Kapak Silecek Area izlenim Sitoloji

1Centre for Contact Lens Research, University of Waterloo
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Muntz, A., van Doorn, K., Subbaraman, L. N., Jones, L. W. Impression Cytology of the Lid Wiper Area. J. Vis. Exp. (114), e54261, doi:10.3791/54261 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

2 mm dar konjonktiva bölge göz küre karşı - insan üst göz kapağı sadece 1 ile 10,000 yanıp her gün yaklaşık 1 yürütür. Yanıp sırasında silme hareketi nedeniyle, göz kapağı kenarında bu bölümü "kapak silecek" bölgesini 2 olarak adlandırılmıştır. Sürtünme yüzünden dünya üzerinde silme kapak, alışılmış kırpma sırasında bu bölgede yüksek olduğu varsayılmaktadır. Bu göz konfor önemli bir rol oynayabilir. Kontakt lens özellikle deneyim göz rahatsızlık kullananlar ve bu mercek 3 giymek durdurması için birincil nedenlerinden biridir. Bir kontakt lens göze yerleştirildiğinde, lens materyali ve göz yüzeyi arasındaki sürtünme katsayısı 4 değiştirme gösterilmiştir. Kuruluk belirtileri bu değiştirilmiş sürtünme 2,5,6 ilişkili olabileceğini gösteren kanıtlar vardır.

Bu ilişki aynı zamanda klinik olarak gözlemlenebilir olayların yansıması olabilir, özellikle kapak wiepitelyopati (LWE) da denilen üst kapak marjı boyama (ULMS) 6 başına. LWE oküler irritasyon erken bir belirtisi ve kuru göz hastalığı için potansiyel bir belirleyicisidir. Bu görülen üst ve alt kapak kenarında bölgelerinin önemli bir boyama ile ölçülür. Bu derecelendirme sistemi 2 ve klinik geçerliliği (yani öznel belirtiler ile korelasyon) tartışma halen iken, göz rahatsızlığı, hem doktorlar ve bilim adamları için bir bilmece kalır ve en önemlisi, hastalar için bir rahatsızlık.

To-date, küçük kapak silecek alanının 7 (alt), hücresel anatomi ve fizyoloji klinik-alakalı varyasyonları hakkında bilinmektedir ve sadece tek bir rapor sitolojik yöntemler 8 kullanmaktadır. Gösterim sitoloji (IC) bir zar 9,10 uygulanması ile bulber veya tarsal konjonktiva epitel yüzeyinden hücreleri toplamak için 40 yıldır istihdam edilmiştir. çıkarılması üzerine, yapışan hücreler c geçmesiytological boyama ve mikroskopik görüntü. Nedeniyle kapak silecek bölgedeki anatomik ve hücresel farklılıkları, bu teknik optimizasyon gerektirir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik deyimi: Ön insan denekler hücreleri toplamak için, aydınlatılmış onam ve etik onayı alınmalıdır.

1. Leke hazırlayın

NOT: Deney günü boya hazırlayın.

  1. 15 ml santrifüj tüpü içinde 2.5 ml fosfat tamponlu tuz (PBS) ile 5 ul Etidyum (veya 4 uM) ve 5 ul Calcein AM (veya 4 uM) ilave et; karıştırın. kullanılana kadar oda sıcaklığında hafif ve deposundan korumak için alüminyum folyo ile sarılır.

2. Toplama Hücreler

  1. kendi paketinden hücre kültürü ekler çıkarın ve her göz kapağı numune alınacak için etiket. kalıcı bir kalem kullanarak zar plastik tutucu tarafında hücre toplama Mark yönelimi. Davranış IC geçmesi bölgenin uygun sağlığını onaylamak için orta büyütme (yaklaşık 20X) Lambanın denetim yarık.
  2. ea alt konjunktival kesesine topikal anestezi (% 0.5 proparacaine hidroklorür) bir damla dağıtınch göz ve gözleri korumak için katılımcıyı talimat bir dakika süreyle kapattı.
  3. Evert üst göz kapağı ve kirpik tarafından yerinde tutun; kapak silecek alanı ile herhangi bir temastan kaçının.
    İsteğe bağlı: İkincil araştırmacı yardım Bu adımı gerçekleştirmek gerekebilir.
  4. minimal basınç ile kapak silecek bölgenin orta kısmında dik olarak membran uygulayın.
  5. 5 saniye - 3 yerine membran tutun. iletişim alanında saydam hale membran gözlemleyin. Bu noktada, hafifçe membran kaldırmak ve yerine geri "çevirmek" için katılımcının kapağını izin verir.
  6. Derhal kurumasını önlemek için, örnek PBS bir damla uygulanır. Membran saydam dönecek ve bu kurumayı belirttiği gibi, herhangi bir zamanda opak dönmemelidir. İkincil araştırmacı örneklerinin işlenmesi (bölüm 3) ile hemen devam var.
  7. konjonktiva bütünlüğünü sağlamak için nihai göz kontrolü yapıyoruz. oküler yağlayıcılar koyun ve katılımcıyı talimatanestetik etki kapalı giyer kadar gözlerini ovuşturarak önlemek için (yakl. 15 dk).

3. Örnek İşleme

  1. mikro-makas kullanılarak, dikey hücresi ile toplama ortasından ikiye (alt analizler her biri için bir adet yarım) membran kesti. plastik tutucu ayırmak için bir membran yarısının dış kenarı boyunca kesme; membran kendi üzerine kat etmemesini sağlamak da dahil olmak üzere membran üzerinde toplanan hücreleri ile etkileşimi önlemek.
  2. tamamen sahibinden ayrılmakta önce cımbız kullanarak membran sabitleyin. % 95 (h / h) ihtiva eden bir 500 ul ihtiva eden ve (Bölüm 4.2) işleme önce 2 saat, en fazla 20 dakika içinde en az düzeltmek için terk etiketli 2 ml santrifüj tüpüne yer membran.
  3. (Bölüm 3.2'de anlatıldığı gibi) ve derhal bölüm 4.1 ile devam membran hemen ayrı ikinci yarısı.

4. Numune Boyama

  1. Immunocytochemical Boyama
    1. Dikkatle toplama yüzü aşağı bakacak şekilde 35 mm cam alt kültür çanak membran yerleştirin; Membran düz olduğundan emin olun.
    2. Pipet zara bölüm 1 monte İmmünositokimyasal leke kompozisyon 20 ul. Örnek bukleler kadar, dikkatle kenarlarını bastırarak membran düzleştirmek için tek kullanımlık pipet uçları kullanın. Hücre toplama alanları ile temastan kaçının.
    3. Yavaşça cam kapak slip ile membran kapak. Numunenin gereksiz hareketini önlemek. Kapaklı çanak Kapak ve kenarlarda laboratuvar film ile kapatın. çanak (üstte ve altta) ve numunenin görünürlük şeffaflık engellemeyin. laboratuar işaretleyici ile etiketleyin.
    4. Hemen görüntüleme (bölüm 5.1) ile devam, sonra membran diğer yarısı sitolojik boyama ile devam etmek için bölüm 4.2 dönün.
  2. sitolojik Boyama
    1. Yavaş yavaş yavaş tüp u damıtılmış su, 500 ul ekleyerek membran hidratbölüm 3.4 tespiti için sed. pipet içine aspire içeriği defalarca sonra içeriğini kaldırmak, karıştırın.
    2. damıtılmış su, 500 ul ekle. Birkaç saniye için ayakta Izin, sonra çıkarın. Alcian blue 500 ul ilave edin ve 3 dakika boyunca bırakın. leke çıkarın ve 3 ardışık 500 ul damıtılmış su durular veya sıvı berrak durular kadar gerçekleştirin.
    3. Hematoksilen 1. leke 500 ul ekleyin ve 3 dakika bekletin. leke çıkarın ve üç ardışık 500 ul distile su durulama gerçekleştirmek veya sıvı berrak durular kadar. berrak bir sıvı aspire (bölüm 4.2.1 tersini) kurutmak.
    4. Papanicolaou RG-6 leke 500 ul ekleyin ve 3 dakika bekletin. leke çıkarın ve bir 500 ul% 95 (v / v) etanol durulama gerçekleştirin.
    5. Papanicolaou EA-65 boyasının 500 ul ekleyin ve 3 dakika bekletin. leke çıkarın ve 3 ardışık 500 ul% 95 yerine (v / v) etanol durular.
    6. Tam üç ardışık 500 ul% 100 etanol durulama kullanarak kurutmak. TWE kullanarakezers, çözeltiden örneği kaldırmak; dokunaklı hücre toplama alanları kaçının.
    7. cam slayt membran yerleştirin; Bu hücre toplama hattı sağlamak paralel veya görüntüleme sırasında daha kolay uyum için marjını slayt dik olarak ayrılmaktadır.
    8. % 100 etanol bir damla uygulayın ve cam slip ile kaplayın. Hemen görüntüleme (bölüm 5.2) ile devam edin.

5. Numune Görüntüleme

  1. Görüntüleme Floresan İmmünositokimyasal Renklendiriciler
    1. Bir görüntü elde etme yazılımı çalıştıran bir bilgisayara bağlı bir dijital renkli kamera ile donatılmış bir konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) 11 veya floresan mikroskop 12, kullanın. örnekler kültür tabaklarına içinde bulunan kısmi olarak, bir inverted mikroskop gerekli olabilir.
    2. Etidyum homodimer-1 (DNA'nın mevcudiyetinde 528/617 nm örn / Em maxima) ve kalsein AM absorpsiyon ve emisyon spektrumu (494/517 nm e göre olan mikroskop 11,12 ayarlamax / Em maxima).
    3. (Örneğin, 2.5X objektif) mikroskop düşük büyütme seçin ve dijital görüntüleme sistemini aktive; bilgisayar ekranında görüntülenen örnek gözlemlemek.
    4. ilgi hücresel özellikleri için örnek olup olmadığını kontrol edin.
    5. İstenilen mikroskop büyütme seçin ve görüntüleme yazılımı kullanarak görüntüleri kazanır.
    6. Yerli mikroskop dosya biçiminde veya sıkıştırılmamış bir dosya biçiminde (örneğin, * .raw, * .tiff) ya dosyaları kaydedin.
  2. Görüntüleme Sitolojik Lekeleri
    1. Bir görüntü elde etme yazılımı çalıştıran bir bilgisayara bağlı bir dijital renkli kamera ile donatılmış herhangi bir filtre standart bir laboratuvar parlak alan mikroskobu, kullanın.
    2. Yeri ve mikroskop sahnede (adım 4.2.8 itibaren) kilit cam slayt. gerektiği gibi tüm görüntüleme işlem boyunca,% 100 etanol ile örnek rehidrate.
    3. (Örneğin, 2.5X objektif) mikroskop düşük büyütme seçin ve inci etkinleştirmekE dijital görüntüleme sistemi; bilgisayar ekranında görüntülenen örnek gözlemlemek.
    4. Emin olun hücre toplama mikroskop sahne kontrolü X veya Y ekseni ya uyumludur. kapak kayma kaldırarak ve bir pipet veya cımbız kullanarak örnek çevirerek, gerekirse ayarlayın.
    5. görüntüleme yazılımı, en düşük mikroskop büyütme ile tüm numunenin yakalama resim (ler) kullanma.
    6. Orta mikroskop büyütme geçin (örneğin, 10 - 20X objektif) ve mikroskop ışık kaynağı ve yazılım görüntüleme parametrelerinin (pozlama, kontrast, beyaz dengesi, vs.) ayarlayabilir ve onların otomatik yazılım ölçüm devre dışı bırakın. ileride kullanmak için bu ayarları kaydedin.
    7. Tarama (örneğin, sol üst ve hücre koleksiyonu sağ alt köşelerinde) başlangıç ​​ve bitiş noktalarını belirleyin.
    8. görüntüleme yazılımı, başlangıç ​​ve bitiş noktaları içinde tüm hücre toplama alanının yakalama resim (ler) kullanma. % 20 yan-yana ve üst-to-alt üst üste betw sağlamaktüm bitişik görüntüleri een.
    9. Yerli mikroskop dosya biçimini veya sıkıştırılmamış dosya biçimi (örneğin, * .raw, * .tiff) kullanarak dosyaları kaydedin.
    10. (Örneğin, Adobe Photoshop Elements) seçim otomatik dikiş yazılımını kullanarak nihai panoramik görüntü oluşturun. Son görüntüde otomatik dikiş doğruluğunu onaylamak için adım 5.2.5 alınan referans görüntüleri) kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

plastik tutucu üzerine yayılmış hücre kültürü membran kapak silecek konjonktiva epitel hücrelerinin el toplanması için uygun bir araçtır. Bu yöntem genellikle hazırlamak ve IC membranlar işlemek için kullanılan ek sterilize aletler için gereğini ortadan kaldırır. 1 hücre kültürü eki kullanarak kapak silecek alanının IC tasvir Şekil. Biz yeni bir moda kapak silecek alanından epitel hücreleri karakterize etmek için birbirini tamamlayan iki farklı boyama protokolleri optimize edilmiş. Şekil 2'de gösterildiği gibi floresan immünositokimyasal boyalar esteraz etkinliği, hücre canlılığının bir göstergesi olan ve nükleik asitleri ortaya koymaktadır, boyama olan hücre membranı uzlaşma yansıtır. Sitolojik boyama protokolü keratinizasyon derece arasında iyi bir ayrım sağlar. Şekil 3 geçiş gösterir tarsal konjonktiva ve gelişmiş keratin düşük keratinizasyon arasındakapak silecek konjonktiva ve epidermiste ization. ilgi seçilen bölge olarak karşı sitoloji lekeli hücre koleksiyonları panoramik görüntüleme, tüm koleksiyonu alanının analiz edilmesini sağlar. Görüntü çözünürlüğü nükleer seviyeye yakınlaştırma için yeterli olduğunu; Hücre morfolojisi hassasiyetle tespit edilebilir. 4 Yaklaşık kullanılarak birbirine dikilmiş bir sitolojik boyanan hücre toplama son görüntüyü, göstermektedir. 100 ayrı yüksek çözünürlüklü dosyaları. Bu araçlar, yeni bir şekilde sürtünme ve / veya kuru göz etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.

Şekil 1
Kapaklı Şekil 1. Gösterim Sitoloji Silecek Alanı. Gösterim sitoloji üst kapak prolapsusunun tarafından gösterilen kapak silecek bölgeye yapıldı. kullanılan Membran Hücre Kültürü takın, 12 mm, hidrofil PTFE olduğunu. Önceden aksine tutulabilir membran tutucu, tırnaklarını (Notdar kapak kenar üzerine membran uygulaması ile karışmaz ve aslında uyum yardımcı olabilir onlar) uygulama öncesi kaldırılmış olduğu bulber konjunktiva, üzerinde keyfiyeti çalışmalar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Kapaklı Silecek Bölge gelen Şekil 2. Floresan Hücreler. Konfokal lazer tarama mikroskopisi büyük skuamöz hücreler arasında hücre morfolojisi değişimini gösteren (A) ve daha küçük bir kübik / kolon hücreleri (B). Kalsein AM yeşil flüoresan hücre gövdesi (yani, hücre canlılığı) esteraz etkinliği gösterir. Etidyum kırmızı floresan hücre zarı uzlaşma belirten nükleik asitleri, ortaya koymaktadır. Birkaç hücre yoğun yeşil ve hiçbir kırmızı floresan, muhtemelen göstermek hücre zarı bütünlüğü (c) dicative. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
IC Numune Şekil 3. Sitolojik Boyama. Morfolojisi ve farklı keratinizasyon değişen derecelerde kapak silecek bölge gösterinin hücreler. marjinal / tarsal konjonktivada bulunan büyük çekirdekleri ile, küçük sütunlu ve kübik hücrelerin mavi renk, hiçbir keratinizasyon gösteren (a); muko-kutanöz kavşakta (MCJ / Marx'ın 'Line) ve epidermisin nukleussuz hücrelerin yoğunlaştırılmış çekirdekleri büyük skuamöz hücrelerin kırmızı / turuncu leke gelişmiş keratinizasyon (c) temsil eder. kapak silecek konjonktiva bölgesinde Geçici renk (kırmızı / mavi) ve hücrelerin morfolojisi keratinizasyon sınırlı öneririz (b).g3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4. Kompozit Görüntü Kapak Silecek Hücre Koleksiyonu. Sitolojik boyamadan sonra kapak silecek alanının Gösterim sitolojisi. Görüntü yaklaşık kullanılarak birbirine dikilir. 100 ayrı fotoğraflar mikroskop ve 20X objektif ile çekilen. (A) Küçük sütunlu / tarsal / marjinal konjonktiva kübik epitel hücreleri. Burada Hücreler mavi / yeşil / mor bir renk yok keratinizasyon gösteren sergilemek; (B) kapak silecek konjonktiva hücreleri, bölgeler arasındaki morfoloji ve leke renk geçiş (a) ve (c); (C) muko-kutanöz kavşak / Marx'ın 'hattının büyük skuamöz hücreler. Turuncu leke renk keratinizasyon bazı derecesini belirtir, ve kırmızı / pembe geç sahne skuamöz geçiş gösterir; (D) Meibum izlenim; (E) nukleussuz, epidermisin boynuzsu hücrelerin; (F) Goblet hücre izlenim ya da gözyaşı müsinler. Aşağı doğru ok tarsal konjonktiva alanı gösterir, yukarı ok dış kapağı gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Gösterim sitoloji genellikle karışık selüloz ester membranlar kullanılarak, konjonktivada üzerinde gerçekleştirilir. Numuneler, dökme malzeme levhalar boyutta kesilir sterilize forseps kullanılarak konjunktival yüzeye uygulanan ve kaldırılır. Aynı membran malzeme kullanarak, bir piston kontrollü IC cihaz son zamanlarda uygulamalar 13 arasında tutarlı bir baskı bulber konjonktiva yüzey geometrisini maç ve korumak için tasarlanmıştır. Bu yaklaşımlar bölge silecek dar, belirgin kavisli kapağı verimsizdir (Şekil 1). Buna ek olarak, karışık selüloz ester membranlar, parlak alan mikroskopisi flüoresan görüntüleme öncesi numune hizalamak için gerekli olan kurulumları için gerekli saydamlığı sağlamaz. Bu protokolde önerilen hücre kültürü ekler onlar ideal büyüklükte sterilize edilir ve hızlı koleksiyonları sağlanması, daha fazla ekipman olmadan, el ele alınabilir çünkü uygundur. Membranlar yapılırkonfokal mikroskopi analizi için yeterli şeffaflık sağlar hidrofil PTFE.

Genel olarak, toplanan hücrelerin morfolojik özellikleri daha önceki literatür raporları 7,8,14,15 ile örtüşmektedir. Sonraki Papanicolaou boyaları, ince renk varyasyonu görüntülemek hücresel keratinizasyon düzeyinde daha detaylı bir bakış açısı sağlayan için alcian mavisi ile yaygın olarak kullanılan (ve chromatically çok yoğun) periyodik asit-Schiff (PAS) leke değiştirilmesi 7,8 önce bildirilen daha izin verir.

Sitolojik örneklerin mikroskobik görüntüleme genellikle görsel Okülerin aracılığıyla denetim ve "ilgi" olarak kabul yapıların yüksek büyütme fotoğraf içerir. Bu yaklaşımla, tüm koleksiyonun "büyük resim" yönleri kaybolmuş olabilir. Düşük büyütme çekim genellikle (nedeniyle vb vinyet, sapmaları, kadar) aşağı optik kalite ve çözünürlük hücresel ayrıntılı olarak tasvir yetersizs. tam membranın bir bakış yanı sıra nükleer detay yakınlaştırmak yeteneği, bir görüntüdeki tüm sağladığı gibi tüketen biraz daha fazla zaman, avantajlı iken panoramik dikiş protokolü, burada önerdi. Hücre sayısı gibi niceliksel ölçümlerini, nükleer sitoplazmik (NC) oranı 16 ve mesafeler burada hesaplanabilir.

örnek işleme adımları (bölümler 2.6 ve 3 ile 5) ve optimal panoramik dikiş için tutarlı görüntüleme parametreleri arasındaki doğru konjonktiva üzerinde membran uygulama (bölüm 2.4), zamanlama (bölüm 5.2: özel dikkat gerektiren protokolü içinde üç kritik adımlar vardır 0,6 - 5.2.8). epidermis ve tarsal sulkusta arasında 2 mm - nispeten düz konjonktivada aksine, bölgedeki silecek kapağı sadece 1 dar bir genişliğe yayılan, belirgin bir eğrilik vardır. Bu büyük ölçüde toplanmış hücre tipini etkileyebilir gibi, membran doğru açı tatbik edilmesi esastır. İkincisi, memmembran basınç uygulamaları arasında tutarlı olmalı. Araştırmacı, bu nedenle tekrarlanabilir koleksiyonları sağlamak için gerekli maharet geliştirmelidir. Numuneler bası sitolojisi tekniği kullanılarak toplanmıştır sonra, işleme zamanlaması önemli hale gelmektedir. Numuneler kurumasına izin verilmemeli, yani membran opak (bölümlerinin 5'e kadar 2,6, 3) haline gelmemelidir. sitolojik boyama geçmesi numune uzun bir süre için sabitleyici sol edilebilir olsa da (20 dk - 2 saat), immünositokimyasal lekeleri ilave edilmelidir ve mümkün olduğu kadar doğru hücre canlılığını değerlendirmek için, gecikmeden görüntülenmiş. zamanlama Tutarlılık da örnekler arasında karşılaştırılabilir sonuçlar için gereklidir; bir bütün numuneler karşılaştırılmak üzere eşit sabitleme ve boyama süreleri tutmak hedeflemelidir. Son olarak, sitoloji örneğinin niteliksel panoramik görüntüler elde etmek için, tüm görüntüleme parametreleri (mikroskop ışık yoğunluğu, kamera pozlama, kontrast, beyaz dengesi, vs.)Çevrede özellikleri (yani, hücre tipleri) en yüksek çeşitlilik ve tüm otomatik ölçüm ile, örnek bir temsilcisi bölgeye kalibre edilmelidir sonraki çekim (bölüm 5.2.6) için devre dışı bırakılabilir. Araştırmacı ayrıca X veya mikroskop sahne Y ekseni ya doğrultusunda hücre toplama yönlendirmek hedeflemelidir. Bu görüntü elde etme ve dikiş işlemi kolaylaştıracaktır. Bulmak ve komşu resimler arasında örtüşen bölgelerde numune (örneğin, hücre yamalar, meibum, enkaz, vb) ayırt edici özellikleri kullanmayı hedefliyoruz. mikroskop odak çekimler arasında düzeltilmesi tek ayar olmalıdır.

Başlangıçta kapak silecek hücrelerinin birbirine karışan yamaları elde bir% 67 başarı oranı bildirmiştir Jalbert 8, gözlemlediği gibi bu tekniğin sınırlama, hücre koleksiyonları değişkenliği yatıyor. Uygulama açısı Toplanan hücrelerin sayısını ve türünü belirler. Bu aşamada ağırlık belirsizdirhether toplama kalitesi (yani örnek üzerinde hücre sayısı) göz sağlığı ile ilişkilidir. Daha büyük örneklem büyüklüğü ile klinik denemeler bu tekniğin geçerliliğini kanıtlamak için gereklidir. Başka bir dezavantaj ise, IC tekniğin kendi doğasında invaziv yatmaktadır. Üstün hücre tabakaları zorla konjonktiva kaldırılır ve bu hasarın neden olabilir. immünositokimyasal lekeleri hücre canlılığını (ve esteraz aktivitesinin tüm koleksiyonları mevcuttur) yansıtmak için tasarlanmıştır iken, bizim koleksiyonlarda hücre çekirdeğinin kırmızı floresan işaret ne olduğu bilinmemektedir. Bazen, meibum (yani, kapak marjı salgılanan lipidler) oküler yüzey veya gözyaşı film ve diğer bileşenler hücresel özellikleri kapsayacak ve analiz zor veya imkansız hale eğiliminde olacaktır. Protokol meibum lipidlerini kaldırmak için ksilen içinde ek bir durulama maddesi ile değiştirilebilir. Son olarak, konjonktiva hücreleri üzerinde anestezik damla etkisi bilinmemektedir.

Kapak silecek bölgenin hücresel yapının veri elde bu hücrelerin ve oküler yüzey ve subjektif konfor arasında oluşan sürtünme arasındaki ilişkiyi doğrulamak yardımcı olacaktır. Bu değerli bilgi sağlamak ve kontakt lens kullananlar hücresel özgüllüklerini keşfetmek için gelecekteki klinik çalışmaların izin verecektir, asemptomatik bireylerde aksine kapak silecek epitelyopati, kuru göz ya da kuruluk belirtileri olan denekler umarım okular rahatsızlık konuda ışık tutacak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcian Blue, 1% in 3% Acetic Acid Sigma B8438-250ML
Hematoxylin, Gill 1 Sigma GHS116-500ML
Papanicolaou stain, OG-6 Sigma HT40116-500 ml
Papanicolaou stain, Modified EA Sigma HT40232-1L
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit Life Technologies L-3224 contains ethidium homodimer-1 and Calcein AM dyes
Alcaine (0.5% proparacaine hydrochloride) Alcon
Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm EMD Millipore PICM01250 
35 mm Glass Bottom Dishes MatTek Corporation P35G-0-20-C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barbato, G., et al. Diurnal variation in spontaneous eye-blink rate. Psychiatry Res. 93, 145-151 (2000).
  2. Korb, D. R., et al. Lid-Wiper Epitheliopathy and Dry-Eye Symptoms in Contact Lens Wearers. Eye & Contact Lens. 28, 211-216 (2002).
  3. Dumbleton, K., Woods, C. A., Jones, L. W., Fonn, D. The impact of contemporary contact lenses on contact lens discontinuation. Eye & Contact Lens. 39, 93-99 (2013).
  4. Roba, M., Duncan, E., Hill, G., Spencer, N., Tosatti, S. Friction measurements on contact lenses in their operating environment. Tribol Lett. 44, 387-397 (2011).
  5. Sickenberger, W., Pult, H., Sickenberger, B. LIPCOF and contact lens wearers: a new tool to forecast subjective dryness and degree of comfort of contact lens wearers. Contactologia. 22, 74-79 (2000).
  6. Pult, H., Purslow, C., Berry, M., Murphy, P. J. Clinical tests for successful contact lens wear: relationship and predictive potential. Optom Vis Sci. 85, E924-E929 (2008).
  7. Doughty, M. J. Morphological features of cells along Marx's line of the marginal conjunctiva of the human eyelid. Clin Exp Optom. 96, 76-84 (2013).
  8. Jalbert, I., et al. Assessing the human lid margin epithelium using impression cytology. Acta Ophthalm. 90, e547-e552 (2012).
  9. Nelson, J. D. Impression cytology. Cornea. 7, 71-81 (1988).
  10. Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84, 798-801 (1977).
  11. Wilson, T. Confocal microscopy. Academic Press. London. 1-64 (1990).
  12. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  13. Tomlins, P., Roy, P., Curnow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival Impression for Flow Cytometry. Invest Ophthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
  14. Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Res Proj Dry Eye Syn. 45, 108-122 (2010).
  15. Knop, E., et al. The lid wiper and muco-cutaneous junction anatomy of the human eyelid margins: an in vivo confocal and histological study. J Anat. 218, 449-461 (2011).
  16. Christensen, J. A., Skaarland, E. Nuclear and cell area measurements in the cytological evaluation of pleural effusions: a study of subjective assessments and morphometric measurements. Diag Cytopathol. 3, 50-54 (1987).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics