ढक्कन वाइपर क्षेत्र की छाप कोशिका विज्ञान

1Centre for Contact Lens Research, University of Waterloo
Medicine

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Muntz, A., van Doorn, K., Subbaraman, L. N., Jones, L. W. Impression Cytology of the Lid Wiper Area. J. Vis. Exp. (114), e54261, doi:10.3791/54261 (2016).

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Abstract

Introduction

मानव ऊपरी पलक, 10,000 झपकाए हर दिन लगभग 1 कार्यान्वित सिर्फ एक साथ 1 - 2 मिमी संकीर्ण conjunctival क्षेत्र नेत्र ग्लोब का विरोध। झपकी के दौरान अपने पोंछते गति के कारण, ढक्कन मार्जिन के इस भाग "ढक्कन वाइपर" क्षेत्र 2 करार दिया गया है। यह माना जाता है कि घर्षण ढक्कन दुनिया भर पोंछते के कारण अभ्यस्त निमिष के दौरान इस क्षेत्र में वृद्धि हुई है। यह आंख का आराम में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं। संपर्क लेंस विशेष अनुभव नेत्र बेचैनी में पहने और इस बंद करके लेंस पहनने 3 के लिए मुख्य कारणों में से एक है। एक संपर्क लेंस आंखों पर रखा जाता है, लेंस सामग्री और नेत्र सतह के बीच घर्षण गुणांक 4 बदलने के लिए दिखाया गया है। वहाँ सबूत सुझाव है कि सूखापन लक्षण इस बदले हुए घर्षण 2,5,6 से संबंधित हो सकता है।

इस संस्था भी चिकित्सकीय नमूदार घटना में परिलक्षित किया जा सकता है, विशेष रूप से ढक्कन वाईepitheliopathy (एलडब्ल्यूई) भी कहा जाता ऊपरी ढक्कन मार्जिन धुंधला (ULMS) 6 फीसदी है। वामपंथी उग्रवाद से नेत्र जलन का संकेत और शुष्क नेत्र रोग के लिए एक संभावित कारक है। यह देखा और ऊपरी और निचले ढक्कन मार्जिन क्षेत्रों के महत्वपूर्ण धुंधला द्वारा मापा जाता है। इस ग्रेडिंग प्रणाली 2 और उसके नैदानिक ​​वैधता (यानी, व्यक्तिपरक लक्षण के साथ सहसंबंध) अभी भी बहस के तहत कर रहे हैं, नेत्र असुविधा चिकित्सकों और वैज्ञानिकों के लिए एक जैसे एक पहेली बनी हुई है और सबसे महत्वपूर्ण बात, रोगियों के लिए एक असुविधा।

टू-डेट, छोटे (उप) सेलुलर शरीर रचना विज्ञान और ढक्कन वाइपर क्षेत्र 7 के शरीर क्रिया विज्ञान में चिकित्सकीय प्रासंगिक रूपों के बारे में जाना जाता है और केवल एक रिपोर्ट कोशिकाविज्ञान तरीकों 8 का उपयोग करता है। छाप कोशिका विज्ञान (आईसी) एक झिल्ली 9,10 के आवेदन के द्वारा बल्बर या टखने की हड्डियों का कंजाक्तिवा की उपकला सतह से कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए 40 साल के लिए नियोजित किया गया है। हटाने पर, पक्षपाती कोशिकाओं ग से गुजरनाytological धुंधला और सूक्ष्म इमेजिंग। ढक्कन वाइपर क्षेत्र में शारीरिक और सेलुलर मतभेद के कारण, इस तकनीक का अनुकूलन की आवश्यकता है।

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Protocol

आचार बयान: मानव विषयों से कोशिकाओं को इकट्ठा करने से पहले, सहमति के बारे में बताया और नैतिकता के अनुमोदन प्राप्त किया जाना चाहिए।

1. दाग तैयार

ध्यान दें: प्रयोग के दिन पर दाग तैयार करें।

  1. 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में 2.5 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के लिए 5 μl Ethidium (या 4 सुक्ष्ममापी) और 5 μl Calcein AM (या 4 सुक्ष्ममापी) जोड़ें; मिश्रण। एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें उपयोग करें जब तक आरटी पर प्रकाश और दुकान से ढाल।

2. लीजिए प्रकोष्ठों

  1. उनके पैकेज से सेल संस्कृति सम्मिलित निकालें और लेबल के लिए प्रत्येक पलक जांचा जा सके। स्थायी मार्कर का उपयोग कर झिल्ली प्लास्टिक धारक के पक्ष में सेल संग्रह के मार्क उन्मुखीकरण। आचार मध्यम बढ़ाई (लगभग 20X) पर दीपक निरीक्षण भट्ठा क्षेत्र की उचित स्वास्थ्य आईसी गुजरना करने के लिए की पुष्टि करें।
  2. ईए के निचले नेत्रश्लेष्मला थैली में सामयिक संवेदनाहारी (0.5% proparacaine हाइड्रोक्लोराइड) की एक बूंद बांटनाचर्चा आंख और आँखें रखने के लिए प्रतिभागी को हिदायत एक मिनट के लिए बंद कर दिया।
  3. एवर्ट ऊपरी आंख ढक्कन और पलकों द्वारा जगह में पकड़; ढक्कन वाइपर क्षेत्र के साथ किसी भी संपर्क से बचें।
    वैकल्पिक: एक माध्यमिक अन्वेषक की सहायता के इस कदम प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक हो सकता है।
  4. कम से कम दबाव के साथ ढक्कन वाइपर क्षेत्र के मध्य भाग पर लंबरूप झिल्ली को लागू करें।
  5. 5 सेकंड - 3 के लिए जगह में झिल्ली पकड़ो। झिल्ली संपर्क क्षेत्र में पारदर्शी बनने का निरीक्षण करें। इस बिंदु पर, धीरे झिल्ली को हटा दें और भागीदार के ढक्कन "फ्लिप" करने के लिए वापस जगह में अनुमति है।
  6. तुरंत इसे बाहर सुखाने से रोकने के लिए नमूने के लिए पीबीएस की एक बूंद लागू होते हैं। झिल्ली पारदर्शी बंद हो जाएगा और किसी भी समय अपारदर्शी बारी नहीं करना चाहिए, क्योंकि यह सुखाने इंगित करता है। माध्यमिक अन्वेषक नमूनों की प्रोसेसिंग (धारा 3) के साथ तुरंत आगे बढ़ना है।
  7. अंतिम आंख की जाँच का संचालन कंजाक्तिवा की अखंडता को सुनिश्चित करने के लिए। नेत्र स्नेहक बांटना और भागीदार हिदायतउनकी आँखों रगड़ से बचने के लिए जब तक संवेदनाहारी के प्रभाव से पहनती (लगभग। 15 मिनट)।

3. नमूना प्रसंस्करण

  1. सूक्ष्म कैंची का प्रयोग, सीधा सेल संग्रह के बीच के माध्यम से, आधे (डाउनस्ट्रीम विश्लेषण से प्रत्येक के लिए एक आधा) में झिल्ली काटा। एक झिल्ली आधा प्लास्टिक धारक से अलग करने के लिए की बाहरी मार्जिन के साथ कट; झिल्ली पर एकत्र कोशिकाओं, यह सुनिश्चित करना है कि झिल्ली खुद पर गुना नहीं करता सहित के साथ बातचीत करने से बचें।
  2. पूरी तरह से धारक से अलग करने से पहले झिल्ली चिमटी का उपयोग कर सुरक्षित। लेबल 2 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज 95% (v / v) इथेनॉल के 500 μl युक्त और (धारा 4.2) प्रक्रिया से पहले 2 घंटा की एक अधिकतम करने के लिए 20 मिनट की एक न्यूनतम के लिए ठीक करने के लिए छोड़ ट्यूब में जगह झिल्ली।
  3. झिल्ली के तुरंत अलग दूसरी छमाही (धारा 3.2 में वर्णित के रूप में) और तुरंत धारा 4.1 के साथ आगे बढ़ें।

4. नमूना धुंधला

  1. Immunocytochemiकैलोरी धुंधला
    1. ध्यान संग्रह नीचे की ओर का सामना करना पड़ के साथ 35 मिमी गिलास नीचे संस्कृति डिश में झिल्ली जगह; सुनिश्चित झिल्ली फ्लैट है।
    2. पिपेट immunocytochemical दाग रचना झिल्ली करने पर धारा 1 में इकट्ठे के 20 μl। नमूना कर्ल अप, डिस्पोजेबल पिपेट सुझावों का उपयोग तो ध्यान से अपने किनारों नीचे धक्का द्वारा झिल्ली समतल करने के लिए। सेल संग्रह क्षेत्रों के साथ संपर्क से बचें।
    3. धीरे गिलास को कवर पर्ची के साथ झिल्ली को कवर किया। नमूने के अनावश्यक आंदोलन से बचें। ढक्कन के साथ पकवान कवर और किनारों के आसपास प्रयोगशाला फिल्म के साथ सील। डिश (ऊपर और नीचे) और नमूना की दृश्यता की पारदर्शिता नहीं बाधा डालती है। प्रयोगशाला मार्कर के साथ लेबल।
    4. इसके तत्काल बाद इमेजिंग (धारा 5.1) के साथ आगे बढ़ना है, तो झिल्ली के दूसरे हाफ के कोशिकाविज्ञान धुंधला के साथ जारी रखने के लिए धारा 4.2 में लौटने।
  2. कोशिकाविज्ञान धुंधला
    1. धीरे धीरे धीरे धीरे ट्यूब यू करने के लिए आसुत जल के 500 μl जोड़कर झिल्ली हाइड्रेटधारा 3.4 में निर्धारण के लिए sed। महाप्राण सामग्री विंदुक टिप में कई बार मिश्रण करने के लिए है, तो सामग्री को हटा दें।
    2. आसुत जल के 500 μl जोड़ें। चलो कुछ सेकंड के लिए खड़े हो जाओ, तो हटा दें। Alcian ब्लू दाग के 500 μl जोड़ें और 3 मिनट के लिए छोड़ दें। दाग को दूर करने और लगातार 3 500 μl आसुत जल rinses या तरल स्पष्ट rinses तक प्रदर्शन करते हैं।
    3. Hematoxylin # 1 दाग के 500 μl जोड़ें और 3 मिनट के लिए छोड़ दें। दाग को दूर करने और लगातार तीन 500 μl आसुत जल rinses प्रदर्शन या जब तक तरल स्पष्ट rinses। साफ तरल aspirating द्वारा (धारा 4.2.1 के रिवर्स) निर्जलीकरण।
    4. Papanicolaou ओग -6 दाग के 500 μl जोड़ें और 3 मिनट के लिए छोड़ दें। दाग हटाने और एक 500 μl 95% (v / v) इथेनॉल कुल्ला प्रदर्शन करते हैं।
    5. Papanicolaou ईए-65 दाग के 500 μl जोड़ें और 3 मिनट के लिए छोड़ दें। दाग को दूर करने और लगातार 3 500 μl 95% प्रदर्शन (v / v) इथेनॉल rinses।
    6. पूरी तरह से लगातार तीन बार 500 μl 100% इथेनॉल rinses का उपयोग कर निर्जलीकरण। TWE का प्रयोगezers, समाधान से नमूना निकालें; दिल को छू लेने सेल संग्रह क्षेत्रों से बचें।
    7. कांच की स्लाइड पर झिल्ली की जगह; यह सुनिश्चित करें कि सेल संग्रह लाइन या तो समानांतर या इमेजिंग के दौरान आसान संरेखण के लिए मार्जिन स्लाइड करने के लिए खड़ा है।
    8. 100% इथेनॉल की एक बूंद लागू करें और कांच पर्ची के साथ कवर किया। इसके तत्काल बाद इमेजिंग (धारा 5.2) के साथ आगे बढ़ें।

5. नमूना इमेजिंग

  1. इमेजिंग फ्लोरोसेंट Immunocytochemical दाग
    1. एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग (CLSM) 11 या 12 प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी, एक डिजिटल कैमरा से लैस रंग, एक छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर चल रहा है एक कंप्यूटर से जुड़ा प्रयोग करें। कारण नमूने के संस्कृति व्यंजन के भीतर निहित जा रहा है, एक औंधा माइक्रोस्कोप आवश्यक हो सकता है।
    2. Ethidium homodimer -1 (528/617 डीएनए की उपस्थिति में एनएम पूर्व / एम Maxima) और calcein AM का अवशोषण और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा (494/517 एनएम ई के अनुसार माइक्रोस्कोप 11,12 सेट अपएक्स / एम Maxima)।
    3. माइक्रोस्कोप के सबसे कम बढ़ाई (जैसे, 2.5X उद्देश्य) का चयन करें और डिजिटल इमेजिंग प्रणाली को सक्रिय; नमूना कंप्यूटर मॉनीटर पर प्रदर्शित निरीक्षण करते हैं।
    4. ब्याज की सेलुलर सुविधाओं के लिए नमूना निरीक्षण किया।
    5. वांछित माइक्रोस्कोप बढ़ाई चयन करें और इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों को प्राप्त।
    6. या तो मूल माइक्रोस्कोप फ़ाइल स्वरूप या एक असम्पीडित फ़ाइल स्वरूप (जैसे, * .raw, * झगड़ा) में फ़ाइलों को बचाओ।
  2. इमेजिंग कोशिकाविज्ञान दाग
    1. कोई फिल्टर के साथ एक मानक प्रयोगशाला उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप, एक डिजिटल कैमरा रंग के साथ सुसज्जित, एक छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर चल रहा है एक कंप्यूटर से जुड़ा प्रयोग करें।
    2. प्लेस और ताला गिलास स्लाइड खुर्दबीन मंच पर (कदम 4.2.8 से)। जरूरत के रूप में 100% इथेनॉल के साथ नमूना rehydrate, पूरे इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान।
    3. माइक्रोस्कोप के सबसे कम बढ़ाई (जैसे, 2.5X उद्देश्य) का चयन करें और वें सक्रियई डिजिटल इमेजिंग प्रणाली; नमूना कंप्यूटर मॉनीटर पर प्रदर्शित निरीक्षण करते हैं।
    4. सुनिश्चित करें सेल संग्रह खुर्दबीन मंच नियंत्रण के दोनों एक्स या वाई अक्ष के साथ गठबंधन किया है। यदि कवर पर्ची हटाने और एक विंदुक टिप या चिमटी का उपयोग नमूना घूर्णन द्वारा, जरूरत को समायोजित करें।
    5. इमेजिंग सॉफ्टवेयर, सबसे कम माइक्रोस्कोप बढ़ाई साथ पूरे नमूना का कब्जा छवि (ओं) का उपयोग करना।
    6. मध्यम माइक्रोस्कोप बढ़ाई स्विच (जैसे, 10 - 20X उद्देश्य) और माइक्रोस्कोप प्रकाश स्रोत और सॉफ्टवेयर इमेजिंग मानकों (जोखिम, इसके विपरीत, सफेद संतुलन, आदि) को समायोजित, और उनके स्वचालित सॉफ्टवेयर पैमाइश को अक्षम करें। भविष्य में उपयोग के लिए इन सेटिंग्स को बचाओ।
    7. स्कैन (जैसे, ऊपर छोड़ दिया और सेल संग्रह के नीचे सही कोनों) की शुरुआत और अंत अंक निर्धारित करते हैं।
    8. इमेजिंग सॉफ्टवेयर, शुरू और अंत अंक के भीतर पूरे सेल संग्रह क्षेत्र का कब्जा छवि (ओं) का उपयोग करना। सुनिश्चित करें एक 20% की ओर से पक्ष और ऊपर से नीचे ओवरलैप between सभी आसन्न छवियों।
    9. मूल निवासी माइक्रोस्कोप फ़ाइल स्वरूप या एक असम्पीडित फ़ाइल स्वरूप (जैसे, * .raw, * झगड़ा) का उपयोग फ़ाइलों को बचाओ।
    10. चुनाव के लिए स्वचालित सिलाई सॉफ्टवेयर (जैसे, एडोब फोटोशॉप तत्वों) का उपयोग कर अंतिम नयनाभिराम छवि उत्पन्न करता है। अंतिम छवि में स्वचालित सिलाई की सटीकता की पुष्टि करने के लिए कदम 5.2.5 में लिया संदर्भ चित्र) का प्रयोग करें।

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Representative Results

सेल संस्कृति झिल्ली प्लास्टिक धारक पर फैला ढक्कन वाइपर कंजाक्तिवा से उपकला कोशिकाओं के हाथ में संग्रह के लिए एक सुविधाजनक उपकरण है। इस विधि के अतिरिक्त निष्फल उपकरणों आम तौर पर तैयार करने और आईसी झिल्ली संभाल करने के लिए इस्तेमाल के लिए की आवश्यकता समाप्त। चित्रा 1 ढक्कन वाइपर एक सेल संस्कृति डालने का उपयोग कर क्षेत्र के आईसी दर्शाया गया है। हम दो अलग धुंधला प्रोटोकॉल है कि एक उपन्यास फैशन में ढक्कन वाइपर क्षेत्र से उपकला कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए एक दूसरे के पूरक अनुकूलित। फ्लोरोसेंट रंगों immunocytochemical esterase गतिविधि, सेल व्यवहार्यता का सूचक है, और न्यूक्लिक एसिड पता चलता है, धुंधला, जिनमें से दर्शाता है कोशिका झिल्ली समझौता, के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया है। कोशिकाविज्ञान धुंधला प्रोटोकॉल keratinization डिग्री के बीच एक अच्छा गौरव के लिए अनुमति देता है। चित्रा 3 संक्रमण से पता चलता है टखने की हड्डियों का कंजाक्तिवा और उन्नत केरातिन में कम keratinization के बीचढक्कन वाइपर कंजाक्तिवा और एपिडर्मिस में ization। के रूप में ब्याज की एक चयनित क्षेत्र में करने का विरोध कोशिका विज्ञान से सना हुआ सेल संग्रह का नयनाभिराम इमेजिंग, पूरे संग्रह क्षेत्र के विश्लेषण के लिए परमिट। छवि संकल्प परमाणु स्तर को जूम करने के लिए पर्याप्त है; सेल आकृति विज्ञान परिशुद्धता के साथ निर्धारित किया जा सकता है। चित्रा 4 एक cytologically दाग सेल संग्रह की अंतिम छवि, साथ सिले लगभग का उपयोग कर पता चलता है। 100 अलग उच्च संकल्प फ़ाइलें। इन उपकरणों एक उपन्यास रास्ते में घर्षण और / या सूखी आंख के प्रभाव का आकलन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1. ढक्कन के छाप कोशिका विज्ञान वाइपर क्षेत्र। छाप कोशिका विज्ञान ढक्कन वाइपर ऊपरी ढक्कन के एवर्सन द्वारा उजागर क्षेत्र पर प्रदर्शन किया। इस्तेमाल किया झिल्ली सेल संस्कृति डालने, 12 मिमी, हाइड्रोफिलिक PTFE है। नोट झिल्ली धारक, जो बनाए रखा जा सकता का टैब (पूर्व के विपरीतबल्बर कंजाक्तिवा, जिसमें वे आवेदन करने से पहले हटा दिया गया है) के रूप में वे संकीर्ण पलक मार्जिन पर झिल्ली के आवेदन के साथ हस्तक्षेप नहीं करते हैं और वास्तव में संरेखण सहायता कर सकते हैं पर vious अध्ययन करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. ढक्कन वाइपर क्षेत्र से फ्लोरोसेंट कोशिकाओं। Confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी बड़े स्क्वैमस कोशिकाओं के बीच सेल आकृति विज्ञान की भिन्नता दिखा (क) और छोटे स्तंभ / cuboidal कोशिकाओं (ख)। Calcein AM की हरी प्रतिदीप्ति सेल शरीर (यानी, सेल व्यवहार्यता) में esterase गतिविधि इंगित करता है। Ethidium के लाल प्रतिदीप्ति न्यूक्लिक एसिड होता है, कोशिका झिल्ली समझौता का संकेत पता चलता है। कुछ कोशिकाओं तीव्र हरे और कोई लाल प्रतिदीप्ति, संभवतः में दिखाने कोशिका झिल्ली अखंडता (ग) के dicative। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. कोशिकाविज्ञान आईसी नमूना का धुंधला हो जाना। ढक्कन वाइपर क्षेत्र शो आकृति विज्ञान और अलग keratinization डिग्री बदलती के प्रकोष्ठों। बड़े नाभिक, सीमांत / टखने की हड्डियों का कंजाक्तिवा में पाया के साथ, छोटे स्तंभ और cuboidal कोशिकाओं की ब्लू रंग, कोई keratinization इंगित करता है (एक); muco-त्वचीय जंक्शन (MCJ / मार्क्स 'रेखा) और एपिडर्मिस की anuclear कोशिकाओं के नाभिक संघनित के साथ बड़े स्क्वैमस कोशिकाओं के लाल / नारंगी दाग ​​उन्नत keratinization (ग) का प्रतिनिधित्व करता है। संक्रमणकालीन रंग (लाल / नीला) और ढक्कन वाइपर conjunctival क्षेत्र में कोशिकाओं की आकृति विज्ञान keratinization सीमित सुझाव देते हैं (ख)।g3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4 के समग्र छवि ढक्कन वाइपर सेल संग्रह। कोशिकाविज्ञान धुंधला के बाद ढक्कन वाइपर क्षेत्र की छाप कोशिका विज्ञान। छवि साथ सिले लगभग इस्तेमाल करते हैं। 100 अलग-अलग तस्वीरों को एक माइक्रोस्कोप और 20x उद्देश्य के साथ लिया। (क) छोटे स्तंभ / टखने की हड्डियों / सीमांत कंजाक्तिवा की cuboidal उपकला कोशिकाओं। यहाँ कोशिकाओं नीले / हरी / बैंगनी रंग कोई keratinization का संकेत दिखा रहे हैं; (ख) ढक्कन वाइपर कंजाक्तिवा की कोशिकाओं, आकृति विज्ञान और क्षेत्रों के बीच दाग रंग में संक्रमणकालीन (क) और (ग); (ग) muco-त्वचीय जंक्शन / मार्क्स 'लाइन की बड़ी स्क्वैमस कोशिकाओं। ऑरेंज रंग दाग keratinization के कुछ डिग्री इंगित करता है, और लाल / गुलाबी देर चरण स्क्वैमस संक्रमण का संकेत मिलता है; (घ) Meibum छाप; (ई) anuclear, एपिडर्मिस की श्रृंगित कोशिकाओं; (च) जीoblet सेल छाप या आंसू फिल्म mucins। नीचे तीर को इंगित करता है टखने की हड्डियों conjunctival क्षेत्र, ऊपर की ओर तीर बाहरी ढक्कन इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

छाप कोशिका विज्ञान आमतौर पर, बल्बर कंजाक्तिवा पर किया जाता है मिश्रित सेलूलोज एस्टर झिल्ली का उपयोग कर। नमूने, थोक सामग्री चादरों से आकार में कटौती निष्फल, आवेदन किया है और conjunctival सतह संदंश का उपयोग करने से हटा रहे हैं। एक ही झिल्ली सामग्री का उपयोग करना, एक पिस्टन नियंत्रित आईसी डिवाइस हाल ही में बल्बर कंजाक्तिवा की सतह ज्यामिति मैच के लिए, और बनाए रखने के अनुप्रयोगों 13 के बीच लगातार दबाव बनाया गया था। इन तरीकों क्षेत्र वाइपर संकीर्ण, घुमावदार प्रमुखता से ढकने के लिए अक्षम हैं (चित्रा 1 देखें)। इसके अतिरिक्त, मिश्रित सेलूलोज एस्टर झिल्ली की व्यवस्था के लिए आवश्यक पारदर्शिता जहां उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए पहले नमूने संरेखित करने के लिए आवश्यक है प्रदान नहीं करते। सेल संस्कृति इस प्रोटोकॉल में प्रस्तावित सम्मिलित सुविधाजनक है क्योंकि वे निष्फल रहे हैं, आदर्श आकार और आगे उपकरणों के बिना मैन्युअल संभाला जा सकता है, तेजी से संग्रह सुनिश्चित कर रहे हैं। झिल्ली से बने होते हैंहाइड्रोफिलिक PTFE, जो confocal माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए पर्याप्त पारदर्शिता प्रदान करता है।

कुल मिलाकर, एकत्र कोशिकाओं की रूपात्मक सुविधाओं पिछले साहित्य रिपोर्ट 7,8,14,15 के साथ मेल खाना। आमतौर पर इस्तेमाल किया है (और वार्णिक बहुत तीव्र) आवधिक एसिड Schiff (पीए) Alcian नीले रंग के साथ दाग जगह से 7.8 से पहले सूचना बाद में Papanicolaou रंजक, महीन रंगीन भिन्नता प्रदर्शित करने के लिए सेलुलर keratinization स्तर पर एक अधिक विस्तृत परिप्रेक्ष्य को सक्षम करने की अनुमति देता है।

कोशिकाविज्ञान नमूनों की सूक्ष्म इमेजिंग आमतौर पर oculars के माध्यम से दृश्य निरीक्षण, और "ब्याज की" समझा संरचनाओं की उच्च वृद्धि फोटोग्राफी शामिल है। इस दृष्टिकोण के साथ, "बड़ी तस्वीर" पूरे संग्रह के पहलुओं को खो दिया जा सकता है। कम बढ़ाई शॉट्स अवर ऑप्टिकल गुणवत्ता (विगनेटिंग, aberrations, आदि के कारण) की होती हैं और संकल्प सेलुलर विस्तार से चित्रित करने के लिए अपर्याप्त हैएस। मनोरम सिलाई प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तावित है, जबकि थोड़ा अधिक समय लगता है, फायदेमंद है, क्योंकि यह पूर्ण झिल्ली के एक सिंहावलोकन, साथ ही परमाणु विस्तार करने के लिए ज़ूम करने की क्षमता है, एक छवि में सभी उपलब्ध कराता है। ऐसी कोशिकाओं की संख्या के रूप में मात्रात्मक मेट्रिक्स, परमाणु cytoplasmic (नेकां) अनुपात 16 और दूरी यहां से गणना की जा सकती है।

कंजाक्तिवा पर झिल्ली का सही आवेदन (धारा 2.4), समय नमूना प्रसंस्करण कदम (वर्गों 2.6 और 3 से 5 तक) और इष्टतम मनोरम सिलाई के लिए लगातार इमेजिंग मापदंडों के बीच (धारा 5.2: वहाँ प्रोटोकॉल के भीतर तीन महत्वपूर्ण कदम है कि विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है .6 - 5.2.8)। एपिडर्मिस और टखने की हड्डियों के बीच परिखा 2 मिमी - अपेक्षाकृत सपाट बल्बर कंजाक्तिवा के विपरीत, इस क्षेत्र वाइपर ढक्कन केवल 1 के एक संकीर्ण चौड़ाई फैले, एक स्पष्ट वक्रता है। यह जरूरी है कि झिल्ली सही कोण पर लागू किया जा रहा है, के रूप में यह बहुत एकत्र कोशिकाओं के प्रकार को प्रभावित कर सकते हैं। दूसरे, मेमbrane दबाव अनुप्रयोगों के बीच लगातार होना चाहिए। अन्वेषक इसलिए repeatable संग्रह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक निपुणता विकसित करनी चाहिए। एक बार नमूने छाप कोशिका विज्ञान तकनीक का उपयोग कर एकत्र कर रहे हैं, प्रसंस्करण के समय महत्वपूर्ण हो जाता है। नमूने बाहर सुखाने के लिए कभी नहीं की अनुमति दी जानी चाहिए, यानी, झिल्ली नहीं अपारदर्शी (वर्गों 2.6, 3 से 5 तक) हो जाना चाहिए। कोशिकाविज्ञान धुंधला गुजरना करने के लिए नमूना एक लंबे समय के लिए लगानेवाला में छोड़ा जा सकता है (20 मिनट - 2 घंटा), immunocytochemical दाग जोड़ा गया है और देरी के बिना imaged, सही रूप में संभव के रूप में सेल व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए किया जाना चाहिए। समय की संगति भी नमूने के बीच तुलनीय परिणाम के लिए आवश्यक है; एक फिक्सिंग और धुंधला बार बराबर रखने के लिए सभी नमूनों तुलना करने के लिए उद्देश्य होना चाहिए। अंत में, आदेश कोशिका विज्ञान नमूना के गुणात्मक नयनाभिराम चित्र प्राप्त करने के लिए, सभी इमेजिंग मानकों (माइक्रोस्कोप प्रकाश की तीव्रता, कैमरा जोखिम, इसके विपरीत, सफेद संतुलन, आदि), नमूना के एक प्रतिनिधि क्षेत्र के लिए calibrated किया जाना चाहिए ब्याज की सुविधाओं (यानी, सेल प्रकार) के उच्चतम विविधता, और सभी स्वचालित पैमाइश के साथ बाद में शॉट्स (धारा 5.2.6) के लिए निष्क्रिय किया। अन्वेषक भी या तो एक्स या खुर्दबीन मंच के वाई अक्ष के साथ लाइन में सेल संग्रह बोध कराता है लक्ष्य रखना चाहिए। इस छवि के अधिग्रहण और सिलाई की प्रक्रिया आसान हो जाएगा। का पता लगाने और आसन्न चित्रों के बीच अतिव्यापी क्षेत्रों में नमूना (जैसे, सेल पैच, meibum, मलबे, आदि) पर विशिष्ट सुविधाओं का उपयोग करने के लिए निशाना लगाओ। माइक्रोस्कोप ध्यान ही समायोजन शॉट्स के बीच सही करने की होनी चाहिए।

के रूप में मूल Jalbert 8, जिन्होंने ढक्कन वाइपर कोशिकाओं का मिला हुआ पैच प्राप्त करने में एक 67% सफलता दर की सूचना दी द्वारा मनाया इस तकनीक की सीमा, सेल संग्रह की परिवर्तनशीलता में निहित है। आवेदन कोण संख्या और एकत्र कोशिकाओं के प्रकार पैदा करती है। इस स्तर पर यह अनिश्चित w हैhether संग्रह गुणवत्ता (यानी, नमूना पर कोशिकाओं की संख्या) नेत्र स्वास्थ्य के साथ जोड़ा जाता है। बड़ा नमूना आकार के साथ नैदानिक ​​परीक्षण इस तकनीक की वैधता साबित करने के लिए आवश्यक हैं। एक और खामी आईसी तकनीक के ही निहित invasiveness में निहित है। बेहतर सेल परतों जबरदस्ती कंजाक्तिवा से हटा रहे हैं और इस नुकसान उत्पन्न हो सकता है। immunocytochemical दाग सेल व्यवहार्यता (और esterase गतिविधि सभी संग्रह में मौजूद है) को प्रतिबिंबित करने का इरादा कर रहे हैं, यह क्या हमारे संग्रह में सेल नाभिक के लाल प्रतिदीप्ति का संकेत स्पष्ट नहीं है। कभी कभी, meibum (यानी, ढक्कन मार्जिन पर स्रावित लिपिड) सतह नेत्र या आंसू फिल्म से और अन्य घटकों सेलुलर सुविधाएं शामिल होंगी और विश्लेषण मुश्किल या असंभव बनाने के लिए करते हैं जाएगा। प्रोटोकॉल xylene में एक अतिरिक्त कुल्ला meibum लिपिड को दूर करने के साथ संशोधित किया जा सकता है। अन्त में, conjunctival कोशिकाओं पर संवेदनाहारी बूंदों का प्रभाव अज्ञात है।

ढक्कन वाइपर क्षेत्र के सेलुलर संरचना का डेटा प्राप्त करने में मदद मिलेगी घर्षण है कि इन कोशिकाओं और सतह नेत्र, और व्यक्तिपरक आराम के बीच होता है के बीच के संबंध की पुष्टि करें। इस बहुमूल्य ज्ञान प्रदान करते हैं और संपर्क लेंस पहनने वालों के सेलुलर विशेषताओं का पता लगाने के भविष्य क्लिनिकल परीक्षण की अनुमति होगी, ढक्कन वाइपर epitheliopathy, सूखी आंख या सूखापन लक्षण, स्पर्शोन्मुख विषयों के विपरीत, के साथ विषयों उम्मीद है कि आंख में तकलीफ के विषय पर प्रकाश डाला।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcian Blue, 1% in 3% Acetic Acid Sigma B8438-250ML
Hematoxylin, Gill 1 Sigma GHS116-500ML
Papanicolaou stain, OG-6 Sigma HT40116-500 ml
Papanicolaou stain, Modified EA Sigma HT40232-1L
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit Life Technologies L-3224 contains ethidium homodimer-1 and Calcein AM dyes
Alcaine (0.5% proparacaine hydrochloride) Alcon
Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm EMD Millipore PICM01250 
35 mm Glass Bottom Dishes MatTek Corporation P35G-0-20-C

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References

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