの単離の迅速な方法。

重要な目標と本研究の主な目的は、その後、精製されたHDLからmiRNAを分離する、赤血球、軟膜、エキソソーム、分泌小胞、VLDL、LDLおよびリポタンパク質(a)に干渉することなく、超遠心分離によってHDL-miRNAの複合体を分離し、単離することでした。 HDLでこれらのコンポーネントのいずれかの汚染や干渉が予想される実験結果およびmiRNAプロファイリングデータを変更します。血液からDNA、RNAおよびmiRNAの単離は、その複雑な性質のために非常に困難な作業です。それは、常に細胞、組織および臓器サンプル18に比べて(miRNAを含む)核酸抽出・精製する技術的な課題の多くに提起されてきました。また、血液細胞を循環中に存在する比較的miRNA遺伝子が存在します。血液は18比較的少ない自由循環のmiRNAと共にエキソソーム、分泌小胞およびHDLのための既知の担体です。したがって、より大きなA血漿サンプルボリュームのマウントHDL-のmiRNA複合体の処理と分離のために必要とされます。さらに、miRNAおよびそれらの標的配列の短い性質は、標準的なPCRオリゴヌクレオチド技術と十分な特異性を達成することも困難になります。血液の細胞成分は、常に温度、微生物および毒素またはストレスなどの外部環境の変化に応じてのmiRNAおよびmRNAを分泌することが知られています。また、血液中のヌクレアーゼ、RNaseが、循環するタンパク質および他の酵素の存在は、これらのmiRNAの分離に影響を与えます。

定量RT-PCRのΔΔCT法を用いながら、循環式のmiRNA増幅は、データの正規化のためのβアクチンまたはGAPDHなどの十分に確立された知られているハウスキーピング遺伝子を欠いています。これは、再度、血液、血清または血漿19を循環からプロファイリングのmiRNAのための主要なハードルの1をもたらします。一般的に使用される短い非コーディングのsnoRNAとのsnRNAはほとんど血とこのメートルで表現されていません内部コントロール遺伝子としてそれらを利用中のことがさらに困難akes。 snoRNAとのsnRNAのこれらのデメリットを解決するために、製造業者のプロトコルに従って以下のように我々は内部コントロール遺伝子としてアッセイで血清/血漿合成スパイクインコントロールを使用していたすべての技術的な問題を避けるために。これは、任意の非特異的な増幅のために正規化するのに役立ちますと変更は、miRNA精製およびPCR反応18中に発生しました。でもmiRNAの劣化や特定のmiRNAの増幅信号がない場合には、スパイクでの制御は、定量RT-PCR反応で増幅し、合理的に一定かつ均一なCt値と予想される信号を与える必要があります。 3陰性対照および陽性対照と一緒に制御増幅におけるスパイクに基づいて、我々は、miR-223遺伝子のための良い最適なデータの検証を得ました。これは、我々はこの単純な方法から、血漿HDLを循環からのmiR-223の良好な収率を持っていることを確認しました。

結論として、我々は、メソッドのOを確立しています血漿HDLからのmiRNAの精製のためのβメルカプトエタノールを添加したF密度勾配超遠心分離(DGUC)。この方法は、いくつかの利点を有する:(a)は、VLDL、LDLとHDLを床超遠心分離によって短時間で分離されている24必要な他の方法と比較して- 96時間8月11日を 。 (b)はLDLとHDL透析、脱塩/濃縮し、24時間以上8,9を取った他の方法と比較し、1時間以内に行われます。 (c)はリポタンパク質の汚染はHDL画分中のβメルカプトエタノールにより除去されるが、LDL画分に使用されるものではありません。必要(d)のサンプル量がすべて段階的にVLDL、LDLとHDLの単離のための唯一の1ミリリットルは、より多くの試料量を必要とする他の方法と比較されます。 (e)のそれは、分離11の間、HDLに酸化的損傷を最小限に抑えます。 (f)は、12サンプルの最大は、単一のリポ蛋白分離分析ランで分析することができます。 (g)で抽出したHDLの250μlのサンプル体積がmを分析するのに十分ですiRNA濃度/純度を、アガロースゲル電気泳動、タンパク質濃度、マイクロアレイおよびRT-qPCRの手順。本手法の限界は、HDL-miRNAのわずかな割合は、エキソソーム沈殿工程の間に失われる可能性があり、必要な血漿サンプルの体積は、HDL-のmiRNAを単離するために、200以上のμlでなければならないということです。

最後に、プラズママイクロRNAのみが循環中の破損または反乱血液細胞からだけでなく、健康な正常な血液細胞と体の継続的な健康状態の影響を受け、様々な健康と病気の組織や器官を備えて身体の他の部分からの細胞から誘導されたものではありません20.この本研究は、系統的にヒト血漿の分​​離されたHDLから成熟miR-223を精製しました。この研究は明らかに高度に精製されたHDLの血漿中の成熟miR-223のレベルが大幅リポタンパク質、リチウムのための未来のテストの臨床使用を容易に、検出可能な安定した、再現性や個人のサンプルの中で一貫していることを示しています版、心血管および他のメタボリックシンドローム。驚くべきことに、HDLの血漿から特にのmiR-223の成熟miRNAは、おそらく潜在的に精製されたHDLでのmiR-223の安定性を説明し、消化し、その他の過酷な条件をヌクレアーゼに耐性があります。 RNアーゼへのmiR-223の耐性機構は、さらなる研究が必要です。明らかに、これらの精製されたHDLの血漿中のmiRNA発現プロファイルを研究することは、様々な病気を研究する中で、将来のmiRNAマーカーに光を当てることになります。血漿中のこれらのHDL関連するマイクロRNAは、潜在的な臨床診断バイオマーカーとして使用され、将来的に薬をパーソナライズすることができます。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes  Becton, Dickinson and Company 366643
Centrifuge Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R  75004261
Densito 30PX densitometer Mettler Toledo MT51324450
ExoQuick solution  Invitrogen 4484451
Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube Thermo Scientific O3237
Sorvall WX100 ultracentrifuge  Thermo Scientific 46902
Fat Red 7B  Sigma-Aldrich 201618
β-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K Millipore UFC901008
Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K Millipore UFC800308
QuickGel Lipo kit  Helena Laboratories  3344,3544T
Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL LipoTrol; Helena Laboratories 5069
Rep Prep buffer  Helena Laboratories  3100
RNeasy MinElute spin columns  Qiagen
NanoDrop 1000 analyzer Thermo Scientific
miScript II RT Kit  Qiagen 218161
CFX96 Touch real-time PCR detection system BioRad
miRNeasy Serum/Plasma Kit QIAGEN 217184
miScript Primer Assays QIAGEN 141078139
miScript SYBR Green PCR Kit  QIAGEN 218073
miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control QIAGEN 219610
NaOH SIGMA-ALDRICH 480878
0.20 µM sterile syringe filter SIGMA-ALDRICH Z227536

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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