Genomförandet av en enhetlig Anti-Stokes Ramanspridning (CARS) System på en Ti: Sapphire och OPO laserbaserade Standard Laserskanning Mikroskop

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Sammanhängande anti-Stokes Ramanspridning (CARS) mikroskopi baserad på inneboende vibrationer molekyl obligationer tillåter etikett fri kemiskt selektiv levande cell imaging. Detta arbete presenteras genomförandet av en kompletterande mikroskopi teknik på en vanlig multifotonlaserskanning mikroskop baserad på en femtosekund Ti: safir laser och en OPO laser.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Mytskaniuk, V., Bardin, F., Boukhaddaoui, H., Rigneault, H., Tricaud, N. Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope. J. Vis. Exp. (113), e54262, doi:10.3791/54262 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Laser scanning mikroskop som kombinerar en femtosekund Ti: safir laser och en optisk parametrisk oscillator (OPO) att duplicera laserlinjen har blivit tillgängliga för biologer. Dessa system är i första hand avsedd för flerkanals två-foton fluorescensmikroskopi. Men utan några ändringar, kompletterande icke-linjär optisk mikroskopi såsom andra övertonen generationen (SHG) eller tredje harmoniska generationen (THG) kan också utföras med detta set-up, vilket gör att etikettfritt avbildning av strukturerade molekyler eller vatten medellång lipid gränssnitt. Dessa tekniker är väl lämpade för in vivo-observation, men är begränsade i kemisk specificitet. Kemiskt selektiv avbildning kan erhållas från inneboende vibrationssignaler baserade på Raman-spridning. Konfokala Raman mikroskopi ger 3D spatial upplösning, men det kräver hög medeleffekt och lång förvärvstid. För att övervinna dessa svårigheter har de senaste framstegen inom laserteknologin möjliggjort devellingen av icke-linjär optisk vibrations mikroskopi, särskilt konsekvent anti-Stokes Ramanspridning (CARS). CARS mikroskopi har därför framträtt som ett kraftfullt verktyg för biologisk och levande cell imaging, genom kemisk kartläggning lipider (via CH stretch vibrationer), vatten (via OH stretch vibrationer), proteiner eller DNA. I detta arbete, beskriver vi genomförandet av CARS tekniken på en vanlig OPO kopplade multifotonlaserskanning mikroskop. Den är baserad på in-time synkronisering av de två laserlinjer genom att justera längden av en av laserstrålens bana. Vi presenterar en steg-för-steg genomförandet av denna teknik på en befintlig multifotonsystem. En grundläggande bakgrund i experimentell optik är hjälpsamma och presenterade systemet inte kräver dyr kompletterande utrustning. Vi visar också BILAR avbildning som erhållits på myelinskidorna av ischiasnerven hos gnagare, och vi visar att denna avbildning kan utföras samtidigt med andra icke-linjär optisk avbildning, såsom standard two-foton fluorescensteknik och andra harmoniska generationen.

Introduction

Optisk mikroskopi har blivit en viktig teknik för oförstörande visualisering av dynamiska processer i levande biologiska system med en subcellulär upplösning. Fluorescensmikroskopi är för närvarande den mest populära imaging kontrasten i levande celler på grund av sin höga specificitet och sensitivitet 1. En stor palett av fluorescerande prober har uppstått (exogena färgämnen, genetiskt kodade proteiner, halvledarnanopartiklar). Olika provbelysning fluorescensbaserade tekniker har blomstrat (såsom konfokal eller två foton mikroskopi) för att utföra 3D-avbildning och för att minska en största nackdelen med denna teknik som är fotoblekning 2. Andra begränsningar inkluderar kravet på fluoroforen märkning eftersom de flesta av molekylslag är inte i sig fluorescerande och därför dessa fluoroforer måste artificiellt införts i den avbildade provet. Denna konstgjorda manipulation kan vara störande, särskilt för små molekyler eller inducerar krukarential- foto-toxicitet. Dessa skäl gör fluorescensmikroskopi inte väl lämpade för in vivo observationer. Därför är mycket önskvärt i biomedicinsk vetenskap användningen av optiska avbildningstekniker med hög känslighet och specifika molekylära kontraster utan användning av fluorescerande molekyler.

Flera icke-linjära optiska avbildningstekniker utan märkning eller färgning har dykt upp, bland annat andra harmoniska generationen (SHG) 3,4 och tredje harmoniska generationen (THG) 5. SHG mikroskopi har använts för att bild strukturella arrangemang på den supramolekylära nivå som mikrotubuli eller kollagen 6. THG genereras från optiska heterogeniteter såsom gränssnitt mellan ett vattenbaserat medium och lipider 7. THG visades också till bild myelin 8,9. Båda teknikerna kan genomföras på ett två-foton fluorescensmikroskop och kräver endast en laserstråle. Men de kräver hög effekt laserintensitet (typiskt 50mW vid 860 nm för SHG 10, 25-50 mW vid 1180 nm för THG 9), som är skadlig i levande prover, och ger inte den kemiska specificitet som krävs för att entydigt bild specifika biologiska strukturer.

Kemiskt selektiv avbildning kan erhållas från inneboende molekylära vibrationssignaler baserade på Raman-spridning. När en ljusstråle träffar materia, kan fotoner absorberas och sprids av atomer eller molekyler. De flesta av de spridda fotoner kommer att ha samma energi, dvs, frekvens, som den infallande fotoner. Denna process kallas Rayleigh-spridning. Emellertid kommer ett litet antal fotoner vara utspridda vid en optisk frekvens som skiljer sig från frekvensen hos de infallande fotonerna, det vill säga, med en inelastisk spridning process som kallas Raman-spridning. Skillnaden i energi härrör från excitering av vibrationslägen beroende på molekylstrukturen och miljö. Därför spontan Raman spridnings provIdes kemiskt selektiv avbildning som olika molekyler har specifika vibrationsfrekvenser. Det är dock begränsad på grund av dess extremt svag signal. Confocal Raman mikroskopi har utvecklats och ger 3D rumslig upplösning, men det kräver hög medeleffekt och lång förvärvs tid 11. För att övervinna dessa svårigheter, har de senaste framstegen inom laserteknik får ökningen av icke-linjära optiska vibrations mikroskopi, särskilt konsekvent anti-Stokes Ramanspridning (CARS) 11,12,13.

CARS är en tredje ordningens ickelinjära optiska process. Tre laserstrålar, som består av en pumpstråle vid frekvensen ω P, är en Stokes balk vid frekvensen ω S och en sondstråle (oftast är den pump) inriktat i ett prov och generera en anti-Stokes-stråle vid frekvensen ω AS = ( 2ω P - ω S) 14. Den anti-Stokes signal kan förbättras avsevärt när frekvensskillnadenmellan pumpen och Stokes balkar är inställd på en Raman molekylär vibration Ω R = (ω P - ω S). CARS signalen är baserad på flera interaktion foton. Det genererar därför en sammanhängande signalstorleksordningar starkare än spontan Raman-spridning.

CARS mikroskopi först experimentellt demonstreras av Duncan et al. 15. Zumbusch et al. Förbättrats sedan tekniken, genom att använda två fokuserade nära infraröda femtosecond laserstrålar med en objektiv med hög numerisk öppning, vilket gör att fasanpassning bilkondition och undvika de två-photon icke-resonant bakgrund 16. CARS mikroskopi har därför framträtt som ett kraftfullt verktyg för levande cell och vävnader avbildning, genom att kemiskt upptäcka molekyler såsom lipider (via CH stretch vibration) 17,18, vatten (via OH stretch vibrationer), proteiner, DNA i levande celler 19,20 men också deutererad kemisk förenings för farmaceutisk 21 och kosmetiska tillämpningar 22.

Den största begränsningen av olinjära mikroskopi härrör från komplexiteten och kostnaden för de optiska källorna. Ett CARS system kräver två våglängder avstämbara lasrar med korta pulsvaraktig och med tid och rum synkroniserade pulstågen. Tidiga bilar mikroskop baserades på två synkroniserade pikosekund Ti: safirlasrar 20. BILAR avbildning erhölls också från en enda femtosecond Ti: safir laser genererar en supercontinuum ljuskälla 23. Nyligen laserkällor som består av en enda femtosecond Ti: har safir laser att pumpa en avstämbar optisk parametrisk oscillatorer (OPO) använts för CARS mikroskopi. Detta upplägg gör i sig tidsmässigt synkroniserade strålar med en skillnad på frekvens mellan pumpen och Stokes trålen täcker hela molekylära vibrationsspektrum 24. Dessutom laserscannande mikroskop baserat på en omsättningnyckel fs laser och en OPO, i första hand för två-photon fluorescens (TPF) finns nu tillgängliga för icke-fysiker. Potentialen för sådana uppställningar kan förbättras avsevärt utan att det krävs kompletterande investeringar genom införlivandet av andra icke-linjär optisk avbildning, eftersom varje icke-linjära (NLO) imaging modalitet är känsliga för specifika strukturer eller molekyler. Multimodal NLO imaging aktiverar därför potentialen hos NLO mikroskopi för komplexa biologiska prover 25. Kopplingen av dessa tekniker har gjort undersökningen av många biologiska frågor, i synnerhet på lipidmetabolismen, hud eller cancerutveckling 26, skelettmuskelutveckling 27 aterosklerotiska lesioner 28. Dessutom ger genomförandet av laserstrålen scanning med bilar förmåga att med hög hastighet avbildning, dvs en tilltalande verktyg för att studera dynamiska processer in vivo.

Syftet med detta arbete är att visa varje steg att genomföra than CARS teknik på en vanlig multifotonlaserskanning mikroskop. Mikroskopet är baserad på en fsec Ti: safir laser och en OPO (pumpas av Ti: safir-laser) som drivs av en mjukvara för biologer. Integreringen utfördes genom att justera längden på en av laserstrålens bana för att synkronisera i tid de båda strålarna. Vi beskriver steg-för-steg genomförandet av denna teknik, som endast kräver grundläggande bakgrund i experimentella optik. Vi visar också BILAR avbildning erhålls på myelinskidorna av ischiasnerven hos gnagare, och vi visar denna avbildning kan utföras samtidigt med andra icke-linjär optisk avbildning, såsom standard två-foton fluorescensteknik och andra harmoniska generationen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Figur 1
Figur 1. Schematisk bild av den allmänna uppställningen Den innehåller Ti:. Safir (680 - 1080 nm) och OPO (1,050 - 1300 nm) lasrar, fördröjningsledningen med de 4 speglarna (M 1 till M 4), den snabba oscilloskop, fotodioden och två fasta iris membran i en och jag 2. Speglar M 2 och M 3 är fixerade på en linjär förflyttning skede möjliggör att ändra fördröjningslinjelängd med en mikrometer upplösning. A 660 -. 685 nm bandpassfilter placerades framför fotomultiplikatorröret (PMT) som används för bilar avbildning Klicka här för att se en större version av denna siffra.

1. Startup av lasersystem

  1. Verifiera att Ti: safir våglängd är inställd på 800 nm eller definieradenna våglängd på Ti: safir nätdelsstymingen. Vrid nyckeln från vänteläge till På för att slå på Ti: safir laser.
  2. Slå på OPO-laser vid baksidan av OPO styrenheten och öppna Ti: safir slutare på Ti: safir nätdelsstymingen.
  3. Slå på Tablet PC för att pumpa upp OPO. Klicka på OPO ansluten och fjärr Anslutna ikoner på tabletten. Vänta 30-40 minuter för att värma upp.
  4. Slå på mikroskop datorn och slå på "Mikroskop Components" växlar. Starta programmet genom att dubbelklicka på ikonen på skrivbordet.
  5. I fliken programvara Förvärv öppnar Laser verktyg i Setup Manager för att driva båda lasrarna från programvaran. Välj Ti: safir laser och OPO laser på. Kontrollera värdet för den optiska lasereffekt (typiska värden på 3700 mW vid 800 nm och 700 mW vid 1000 nm).
  6. För att konfigurera strålbanan och lasrar,öppna Light Path verktyget i Konfigurera installationsprogrammet grupp och kryssrutan första fotomultiplikatorrör (PMT).
  7. För att kontrollera Ti: safir laserpunkt vid utgången av målet, öppnar kanaler verktyget i förvärvet Parameter verktygsgruppen. Välj Ti: safir effekt vid lågt värde (ca 1%), minska förstärkningen till 0 (ingen bild behövs i detta skede) och klicka på Kontinuerlig knappen för att starta skanningen proceduren att starta laserstrålen genom mikroskop målet. Kontrollera förekomsten av en röd fläck genom direkt observation genom att placera IR-laser tv-kort vid utgången av luft mikroskop målet (10X).
  8. För att kontrollera OPO laserpunkt, stoppa genomsökning av Ti: safir laser genom att klicka på stoppknappen. Välj OPO effekten vid lågt värde i Kanaler fönstret och klicka på Continuous knappen.

2. Mikroskop Inställningar

  1. Placera manuellt dikroiska spegeln med en gränsvåglängd vid 760 nm i sidoporten reglaget i oändlighet utrymmet ovanför målet revolvern för att starta ljus upp till 760 nm från provet i PMTs i icke-descanned detektion (NDD) läge.
  2. Ställ det smala bandpassfilter vid 660-685 nm i NDD reflektorn kub framför PMT1 att endast spela CARS signalen vid 670 nm att reproducera de resultat som presenteras i detta arbete.
  3. Placera ett smalt bandfilter ligger mellan 500 och 550 nm i NDD reflektorn kub framför pMT3 för fluorescens observation av myelin. Placera ett smalt bandfilter i intervallet 565-610 nm i reflektorn kub framför PMT4 för SHG observation.
  4. Att välja i programvaran inspelning av signalen på detektorn med ad hoc-bandpassfilter, öppna Light Path verktyg i Setup Manager-menyn fliken Acquisition. Aktivera önskad PMT (kryssrutan) och välj en färg för den här kanalen. I detta arbete har den gröna valts för bilar, rött för fluorescens och magenta för SHG.

3. Temporal Synkronisering

Obs: De två laserstrålar kommer från samma Ti: safir laser men OPO trålen fördröjs när det genereras så de två strålarna inte är synkroniserade i tiden när de når mikroskop. Målet här är att fördröja en av de två strålarna för att återsynkronisera dem i tid innan de når mikroskop.

  1. Anslut med BNC kablar ingångskanal CH1 av oscilloskopet till den elektriska BNC laserutgång (synk. Out). Anslut ingångskanal CH2 av oscilloskopet till fotodioden och välj CH1 kanal som utlösare kanal genom att trycka triggmenyn, sedan huvudmenyknappen Källa och sedan sidomenyknappen som motsvarar den valda kanalen CH1.
  2. Position och fixera med optiska monteringstappar fotodioden i fokalplanet hos en luftmikroskopobjektiv (10X) eller i strålgången av mikroskop efter avlägsnande av målet. Obs: Om det behövs, ta bort kylaren och dess bärare.
  3. I Kanaler verktyget (Acquisition Parameter verktygsgruppen), definiera Ti: safir laser våglängd vid 830 nm med låg effekt (dvs mindre än 1% av full effekt). I förvärvsläge verktyget minska skanningsområdet till en punkt för att belysa fotodioden med minsta strålen. Slå på laserskanningen genom att klicka på kontinuerlig knappen.
  4. Tryck AUTOSET på oscilloskopet frontpanelen och manuellt flytta positionen för fotodioden för att få pulstågen på skärmen. Tryck på RUN / STOP-knappen för att frysa displayen.
    1. Om du vill spara en kopia av oscilloskopet displayen så sätt en 3,5tums diskett i diskettenheten eller anslut GPIB-porten på baksidan till en dator. Tryck sedan på SHIFT HÅRDKOPIA MENY, trycker FORMAT (huvud) för att välja TIFF bildformat och ange i hamnen menyn utgångskanal. Tryck HÅRDKOPIA-knappen för att spela in oscilloskopet visning av pulstågen i Ti: safir laser.
  5. Stäng av Ti: safir laser skanning genom att klicka på stoppknappen. Genom att klicka på Kanaler verktyg definierar OPO signal vid 1107 nm och låg effekt. Slå på OPO laserskanningen och registrera pulstågen i OPO laser på oscilloskopet. Stäng av OPO laserskanningen.
  6. Jämföra den tidsmässiga förskjutning mellan Ti: safir och OPO signaler.
    OBS! Tidsskift t skift ger längden på fördröjningslinjen L DelayLine som måste genomföras enligt den ekvation: L delayLine = c5; t skifta där c är ljusets hastighet.
  7. Välj en av de laserlinjer.
    OBS: I detta arbete, Ti: var safir laserlinjen valts eftersom ledigt utrymme fanns nära denna laserlinjen. Dessutom tillåter detta val för att uppnå den återinställning av laserlinjen med en synlig laserljus.
  8. Öppna laserlinjen genom att ta bort de skyddande rören vid den position där fördröjningsledningen kommer att genomföras.
    Varning! Använd lämpliga skyddsglasögon och ta bort kedjan armband eller titta från handlederna.
  9. Välja en våglängd inom det synliga området för att enkelt kunna observera laserstrålen (700 nm till exempel, vid låg effekt i kanalerna verktyget av programvaran). Slå på laserskanningen.
  10. Placera och ställa med optiska monterings inlägg två iris membran längs öppna laserlinjen. Position en iris vid utgången av fördröjningslinjen och placera andra iris vid ingången till periskop.
    OBS: periscope kontroller två motoriserade speglar prövats av programvaran vinkel ingången av laserstrålen i avsökningshuvudet för laserskanning mikroskop.
  11. Minska bländaröppningen och justera membran positioner för att passa laserstrålens bana. Fixera dem på den optiska bordet. Justera den vertikala positionen av en tredje mobil irisbländare, kontrollera höjden på laserstrålen medan successivt placera fyra speglar av fördröjningslinjen.
    OBS! Dessa iris membran kommer att fungera som kontroll för återinriktningsförfarande genom att visa vägen att följa.
  12. Placera spegeln M1 monterad på en kompakt kinematisk spegel montera vid ingången av fördröjningsledningen (som visas i figur 1) och justera dess position och dess orientering för att hålla strålen höjd med hjälp av den mobila irisbländare. Plats speglar M2 och M3 (också monterad på kompakta kinematiska spegel fästen) vid 90 ° på översättningen scenen som kommer att placeras på Midcourse. Placera dem att passa fördröjningsledning längd som tidigare beräknats.
  13. Justera orienteringen av M2 och M3 med användning av den mobila irisbländare. Set M4 (också fäst på en kompakt monterad) vid utloppet av fördröjningsledningen (strax före iris I en såsom visas i figur 1) och försiktigt justera dess position och vinkel för att passa laserstrålens bana genom de två fasta iris diafragmor.
  14. Placera laser tv-kort vid utgången av mikroskopobjektivet och kontrollera laserstrålen profil genom att klicka på Kontinuerlig att slå på laserskanningen. Iaktta en enhetlig ljus skiva. Om nödvändigt, justera en aning orienteringen av M4.
  15. Position igen den snabba fotodiod under laserstrålen i provet fokus plan mikroskop. Observera den tidsmässiga förskjutning mellan Ti: safirlaserstrålen och OPO trålen på oscilloskopet.
    Obs: Om det är nödvändigt, ändra fördröjningsledningslängden genom att flytta hela systemet M2, M3 monterad påöversättningsstadiet (utan att ändra översättningsstadiet tuning) för att synkronisera båda pulser. kan krävas förändringar av några få centimeter.

4. Spatial överlappning av strålar

Obs: För att producera en CARS signal, krävs det rumsliga överlappning av de två laserstrålarna. Den alternativa belysning av båda strålarna på samma pärlorna färgades hela med två olika fluorescerande färgämnen kan användas för att indikera den rumsliga förskjutning. Finjusteringar av spegelpositioner kan sedan minimera skift.

  1. Använd förmonterade fluorescerande mikrosfärer. Eller montera mikrosfärer i suspension på rena objektglas som beskrivs nedan:
    1. Före provtagning, för att blanda (på en cortex mixer eller genom sonikering) lösningen pärlor vara säker på att kulorna är jämnt suspenderade.
    2. Applicera 5 pl av kulsuspensionen till ytan av ett objektglas och sprids med pipettspetsen. Vänta på droppen för att torka och sedan tillämpa 5 pl av mounting medium, såsom glycerol, vatten eller nedsänkning olja över det torra provet av pärlor. Täck över provet med ett täckglas och försegla täckglas med snabbtorkande lim eller smält paraffin.
  2. Placera de fluorescerande polystyrenpärlor fixerade på ett objektglas under 20X vatten mål. Lägg till några droppar vatten för att fördjupa målet.
  3. För att uppnå fokus på pärlorna öppnar Lokalisera fliken i programvaran för att växla från laseravsökningsmoden till den direkt observation av provet med ögat, genom att trycka på knappen Online. Öppna ögonverktyget för att markera särskilda filter och slå på halogenlampan genom att klicka på ikoner.
  4. Manuellt ta bort den dikroiska spegeln i reglaget sidoporten i oändlighet utrymme och använda fokuseringsdrevet i mikroskop för att fokusera preparatplanet genom att observera pärlor med okularen. Byt den dikroiska spegeln.
  5. iLokalisera fliken, växla till laserskanning läget genom att trycka på knappen Offline. Gå till fliken Acquisition att definiera parametrar för skanning: Välj den bildstorlek till 512 pixlar, en skanningshastighet på 9, en utjämning av en, en bit djup på 8 bitar och öka skanningsområdet maximalt.
  6. I Kanaler verktygetfliken Acquisition, lägga till ett spår (spår 1) om den inte redan skapats. Välj våglängden vid 830 nm och låg effekt för Ti. Safir laserstråle Markera färg till grönt i spår en låda från Kanaler fönstret och i pMT3 eller PMT4 låda från Light Path fönstret.
  7. I Kanaler verktygetfliken Acquisition, lägga till en andra spåret (spår 2). Välj våglängden vid 1107 nm och låg effekt för OPO laserstrålen. Kryssa färgen till rött i spår två rutan från Kanaler fönstret och i pMT3 rutan från
  8. Justera förstärkningen av båda spåren till 600. Sedan sekventiellt tillämpa genomsökning av de två strålarna på provet genom att klicka på Kontinuerlig.
  9. Observera bilden på skärmen området i 2D-vy. I visningsvy Option styrblock, justera skärmens intensitet.
    Obs: Om det behövs, rör sig något fokuseringsdrevet för att hitta fokus plan pärlorna. Justera Beskär och zooma in bilden i en enda kula eller en grupp av angränsande kulor.
  10. Använd periskopet kontrollen för att överlappa balkarna i xy-planet. I programmet öppnar du fliken Underhåll. Klicka på Systemalternativ och visa motoriserad Periscope verktygsfönster. Använd grova och fina justeringar av periskopet speglar av Ti: safir laserstråle för att synkronisera i rymden båda bilderna.
  11. För periskopet manipulation, använd första takterna justerings för vertikal och Second ett för horisontella rörelser av laserstrålen. Flytta strålen med ingångsspegeln tills bilden är något synligt, och sedan kompensera för laserintensiteten med utgångsspegeln av periskopet genom att klicka på "input" och "output".
  12. I syfte att vertikalt överlappar strålarna, i fliken Underhåll öppnar kollimator verktyget och justera värdet på fokalavståndet av Ti: safir laserstråle.
  13. Flytta försiktigt målet vertikalt läge för att kontrollera skillnaden i fokus på båda bilderna. Eller ta en z-stack av provet genom öppningen i fliken Förvärv Z-Stack verktyg och välja de olika parametrarna (intervall, antal skivor). Tryck Ortho i bildskärmen område för att se balkarna i axiellt tvärsnitt. Maximera z-överlappningen genom att göra samma förfarande flera gånger.

5. Slutliga justeringar och Coherent Anti-Stokes Ramanspridning (CARS) Signal Observation från olivolja Droplets

  1. Sätt en droppe av olivolja på en glasplatta och täck den med en glaskupa halka. Lägg till några droppar vatten för att doppa en 20X nedsänkning i vatten mål. Fokusera vid kanten av locket glida med hjälp okularen (såsom förklarats tidigare i 4,2).
  2. I Kanaler verktygetfliken Förvärv, välj en liten en våglängd på 830 nm för Ti: safir laserstråle och vid 1107 nm för OPO. Kryssa båda lasrarna i spår 1 för att få en samtidig avsökning av båda lasrarna. Ställ befogenheter vid lågt värde för en start.
  3. I ljusbanan fönstret väljer PMT1. Slå på laserskanningar genom att klicka på kontinuerlig knappen. Röra sig något i fokus för att leverera laserljus in i oljan tunt lager.
  4. Om det behövs, öka den optiska effekten av båda lasrarna. Justera skärmstyrka i visningsvy Alternativ styrblock. Sakta översättning skede av fördröjningslinjen tills signalen blir sigligt förbättras.
  5. Efter de fina anpassningar är klar, kontrollera om det är verkligen en CARS signal: Flytta något översättningsstadiet; intensiteten av signalen måste bli svagare. Och / eller stänga en av laserstrålen, antingen Ti: safir laser eller OPO. Återigen måste det finnas en stark sönderfall i intensitet jämfört med den CARS signalen.
  6. För att uppnå maximal CARS signalen väljer du alternativet på programvaran för att tillhandahålla ett värde för medelintensiteten av hela bilden (i Histo tanke på fliken skärmyta). Justera våglängden (fåtal nm), då x, y, z positionerna för fokusstråle för att maximera medelintensiteten värdet.

6. Bilaga hos ljusstrålen av fördröjningslinjen

  1. Eftersom det slutliga systemet är tillägnad icke-fysiker, innesluta strålgången hos fördröjningsledningen med rör eller en inneslutning låda, för att undvika direkt tillgång till skadliga icke-synliga hög toppeffekt laserstråle. Var noga med att ge en tillgång till översättningsstadietknopp.

7. Wavelength Tuning för BILAR

  1. Använd ekvationen ekvation 1 för att ställa in laservåglängder till den önskade Raman vibrationer. Att reproducera de resultat som presenteras i detta arbete för att bild CARS signal från CH obligationer med stretching vibration av 3015 cm -1, väljer λ Ti: safir = 830 nm och λ OPO = 1095 nm.
    OBS: Raman karakteristiska vibrational frekvenser som observeras i biologiska prover, såsom vatten, kan CH-bindning hittas i et al Evans 13 eller i Ellis et al 29...
  2. Använd ekvationen ekvation 2 att fastställa emissionsvåglängd av CARS signal. För CH bond avbildning av CARS, väljer ett smalt bandfilter vid 670 nm sedan X-CARS = 670 nm med laservåglängder som presenteras i 7.1.
    OBS: En mobiltelefon ansökan är AVAILABLE att beräkna X-CARS från λ P och λ S-värden (se referens 30).

8. Observation av CARS signal och målat Myelin från ischiasnerven Cuts

Obs! Alla djurförsök utfördes i enlighet med de institutionella bestämmelser.

  1. Förbereda de axiella och longitudinella ischiasnerv snitt på ett objektglas som presenteras i Ozcelik et al. 31.
  2. Förbered fluoromyelin röd färgningslösningen genom att späda stamlösningen 300-faldigt i PBS. Svämma nerv snitt med färgningslösningen under 20 min vid RT. Avlägsna lösningen och tvätta 3 gånger i 10 min med PBS.
  3. Placera snitten under 20X nedsänkning i vatten mål. Placera ett täckglas. Lägg till några droppar PBS för att fördjupa målet och justera fokus för målet att få en klar bild av de skär genom okularen (som tidigare beskrivs i 4.2).
  4. <li> I spår 1, välj Ti: safir och OPO lasrar och definiera sina våglängder till 830 nm och 1095 nm, respektive. I ljusbanan fönstret väljer PMT1 och grön färg.
  5. I Spår 2, välj OPO lasern endast (våglängd på 1095 nm). I ljusbanan fönstret väljer PMT4 och röd färg.
  6. För båda lasrarna, välj låg effekt och ställa in förstärkningen till 600 för en start. Slå på laserskanningar och justera följande parametrar för att förbättra CARS och fluorescenssignalen kontraster: effektvärden, översättning skede ratten (mycket svagt), våglängder (några nm), display intensitet.
  7. För att spela in slut bilder med hög upplösning, välj i inställningsmoden verktyget följande parametrar: ramstorlek på 1024 pixlar, skanningshastighet på 7, medelvärdes 4. Klicka på Snap-knappen för att spela in en enda bild. Spara bilden i det proprietära formenpå att spela in bilden och hela förvärvsparametrar.

9. Observation av bilar och SHG Signaler från ischiasnerven Cuts

  1. Förbered ischiasnerven som presenteras i Ozcelik et al. 31.
  2. Följ proceduren som beskrivs i del 8 för att få en bild genom okularen och för att välja CARS signalparametem (spår 1).
  3. I Spår 2, välj OPO lasern endast (våglängd på 1095 nm). I ljusbanan fönstret väljer pMT3 och magenta färg.
  4. Följ proceduren som beskrivs i del 8 för att slå på laserskanningar och spara högupplösta bilder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Pulståget frekvensen för standard Ti: safirlaser är typiskt omkring 80 MHz. OPO har samma frekvens eftersom den pumpas av den Ti: safir-laser. En snabb oscilloskop med minst 200 MHz krävs därför. En snabb fotodiod i intervallet 600 till 1100 nm krävs också. Den maximala tidsskifte inträffar när Ti: safir och OPO signaler förskjuts av 1 / (2 × 80 × 10 6) = 6,2 nanosekunder. Det motsvarar en maximal strålgång förskjutning av 1,9 m Figur 2 visar pulståget registrerades från OPO laserstrålen (A) och från den Ti:. Safir laserstråle utan fördröjningsledningen (B) och med den justerade fördröjningslinje (C ). Pulstågen är således grovt synkroniserad i tid med genomförda fördröjningslinjen som visas i figur 2A och 2C.

pg "/>
Figur 2. laserpuls tåg inspelningar för tidssynkronisering Inspelning av pulstågen på mikroskopprovplanet med en 10X mål för OPO balken (A), Ti:. Safir laserstråle utan (B) och med fördröjningslinjen (C ). Den översta kurvan för varje graf tomter signalen direkt inspelade från BNC-kontakten på baksidan av Ti: safir laser (Sync ut kontakten.). Oscilloskopet trigger justeras på denna signal. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Den rumsliga överlappningen av de två strålarna kan erhållas genom visualisering av fluorescerande polystyrenpärlor fixerade ovanpå ett objektglas (figur 3A). Figur 3B visar bilden av tre närliggande pärlor ges avOPO laser vid 1107 nm (röd falsk färg) och Ti: safir laser vid 830 nm (grön falsk färg). Det rumsliga förskjutning mellan de båda laserstrålar har kompenserats följa förfarandet i den rumsliga synkroniseringen tidigare beskrivits (fig 3C).

Figur 3
Figur 3. Fysisk överlappning av strålarna. Allmän överblick över de fluorescerande mikrosfärer (A). In på 3 intilliggande mikrosfärer. Belysningen av pärlor vid 830 och 1107 nm visar en rumslig förskjutning av däckfotsbilder (falska färger) (B). Efter x, y, z justeringar, är pärla bilderna samman (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Den slutligasteg för att uppnå den exakta tidsjustering för att aktivera bilar kan lätt realiseras genom avbildning olivoljedroppar (innehållande många CH obligationer 32) och genom att flytta något speglarna hos fördröjningsledningen för att slutföra synkroniseringen i tiden för båda laserpulstågen. Figur 4 visar bilder av en olivoljedroppe levereras från Ti: safir laser belysning endast (Figur 4A) och från OPO belysningen endast (Figur 4B). Båda strålarna samtidigt som tillämpas inducera en tydlig signalförstärkning (figur 4C) vid 670 nm, vilket motsvarar en CARS signal från inneboende kol-väte (CH) sträckningsvibration med en Raman-vibrationsområdet runt 2800 - 3100 cm-1. CARS signal (C) försvinner när en de två strålarna är avstängd. Eftersom olivolja innehåller naturliga fluoroforer 33, i synnerhet klorofyllmolekyler som emitterar inom intervallet från 650 till 670 nm, är den svaga signalen i (A) och (B) en multiphoton fluorescens processen. Intensiteten av dessa signaler är flera tiopotenser lägre än CARS signalen. Därför betyder inte störa mätningen av CARS signalen.

figur 4
Figur 4. Slut fina tids justeringar för bilar signal utbrott. Olivolja droppar kan användas för att ställa in tid båda strålarna genom att justera fördröjningslinjelängd med den linjära överförings scenen med mikrometer-enhet. Droppar enligt (A) 830 nm laser bara och under lätt (B) 1107 nm laserljus endast visa en svag signal. Under samtidig belysning (C), är tydlig signal förbättring observeras, motsvarande den CARS signalen. Skalstrecken är 100 ^ m. Raman vibrationer topp vid 3,015 cm -1. Klicka hennee för att se en större version av denna siffra.

Myelinskidan är en biologisk struktur som produceras av specifika celler som wrap och kondensat deras plasmamembran runt axoner av nervceller i centrala och perifera nervsystemen 34. Detta hölje är starkt anrikad på olika lipider. Vi använde här myelinskidorna av ischiasnerv från en mus. Tvärgående och längsgående ischiasnervtvärsnittssegment har färgades för två-foton-fluorescens avbildning av myelin vid 1095 nm, såsom visas i figur 5B och figur 5E, respektive. En fluoromyelin röd färg, som har selektivitet för myelin användes 35. Dessa prover har samtidigt upplyst på 830 och 1095 nm och CARS signal observerades (figur 5A och figur 5D). I figur 5A-C, cirklarna motsvarar myelinskidorna kring axoner (tomt utrymme isida ringarna) i tvärgående snitt. Som visas i figur 5C och 5F är samma struktur hittades vid överlappande CARS och fluorescensbilder. Vi drar slutsatsen att liknande nivå av detaljer kan erhållas med bilar och därför utan användning av fluorescensmärkning.

figur 5
Figur 5. bilar och färgade myelin avbildning av ischiasnerven nedskärningar. (A) Övergripande och (D) längsgående snitt av etikettfria CARS avbildning av myelinskidor. (B) Tvärgående och (E) längsgående snitt av samma prov färgades av fluoromyelin röda färgämnet i två-foton fluorescensbelysning vid 1095 nm. (C) Tvärgående och (F) längsgående snitt överlappning av båda bilderna. Skala barer är 10 mikrometer. Genomsnittliga optiska krafter var 5 mW vid 830 nm och 16mW vid 1095 nm för CARS signal. Genomsnittlig optisk effekt var 8 mW vid 1095 nm för två-photon fluorescens avbildning. Raman vibrationer topp vid 2,915 cm -1. CARS signalen försvinner genom att stoppa genomsökning av en laser eller genom att flytta translationssteg från Raman resonans. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Dessutom till CARS avbildning, tillåter den tillgängliga mikroskopi systemet för att samtidigt generera andra övertonen från kollagenfibrerna vid den yttre ytan av ischiasnerverna. Denna ytterligare bilden kräver endast användning av en annan detektor för att spela in en signal vid 550 nm (halva våglängden hos den OPO), eftersom ett smalt bandpassfilter på 670 nm används för CARS signalinspelnings. Figur 6 visar en kontrastbilden av myelinskidorna som avbildas i falsk grön färg (CARS signal påly i figur 6A) omgiven av kollagenfibrer som illustreras i falsk magenta färg (SHG endast i figur 6B). CARS signal uppnåddes med en genomsnittlig optiska befogenheter 4 mW vid 830 nm och 13 mW vid 1095 nm, medan det krävs 50 mW vid 1095 nm för att få SHG-signalen. Därför mycket lägre optisk energi krävs för att erhålla CARS signal jämfört med SHG eller THG (ej visad) signalerna i våra biologiska prov.

figur 6
Figur 6. bilar och SHG avbildning av mus ischiasnerven. (A) CARS bildbehandling, (B) SHG imaging och (C) samtidig visualisering av myelin av CARS avbildning (grön falsk färg) och kollagen av SHG imaging (i magenta) på musen ischiasnerven. Genomsnittliga optiska krafter var 4 mW vid 830 nm och 13 mW vid 1095 nm för bilar. Genomsnittlig optisk effekt var 50 mW vid 1095nm för SHG. Skala bar är 10 mikrometer. Raman vibrationer topp vid 2,915 cm -1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den mest utmanande delen av arbetet är tidssynkronisering av laserstrålarna. Det kräver en snabb fotodiod i kombination med en snabb oscilloskop, men endast en grov överlappning i tid kan utföras i början. Sedan en ytterligare justering av några cm krävs. Slutligen mikrometer flyttas från en linjär förflyttning skede tillåter att utföra den slutliga finjusteringen av fördröjnings radlängden för att utlösa CARS signalen. Denna signal hålls i ett snävt intervall av cirka 20 mikrometer, såsom observeras genom avstämning av translationssteg mikrometer enhet. Det motsvarar en topp förskjutning av strålar av ungefär hälften av pulsvaraktigheten, det vill säga 140 fsec. Den rumsliga överlappning av de två strålarna som krävs för CARS signalen liknar en normal ljushöjden för en sådan laserskanning mikroskopsystem.

Genomförandet av fördröjningsledningen kan åstadkommas på några veckor av biologer med en basisk bakgrund i experimental optik eller i samarbete med fysiker. Särskild försiktighet måste tas vid valet av speglarna för att minimera reflektionsförluster. Om majoriteten av de material för att bygga fördröjningsledningen är prisvärd, är oscilloskopet som erfordras inte en standard oscilloskop. Således, eftersom dagarna är tillräckligt för att slutföra tidssynkronisering förfarande, låna oscilloskopet från en fysik laboratorium tycks vara det bästa alternativet. Spatial överlappning kan vara tidskrävande eftersom det kräver avstämning av flera speglar och linser (som kan motoriserad beroende på laserskanningssystem). Tidigare CARS lasersystem baserat på två elektroniskt synkroniserade Ti: safir laser hade ett problem med lång sikt (tiotals minuter till timmar) tidspuls överlappande. Detta problem har varit helt löst med OPO pumpad med en unik laserkälla 20,21. Med ett sådant lasersystem, och med hjälp av fastklämd optik, balkar ingen tids walk-off mellan pump och Stokes observerades övermånaders drift.

En viktig begränsning av CARS teknik är att CARS signalen kan ske utan närvaro av resonans molekyler (från lösningsmedlet eller de spridarna) 11. Denna icke-resonant bakgrund kan begränsa känsligheten. Sätt att minimera denna bakgrund inkluderar konfigurationen av detektion (framåt eller bakåt detektering), laseregenskaper (femtosecond eller pikosekund), valet av den lösning som används för att doppa den objektiva eller bildbehandlingen. En bakåt upptäckt gör det möjligt att minimera den icke-resonant bakgrund 11 som det används i detta arbete (Figur 1). Femtosekund Ti: safirlasrar ger höga toppintensitet högst önskvärda för icke-linjära optiska processer. Men i den spektrala domänen, är bredden av de flesta Raman linjer som är mindre än den spektrala bredden på en femtosekund puls medan den passar den spektrala bredden av en pikosekund puls. Därför användningen av pikosekund laser ökar förhållandet of resonans signal till icke-resonant bakgrund. För CH obligationer i lipid, på grund av den höga tätheten av obligationer, är den icke-resonant bakgrund försumbar för en femtosecond laser. För att reducera bakgrundseffekt, kan subtraktion av en referensbild registreras under off-resonans också tillämpas (inte gjort för detta arbete).

Trots användningen av nära infrarött laserstrålar som möjliggör djup penetration i vävnad (200 - 300 mikron), den praktiska inträngningsdjupet erhölls i nervavbildning var cirka 50 mikrometer med experiment som utförts i detta arbete. denna parameter är dock starkt beroende av den biologiska vävnaden avbildas och eftersom alla myeliniserade fibrer är i linje och koncentreras i ett litet utrymme, perifera nerver förmodligen inte utgör de bästa prover för att utvärdera denna ljuspenetrering. Dessutom är några sekunder som behövs för att spela in bilder med hög upplösning (1024 x 1024 pixlar), vilket kan begränsa visualisering av in vivo

CARS mikroskopi tillåter kemiskt specifik selektiv avbildning med en upplösning nära diffraktionsgränsen. Denna teknik kräver inte någon märkning, och sedan Ti: safir laser är avstämbar från 700 till 1000 nm och OPO laser från 1100 till 1300 nm, täcker hela spektrat regionen molekylära vibrationer i biologiska system (från 500 till 7000 cm -1). Sålunda är det tillämpligt och mycket diskriminerande till DNA, proteiner, lipider, eller vatten, medan den starkare signalen härrör från den lipid CH stretching bindning. Fotoskada reduceras också på grund av den låga nivån på lasereffekten används för att generera CARS signalen jämfört med den andra övertonen generationens avbildning. Eftersom BILAR avbildning kan realiseras med låg lasereffekt och utan invasiva taggar, är det därför ett verktyg för val för in vivo-studier.

Laserscannande mikroskop with en femtosekund Ti: safir laserkälla i kombination med en OPO har blivit till stor del för två-foton mikroskopi i många biologiska laboratorier. Eftersom den rumsliga synkronisering redan genomförts i dessa system, den tidsmässiga överlappande förfarandet för de två strålarna som beskrivs i detta arbete ger en ytterligare teknik för mikroskopi utan dyr extrautrustning. Således kan den modifierade set-up för samtidig avbildning av celler eller levande vävnad med andra eller tredje övertonen Generation (SHG, THG), två-foton fluorescens och bilar. CARS teknik har visat stor potential för in vivo avbildning av levande djur som möjliggör studier av dynamiska processer (utan fläckar eller genetiska manipulationer). Lovande användningsområden in vivo etikett fria icke-invasiv lipid imaging, används till exempel i realtid avbildning av neuronal myelin i levande spinal vävnader 36, för att studera fettrelaterade sjukdomar (fetma, demyeliniserande och cardiovascular sjukdomar) 37, human hudpenetration mekanismer 22 eller hudbesvär 38. Vi tror att framtida förbättringar kommer att gälla användningen av särskilda objektiv som GRIN mikro mål eller miniatyr mål att förbättra penetration av CARS signalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oscilloscope Tektronix TDS 520D 500 MHz 
Photodetector Thorlabs DET08C/M, T4290 5 GHz InGaAs, 800 - 1,700 nm
Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II Coherent
Optical parametric oscillator OPO Compact Family APE Berlin
Axio Examiner microscope LSM 7 MP Carl Zeiss
Motorized periscope Newport
Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 Carl Zeiss
Beam combiner Carl Zeiss
Acousto-optic modulator Carl Zeiss
OPO power attenuator Carl Zeiss
Photomultiplier tube Carl Zeiss
ZEN software Carl Zeiss
Bandpass filters Carl Zeiss LSM BiG 1935-176 400 - 480 nm; 500 - 550 nm; 465 - 610 nm
Dichroic mirror Carl Zeiss Cutoff wavelength 760 nm
Silver mirrors Newport 10D20ER.2  λ/10, 480 - 20,000 nm, Quantity 4
Single-axis translation stage with standard micrometer Thorlabs PT1/M Quantity 1
Aluminium breadboard Thorlabs MB1015/M  Quantity 1
Mirror mount Thorlabs KMSS/M  Quantity 4
Mirror holder for Ø1" Optics  Thorlabs MH25 Quantity 4
Iris diaphragms  Thorlabs ID8/M Quantity 3
Protective box Thorlabs TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S Quantity 1
Optical posts Thorlabs TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M Quantity 8 (lengths depending on the set-up)
661 - 690 nm bandpass filter Semrock 676/29 nm BrightLine® single-band bandpass filter Quantity 1
Fluorescent beads ThermoFisher TetraSpeck™ Fluorescent Microspheres Size Kit
Laser viewing card Thorlabs IR laser viewing card
Laser safety glass Newport LV-F22.P5L07 
FluoroMyelin™ Red Fluorescent Myelin Stain  ThermoFisher F34652

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Valeur, B., Berberan-Santos, M. N. Molecular Fluorescence: Principles and Applications. 2nd Edition, Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).
  2. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, (4951), 73-76 (1990).
  3. Moreaux, L., Sandre, O., Mertz, J. Membrane imaging by second-harmonic generation microscopy. JOSA B. 17, (10), 1685-1694 (2000).
  4. Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, (17), 11014-11019 (2002).
  5. Yelin, D., Silberberg, Y. Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology. Opt. Express. 5, (8), 169-175 (1999).
  6. Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution Second-Harmonic Generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 81, (1), 493-508 (2002).
  7. Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329, (5994), 967-971 (2010).
  8. Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100, (5), 1362-1371 (2011).
  9. Lim, H., Sharoukhov, D., Kassim, L., Zhang, Y., Salzer, J. L., Melendez-Vasquez, C. V. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, (50), 18025-18030 (2014).
  10. Strupler, M., Pena, A. M., Hernest, M., Tharaux, P. L., Martin, J. L., Beaurepaire, E., Schanne-Klein, M. C. Second harmonic imaging and scoring of collagen in fibrotic tissues. Opt. Express. 15, (7), 4054-4065 (2007).
  11. Cheng, J. X., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: Instrumentation, theory, and applications. J. Phys. Chem. B. 108, (3), 827-840 (2004).
  12. Volkmer, A. Vibrational imaging and microspectroscopies based on coherent anti-Stokes scattering microscopy. J. Phys. D: Appl. Phys. 38, R59-R81 (2005).
  13. Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annu. Rev. Anal. Chem. 1, 883-909 (2008).
  14. Mukamel, S. Principles of nonlinear optical spectroscopy. Oxford University Press. New York. (1995).
  15. Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope. Opt. Lett. 7, (8), 350-352 (1982).
  16. Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering. Phys. Rev. Lett. 82, (20), 4142-4145 (1999).
  17. Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, (5), 585-590 (2011).
  18. Wang, P., Liu, B., Zhang, D., Belew, M. Y., Tissenbaum, H. A., Cheng, J. X. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53, (44), 11787-11792 (2014).
  19. Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).
  20. Cheng, J. X., Jia, Y. K., Zheng, G., Xie, X. S. Laser-scanning coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and applications to cell biology. Biophys J. 83, (1), 502-509 (2002).
  21. Chiu, W. S., Belsey, N. A. N., Garrett, L., Moger, J., Delgado-Charro, M. B., Guy, R. H. Molecular diffusion in the human nail measured by stimulated Raman scattering microscopy. Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 7725-7730 (2015).
  22. Chen, X., Grégoire, S., Formanek, F., Galey, J. -B., Rigneault, H. Quantitative 3D molecular cutaneous absorption in human skin using label free nonlinear microscopy. J. of Control. Release. 200, 78-86 (2015).
  23. Kano, H., Hamaguchi, H. In vivo multi-nonlinear optical imaging of a living cell using a supercontinuum light source generated from a photonic crystal fiber. Opt. Express. 14, (7), 2798-2804 (2006).
  24. Brustlein, S., Ferrand, P., Walther, N., Brasselet, S., Billaudeau, C., Marguet, D., Rigneault, H. Optical parametric oscillator-based light source for coherent Raman scattering microscopy: practical overview. J. Biomed. Opt. 16, (2), 021106 (2011).
  25. Chen, H., et al. A multimodal platform for nonlinear optical microscopy and microspectroscopy. Opt. Express. 17, (3), 1282-1290 (2009).
  26. Yue, S., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Multimodal nonlinear optical microscopy. Laser Photonics Rev. 5, (4), 496-512 (2011).
  27. Sun, Q., Li, Y., He, S., Situ, C., Wu, Z., Qu, J. Y. Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals fundamental insights of skeletal muscle development. Biomed Opt Express. 5, (1), 158-166 (2013).
  28. Le, T. T., Langohr, I. M., Locker, M. J., Sturek, M., Cheng, J. X. Label-free molecular imaging of atherosclerotic lesions using multimodal nonlinear optical microscopy. J. Biomed. Opt. 12, (5), 054007 (2007).
  29. Ellis, D. I., Cowcher, D. P., Ashton, L., O'Hagana, S., Goodacre, R. Illuminating disease and enlightening biomedicine: Raman spectroscopy as a diagnostic tool. Analyst. 138, 3871-3884 (2013).
  30. A•P•E Angewandte Physik & Elektronik GmbH. Germany. Available from: http://www.ape-berlin.de/en/page/calculator (2015).
  31. Ozçelik, M., et al. Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves. J Neurosci. 30, (11), 4120-4131 (2010).
  32. Heinrich, C., Hofer, A., Ritsch, A., Ciardi, C., Bernet, S., Ritsch-Marte, M. Selective imaging of saturated and unsaturated lipids by wide-field CARS-microscopy. Opt. Express. 16, (4), 2699-2708 (2008).
  33. Kyriakidis, N. B., Skarkalis, P. Fluorescence spectra measurement of olive oil and other vegetable oils. J. AOAC Int. 83, (6), 1435-1439 (2000).
  34. King, R. Microscopic anatomy: normal structure. Handb. Clin. Neurol. 115, 7-27 (2013).
  35. Monsma, P. C., Brown, A. FluoroMyelin Red is a bright, photostable and non-toxic fluorescent stain for live imaging of myelin. J. Neurosci. Methods. 209, (2), 344-350 (2012).
  36. Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys. J. 89, (1), 581-591 (2005).
  37. Wang, H. W., Fu, Y., Huff, T. B., Le, T. T., Wang, H., Cheng, J. X. Chasing lipids in health and diseases by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Vib. Spectrosc. 50, (1), 160-167 (2009).
  38. Jung, Y., Tam, J., Jalian, H. R., Anderson, R. R., Evans, C. L. Longitudinal, 3D in vivo imaging of sebaceous glands by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: normal function and response to cryotherapy. J. Invest. Dermatol. 135, (1), 39-44 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics