Rápido e simplificado método para isolamento alto Através-put de miRNA de altamente purificada lipoproteína de alta densidade

Biology

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Summary

MicroRNAs desempenhar um papel regulador importante e estão a emergir como novos alvos terapêuticos para várias doenças humanas. Tem sido demonstrado que miARNs são realizadas em lipoproteínas de alta densidade. Nós desenvolvemos um método simplificado para isolar rapidamente HDL purificada adequada para análise de miARN a partir de plasma humano.

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Seneshaw, M., Mirshahi, F., Min, H. K., Asgharpour, A., Mirshahi, S., Daita, K., Boyett, S., Santhekadur, P. K., Fuchs, M., Sanyal, A. J. Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein. J. Vis. Exp. (113), e54257, doi:10.3791/54257 (2016).

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Abstract

Protocol

1. Recolha de amostras de sangue

  1. Recolha de amostras de sangue em jejum venosos periféricos em tubos de 10 ml em plástico contendo anticoagulante ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (que tem diversas vantagens sobre os outros anticoagulantes) por punção venosa de uma veia padrão proeminente na fossa antecubital.
  2. Centrifugar as amostras de sangue a 1600 xg durante 20 min a 4 ° C numa centrífuga de mesa a obter o plasma livre de células vermelhas do sangue e pequenas quantidades de ARN.
  3. Sequencialmente centrifugar o sobrenadante a 3000 g (4 ° C) num rotor de balde oscilante durante 10 min para remover WBC e plaquetas e, em seguida, mais 15 min para remover as partículas remanescentes de células, respectivamente.
  4. Medir a densidade do plasma, utilizando um densitómetro à TA de acordo com as instruções de fabrico.
    NOTA: O ajuste da densidade (d = 1,023 g / ml), com solução salina a 0,9% pode ser necessário após a remoção de exossomas, mas antes a uma ultracentrifugação de gradiente de densidade.
  5. 2. exossomo Remoção de Plasma

    1. Retire os exossomos circulantes que têm uma densidade semelhante ao HDL e representam uma fonte quantitativamente significativo de miRNA 3.
      1. Para fazer isso, a adição de 252 ul de solução exossomo precipitação a 1 ml de plasma, seguido por incubação durante 30 min a 4 ° C. Para peletizar os exossomas, centrifugar a mistura durante 30 min a 1500 g a 4 ° C.
      2. Para isolar o HDL, Transferir 1 ml do sobrenadante resultante para um tubo de ultracentrífuga policarbonato de parede espessa para processamento adicional com ultracentrifugação em gradiente de densidade (ver abaixo).

    3. gradiente de densidade Ultracentrifugação (Figura 1).

    1. Para separar HDL usar um processo de três passos empregando uma ultracentrífuga chão com um rotor de ângulo fixo operando a 448811 x G e 8 ° C, respectivamente.
    2. Preparar três soluções de densidade diferentes sequencialmente e fresco para cada isolamento.
      1. Preparar a solução de A (isolamento de VLDL, d = 1,006 g / ml) por dissolução de 11,4 g de NaCl (NaCl: 0,195 mol), 0,1 g EDTA2Na e 1 ml de NaOH 1 N em 1000 mL de água destilada autoclavada-. Em seguida, adicionar um adicional de 3 ml de água esterilizada destilada.
      2. Preparar a solução de B (isolamento de LDL, d = 1,182 g / ml) por adição de 25,2 g de NaBr a 100 ml de solução A (NaCl 0,195 mol, NaBr 2,44 mol).
      3. Preparar a solução de C (isolamento de HDL, d = 1,470 g / ml) por mistura de 78,8 g de NaBr com 100 ml de solução A (NaCl 0,195 mol, NaBr 7,7 mol). Confirmar a densidade adequada à temperatura ambiente usando um densitômetro. Mantenha todas as soluções a 4 ° C até uso posterior.

    4. Isolamento de VLDL

    1. Misture 1 ml de plasma (densidade média = 1,023 g / ml) e nuclease livre 200 mL de Fat Red 7B em um tubo de ultracentrífuga 6,5 ​​ml de policarbonato de paredes espessas.
    2. Em seguida, a camada cuidadosamente 5 ml de solução A em cima da mistura. Se necessário, adicionar gordura adicional Red 7B no topo da solução A, TO equilibrar o peso de cada tubo. Centrifugar durante 2 h (aceleração - 5), (desaceleração - 7).
      Nota: Durante a centrifugação, as lipoproteínas são acumulados como uma banda nas suas regiões de densidade de equilíbrio.
    3. No final da corrida observar 2 camadas. Remover 1,5 mL da fracção VLDL representando a camada superior e armazenar a 4 ° C.
    4. Finalmente, usando uma pipeta de transferência de 4 ml a partir do fundo do tubo contendo o LDL, HDL, albumina e fracção de ácido gordo para um novo tubo de policarbonato para o isolamento de LDL.

    5. Isolamento de LDL

    1. Misturar 2 ml de solução B e 100 ul de nuclease isenta de gordura Red 7B para dentro do tubo que contém a fracção LDL e HDL (ponto 4), respectivamente.
    2. Em seguida, centrifugar para fora para 3 horas (aceleração 9, desaceleração 7). Em seguida, remover 1,5 ml da fracção de LDL que representa a camada superior e manter a 4 ° C ou armazenar a -80 ° C. Finalmente, transferir 4 ml a partir do fundo do tubo contendo a HDLfracção para um novo tubo de policarbonato.

    6. Isolamento de HDL

    1. Misturar 2 ml de solução C, 100 ul de nuclease isenta de gordura Red 7B e 15 ul de 98% β-mercaptoetanol para o tubo contendo a fracção HDL, respectivamente.
    2. Centrifugar durante 3 h (9 aceleração, desaceleração 7). Em seguida remover 2 ml da fracção de HDL que representam a camada de topo e, ou manter a 4 ° C ou armazenar a -80 ° C.

    7. A dessalinização e concentração da lipoproteína de Frações

    1. Para evitar a interferência com electroforese em gel de agarose subsequente e PCR, remover excesso de sal adicionada durante a ultracentrifugação em gradiente de densidade usando dispositivos de filtro centrífugo com o corte de peso molecular apropriado (tubo 3K para VLDL e tubo de 10K para LDL / HDL) tal como descrito nas instruções do fabricante.
      1. Resumidamente, após a adição de 2,5 ml de PBS frio (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 8 mM, KH2PO4 2 mM; pH 7,4) centrifuGE toda a fracção VLDL recolhidos durante densidade-gradiente ultracentrifugação a 4 ° C durante 60 min, utilizando um rotor basculante.
      2. Dessalinizar a fracção LDL duas vezes com 10 ml de PBS frio de gelo durante 30 min cada. Em seguida, use 13 ml de gelo frio PBS duas vezes para dessalgar a fração HDL. O volume PBS maior é necessário para melhorar a mobilidade com eletroforese em gel de agarose. Após centrifugação, remove as lipoproteínas contendo solutos e manter a 4 ° C, ou armazenada a -80 ° C.

    8. Agarose Gel Eletroforese

    1. Perfrom electroforese em gel de agarose utilizando o kit lipoproteína com pequenas modificações de instruções do fabricante, tal como se segue.
      Nota: Esta etapa é apenas para avaliar a qualidade e pureza das amostras de lipoproteína concentradas.
      1. Resumidamente, 6 ul de obter a fracção de lipoproteína dessalinizada com ultracentrifugação em gradiente de densidade e carregar num gel de lipoproteína de pré-molde. Use lipop humananormas rotein para VLDL, LDL e HDL como referência de tamanho. Realizar electroforese a RT a 100 V durante 60 min utilizando tampão de Rep Prep.
      2. Seca-se o gel durante 10 min e em seguida corar durante 10 min à TA com Fat Red 7B. Destain o gel em uma mistura de metanol-água 75:25 (v / v) e seco de novo durante 5 min.

    9. Extracção e purificação de ARN

    1. Perfrom isolamento de miARN pela HDL humana purificada utilizando o kit de soro / plasma de miARN isolamento e purificação.
      1. Resumidamente, adicionar 1 ml de reagente de lise de ARN de 200 ul de HDL purificada, misturar com um vortex e depois incubada durante 5 min à temperatura ambiente para garantir a completa dissociação de complexos nucleoproteicos e inactivação de RNases.
      2. Em seguida 3,5 ul de pico sintético Caenorhabditis elegans microARN (CEL-miR-39; 1,6 x 10 8 cópias / ul) na mistura. Em seguida, realizar a extracção de ARN de acordo com as instruções do fabricante.
    2. execute purificatina de extraiu-miARN com colunas de giro eluir conforme as instruções do fabricante. Medir a concentração de miARN de HDL purificada com um spectrophorometer.
      NOTA: eluição de miRNA das colunas de spin empregadas 16 mL de água livre de RNase.

    10. Transcrição Reversa (RT-PCR)

    1. Isolar 100 ng do miARN de HDL enriquecida com miARN sintético (CEL-miR-39) e sujeitos a transcrição reversa num volume de reacção de 20 ul utilizando o kit de transcrição reversa e de acordo com as instruções do fabricante.
    2. Realizar os controlos adequados, sem modelo de miRNA (NTC) e sem mistura de enzima transcriptase reversa (NRT).

    11. Real-time PCR (qRT-PCR)

    1. Perfrom-PCR em tempo real em um volume total de 20 ul com 2 ul de uma diluição 1: 2 do ADNc, 10 ul de mistura de PCR, 2 ul de iniciador universal, 2 ul de iniciadores de miARN e 4 ul de água livre de RNase-.
    2. Execute os Reactiem em placas de 96 poços a 95 ° C durante 15 min, seguido de 45 ciclos de 94 ° C durante 15 seg e 55 ° C durante 30 s e uma fase de extensão a 70 ° C durante 30 s.ec perfrom todas as reacções em triplicado .
    3. Em seguida, calcuate quantidades relativas de miARN usando o método 2 -ΔΔ Ct após a normalização para o gene doméstico de síntese de acordo com as instruções do fabricante.

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Representative Results

Isolamento de lipoproteína de alta densidade após a remoção dos exossomas
Para obter a partir de miARN HDL altamente purificada é necessário remover exossomas que representam uma fonte de contaminação miARN 7. Isto foi feito antes de ultracentrifugação em gradiente de densidade com um kit disponível comercialmente. Para fins práticos um padrão de três passos protocolo de ultracentrifugação de gradiente de densidade desenvolvido pela empresa comercial foi modificada (Figura 1). Este protocolo necessita de centrifugação com um rotor de ângulo fixo a uma velocidade de 140.000 rpm, que é substancialmente mais rápido do que os protocolos vulgarmente utilizados com forças de centrifugação até 54.000 rpm 3, 8, 9, e 10. Empregando um rotor T-1270 amplamente disponíveis com um força máxima de 70.000 rpm, a centrifugação foi realizada inicialmente com tubos de polialómero que falharam para resistir às forças de centrifugação. Para evitar o colapso de tubos,tubos de policarbonato foram usadas com êxito. Tempo de centrifugação é fundamental para a oxidação da lipoproteína e potencialmente degradação miRNA 11. Por isso várias vezes centrifugação diferentes, que vão desde um total de 8-96 horas foram testados. Além disso, temperatura à qual a centrifugação foi realizada foi ajustado com base no tempo de centrifugação e força, respectivamente.

Pureza da lipoproteína de alta densidade Frações
A pureza das fracções isoladas de lipoproteínas de alta densidade foram verificados por electroforese em gel de agarose. Figura 2. ilustra um resultado típico de electroforese para a subtracção de HDL isolada por ultracentrifugação de gradiente. Ele mostrou claramente que HDL era desprovida de qualquer contaminação da VLDL e exibe α-mobilidade típico. A ausência de quaisquer lipoproteínas de migrar ct nas fracções LDL e VLDL demonstra a recuperação completa de HDL durante o ultracentetapa rifugation. A fracção de HDL, no entanto, também mostrou um vestígio de β-mobilidade, um padrão de bandas de electroforese conhecido devido à contaminação com lipoproteínas (Lp (a)) 12.

Eliminação da Lp (a) isolada a partir de HDL
Estudando miARNs realizadas em HDL requer o isolamento de HDL de mais alta pureza. Interferência de Lp (a), com HDL potencialmente contribuir para a contaminação cruzada de HDL com miARNs realizadas em LDL. Para minimizar esta contaminação de HDL, 15 ul de β-mercaptoetanol 10 foi adicionado à solução C, durante o último passo de centrifugação (Figura 1). A adição de β-mercaptoetanol foi mostrado não para alterar as propriedades de densidade de HDL 10. Como apresentado na Figura 3., adição de β-mercaptoetanol resultou na ausência de quaisquer lipoproteínas de migração b consistentes com remoção muito eficiente da Lp (a).

Purificação de miRNA de HDL
Isolamento de miARN foi inicialmente tentada utilizando reagente de lise, que é comumente utilizado para a extracção de ARN a partir de sangue. Embora este método resultou em um rendimento muito bom RNA (91,45 ng / mL), mas depois de espectrofotometria mostrou pureza RNA insatisfatória. Purificação adicional do RNA isolado por remoção de fenol a pureza melhorada, mas o rendimento de ARN foi agora significativamente baixa. Em seguida, um outro kit foi testado que mostrou pureza aceitável RNA (260/280 relação nm de 1,7), mas o rendimento RNA foi 26 vezes menor em comparação com o reagente de lise (3,45 vs. 91,45 ng / mL). Os melhores resultados para a pureza do RNA aceitável com um bom rendimento foram obtidos com o kit de plasma miRNeasy soro / (48,2 ng / mL; proporção 260/280 nm de 1,6) e, por conseguinte, este procedimento de extracção foi subsequentemente utilizada para a detecção de miARN do isolado fracção de lipoproteína HDL.

3 e foi mostrada para reprimir a entrada de colesterol HDL 5. A Figura 4A. mostra um gráfico log típico de curvas de amplificação comparando valores de limiar e ciclo limite da linha de base após a otimização da reação de PCR para o miR-223 e da cravado-in Cel-mir-39. Este gene sintético foi utilizado como controle interno, não há relatos de controle de normalização conhecido por miRNA no plasma. Além disso, vários genes de manutenção possíveis estabelecidas endógenos como RNU6-2, RNU-48, HY3 poderia não ser detectado e SNORD95 podia ser detectada nos níveis de HDL purificada, mas, a diferença de valores de Ct de miR-223 e SNORD95 é inferior a cinco ( dados não mostrados). Derreter análise da curva ilustrado na figura 5. mostra claramente um único distintopico consistente com a amplificação de um miARN selectiva na PCR anterior. Tal como ilustrado na Figura 4B., Tanto o miR-223 e a referência Cel-mir-39 poderia ser consistentemente detectados em todas as seis bandas pro. Relativamente pequenas variações entre todos os indivíduos foram observados para Cel-mir-39 em comparação com o miR-223. Estes resultados suportam o isolamento de HDL em pureza elevada para permitir a detecção da sua carga miARN.

Detecção de miR-223 em HDL purificada
tempo real método de PCR quantitativo foi utilizado para quantificar hairpin-estrutura dupla miRNA precursores de miRNA único fio. Este método necessita de uma para a frente / para trás iniciadores específicos do gene e uma transcriptase reversa para converter termoestável a estrutura em gancho de miARN em ADNc. O ADNc foi, subsequentemente, amplificada e quantificada utilizando-qPCR em tempo real com a ajuda de detecção verde SYBR. MicroRNA a partir de soro, plasma e HDL plasmático purificado pode ser precisamente profilEd usando o sistema de miARN RT PCR.

O nosso produto experimental da expressão do gene significativo miR-223 mostrou um valor de Ct de 30,9 em HDL purificada e os seus correspondentes controlos negativos foram acima de 35 de corte (NTC = 38,1 valor de Ct, NRT e NAC não foram amplificados). Neste experimento, nós vimos nas amostras de HDL purificadas a formação de Primer-dímero com baixa temperatura de fusão (73 ° C no miR-223 e 75,5 ° C em Cel-miR-39) e maior valor t C do que os ensaios de miRNA específicos (Tabela 1). Os dimeros de iniciadores na Tabela 1. ocorrem provavelmente por causa da concentração elevada de iniciadores na solução. Isso ocorre principalmente quando as moléculas de iniciadores anexar ao outro após 30 ciclos de PCR 13. Isto permite-lhes a emparelhar com outras moléculas de iniciadores e no efeito, tornar-se mini-modelos lineares e vai causar maior plano e podem levar a uma geração de valor t C <40 para NTC (n Template controle) amostras.

figura 1
Figura 1. Representação esquemática do procedimento de isolamento de HDL. HDL foi preparada por ultracentrifugação de gradiente de densidade de uma série de três passos de centrifugação. Distribuição das bandas de lipoproteínas e frações intermediárias no gradiente de densidade são ilustrados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. agarose eletroforese em gel de lipoproteínas isolada sem β-mercaptoetanol. VLDL, frações LDL e HDL isoladas por ultracentrifugação em gradiente de densidade, sem adição de mercaptoetanol β à solução C demonstavaliar a presença de Lp (a) na fracção HDL. As faixas 1, 2, 9 e 10 cada um representa o marcador de tamanho; Lanes 3/4, 5/6 e 7/8 representam VLDL, LDL e HDL, respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Electroforese de gel de agarose de HDL isolada com β-mercaptoetanol. A adição de mercaptoetanol β à solução C, antes do último passo de centrifugação resultou na remoção de Lp (a), a partir da fracção de HDL. As faixas 1, 2, 9 e 10 de cada representam o marcador de tamanho; Lanes 3-8 representam HDL. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


Figura 4. Amplificação Lote de dois miRNAs diferentes e Expressão de Cel-miR-39 e miR-223. (A) PCR em tempo real quantitativo empregando HDL isolada foi realizada como descrito. A PCR foi realizada durante 45 ciclos e o ponto em que a curva cruza o limiar é o C T -Value. Os dados mostram a expressão de Cel-miR-39 (painel da esquerda) e miR-223 (painel da direita), respectivamente. A linha horizontal representa o limiar de detecção. Um número de ciclos de 35 foi definido como ponto de corte para a amplificação positiva. (B) representativas em tempo real de dados de PCR a partir de HDL isolada obtida a partir de 6 amostras são mostrados. Raw significa valores Ct são mostrados para Cel-miR-39 e miR-223, cujos níveis de expressão variam menos de 2 valor Ct da fração HDL do plasma purificada entre 6 amostras, cada uma de um doador diferente. Perfil de expressão foi realizada utilizando o sistema de PCR e o soro e plasma humano miRNA qRT-PCR. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. curvas de fusão para Cel-miR-39 e miR-223. Tal como ilustrado, a presença de um único pico indica a amplificação específica de Cel-miR-39 (painel da direita) e miR-223 (painel da esquerda), respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

tabela 1
Tabela 1. Fila valor C T de controlo negativo e positivo da sintético Cel-miR-39 e miR-223 caracterizado por soro, plasma, de ADNc, e a fracção HDL purificada. NTC (Sem template controle), NRT (sem enzima transcrição reversa), NAC (Sem controle de amplificação, apenas água e reagentes de qRT-PCR).

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Discussion

A identificação de novos biomarcadores a partir de sangue irá ajudar no diagnóstico e prognóstico clínico de várias doenças. MicroRNAs têm conhecido por possuir todas as qualidades de biomarcadores e tem sido demonstrado em vários estudos 14-17. Neste estudo demonstrámos método fácil rápida e simples para isolar miARN de HDL no plasma. Densidade convencional gradiente método ultra-centrifugação de isolamento de VLDL, LDL e HDL depende amostragem exacta de plasma, preparação precisa da solução tampão, a medição de densidade e a transferência quantitativa das fracções de lipoproteínas de fundo 8. Existem numerosos métodos que têm sido descritos para isolar HDL 8 -11. Estes métodos são frequentemente ou muito trabalhoso ou exigir grande volume de plasma e diálise extensiva para dessalinização isolado lipoproteínas e não remover completamente exossomos e lipoproteínas como fonte de miRNAs 3. Para colmatar estas lacunas que estabelecemos esta simple e método rápido de isolamento de miRNA de HDL plasma.

O principal objetivo e propósito principal deste estudo foi a de separar e isolar complexo HDL-miRNA por ultracentrifugação sem hemácias, buffy coat, exossomos, vesículas secretoras, VLDL, LDL e lipoproteínas (a) interferência, então isolar miRNAs de HDL purificada. Contaminação e interferência de qualquer um destes componentes com HDL alterará os resultados experimentais e previstos de miARN dados de perfil. Isolamento de ADN, ARN e miARNs a partir do sangue é uma tarefa muito difícil, devido à sua natureza complexa. Tem sido sempre posou com muitos desafios técnicos para os ácidos nucleicos (incluindo miRNAs) extração e purificação comparação com as células, tecidos e amostras de órgãos 18. Além disso, há relativamente menos os genes de miARN presentes nas células sanguíneas em circulação. O sangue é um transportador conhecido por exossomas, vesículas secretoras e HDL juntamente com miARNs circulantes livres, que são relativamente menos 18. Portanto, uma maiormontagem de volume da amostra de plasma sanguíneo é necessário para o processamento e isolamento do complexo HDL-miRNA. Além disso, a natureza de curto do miARNs e as suas sequências alvo, torna ainda difícil de alcançar especificidade suficiente com as tecnologias convencionais de oligonucleótidos de PCR. Os componentes celulares do sangue são sempre saber para secretar miARN e ARNm em resposta a alterações no ambiente externo, incluindo a temperatura, microrganismos e toxinas ou stress. Também presença de nucleases, RNases, proteínas circulantes e outras enzimas no sangue irá afectar estes isolamento miRNA.

A amplificação miARN circulante também não tem uma bem estabelecidos conhecidos como genes de manutenção β-actina ou GAPDH para normalização de dados durante a utilização do método ΔΔCt de qRT-PCR. Isso novamente coloca um dos principais obstáculo para miRNA perfis de circular soro ou plasma sanguíneo 19. Comumente usado snoRNAs codificação não curto e snRNAs raramente são expressas no sangue e este makes-lo ainda mais difícil em utilizá-los como genes de controlo interno. Para resolver estes deméritos de snoRNAs e snRNAs e para evitar quaisquer dificuldades técnicas que usamos controle de Spike-In sintética Soro / Plasma nos ensaios como gene controle interno como a seguir de acordo com o protocolo do fabricante. Ele ajuda na normalização para qualquer amplificação não específica e mudanças ocorridas durante a purificação miRNA e reação PCR 18. Mesmo no caso de degradação de miARN ou ausência de quaisquer sinais de amplificação específicos de miARN, a espiga no controle devem amplificar em reacções de qRT-PCR e dar um sinal esperado com um valor de Ct razoavelmente constante e uniforme. Com base no pico de amplificação de controlo, juntamente com três controlos negativos e controles positivos que temos um bom validação de dados ideal para o gene miR-223. Este confirmou que temos boa rendimento de miR-223 de circular HDL plasma a partir deste método simples.

Em conclusão, nós estabelecemos um método óf ultracentrifugação em gradiente de densidade (DGUC) com a adição de β-mercaptoetanol para a purificação de miARN de HDL no plasma. O método tem várias vantagens: (a) de VLDL, LDL e HDL são separadas dentro de um curto período de tempo por ultracentrifugação andar de comparação com outros métodos que necessita 24-96 HR 11/08; (b) LDL e HDL diálise, dessalinização / concentração, ocorrer no prazo de 1 hora comparar com outros métodos que tiveram 24 ou mais horas 8,9; (C) contaminação das lipoproteínas é removido por β-mercaptoetanol na fracção HDL, mas não se destina a ser utilizado na fracção LDL; (D) O volume de amostra necessário é de apenas 1 ml para todos gradual VLDL, LDL e HDL isolamentos comparar com os outros métodos que necessita de mais volume de amostra; (e) É minimizado o dano oxidativo ao HDL durante o isolamento 11; (F) Um máximo de 12 amostras pode ser analisada num separação lipoproteína corrida analítica; (G) O volume de amostra de 250 uL de HDL extraída é suficiente para analisar mconcentração de iARN / pureza, electroforese em gel de agarose, a concentração de proteína, de microarray e procedimentos de RT-qPCR. As limitações do nosso método é que a pequena porcentagem de HDL-miARN pode perder durante o passo de precipitação e exossomo o volume requerido da amostra de plasma deve ser mais do que 200 ul de isolar o HDL-miARN.

Finalmente, os microARNs de plasma não só são derivadas de células sanguíneos danificados ou renegados na circulação, mas também a partir de células de sangue normais saudáveis ​​e células de outras partes do corpo que inclui vários tecidos e órgãos saudáveis ​​e doentes afectados pelo estado de saúde em curso do corpo 20. O presente estudo tem sistematicamente purificado madura miR-223 a partir de HDL isolada de plasma humano. Este estudo demonstra claramente que níveis de maturidade de miR-223 no plasma HDL altamente purificado são detectáveis, estável, reprodutível e consistente entre os indivíduos da amostra, facilitando assim o uso clínico de testes futuridade para lipoproteínas, Liver, síndromes metabólicas cardiovasculares e outras. Surpreendentemente, miARNs maduros, especialmente o miR-223 a partir de HDL no plasma são provavelmente resistente à digestão por nuclease e outras condições adversas que explicar potencialmente a estabilidade de miR-223 em HDL purificada. O mecanismo de resistência de miR-223 para RNases requer um estudo mais aprofundado. Obviamente, estudar perfis de expressão de miRNA nestes plasma HDL purificada iria lançar luz sobre futuros marcadores de miRNA em estudar várias doenças. Estes microARNs associada HDL no plasma pode ser utilizado como um diagnóstico clínico potenciais biomarcadores e medicina personalizada no futuro.

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Disclosures

Os autores não têm nada para revelar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes  Becton, Dickinson and Company 366643
Centrifuge Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R  75004261
Densito 30PX densitometer Mettler Toledo MT51324450
ExoQuick solution  Invitrogen 4484451
Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube Thermo Scientific O3237
Sorvall WX100 ultracentrifuge  Thermo Scientific 46902
Fat Red 7B  Sigma-Aldrich 201618
β-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K Millipore UFC901008
Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K Millipore UFC800308
QuickGel Lipo kit  Helena Laboratories  3344,3544T
Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL LipoTrol; Helena Laboratories 5069
Rep Prep buffer  Helena Laboratories  3100
RNeasy MinElute spin columns  Qiagen
NanoDrop 1000 analyzer Thermo Scientific
miScript II RT Kit  Qiagen 218161
CFX96 Touch real-time PCR detection system BioRad
miRNeasy Serum/Plasma Kit QIAGEN 217184
miScript Primer Assays QIAGEN 141078139
miScript SYBR Green PCR Kit  QIAGEN 218073
miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control QIAGEN 219610
NaOH SIGMA-ALDRICH 480878
0.20 µM sterile syringe filter SIGMA-ALDRICH Z227536

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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