Gennemførelse af en sammenhængende Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System på en Ti: Sapphire og OPO laserbaseret Standard Laser Scanning Microscope

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Sammenhængende anti-Stokes Raman spredning (CARS) mikroskopi baseret på iboende vibration af molekyle obligationer tillader label-fri kemisk selektiv levende celler. Dette arbejde viser gennemførelsen af ​​en supplerende mikroskopi teknik på en standard multifoton laser scanning mikroskop baseret på et femtosekund Ti: safir laser og en OPO laser.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Mytskaniuk, V., Bardin, F., Boukhaddaoui, H., Rigneault, H., Tricaud, N. Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope. J. Vis. Exp. (113), e54262, doi:10.3791/54262 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Laser scanning mikroskoper kombinerer en femtosekund Ti: safir laser og en optisk parametrisk oscillator (OPO) at duplikere laser linje er blevet tilgængelige for biologer. Disse systemer er primært designet til multi-kanal to-foton fluorescens mikroskopi. Men uden nogen ændring, supplerende ikke-lineær optisk mikroskopi, såsom anden harmonisk generation (SHG) eller tredje harmoniske generation (THG) kan også udføres med denne opsætning, så etiketten uden billeddannelse af strukturerede molekyler eller vandig mellem- lipid grænseflader. Disse teknikker er velegnede til in vivo observation, men er begrænset i kemisk specificitet. Kemisk selektiv billeddannelse kan opnås fra iboende vibrationssignaler baseret på Raman-spredning. Konfokal Raman mikroskopi giver 3D rumlig opløsning, men det kræver høj gennemsnitlig effekt og lang erhvervelse tid. For at overvinde disse vanskeligheder, har de seneste fremskridt inden for laserteknologi tilladt udvikling af ikke-lineær optisk vibrations mikroskopi, især sammenhængende anti-Stokes Raman spredning (CARS). CARS mikroskopi har derfor vist sig som et effektivt værktøj til biologisk og levende celler ved kemisk kortlægning lipider (via CH stræk vibration), vand (via OH stretch vibrationer), proteiner eller DNA. I dette arbejde, vi beskriver gennemførelsen af ​​CARS teknik på en standard OPO-koblede multifoton laser scanning mikroskop. Den er baseret på den in-time synkronisering af de to laserlinjer ved at justere længden af ​​en af ​​laserstrålevejen. Vi præsenterer en trin-for-trin gennemførelse af denne teknik på en eksisterende multifoton system. En grundlæggende baggrund i eksperimentel optik er nyttige og præsenterede systemet ikke kræver dyrt supplerende udstyr. Vi illustrerer også CARS imaging opnået på myelinskeder af iskiasnerven af ​​gnaver, og vi viser, at denne imaging kan udføres samtidig med andre ikke-lineær optisk billeddannelse, såsom standard tWO-foton fluorescens-teknik og anden-harmonisk generation.

Introduction

Optisk mikroskopi er blevet en vigtig teknik til ikke-destruktiv visualisering af dynamiske processer i levende biologiske systemer med en subcellulær opløsning. Fluorescensmikroskopi er i øjeblikket den mest populære billeddannelse kontrast, der anvendes i levende celler på grund af sin høje specificitet og følsomhed 1. En stor palet af fluorescerende prober er opstået (exogene farvestoffer, genetisk indkodede proteiner, halvleder nanopartikler). Forskellige belysningsstyrke prøve fluorescerende teknikker har blomstrede (såsom konfokal eller to-foton mikroskopi) at udføre 3D billedbehandling og at reducere en største ulempe ved denne teknik, der er fotoblegning 2. Andre begrænsninger omfatter kravet om fluoroforen mærkning, fordi de fleste af molekylære arter er ikke i sig selv fluorescerende og har derfor kunstigt indført i det afbildede prøve disse fluoroforer. Denne kunstige manipulation kan være forstyrrende især for små molekyler eller inducerer potrentielle foto-toksicitet. Disse grunde gør fluorescensmikroskopi ikke velegnet til in vivo observationer. Derfor er brugen af ​​optiske billeddannende teknikker med høj følsomhed og specifikke molekylære kontraster uden anvendelse af fluorescerende molekyler er meget ønskeligt i biomedicinsk videnskab.

Flere ikke-lineære optiske billeddiagnostiske teknikker uden mærkning eller farvning er opstået, herunder anden-harmoniske generation (SHG) 3,4 og tredje-harmonisk generation (THG) 5. SHG mikroskopi er blevet brugt til billedet strukturelle ordninger på supramolekylære niveau såsom mikrotubuli eller kollagen 6. THG genereres fra optiske heterogeniteter, såsom grænsefladen mellem et vandigt medium og lipider 7. THG blev også demonstreret af billedet myelin 8,9. Begge teknikker kan gennemføres på en to-foton fluorescens mikroskop og kun kræve en laserstråle. Men de kræver høj effekt laser intensitet (typisk 50mW ved 860 nm for SHG 10, 25 - 50 mW ved 1.180 nm for THG 9), som er skadelig i levende prøver, og ikke giver den kemiske specificitet, der kræves til entydigt billede specifikke biologiske strukturer.

Kemisk selektiv billeddannelse kan opnås fra iboende molekylære vibrationer signaler baseret på Raman-spredning. Når en lysstråle rammer stof, kan fotoner absorberes og spredt af atomer eller molekyler. De fleste af de spredte fotoner vil have den samme energi, dvs. frekvens, som de indfaldende fotoner. Denne proces kaldes Rayleigh-spredning. Imidlertid vil et lille antal fotoner blive spredt ved en optisk frekvens forskellig fra frekvensen af de indfaldende fotoner, dvs., med en uelastisk spredning proces kaldet Raman-spredning. Forskellen i energi stammer fra excitation af vibrationsformer afhængigt molekylære struktur og miljø. Derfor spontan Ramanspredning provides kemisk selektiv billeddannelse som forskellige molekyler har specifikke vibrationsfrekvenser. Men det er begrænset på grund af sin ekstremt svagt signal. Konfokal Raman mikroskopi er udviklet og giver 3D rumlig opløsning, men det kræver høj gennemsnitlig effekt og lang erhvervelse tid 11. For at overvinde disse vanskeligheder, har de seneste fremskridt inden for laserteknologi tillod fremkomsten af ikke-lineær optisk vibrations mikroskopi, især sammenhængende anti-Stokes Raman spredning (CARS) 11,12,13.

BILER er en tredje ordens lineære optiske proces. Tre laserstråler, der består af en pumpe stråle mod frekvens ω P, er en Stokes stråle mod frekvens ω S og en sonde stråle (oftest er den pumpe) fokuserede i en prøve og generere en anti-Stokes stråle ved frekvensen ω AS = ( 2ω P - ω S) 14. Den anti-Stokes-signalet kan blive væsentligt forbedret, når frekvensforskellenmellem pumpen og Stokes bjælker indstilles til en Raman molekylær vibration Ω R = (ω P - ω S). CARS signal er baseret på multipel foton interaktion. Det genererer derfor en sammenhængende signal størrelsesordener stærkere end spontan Raman spredning.

CARS mikroskopi blev først eksperimentelt påvist af Duncan et al. 15. Zumbusch et al. Forbedres derefter teknikken, ved anvendelse af to fokuserede nær-infrarøde femtosekund laserstråler med en objektivlinse med høj numerisk apertur, således at fase matching tilstand af biler og undgå de to-foton ikke-resonant baggrund 16. CARS mikroskopi har derfor vist sig som et effektivt værktøj til levende celler og væv billeddannelse ved kemisk detektion molekyler såsom lipider (via CH stretch vibration) 17,18, vand (via OH stretch vibrationer), proteiner, DNA i levende celler 19,20 men også deutereret kemisk forbindelses til farmaceutisk 21 og kosmetiske anvendelser 22.

Den største begrænsning af ikke-lineær mikroskopi stammer fra kompleksiteten og omkostningerne ved de optiske kilder. En CARS system kræver to bølgelængde afstemmelige lasere med korte puls varigheder og med tidsmæssigt og rumligt synkroniserede puls tog. Tidlige CARS mikroskoper var baseret på to synkroniseret picosekund Ti: safir lasere 20. CARS billeddannelse blev også opnået fra en enkelt femtosekund Ti: safir laser genererer en superkontinuum lyskilde 23. For nylig, laser kilder bestående af en enkelt femtosekund Ti: har safir laser pumpe en justerbar optiske parametriske oscillatorer (OPO) været brugt til CARS mikroskopi. Denne opsætning giver reelt tidsmæssigt synkroniseret bjælker med en forskel på frekvens mellem pumpen og Stokes stråle, der dækker det fulde molekylære vibrationelle spektrum 24. Desuden laserscanningmikroskoper baseret på en omsætningnøgle fs laser og en OPO, primært anvendes til to-foton fluorescens (TPF) er nu tilgængelige for ikke-fysikere. Potentialet i sådanne opsætninger kan stærkt forbedret uden at kræve yderligere investeringer ved inkorporering af andre ikke-lineær optisk billeddannelse, da hver lineær (NLO) imaging modalitet er følsomme over for specifikke strukturer eller molekyler. Multimodal NLO imaging udnytter derfor potentialet i NLO mikroskopi for komplekse biologiske prøver 25. Koblingen af disse teknikker har muliggjort undersøgelse af mange biologiske spørgsmål, navnlig på lipidmetabolisme, hud eller cancerudvikling 26, skeletmuskel udvikling 27, atherosklerotiske læsioner 28. Desuden gennemførelsen af laserstrålescanning med CARS giver evnen til high-rate billedbehandling, dvs en tiltalende værktøj til at studere dynamiske processer in vivo.

Formålet med dette arbejde er at vise hvert trin at gennemføre than CARS teknik på en standard multifoton laser scanning mikroskop. Mikroskopet er baseret på en fsec Ti: safir laser og en OPO (pumpes af Ti: safir laser) drives af en software til biologer. Integrationen blev udført ved at justere længden af ​​en af ​​laserstrålens vej for at synkronisere i gang de to bjælker. Vi beskriver trin-for-trin gennemførelsen af ​​denne teknik, som kun kræver grundlæggende baggrund i eksperimentelle optik. Vi illustrerer også CARS Imaging opnået på myelinskeder af iskiasnerven af ​​gnavere, og vi viser denne imaging kan udføres samtidig med andre ikke-lineær optisk billeddannelse, såsom standard to-foton fluorescens teknik og anden-harmoniske generation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

figur 1
Figur 1. Skematisk afbildning af den generelle opbygning Det omfatter Ti:. Safir (680 - 1.080 nm) og OPO (1.050 - 1.300 nm) lasere, forsinkelseslinien med de 4 spejle (M 1 til M 4), den hurtige oscilloskop, fotodioden og to faste iris membraner I1 og 2. Spejle M 2 og M 3 er fastgjort på en lineær translation stadium gør det muligt at ændre forsinkelsen linjelængde med et mikrometer opløsning. En 660 -. 685 nm båndpasfilter blev placeret foran fotomultiplikatorrørets (PMT), der anvendes til BILER imaging Klik her for at se en større version af dette tal.

1. Idrifttagning af lasersystem

  1. Kontroller, at Ti: safir bølgelængde er indstillet til 800 nm eller defineredenne bølgelængde på Ti: safir strømforsyning controller. Drej nøglen fra Standby til Til for at tænde Ti: safir laser.
  2. Tænd OPO-laser ved bagsiden af ​​OPO controller og åbn Ti: safir lukkeren på Ti: safir strømforsyning controller.
  3. Tænd for tablet computer til at pumpe op OPO. Klik på OPO Connected og Remote Connected ikoner på tablet. Vent i 30 - 40 min til opvarmning.
  4. Tænd mikroskopet computeren og tænde på "Microscope Components" skifter. Start softwaren ved at dobbeltklikke på ikonet på skrivebordet.
  5. Ind i fanen software Acquisition Åbn Laser værktøj i Setup Manager til at betjene begge lasere fra softwaren. Vælg Ti: safir laser On og OPO laser On. Kontrollere værdien af ​​den optiske laser power (typiske værdier for 3.700 mW ved 800 nm og 700 mW ved 1000 nm).
  6. For at konfigurere strålegangen og lasere,åbne Light Path værktøj i Setup manager værktøj gruppe og afkrydsningsfeltet den første Fotomultiplikatorrør (PMT).
  7. Sådan kontrolleres Ti: safir laser spot på outputtet af det mål, åbne kanaler værktøj i Acquisition Parameter værktøj gruppe. Vælg Ti: safir effekt ved lav værdi (ca. 1%), reducere gevinsten til 0 (der er behov for noget billede på dette stadium), og klik på Kontinuerlig knap for at starte scanning procedure at lancere laserstrålen gennem mikroskop mål. Kontrol af tilstedeværelse af en rød plet ved direkte observation ved at placere IR laser gennemsyn kort på outputtet af luften mikroskopobjektiv (10X).
  8. For at kontrollere OPO laser spot, stop scanning af Ti: safir laser ved at klikke på knappen Stop. Vælg OPO effekt ved lav værdi i vinduet Kanaler og klik på Continuous knap.

2. Mikroskop Indstillinger

  1. Manuelt placere dichroic spejl med en cutoff bølgelængde på 760 nm i sideport skyderen i uendelighed rummet over målet næsestykket at starte lys op til 760 nm fra prøven i PMT'erne i ikke-descanned detektion (NDD) mode.
  2. Sæt den smalle båndpasfilter på 660-685 nm i NDD reflektor terning foran PMT1 til kun at optage CARS signal ved 670 nm til at reproducere de resultater, der præsenteres i dette arbejde.
  3. Placer et smalt båndfilter fra 500 til 550 nm i NDD reflektor terning foran pMT3 til fluorescens observation af myelin. Placer et smalt bånd filter spænder fra 565 til 610 nm i reflektoren terning foran PMT4 for SHG observation.
  4. For at vælge i softwaren optagelsen af signalet på detektoren med ad hoc-band pass filter, åbn Light Path værktøj i menuen Setup manager fanen Acquisition. Aktiver den ønskede PMT (afkrydsningsfelt) og vælg en farve til denne kanal. I dette arbejde, blev den grønne valgt til CARS, rød til fluorescens og magenta til SHG.

3. Temporal Synkronisering

Bemærk: De to laserstråler stammer fra samme Ti: safir-laser, men OPO strålen forsinkes, når det er genereret således de to stråler ikke er synkroniseret i tid, hvor de når mikroskopet. Målet her er at forsinke en af ​​de to stråler for at synkronisere dem i tide, før de når mikroskopet.

  1. Slut med BNC kabler input kanal CH1 af oscilloskopet til den elektriske BNC laser output (Sync. Out). Slut indgangskanal CH2 af oscilloskopet til fotodiode og vælge CH1 kanal som udløser kanal ved at trykke TRIGGER MENU, derefter den vigtigste-menuknappen Source og derefter side-menu knap, der svarer til den valgte C-kanalH1.
  2. Position og fix med optiske monteringsmuligheder indlæg fotodiode i brændplanet af en luft mikroskop mål (10X) eller i strålebanen af ​​mikroskopet efter fjernelse af målet. Bemærk: Fjern om nødvendigt kondensatoren og dets luftfartsselskab.
  3. I Kanaler værktøj (Acquisition Parameter værktøj gruppe), definere Ti: safir laser bølgelængde på 830 nm ved lav effekt (dvs. mindre end 1% af den fulde effekt). I Acquisition mode værktøj, reducere scanningsområdet til et punkt for at belyse fotodiode med den mindste stråle. Tænd laseren scanning ved at klikke på Kontinuerlig knappen.
  4. Tryk AUTOSET på oscilloskopet frontpanelet og manuelt flytte placeringen af fotodioden for at få de impulstog på skærmen. Tryk på RUN / STOP-knappen for at fryse displayet.
    1. For at gemme en kopi af oscilloskop skærm, indsætte en 3,5tomme diskette i diskettedrevet eller tilslut GPIB port på bagpanelet til en computer. Tryk derefter SHIFT HARDCOPY MENU, trykke FORMAT (hoved) for at vælge TIFF-billede format, og angiv i menuen Port output kanal. Tryk på knappen HARDCOPY at registrere oscilloskop visning af puls tog af Ti: safir laser.
  5. Sluk for Ti: safir laser scanning ved at klikke på knappen Stop. Ved at klikke Kanaler værktøj definerer OPO signal ved 1107 nm og lavt strømforbrug. Tænd for OPO laser scanning og registrere puls tog af OPO laser på oscilloskopet. Sluk for OPO laser scanning.
  6. Sammenlign tidsmæssige forskydning mellem Ti: safir og OPO signaler.
    BEMÆRK: Den tidsmæssige forskydning t skift giver længden af forsinkelseslinien L DelayLine som skal gennemføres efter ligningen: L delayLine = c5; T-skift hvor c er lysets hastighed.
  7. Vælg en af ​​de laser linjer.
    BEMÆRK: I dette arbejde, Ti: blev safir laserlinje valgt, fordi ledig plads var tilgængelig i nærheden af ​​denne laser linje. Derudover dette valg gør det muligt at opnå den re-alignment af laseren linje med en synlig laserlys.
  8. Åbn laser linje ved at fjerne de beskyttende rør ved den position, hvor forsinkelsen vil blive gennemført.
    Forsigtig! Bær passende beskyttelsesbriller og fjern kæde armbånd eller se fra håndled.
  9. Vælg en bølgelængde i det synlige område for at være i stand til nemt at observere laserstrålen (700 nm for eksempel ved lav effekt i kanalerne værktøjet af softwaren). Tænd for laseren scanning.
  10. Placer og sæt med optisk montering indlæg to iris membraner langs åbne laserlinje. Placer en iris ved udgangen af ​​forsinkelsen linje og placere andre iris ved indgangen af ​​periskop.
    BEMÆRK: periscope kontrol med to motoriserede spejle fremkommet i forbindelse med software vinklen på indgangen af ​​laserstrålen i scanning leder af laserscanning mikroskop.
  11. Reducer irisblænde blænde og justere membran positioner for at passe laserstrålen sti. Fix dem på den optiske bordet. Justere den lodrette position af en tredje mobil membran iris, at kontrollere højden af ​​laserstrålen, mens successivt positionering af fire spejle af forsinkelseslinien.
    BEMÆRK: Disse iris membraner vil tjene som kontrol for proceduren re-tilpasning ved at vise vej at følge.
  12. Placer spejlet M1 monteret på en kompakt kinematisk spejl mount ved indgangen af forsinkelseslinie (som vist i figur 1) og justere sin position og dens orientering for at opretholde strålen højde med anvendelse af den mobile irisblænde. Place spejle M2 og M3 (også monteret på kompakte kinematiske spejl mounts) ved 90 ° på oversættelsen fase, som vil blive placeret på midcourse. Anbring dem til at passe forsinkelseslinien længde som tidligere beregnet.
  13. Juster orienteringen af ​​M2 og M3 med brug af den mobile irisblænde. Set M4 (også fastgjort på en kompakt mount) ved afgangen fra forsinkelseslinien (lige før iris I 1 som vist i figur 1) og omhyggeligt justere sin position og vinkel til at passe laserstrålen sti gennem to faste iris membraner.
  14. Placer laseren gennemsyn kortet på udgangen af mikroskopobjektivet og tjekke laserstrålen profil ved at klikke på Kontinuerlig at tænde laser scanning. Overhold en ensartet lys disk. Hvis det er nødvendigt, let justere retningen af ​​M4.
  15. Position igen den hurtige fotodiode under laserstrålen i prøven fokusplan af mikroskopet. Overhold den tidsmæssige forskydning mellem Ti: safir laserstråle og OPO stråle på oscilloskopet.
    Bemærk: Hvis det er nødvendigt, ændre forsinkelsen line længde ved at flytte hele systemet M2, M3 monteret påoversættelse etape (uden at ændre oversættelsen fase tuning) for at synkronisere begge pulser. kan kræves Ændringer af nogle få centimeter.

4. Spatial Overlap af bjælker

Bemærk: For at producere et CARS signal, er den rumlige overlapning af de to laserstråler påkrævet. Den alternative belysning af begge stråler på samme perler farves hele med to forskellige fluorescerende farvestoffer kan anvendes til at indikere den rumlige forskydning. Fin justeringer af spejlpositioner kan derefter minimere skift.

  1. Brug formonteret fluorescerende mikrokugler. Eller montere mikrosfærer i suspension på rene objektglas som beskrevet nedenfor:
    1. Før prøvetagning, at mix (på en cortex mixer eller ved sonikering) den perler løsningen være sikker på, at perlerne ensartet suspenderet.
    2. Påfør 5 pi af perlesuspensionen til overfladen af ​​et objektglas og spredes med pipettespidsen. Vent til dråben at tørre og derefter anvende 5 ul mounting medium, såsom glycerol, vand eller nedsænkning olie over den tørre prøve af perler. Dæk prøven med et dækglas og forsegle dækglasset med hurtigtørrende lim eller smeltet paraffin.
  2. Placer de fluorescerende polystyrenperler fikseret på et objektglas under 20X vand målet. Tilføj par dråber af vand for at fordybe målet.
  3. For at opnå fokus på perlerne, åbne Find fanen i softwaren for at skifte fra laserscanning tilstand til direkte observation af prøven med øjet, ved at trykke på knappen Online. Åbn Ocular til at markere ad hoc filter og tænd for halogenlampe ved at klikke på ikonerne.
  4. Fjern manuelt det dikroiske spejl i skyderen sideports- i uendeligt rum og bruge fokusdrevet af mikroskopet til at fokusere prøven flyet ved at observere perlerne med okularerne. Udskift dichroic spejl.
  5. iFind fanen skifte til laserscanning tilstand ved at trykke på knappen Offline. Gå til fanen Acquisition at definere parametrene for scanning: Vælg rammen størrelse til 512 pixels, en scanning hastighed på 9, en gennemsnitsberegning af en, lidt dybde på 8 bit og øge scanningsområdet til det maksimale.
  6. I Kanaler værktøj under fanen Acquisition, tilføje et spor (spor 1), hvis det ikke allerede oprettet. Vælg bølgelængde på 830 nm og lavt strømforbrug for Ti:. Safir laserstråle Afkryds farven til grøn i Spor 1 kasse fra vinduet Kanaler og i pMT3 eller PMT4 feltet Light Path vinduet.
  7. I Kanaler værktøj under fanen Acquisition, tilføjer en anden Track (Spor 2). Vælg bølgelængden på 1107 nm og lavt strømforbrug for OPO laserstråle. Sæt kryds i farven til rød i Spor 2 feltet vinduet Kanaler og i pMT3 feltet
  8. Justér forstærkningen af begge spor til 600. Derefter sekventielt anvende scanning af de to stråler på prøve ved at klikke på Kontinuerlig.
  9. Overhold billedet i skærmens område i 2D-visning. I Display View Option kontrol blok, justere skærmen intensitet.
    Bemærk: Hvis det er nødvendigt, at flytte lidt fokusdrevet at finde fokus planet af perlerne. Juster Beskær og zoome billedet i en enkelt perle eller i en gruppe af tilstødende perler.
  10. Brug periskop controller til at overlappe bjælkerne i xy-planet. I softwaren Åbn fanen Vedligehold. Klik på System Optioner og vise Motoriseret Periscope værktøj vindue. Brug grove og fine justeringer af periskop spejle Ti: safir laserstråle for at synkronisere i rummet begge billeder.
  11. For periskop manipulation, bruge de første justering barer til lodret og second en for vandrette bevægelser af laserstrålen. Flyt bjælken med input spejl indtil billedet er lidt synlig, og derefter kompensere for laser intensitet med output spejl af periskopet ved at klikke på "input" og "output".
  12. For at vertikalt overlapper bjælkerne, i fanen Vedligehold, åbne Kollimatorværktøjet og justere værdien af brændvidden af Ti: safir laserstråle.
  13. Flyt forsigtigt målet lodret position til at kontrollere forskellen fokus på begge billeder. Eller tage en z-stak af prøven ved åbningen i fanen Acquisition Z-Stack værktøj og vælge de forskellige parametre (interval, antal skiver). Tryk Ortho i billedet skærmområde at se strålerne i aksialt tværsnit. Maksimer z-overlap ved at gøre den samme procedure flere gange.

5. Afsluttende Justeringer og Sammenhængende Anti-Stokes Raman spredning (CARS) Signal Observation fra olivenolie Droplets

  1. Put en dråbe af olivenolie på en glasplade og dække det med et glas cover slip. Tilføj par dråber vand til at nedsænke en 20X vand nedsænkning mål. Fokus på kanten af ​​dækglasset ved hjælp okularerne (som forklaret tidligere i 4.2).
  2. I Kanaler værktøj under fanen Acquisition, vælger i Spor 1 bølgelængden på 830 nm for Ti: safir laserstråle og ved 1107 nm for OPO. Sæt kryds begge lasere i Spor 1 for at få en samtidig scanning af begge lasere. Set beføjelser ved lav værdi til en start.
  3. I strålegangen vinduet, skal du vælge PMT1. Tænd laser scanninger ved at klikke på Kontinuerlig knappen. Bevæge sig lidt fokus at levere laserlyset i olien tyndt lag.
  4. Om nødvendigt øge den optiske effekt af begge lasere. Juster skærmens intensitet i Display View Option kontrol blok. Flyt langsomt oversættelse etape af forsinkelsen linje indtil signalet bliver SIGligt forbedret.
  5. Efter de fine justeringer er færdige, kontrollere, om det er virkelig en BILER signal: Flyt lidt oversættelsen fase; intensiteten af ​​signalet skal blive svagere. Og / eller slukke en af ​​laserstrålen, enten Ti: safir laser eller OPO. Igen skal der være en stærk henfald i intensitet i forhold til bilerne signal.
  6. For at opnå den maksimale CARS signal, skal du vælge indstillingen af ​​den software til at give en værdi af den gennemsnitlige intensitet hele billedet (i Histo billede af skærmbillede område). Juster bølgelængde (få nm), derefter x, y, z positioner af fokus stråle at maksimere betyde intensitetsværdi.

6. Bilag af strålegang af forsinkelseslinjen

  1. Da det endelige system er dedikeret til ikke-fysikere, vedlægge strålegangen af ​​forsinkelsen linje med rør eller en indhegning kasse, for at undgå direkte adgang til skadelige ikke-synlige høj spidseffekt laserstråle. Vær omhyggelig med at give en adgang til oversættelsen faseknop.

7. Bølgelængde Tuning til BILER

  1. Brug ligningen ligning 1 at tune laser bølgelængder til den ønskede Raman vibrationer. For at gengive resultaterne i dette arbejde billedet CARS signal fra CH obligationer har stræksvingningsområde af 3015 cm-1, skal du vælge λ Ti: safir = 830 nm og λ OPO = 1095 nm.
    BEMÆRK: Raman karakteristiske vibrationsfrekvenser observeret i biologiske prøver, såsom vand, kan CH bond findes i Evans et al 13 eller i Ellis et al 29...
  2. Brug ligningen ligning 2 at bestemme emissionsbølgelængde på CARS signal. For CH bond billeddannelse af CARS, vælge et snævert bånd filter ved 670 nm, da Å-BILER = 670 nm med laser bølgelængder præsenteres i 7.1.
    BEMÆRK: En mobiltelefon ansøgning er available at beregne Å-BILER fra λ P og λ S-værdier (se reference 30).

8. Observation af CARS Signal og Stained Myelin fra iskiasnerven Cuts

Bemærk: Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med de institutionelle regler.

  1. Forbered de aksiale og langsgående iskiasnerven nedskæringer på et objektglas, som præsenteres i Ozcelik et al. 31.
  2. Forbered fluoromyelin røde farvning ved at fortynde stamopløsningen 300-fold i PBS. Oversvømme nerve snit med farveopløsningen i 20 minutter ved stuetemperatur. Fjern opløsningen og vask 3 gange i 10 minutter med PBS.
  3. Placer de nedskæringer under 20X nedsænkning i vand mål. Placer en dækglas. Tilføj par dråber PBS til fordybe mål og justere fokus af målet for at opnå et klart billede af de nedskæringer gennem okularer (som tidligere beskrevet i 4.2).
  4. <li> I spor 1, skal du vælge Ti: safir og OPO lasere og definere deres bølgelængder til 830 nm og 1095 nm. I strålegangen vinduet, skal du vælge PMT1 og grøn farve.
  5. I spor 2, skal du vælge OPO laser kun (bølgelængde på 1095 nm). I strålegangen vinduet, skal du vælge PMT4 og rød farve.
  6. For begge lasere, vælg lavt strømforbrug og indstille forstærkningen til 600 til en start. Tænd laseren scanner og justere følgende parametre for at forbedre CARS og fluorescens-signalet kontraster: effektværdier, oversættelse etape knop (meget lidt), bølgelængder (par nm), display intensitet.
  7. For at optage endelige billeder i høj opløsning, skal du vælge i Acquisition mode værktøj følgende parametre: rammestørrelse på 1.024 pixels, scanningshastighed på 7, gennemsnitsberegning af 4. Klik på knappen Snap for optagelse af et enkelt billede. Gem billedet i proprietære formularved at optage billedet og det fuldstændige erhvervelse parametre.

9. Observation af biler og SHG Signaler fra iskiasnerven Cuts

  1. Forbered iskiasnerven, som præsenteres i Ozcelik et al. 31.
  2. Følg proceduren som beskrevet i del 8 for at få et billede gennem okularerne og til at vælge CARS signalparameter (spor 1).
  3. I spor 2, skal du vælge OPO laser kun (bølgelængde på 1095 nm). I strålegangen vinduet, skal du vælge pMT3 og magenta farve.
  4. Følg proceduren som beskrevet i del 8 for at tænde laser scanner og gemme billeder i høj opløsning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Pulsen tog hyppigheden af ​​standard Ti: safir laser er typisk omkring 80 MHz. Den OPO har den samme frekvens, idet den pumpes af Ti: safir laser. En hurtig oscilloskop på mindst 200 MHz er derfor påkrævet. En hurtig fotodiode i intervallet 600 til 1.100 nm er også påkrævet. Den maksimale tidsmæssige forskydning opstår, når Ti: safir og OPO signalerne forskydes på 1 / (2 x 80 x 10 6) = 6,2 nanosekunder. Den svarer til en maksimal strålegang skift på 1,9 m Figur 2 viser impulstoget optaget fra OPO laserstrålen (A) og fra Ti:. Safir laserstråle uden forsinkelseslinien (B) og med den justerede forsinkelseslinie (C ). Pulstogene således groft synkroniseret i tid med den implementerede forsinkelseslinie som vist i figur 2A og 2C.

pg "/>
Figur 2. Laser puls tog optagelser til den tidsmæssige synkronisering Optagelse af puls tog på mikroskopet prøve fly med en 10X mål for OPO stråle (A), Ti:. Safir laserstråle uden (B) og med forsinkelsen linje (C ). Den øverste kurve af hver graf plots signalet direkte indspillet fra BNC-stik på bagsiden af ​​Ti: safir laser (Sync out stik.). Den oscilloskop udløser justeres på dette signal. Klik her for at se en større version af dette tal.

Den rumlige overlap af de to stråler kan opnås ved visualisering af fluorescerende polystyrenperler fast på toppen af et objektglas (figur 3A). Figur 3B viser billedet af tre nærliggende perler givet vedOPO laser ved 1107 nm (rød falsk farve) og af Ti: safir laser på 830 nm (grøn falske farver). Den rumlige forskydning mellem begge laserstråler er blevet kompenseret ved at følge fremgangsmåden af den rumlige synkronisering tidligere beskrevet (figur 3C).

Figur 3
Figur 3. Rumlig overlap af bjælkerne. General view af de fluorescerende mikrokugler (A). Ind på 3 tilstødende mikrokugler. Belysningen af perler på 830 og 1107 nm viser en rumlig forskydning af perle billeder (falske farver) (B). Efter x, y, z justeringer, er perle billeder flettes (C). Klik her for at se en større version af dette tal.

Finalentrin for at opnå den præcise tidsmæssige justering for at aktivere biler kan nemt realiseres ved billeddannelse olivenolie dråber (indeholdende talrige CH bindinger 32) og ved at flytte lidt spejle forsinkelseslinien at udføre synkroniseringen i tide af både laser pulstog. Figur 4 viser billeder af en olivenolie dråbe leveret fra Ti: safir laser belysning kun (Figur 4A) og fra OPO belysning kun (figur 4B). Begge stråler samtidigt anvendte inducere et klart signal enhancement (figur 4C) ved 670 nm, hvilket svarer til en CARS signal fra iboende carbon-hydrogen (CH) stræksvingningsområde med et Raman vibration interval omkring 2.800 - 3.100 cm-1. CARS signal (C) forsvinder, når én af de to stråler er slukket. Da olivenolie indeholder naturlige fluoroforer 33, navnlig klorofylmolekylerne udsender i området 650 - 670 nm, det svage signal i (A) og (B) er en multiphoton fluorescens proces. Intensiteten af ​​disse signaler er flere størrelsesordener lavere end CARS signal. Derfor er det ikke forstyrre målingen af ​​bilerne signal.

Figur 4
Figur 4. Afsluttende fine tidsmæssige justeringer for CARS signal udbrud. Olivenolie dråber kan bruges til at stille ind på tid begge stråler ved at justere forsinkelsen linje længde med den lineære oversættelse scenen med mikrometer-drev. Dråber under (A) 830 nm laser og kun under lys (B) 1107 nm laserlys viser kun et svagt signal. Under samtidig belysning (C), observeres klart enhancement signal, svarende til bilerne signal. Scale barer er 100 um. Raman vibrationer toppe på 3.015 cm -1. Klik hendee for et større version af denne figur.

Myelinskeden er en biologisk struktur produceret af specifikke celler, der kan samles og kondensat deres plasmamembran omkring axoner af neuroner i centralnervesystemet og det perifere nervesystem 34. Denne kappe er stærkt beriget med forskellige lipider. Vi bruges her myelinskeder iskiasnerven på en mus. Tværgående og langsgående iskiasnerven tværsnit segmenter er blevet farvet for to-foton fluorescens billeddannelse af myelin ved 1.095 nm, som vist i figur 5B og figur 5E, hhv. En fluoromyelin rødt farvestof, som har selektivitet for myelin blev anvendt 35. Disse prøver samtidigt har været belyst ved 830 og ved 1.095 nm og bilerne signal blev observeret (figur 5A og figur 5D). I figur 5A-C, cirklerne svarer til myelinskeder omkring axoner (tom plads iside ringene) i tværgående snit. Som vist i figur 5C og 5F er den samme struktur fundet under overlappende biler og fluorescens billeder. Vi konkluderer, at der kan opnås tilsvarende niveau for detaljer med CARS og derfor uden brug af fluorescerende mærkning.

Figur 5
Figur 5. CARS og farves myelin billeddannelse af iskiasnerven nedskæringer. (A) tværgående og (D) langsgående udskæringer af etiket-fri CARS billeddannelse af myelinskeder. (B) Tværgående og (E) langsgående snit af den samme prøve farvet ved fluoromyelin rødt farvestof under to-foton fluorescens belysning ved 1.095 nm. (C) Tværgående og (F) langsgående snit overlapning af begge billeder. Scale barer er 10 um. Gennemsnitlige optiske effekter var 5 mW ved 830 nm og 16mW ved 1095 nm for CARS signal. Gennemsnitlig optisk effekt var 8 mW ved 1095 nm for to-foton fluorescens billeddannelse. Raman vibrationer top ved 2.915 cm-1. CARS signalet forsvinder ved at stoppe scanning af en laser eller ved at flytte oversættelse etape ud af Raman resonans. Klik her for at se en større version af dette tal.

Udover CARS billeddannelse er den tilgængelige mikroskopi system tillader samtidigt at generere anden harmoniske fra collagenfibrene ved den ydre overflade af de iskiasnerverne. Denne yderligere billede kræver kun anvendelse af en anden detektor til at registrere et signal ved 550 nm (halvdelen af bølgelængden af OPO), da et smalt båndpasfilter ved 670 nm anvendes til biler signaloptagelse. Figur 6 viser en kontrast billede af myelinskeder afbildet i falsk grøn farve (CARS signal påly i figur 6A) omgivet af collagenfibre illustreret i falsk magenta farve (SHG kun i figur 6B). CARS signal blev opnået med gennemsnitlige optiske effekter af 4 mW ved 830 nm og 13 mW ved 1.095 nm, mens det krævede 50 mW ved 1.095 nm til opnåelse af SHG-signalet. meget lavere optisk energi Derfor kræves for at opnå CARS signal i forhold til SHG eller THG (ikke vist) signaler i vores biologiske prøver.

Figur 6
Figur 6. CARS og SHG billeddannelse af mus iskiasnerven. (A) CARS billedbehandling, (B) SHG billeddannelse og (C) samtidig visualisering af myelin ved CARS imaging (i grøn falsk farve) og af kollagen ved SHG imaging (i magenta) på musen iskiasnerven. Gennemsnitlige optiske effekter var 4 mW ved 830 nm og 13 mW ved 1095 nm for BILER. Gennemsnitlig optisk effekt var 50 mW ved 1,095nm for SHG. Scale bar er 10 um. Raman vibrationer toppe på 2.915 cm -1. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den mest udfordrende del af arbejdet er den tidsmæssige synkronisering af laserstråler. Det kræver en hurtig fotodiode kombineret med en hurtig oscilloskop, men kun et groft overlappende i tid kan udføres ved først. Derefter kræves en yderligere justering af få cm. Endelig mikrometer flytter ved en lineær oversættelse etape tillader udfører den endelige finjustering af forsinkelsen linje længde for at udløse CARS signal. Dette signal holdes i et snævert område på omkring 20 mikrometer, som observeres ved at tune oversættelsen mikrometerobjektglasset drev. Det svarer til et højdepunkt skift af stråler af omkring halvdelen af pulsen varighed, dvs 140 fsec. Den rumlige overlapning af de to stråler, som er nødvendige for CARS signal svarer til en normal lyshøjden for sådan laserscanningsmikroskop system.

kan opnås implementeringen af ​​forsinkelseslinien i få uger af biologer, der har en grundlæggende baggrund i eksperimental optik eller i samarbejde med fysikere. Særlig forsigtighed skal tages for valget af spejle til at minimere tab refleksion. Hvis hovedparten af ​​de materialer til at bygge forsinkelseslinien er overkommelig, oscilloskop, der kræves, er ikke en standard oscilloskop. Således da få dage er nok til at fuldføre den tidsmæssige synkronisering procedure, låne oscilloskopet fra en fysik laboratorium synes at være den bedste løsning. Rumlig overlapning kan være meget tidskrævende, da det kræver tuning af flere spejle og linser (som kan motoriseret afhængig af laser scanning system). Tidligere CARS laser system baseret på to elektronisk synkroniseret Ti: safir laser havde et problem med langsigtede (ti minutter til timer) tidsmæssig puls overlappende. Dette problem er blevet totalt løst med OPO pumpet med en unik laserkilde 20,21. Med sådan et lasersystem, og ved hjælp af solidt fastspændt optik, bjælker ingen tidsmæssig walk-off mellem pumpe og Stokes blev observeret overmåneders drift.

En væsentlig begrænsning af bilerne teknik er, at bilerne signal kan forekomme uden tilstedeværelse af resonante molekyler (fra opløsningsmidlet eller de spredere) 11. Denne ikke-resonant baggrund kan begrænse følsomhed. Måder at minimere denne baggrund omfatter konfigurationen af ​​detektion (fremad eller tilbage detektion), laser karakteristika (femtosekund eller picosekund), valget af opløsningen anvendes til at nedsænke det mål eller billede behandling. En baglæns detektering gør det muligt at minimere den ikke-resonante baggrund 11 som det blev anvendt i dette arbejde (figur 1). Femtosekund Ti: safir lasere giver høje maksimale intensiteter meget ønskelige for ikke-lineære optiske processer. Men i det spektrale domæne, bredden af ​​de fleste Raman linjer er mindre end den spektrale bredde af en femtosekund puls henviser det passer den spektrale bredde af en picosekund puls. Derfor er brugen af ​​picosekund laser øger forholdet of resonant signal til ikke-resonant baggrund. For CH bindinger i lipid, på grund af den høje tæthed af obligationerne, den ikke-resonante baggrund er ubetydelig for en femtosekund laser. For at reducere baggrunden effekt, kan den subtraktion af en reference billede optaget under off-resonante også anvendes (ikke gjort for dette arbejde).

Trods anvendelsen af ​​nær-infrarøde laserstråler giver mulighed dybe indtrængen i væv (200 - 300 mikron), den praktiske indtrængningsdybde opnået i nerve billeddannelse var omkring 50 mikrometer, hvor de udførte forsøg i dette arbejde. Men denne parameter er stærkt afhængig af det biologiske væv afbildes, og fordi alle myelinerede fibre er justeret og koncentreret i et lille rum, perifere nerver sandsynligvis ikke udgør de bedste prøver for at vurdere dette lys penetration. Desuden er nogle sekunder kræves for at optage billeder i høj opløsning (1.024 × 1.024 pixels), som kan begrænse visualisering af in vivo

CARS mikroskopi tillader kemisk specifik selektiv billeddannelse med en opløsning tæt på diffraktion grænse. Denne teknik kræver ikke nogen mærkning, og da Ti: safir laser er justerbar fra 700 til 1.000 nm, og OPO laser fra 1.100 til 1.300 nm, det dækker hele spektret region af molekylære vibrationer i biologiske systemer (fra 500 til 7.000 cm -1). Det er således anvendelig og meget diskriminerende til DNA, proteiner, lipider, eller vand, mens den stærkere signal skyldes lipid CH strækning binding. Fotobeskadigelse reduceres også på grund af det lave niveau af lasereffekten anvendes til at generere CARS signal i forhold til andet-harmoniske generation billeddannelse. Da CARS imaging kan realiseres med lav laser magt og uden invasive tags, er det derfor et oplagt middel for in vivo studier.

Laser scanning mikroskoper with en femtosekund Ti: safir laser kilde kombineret med en OPO vidt omfang er blevet tilgængelige for to-foton mikroskopi i mange biologiske laboratorier. Da den rumlige synkronisering allerede er implementeret i disse systemer, er den tidsmæssige overlapning procedure af de to stråler er beskrevet i dette arbejde bringer en yderligere teknik til mikroskopi uden kostbare ekstra udstyr. , Det modificerede set-up giver således for samtidig billeddannelse af celler eller levende væv med anden eller tredje Harmonic Generation (SHG, THG), to-foton fluorescens og CARS. CARS teknik har vist stort potentiale for in vivo-billeddannelse af levende dyr tillader studiet af dynamiske processer (uden pletter eller genetiske manipulationer). Lovende anvendelsesområder omfatter in vivo label-free non-invasiv lipid billeddannelse, anvendes for eksempel til tidstro billeddannelse af neuronal myelin med levende spinal væv 36, for at studere lipid sygdomme (fedme, demyeliniserende og cardiovascular sygdomme) 37, menneskelig hud penetration mekanismer 22 eller hudlidelser 38. Vi mener, at fremtidige forbedringer vil vedrøre brug af særlige objektive linser, såsom GRIN mikro-mål eller miniature til formål at forbedre indtrængningsdybde af CARS signal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oscilloscope Tektronix TDS 520D 500 MHz 
Photodetector Thorlabs DET08C/M, T4290 5 GHz InGaAs, 800 - 1,700 nm
Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II Coherent
Optical parametric oscillator OPO Compact Family APE Berlin
Axio Examiner microscope LSM 7 MP Carl Zeiss
Motorized periscope Newport
Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 Carl Zeiss
Beam combiner Carl Zeiss
Acousto-optic modulator Carl Zeiss
OPO power attenuator Carl Zeiss
Photomultiplier tube Carl Zeiss
ZEN software Carl Zeiss
Bandpass filters Carl Zeiss LSM BiG 1935-176 400 - 480 nm; 500 - 550 nm; 465 - 610 nm
Dichroic mirror Carl Zeiss Cutoff wavelength 760 nm
Silver mirrors Newport 10D20ER.2  λ/10, 480 - 20,000 nm, Quantity 4
Single-axis translation stage with standard micrometer Thorlabs PT1/M Quantity 1
Aluminium breadboard Thorlabs MB1015/M  Quantity 1
Mirror mount Thorlabs KMSS/M  Quantity 4
Mirror holder for Ø1" Optics  Thorlabs MH25 Quantity 4
Iris diaphragms  Thorlabs ID8/M Quantity 3
Protective box Thorlabs TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S Quantity 1
Optical posts Thorlabs TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M Quantity 8 (lengths depending on the set-up)
661 - 690 nm bandpass filter Semrock 676/29 nm BrightLine® single-band bandpass filter Quantity 1
Fluorescent beads ThermoFisher TetraSpeck™ Fluorescent Microspheres Size Kit
Laser viewing card Thorlabs IR laser viewing card
Laser safety glass Newport LV-F22.P5L07 
FluoroMyelin™ Red Fluorescent Myelin Stain  ThermoFisher F34652

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Valeur, B., Berberan-Santos, M. N. Molecular Fluorescence: Principles and Applications. 2nd Edition, Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).
  2. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, (4951), 73-76 (1990).
  3. Moreaux, L., Sandre, O., Mertz, J. Membrane imaging by second-harmonic generation microscopy. JOSA B. 17, (10), 1685-1694 (2000).
  4. Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, (17), 11014-11019 (2002).
  5. Yelin, D., Silberberg, Y. Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology. Opt. Express. 5, (8), 169-175 (1999).
  6. Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution Second-Harmonic Generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 81, (1), 493-508 (2002).
  7. Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329, (5994), 967-971 (2010).
  8. Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100, (5), 1362-1371 (2011).
  9. Lim, H., Sharoukhov, D., Kassim, L., Zhang, Y., Salzer, J. L., Melendez-Vasquez, C. V. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, (50), 18025-18030 (2014).
  10. Strupler, M., Pena, A. M., Hernest, M., Tharaux, P. L., Martin, J. L., Beaurepaire, E., Schanne-Klein, M. C. Second harmonic imaging and scoring of collagen in fibrotic tissues. Opt. Express. 15, (7), 4054-4065 (2007).
  11. Cheng, J. X., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: Instrumentation, theory, and applications. J. Phys. Chem. B. 108, (3), 827-840 (2004).
  12. Volkmer, A. Vibrational imaging and microspectroscopies based on coherent anti-Stokes scattering microscopy. J. Phys. D: Appl. Phys. 38, R59-R81 (2005).
  13. Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annu. Rev. Anal. Chem. 1, 883-909 (2008).
  14. Mukamel, S. Principles of nonlinear optical spectroscopy. Oxford University Press. New York. (1995).
  15. Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope. Opt. Lett. 7, (8), 350-352 (1982).
  16. Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering. Phys. Rev. Lett. 82, (20), 4142-4145 (1999).
  17. Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, (5), 585-590 (2011).
  18. Wang, P., Liu, B., Zhang, D., Belew, M. Y., Tissenbaum, H. A., Cheng, J. X. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53, (44), 11787-11792 (2014).
  19. Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).
  20. Cheng, J. X., Jia, Y. K., Zheng, G., Xie, X. S. Laser-scanning coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and applications to cell biology. Biophys J. 83, (1), 502-509 (2002).
  21. Chiu, W. S., Belsey, N. A. N., Garrett, L., Moger, J., Delgado-Charro, M. B., Guy, R. H. Molecular diffusion in the human nail measured by stimulated Raman scattering microscopy. Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 7725-7730 (2015).
  22. Chen, X., Grégoire, S., Formanek, F., Galey, J. -B., Rigneault, H. Quantitative 3D molecular cutaneous absorption in human skin using label free nonlinear microscopy. J. of Control. Release. 200, 78-86 (2015).
  23. Kano, H., Hamaguchi, H. In vivo multi-nonlinear optical imaging of a living cell using a supercontinuum light source generated from a photonic crystal fiber. Opt. Express. 14, (7), 2798-2804 (2006).
  24. Brustlein, S., Ferrand, P., Walther, N., Brasselet, S., Billaudeau, C., Marguet, D., Rigneault, H. Optical parametric oscillator-based light source for coherent Raman scattering microscopy: practical overview. J. Biomed. Opt. 16, (2), 021106 (2011).
  25. Chen, H., et al. A multimodal platform for nonlinear optical microscopy and microspectroscopy. Opt. Express. 17, (3), 1282-1290 (2009).
  26. Yue, S., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Multimodal nonlinear optical microscopy. Laser Photonics Rev. 5, (4), 496-512 (2011).
  27. Sun, Q., Li, Y., He, S., Situ, C., Wu, Z., Qu, J. Y. Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals fundamental insights of skeletal muscle development. Biomed Opt Express. 5, (1), 158-166 (2013).
  28. Le, T. T., Langohr, I. M., Locker, M. J., Sturek, M., Cheng, J. X. Label-free molecular imaging of atherosclerotic lesions using multimodal nonlinear optical microscopy. J. Biomed. Opt. 12, (5), 054007 (2007).
  29. Ellis, D. I., Cowcher, D. P., Ashton, L., O'Hagana, S., Goodacre, R. Illuminating disease and enlightening biomedicine: Raman spectroscopy as a diagnostic tool. Analyst. 138, 3871-3884 (2013).
  30. A•P•E Angewandte Physik & Elektronik GmbH. Germany. Available from: http://www.ape-berlin.de/en/page/calculator (2015).
  31. Ozçelik, M., et al. Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves. J Neurosci. 30, (11), 4120-4131 (2010).
  32. Heinrich, C., Hofer, A., Ritsch, A., Ciardi, C., Bernet, S., Ritsch-Marte, M. Selective imaging of saturated and unsaturated lipids by wide-field CARS-microscopy. Opt. Express. 16, (4), 2699-2708 (2008).
  33. Kyriakidis, N. B., Skarkalis, P. Fluorescence spectra measurement of olive oil and other vegetable oils. J. AOAC Int. 83, (6), 1435-1439 (2000).
  34. King, R. Microscopic anatomy: normal structure. Handb. Clin. Neurol. 115, 7-27 (2013).
  35. Monsma, P. C., Brown, A. FluoroMyelin Red is a bright, photostable and non-toxic fluorescent stain for live imaging of myelin. J. Neurosci. Methods. 209, (2), 344-350 (2012).
  36. Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys. J. 89, (1), 581-591 (2005).
  37. Wang, H. W., Fu, Y., Huff, T. B., Le, T. T., Wang, H., Cheng, J. X. Chasing lipids in health and diseases by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Vib. Spectrosc. 50, (1), 160-167 (2009).
  38. Jung, Y., Tam, J., Jalian, H. R., Anderson, R. R., Evans, C. L. Longitudinal, 3D in vivo imaging of sebaceous glands by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: normal function and response to cryotherapy. J. Invest. Dermatol. 135, (1), 39-44 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics