En detaljeret protokol til karakterisering af murine C1498 Cell Line og dets associerede Leukæmi Mouse Model

Cancer Research
 

Summary

Dette håndskrift tilvejebringer en teknisk procedure, der kan anvendes til at karakterisere C1498 cellekulturer in vitro og akut leukæmi induceret i mus efter deres injektion. Fænotypiske og funktionelle Analyserne foretages flowcytometri, immunfluorescensmikroskopi, cytokemi og May-Grünwald Giemsa farvning.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Mopin, A., Driss, V., Brinster, C. A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model. J. Vis. Exp. (116), e54270, doi:10.3791/54270 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den intravenøse injektion af C1498-celler i syngene eller kongene mus er blevet udført siden 1941. Disse injektioner resultere i udvikling af akut leukæmi. Arten af ​​denne sygdom er ikke blevet veldokumenteret i litteraturen. Her giver vi en teknisk protokol til karakterisering C1498 celler in vitro og til at bestemme arten af den inducerede leukæmi in vivo. Den første del af denne procedure er fokuseret på bestemmelse af hæmatopoietisk afstamning og den fase af differentiering af dyrkede C1498 celler. For at opnå dette, er multi-parametrisk flowcytometrisk farvning anvendes til at detektere hæmatopoietiske cellemarkører. Immunfluorescensmikroskopi, cytokemi og et May-Grunwald Giemsa-farvning udføres derefter for at vurdere ekspressionen af ​​myeloperoxidase, aktiviteten af ​​esteraser og cellulær morfologi, hhv. Den anden del af denne protokol er dedikeret til at beskrive leukæmi sygdom, der induceres ivivo. Sidstnævnte kan opnås ved at bestemme hyppigheden af leukæmiske og iboende celler i blodet, hæmatopoietiske organer (f.eks, knoglemarv og milt) og ikke-lymfoide væv (f.eks leveren og lungerne) under anvendelse specifik farvning og flowcytometri-analyse. Beskaffenheden af ​​leukæmi bekræftes derefter ved anvendelse af May-Grunwald Giemsa-farvning og farvning for specifikke esteraser i knoglemarven. Her præsenterer vi de resultater, der blev opnået ved hjælp af denne protokol i samme alderskategori C1498- og PBS-injicerede mus.

Introduction

Akut myeloid leukæmi (AML) er kendetegnet ved ukontrolleret proliferation af hæmatopoietiske myeloide celler, der er blokeret på forskellige stadier af modning. Denne dysregulering kan påvirke granulocytisk, monocytiske, erythrocytkoncentrationen eller megaryocytic differentieringsveje 1. AML-celler ophobes i knoglemarven, hvilket fører til forringet hæmatopoiese, hvilket resulterer i thrombopeni, lymfopeni og anæmi. De leukæmiceller også invadere blod og ikke-lymfoide organer.

Den C1498 musemodel er blevet anvendt i årtier som en model for akut leukæmi eftersom cancerceller blev isoleret fra en leukæmisk 10-måneder gamle C57BL / 6 (H-2b) hunmus i 1941. I litteraturen beskrives invasionen i blodet , hæmatopoietiske organer (f.eks, milt og lymfeknuder) og ikke-hæmatopoietiske organer (f.eks, leveren, lunger, ovarier og nyrer) ved stærkt proliferative C1498-celler efter at de blev injiceret via en iintravenøse, subkutan eller intraperitoneal rute ind modtagelige mus 2-4. Imidlertid var dette musemodel rapporteret at inducere enten granulocytisk 2,5 eller myelomonocytisk 6 leukæmi. For nylig en undersøgelse offentliggjort i 2002 beskrev denne form for kræft som murine NKT-celle leukæmi 7. Således litteraturen afviger vedrørende arten af ​​denne C1498 cellelinie og den tilhørende leukæmi den inducerer hos mus. Disse uoverensstemmelser skyldes hovedsagelig en mangel på detaljeret og opdateret offentliggjorte oplysninger om cellerne og den leukæmiske sygdom i almindelighed, fordi mange undersøgelser blev udført i 1950 - 70'erne.

Her giver vi en detaljeret protokol til at beskrive, hvordan at karakterisere C1498 celler og analysere arten af ​​den leukæmiske sygdom, der induceres af deres intravenøs injektion i mus. Den første del af denne protokol er dedikeret til en beskrivelse af C1498-celler, der er dyrket in vitro. Fluorescerende antiorganer rettet mod overfladen og intracellulære hæmatopoietiske markører blev anvendt til at bestemme deres fænotype ved anvendelse af flowcytometri. Tilstedeværelsen af ​​myeloperoxidase blev vurderet ved anvendelse immunfluorescensmikroskopi blev deres hæmatopoietisk linje og differentiationsstadium vurderet ved anvendelse cytokemi at vurdere aktiviteten af ​​esteraser, og May-Grunwald Giemsa-farvning blev udført. De C1498 celler blev derefter injiceret i mus, og den akutte leukæmi sygdom, der blev induceret, er beskrevet i det andet afsnit af dette håndskrift. De samme teknikker blev anvendt til at bestemme de frekvenser og de fænotyper leukæmiske og iboende celler i knoglemarven, perifert blod, milt og ikke-hæmatopoietiske organer (lever og lunger).

Denne protokol er meget reproducerbar, og de data, der præsenteres her, vil hjælpe forskerne til at vurdere virkningerne af nye terapeutiske strategier. Denne leukæmi musemodel er allerede blevet anvendt til at teste immunterapi nærmer sig ennd forskellige cancer kemoterapeutiske stoffer 8,9. Deres effektivitet blev evalueret ved at bestemme udviklingen af ​​tumor byrde og overlevelsesrater. Denne protokol kan bruges til at give yderligere oplysninger om fordelingen og underhold af leukæmi og andre hæmatopoietiske cellepopulationer under behandlingen.

Protocol

Animal bolig og alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af den lokale Animal Care Komité, CEEA.NPDC (aftale no.512012), og alle forsøg blev udført i overensstemmelse med de franske og europæiske retningslinjer for pleje og anvendelse af forsøgsdyr.

1. In vitro karakterisering af C1498 cellelinie

  1. In vitro kultur af C1498-celler
    1. Forbered komplet RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 medium ved tilsætning af 50 ml føtalt bovint serum (FBS), 5 ml penicillin (100 U / ml) -streptomycin (100 ug / ml), 500 pi 50 mM β-mercaptoethanol , 5 ml N-2-hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsyre (HEPES), 5 ml af ikke-essentielle aminosyrer og 5 ml natriumpyruvat til 500 ml RPMI-medium.
    2. Grow C1498 cellelinje i komplet RPMI. Cellerne høstes i suspension ved pipettering, og overføre cellerne til et 50 ml rør. Centrifuger ved 350 x g i 10 minutter, og fjern supernatant.
    3. Der tilsættes 20 ml phosphatpufret saltvand (PBS) (1x) opløsning, centrifugeres ved 350 xg i 10 min, og supernatanten fjernes.
    4. Resuspender cellerne i 10 ml fluorescensaktiveret Cell Sorter (FACS) puffer (2,5 g bovint serumalbumin (BSA) pulver og 2 ml 0,5 M ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) opløsning i 500 ml PBS-opløsning). Tæl cellerne under anvendelse en Thoma celle tællekammer efter farvning af cellerne med trypanblåt.
  2. Fænotypisk karakterisering af C1498 cellelinje ved hjælp immunfarvning og flowcytometri analyse
    1. Celleoverfladefarvning
      1. Forbered FACS-buffer.
      2. Juster de høstede celler i FACS-buffer til 10 7 celler / ml og dispensere 10 6 celler (i 100 pi) for hver farvning eksperiment i flowcytometri rør.
      3. Mærk cellerne med 100 pi af følgende antistoffer eller dertilhørende isotypekontroller fortyndet i FACS-buffer:
        1. Formarkers af precursor og differentierede celler, mærke cellerne med anti-CD11b / anti-CD18 (1), anti-Ly-6G (1), anti-CD19, anti-B220 (2), anti-NK1.1, anti- CD49b, anti-CD4 (1), anti-CD8 (2), anti-CD3 (3), anti-CD21 / 35, anti-CD115 og anti-TCRVβ antistoffer.
        2. For hæmatopoietiske stamceller / progenitorceller markører, bruger en kombination af anti-CD34 / anti-CD117 / anti-Sca-1, anti-CD150 / anti-CD117 / anti-Sca-1, anti-CD117 / anti-CD127 eller anti- CD16 / 32-biotin antistoffer alene.
        3. For markører for cellefunktioner (f.eks adhæsion, antigenpræsentation, co-stimulerende molekyler og receptorer), plette cellerne med anti-CD18 (2) / anti-CD11a, anti-MHC klasse I, anti-MHC klasse II, anti- CD31, anti-CD44, anti-CD80-biotin, anti-CD86 og anti-CD274-antistoffer.
      4. Inkubér alle af flowcytometri rør ved 4 ° C i 30 minutter.
      5. Vask cellerne to gange ved tilsætning af 2 ml FACS-buffer til hvert rør, centrifugeres ved 350 xg i 5 min, og supernatanten fjernes. Tilsæt 100 pi FACS-buffer til hvert rør og fortsætte til sekundær farvning ved tilsætning af 100 pi fluorescerende streptavidin (1/100 i FACS-buffer til en slutfortynding på 1/200) til de biotinylerede-konjugerede antistoffer. Inkuber rørene ved 4 ° C i 30 minutter.
      6. Vask cellerne to gange som følger: Der tilsættes 2 ml FACS-buffer til hvert rør, centrifugeres rørene ved 350 xg i 5 min, og supernatanten fjernes ved pipettering.
      7. Resuspender cellerne i 500 pi kold PBS og placere cellerne på is, holde dem i mørke ved hjælp af aluminiumsfolie dækker rørene. Analysere resultater ved hjælp af en cytometer 10.
    2. intracellulær farvning
      1. Forbered fiksering buffer ved tilsætning 125 ml af en 4% paraformaldehyd (PFA) opløsning til 375 ml PBS-opløsning.
        BEMÆRK: Til fremstilling 500 ml 4% PFA, varme- 400 ml PBS-opløsning til ca. 60 ° C på en omrøringsplade i et ventileret stinkskab. Tilsæt 20 g PFA pulver, og hæve pHindtil PFA er opløst. Lad opløsningen afkøle, justere pH til 6,9, og der fyldes op til 500 ml med PBS.
      2. Forbered permeabiliserende puffer ved tilsætning af 0,5 g saponin og 0,5 g BSA til 500 ml PBS-opløsning.
      3. Juster de høstede celler i FACS-buffer til 10 7 celler / ml og distribuere 10 6 af cellerne (100 pi) for hver farvning eksperiment i flowcytometri rør. Centrifugeres cellerne ved 350 x g i 5 min, og supernatanten fjernes.
      4. Fikseres cellerne i 200 pi af 1% PFA-opløsning og inkuberes i 10 minutter ved 4 ° C.
      5. Der tilsættes 2 ml permeabiliserende buffer til hvert rør, centrifugeres rørene ved 350 xg i 5 min, og supernatanten fjernes ved pipettering. Tilsæt 100 pi permeabiliserende buffer til hvert rør.
      6. Mærk cellerne med 100 pi følgende antistoffer eller deres tilsvarende isotypekontroller efter fortynding dem i permeabiliserende buffer: anti-CD3 (2) / anti-CD8 (1), anti-CD3 (3) / aNTI-CD4 (2), anti-CD107b og anti-CD3 (3) / anti-TCRVβ.
      7. Inkuber cellerne ved 4 ° C i 30 minutter.
      8. Vask cellerne to gange ved tilsætning af 2 ml permeabiliserende buffer til hvert rør. Centrifuger rørene ved 350 xg i 5 min, og supernatanten fjernes.
      9. Tilsæt 100 pi permeabiliserende buffer til cellerne. Fortsæt til sekundær farvning ved tilsætning af 100 pi fluorescerende streptavidin fortyndet i permeabiliserende buffer til biotinyleret-konjugerede antistoffer. Inkuber rørene ved 4 ° C i 30 minutter.
      10. Der tilsættes 2 ml permeabiliserende buffer til hvert rør, centrifugeres rørene ved 350 xg i 5 min, og supernatanten fjernes. Gentag dette trin en gang til.
      11. Cellerne resuspenderes i 500 pi kold PBS, og derefter placere cellerne på is i mørke. Analysere resultaterne ved hjælp af et flowcytometer 10.
  3. Udarbejdelse af en celle suspension på dias for mikroskopi
    1. Wash 10 6 harvested C1498-celler (opnået i trin 1.1.4) med 5 ml kold FACS-buffer to gange, og fortynd cellerne i 1 ml kold FACS-buffer. Anbring glassene på is.
    2. Placer glider ind engangs kamre med præ-fastgjort filter kort og placere disse i en cytocentrifuge.
    3. Tilsæt 100 pi FACS-buffer til hvert kammer og filterkortet, og spin dem i 2 min ved 4,52 x g.
    4. Tilsæt 100 pi celler til hvert kammer og filterkortet, og spin cellerne ved 4,52 x g i 2 min.
    5. Fjern forsigtigt glider fra kamrene og lufttørre dias før farvning dem med myeloperoxidase (trin 1.4), esteraser (trin 1.5) eller maj-Grünwald Giemsa (trin 1.6).
  4. Myeloperoxidase farvning for immunfluorescens
    1. Fikseres cellerne på objektglassene ved nedsænkning af objektglassene i en kold methanol: acetone (1: 1) opløsning i 2 min, og derefter lufttørre objektglassene.
    2. At lade væsken til det område af objektglasset indeholder cellerne, tegne en circle omkring cellerne under anvendelse af en vandafvisende pen.
    3. Skyl cellerne i 200 pi kold PBS-opløsning i 10 minutter.
    4. Blokere cellerne i 200 pi 3% BSA / PBS-buffer indeholdende 10 pi normal donkey serum og 10 pg / ml af oprensede anti-CD16 / 32-antistoffer.
    5. Påfør 200 pi anti-muse myeloperoxidase (fortyndet til 20 ug / ml i 3% BSA / PBS-buffer). Inkubér cellerne O / N ved 4 ° C i et fugtighedskammer.
    6. Vask cellerne med 200 pi kold 0,1% BSA / PBS.
    7. Påfør 200 pi anti-gede-IgG antistoffer fortyndet ved 1/250 i 3% BSA / PBS-buffer. Inkubér cellerne i 2 timer ved stuetemperatur i et fugtigt kammer.
    8. Vask cellerne 3 gange med 200 pi 0,1% BSA / PBS-buffer og to gange i kold PBS.
    9. Farv cellekernerne med 200 pi Hoechst fortyndet ved 1 / 1.000 i PBS (til en slutkoncentration på 1 ug / ml) i 2 minutter ved stuetemperatur.
    10. Vask dias med vand og lad dem lufttørre før mounting. Påfør en dråbe montering medium 1 til cellerne, placere en kant af en cover-glas på dias, og sænk forsigtigt det på cellerne ved hjælp af pincet. Tryk forsigtigt på cover-glas for at fjerne eventuelle luftbobler.
  5. esterase cytokemi
    Bemærk: Pre-varme alle reagenser til stuetemperatur.
    1. fiksativ forberedelse
      1. Til fremstilling af citrat-acetone-formaldehyd (CAF) opløsning tilsættes 2,5 ml citratopløsning, 6,5 ml acetone og 0,8 ml 37% formaldehyd til en glasflaske. Bland forsigtigt og opbevares ved 4 ° C.
    2. Naphthol AS-D chloracetat esterase (CAE) aktivitetsassay
      1. Varm deioniseret vand til 37 ° C.
      2. I et 50 ml rør, tilsættes 1 ml natriumnitritoploesning til 1 ml farveopløsning. Bland forsigtigt og lad stå i 2 min. Tilsæt 40 ​​ml forvarmet deioniseret vand, 5 ml pH 6,3 buffer koncentrat og 1 ml naphthol AS-D chloracetat opløsning. Bland og overføres til en Coplin-skål.
      3. Fix cellerne ontoslides (se afsnit 1.3) i 30 sekunder med CAF opløsning (se trin 1.5.1.1), og vaske slides i 45 sek med demineraliseret vand.
      4. Overfør objektglassene i opløsningen, der blev fremstillet i trin 1.5.2.2, og inkuber objektglassene ved 37 ° C i 30 minutter i et fugtigt kammer beskyttet mod lys.
      5. Tør dias og derefter skylle dem via nedsænkning i deioniseret vand i 2 min.
      6. Kontrastfarve cellerne ved tilsætning af nogle få dråber Hematoxylinopløsning og inkubere dem i 1 min.
      7. Vaskes objektglassene med neutralt vand (pH 7), og lad dem lufttørre. Påfør en dråbe montering medium 2 til cellerne, placere en kant af en cover-glas på objektglasset og omhyggeligt sænke den på cellerne ved hjælp af pincet. Tryk forsigtigt på cover-glas for at fjerne eventuelle luftbobler.
    3. Alpha-naphthyl butyrat esterase (NBE) aktivitetsassay
      1. Varm α-naphthyl butyrat opløsning til 37 ° C før brug.
      2. Fortynd en tablet af natrium nitrite i 6,25 ml deioniseret vand.
      3. I et 50 ml rør, tilsættes 1,5 ml af en natriumnitrit tablet opløsning og 1,5 ml af en Pararosanilin opløsning. Bland forsigtigt og lad opløsningen stå i 5 min. Supplere opløsningen med 40 ml phosphatpufret opløsning. Bring til pH 6 ved forsigtig tilsætning af 10 N NaOH dråbevis. Der tilsættes 5 ml af α-naphthyl butyrat opløsning, bland hele løsningen, og overføre den til en Coplin-skål.
      4. Fikseres cellerne på objektglassene i 10 sek ved anvendelse af CAF-opløsning ved stuetemperatur og skylles i 45 sekunder med deioniseret vand.
      5. Transfer glider ind i Coplin beholder indeholdende den løsning, der blev fremstillet i trin 1.5.3.2 og inkuber sammen i 1 time ved 37 ° C i et fugtighedskammer mens beskyttet mod lys.
      6. Skyl dias i 2 min i neutralt vand (pH 7) og lufttørre.
      7. Kontrastfarve cellerne med opløsning af methylenblåt ved at tilsætte nogle få dråber på objektglasset og inkuberes i 4 min.
      8. Fordyb dias i deioniseret vand i 2 min og tillade dem at lufttørre. For at montere dias, anvende en dråbe montering medium 2 til cellerne, placere en kant af cover-glas på dias, og sænk forsigtigt det på cellerne ved hjælp af pincet. Tryk forsigtigt på cover-glas for at fjerne eventuelle luftbobler.
  6. Maj-Grünwald Giemsa (MGG) farvning
    1. Farv cellerne (udarbejdet i afsnit 1.3) ved at nedsænke objektglassene i en Coplin krukke indeholdende May-Grünwald løsning til 3 min.
    2. Overfør objektglassene i en Coplin krukke indeholdende pH 6,8 puffer-opløsning i 1 min.
    3. Farv objektglassene ved at anbringe dem i en Coplin krukke indeholdende Giemsa R opløsning (fortyndet til 1/20 i pH 6,8 pufferopløsning) i 10 minutter. Vaskes objektglassene med neutralt vand (pH 7) i 10 sek.
    4. Hæld vandet fra og air-tørre dias. Monter dias ved at anvende en dråbe montering medium 2 på cellerne. Placer den ene kant af dækslet glas på objektglasset og omhyggeligt sænke den påtil cellerne ved hjælp af pincet. Tryk forsigtigt på cover-glas for at fjerne eventuelle luftbobler.

2. In vivo Udvikling og karakterisering af akut leukæmi

BEMÆRK: Fire uger gamle kvindelige kongene C57BL / 6J-Ly5.1 mus blev opretholdt under specifikke patogenfrie betingelser (dvs., i et sterilt miljø). Musene blev injiceret, når de var mellem 5 og 6 uger gamle.

  1. Intravenøs injektion med C1498 celler
    1. Høst de dyrkede C1498 celler i suspensioner ved pipettering. Overfør cellerne til et 50 ml rør og centrifugeres ved 350 xg i 10 min. Vask cellerne i 10 ml kold PBS to gange, og fremstille en cellesuspension af 10 7 celler / ml i PBS. Placer den cellulære suspension på is, før du udfører injektionen.
    2. Placer musen i en fastholdelsesanlæg og udfører injektion under sterile betingelser i en laminær strømning.
    3. Brug en 29G nål med en sprøjte til at injicere cellerne i dethalevene. Tag fat i halen ved den distale ende, og desinficere det med en gaze svamp opblødt i 70% ethanol. Kontroller at være sikker på at der ikke er luftbobler i sprøjten, og derefter langsomt injicere 100 pi af C1498 cellesuspensionen (10 6 celler) i halen vene.
    4. Efter injektionen, fjernes kanylen fra halen, og kontrollere blødning ved at anvende pres med en steril gaze svamp på injektionsstedet. Retur dyret til sit bur, og nøje kontrollere dets sundhed løbet af de næste timer og dage.
  2. Retro orbital samling blod
    1. Overvåg adfærd PBS og C1498-injicerede mus for tegn på leukæmiske sygdom (f.eks, hårrejsning, isolation fra gruppen, og reduceret eller ingen bevægelser i bur).
      BEMÆRK: Dette sker normalt mellem 17 til 19 dage efter, at cellerne injiceres.
    2. Udfør retro orbital blodtapning lige før eutanasi (se trin 2.2.7) under sterile forhold i et laminar flowhætte og under en varmelampe for at forhindre hypotermi.
    3. Til anæstesi, bruge ketamin ved 150 mg / kg og xylazin 10 mg / kg. Forbered bedøvende opløsning ved at fortynde 1,5 ml ketamin og 0,5 ml xylazin i 18 ml PBS-opløsning.
    4. Anesthetize kontrol og leukæmiske mus. Fortsæt med en intraperitoneal injektion af 200 pi af bedøvende opløsning pr 10 g mus under anvendelse af en 26G nål og en 1 ml sprøjte. Kontroller for tabet af pedalen refleks at bekræfte anæstesi.
    5. Sæt et kapillærrør i den mediale øjenkrog af øjet. Blod vil stige fra det orbitale sinus ind i kapillarrøret. Styr blødningen ved forsigtigt at anvende pres på øjet med en steril gaze svamp.
      BEMÆRK: kan indsamles Et volumen på 100 til 200 pi af blod under anvendelse af denne teknik.
    6. Saml blodet ind i et EDTA-rør, og opbevar prøven på is, før isolere mononukleære celler.
    7. Aflive musen med cervikal dislokation, ogfortsæt at isolere de organer (afsnit 2.3).
  3. Organer og celler isolation
    1. organer isolation
      1. Placer aflives musen på ryggen på en plastik bord og bruge nåle til pin dyrets fødder for at lette orgel isolation. Desinficer musen ved hjælp 70% ethanol, før du udfører et snit.
      2. Anvendelse af steril saks, udføre en ventral incision fra den abdominale hud til halsen. Skær gennem bugvæggen for at få adgang til leveren. Skære gennem brystkassen og membranen for at få adgang til lungerne. Flyt tarmen til siden og fjerne milten med sterile sakse og tænger.
      3. For at isolere knoglemarven, skåret benene på toppen af ​​lårben over fælles med sterile sakse. Afbryd skinneben fra lårbenet ved forsigtigt at trække, og fjern hud og muskler fra knoglerne ved hjælp af pincet og saks.
      4. Placer hvert organ og ben i et 50 ml rør indeholdende kold PBS, og læg dem på is.
    2. Isolering af celler fra organerne
      1. Afvej milten før sprængning af cellerne. Mekanisk forstyrre milten, lungerne og leveren ved at presse dem gennem en 70 um si ved anvendelse af et sprøjtestempel i en 50 ml rør, og opsamle cellerne i 30 ml koldt PBS.
      2. At indsamle knoglemarvsceller, satte lårben og skinneben i en petriskål på is, klippe ekstremiteterne anvendelse af sterile sakse, og skyl knoglemarven ved at indsætte en 26G nål fastgjort til en 10 ml sprøjte indeholdende 5 ml kold PBS.
        1. Forstyrre knoglemarvsceller ved at lede cellesuspensionen gennem nålen / sprøjten og filtreres cellesuspensionen gennem en 70 um si i et 50 ml rør.
      3. Centrifuge alle rørene indeholdende hver af de organer og de knoglemarvsceller ved 350 xg i 10 min. Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes indsamlet fra lungerne og knoglemarv i 2 ml lysepuffer (1x) og cellens isoleret fra leveren og milten i 5 ml lysispuffer (1x) ved forsigtigt at pipettere blandingen op og ned. Fyld rørene til 50 ml med kold PBS.
      4. Centrifugeres cellerne ved 350 x g i 10 min. Resuspender cellerne i FACS-buffer til flowcytometrianalyse eller forberede cellerne til mikroskopi. Tæl cellerne under anvendelse en Thoma celletælling kammer efter farvning dem med trypanblåt.
  4. Celleoverfladefarvning af celler isoleret fra organer til flowcytometrianalyse
    1. I en flowcytometri rør, etiket 10 6 celler, der var isoleret fra organer med 10 ug / ml renset anti-CD16 / 32-antistoffer i 100 pi FACS-buffer.
    2. Til 10 6 knoglemarvsceller, tilsættes 100 pi af følgende antistoffer eller kombinationer af antistoffer og deres tilsvarende isotypekontroller fortyndet i FACS-buffer: anti-CD11b / anti-CD3 (1) / anti-Ly6C / anti-Ly6G (2), anti-B220 (1) /anti-CD45.2/anti-CD19, anti-CD115 / anti-CD3 (1) / enTI-Ly6C / anti-Ly6G (2), anti-CD45,2, anti-Ly6G (2), anti-CD11, anti-CD115 eller anti-CD19 alene til kompensationsindstillinger.
    3. Til splenocytter, tilsættes 100 pi af følgende antistoffer og deres tilsvarende isotypekontroller fortyndet i FACS-buffer: en kombination af anti-CD11b / anti-CD3 (1) / anti-Ly6C / anti-Ly6G (2), anti-B220 (1 ) /anti-CD45.2/anti-CD19, anti-CD45,2, anti-Ly6G (2), anti-CD11 eller anti-CD19 for kompensationsindstillinger.
    4. Til lunge- og leverceller, tilsættes 100 pi anti-CD45,2 antistoffer og dens tilsvarende isotypekontrol fortyndet ved 1/100 i FACS-buffer.
    5. Inkuber alle af cellen løsninger til 30 minutter ved 4 ° C.
    6. Vask cellerne ved tilsætning af 2 ml FACS-buffer til hvert rør. Centrifugeres rørene i 5 minutter ved 350 xg og bortkastning af supernatanten ved pipettering. Gentag dette trin en gang til.
    7. Resuspender mærkede celler i 500 pi kold PBS. Hold cellerne på is og beskyttet mod lys, før du udfører flowcytometri for actagelsen og analyse 10.
  5. Isolering af mononukleære blodceller og immunfluorescensfarvning for flowcytometrianalyse
    1. Før du starter protokollen, pre-varme adskillelse løsning på RT.
    2. Overfør blodprøven (100 til 200 pi; opnået fra trin 2.2) i et mikrocentrifugerør, og der tilsættes PBS / 1 mM EDTA-opløsning, indtil opløsningen volumen er 500 pi. lag omhyggeligt 500 pi adskillelse opløsning under opløsningen indeholdende blod under anvendelse af en 30G nål og en 1 ml sprøjte. Bland ikke blodet og adskillende løsning.
    3. Centrifuger rørene ved 800 xg (uden bremse) i 20 minutter ved stuetemperatur. Efter centrifugering opsamles det cellulære ring (det uigennemsigtige hvide lag) under anvendelse af en pipette. Overfør cellerne til et mikrocentrifugerør.
      BEMÆRK: uigennemsigtig hvid lag indeholder lymfocytter samt monocytter og vises mellem det nedre lag - den separerende løsning - og det øvre lag.
    4. Tilsæt 1 mlPBS-opløsning, og centrifuger røret ved 350 xg i 10 min. Cellerne resuspenderes i 600 pi FACS-buffer.
    5. Tilsæt 10 ug / ml oprensede anti-CD16 / 32-antistoffer og distribuere 100 pi af cellesuspensionen i seks separate rør (100 pi hver).
    6. Mærk cellerne med 100 pi af følgende antistoffer eller dertilhørende isotypekontroller fortyndet i FACS-buffer: en kombination af anti-CD3 (1) / anti-B220 (1) /anti-CD45.2 og anti-Ly6C / anti-CD115 /anti-CD45.2 eller anti-CD45,2 og anti-CD115 alene for kompensation indstillinger.
    7. Inkuber alle rørene ved 4 ° C i 30 minutter.
    8. Vask cellerne ved tilsætning af 2 ml FACS-buffer til hvert rør, og derefter centrifugeres rørene i 10 minutter ved 350 xg, og kassér supernatanten med en pipette.
    9. Resuspender mærkede celler i 500 pi kold PBS. Hold cellerne på is og beskyttet mod lys, før du udfører flowcytometri indsamling og analyse 10.
  6. Fremstilling af knoglemarvs-suspensioner på objektglas til mikroskopi
    1. Følg trinene beskrevet i afsnit 1.3, men i trin 1.3.1, bruge 10 5 knoglemarvsceller, og i trin 1.3.4, spinde cellerne i hvert kammer på 72,26 xg i 10 min.
  7. Esteraseaktivitet assays under anvendelse af knoglemarvsceller
    1. For at udføre de knoglemarv esterase cytokemi analyser, fortsæt fra trin 1.5 til 1.5.3.7.
  8. May-Grünwald Giemsa farvning af knoglemarvsceller
    1. At farve knoglemarvsceller, følge protokollen beskrevet i afsnit 1.6, men i trin 1.6.1, inkuberes dias i maj-Grünwald løsning i 5 min.

Representative Results

For at karakterisere C1498 musemodel, vi fortsatte med to store skridt. Først blev C1498 celler karakteriseret for at bestemme deres hæmatopoietisk linje og modning fase in vitro (figur 1). Disse celler blev derefter sprøjtet ind kongene mus, og arten af ​​den inducerede leukæmiske sygdom blev vurderet for at bestemme forskellige funktioner: leukæmisk celleinfiltration, deres fænotype, en kvantificering af de hæmatopoietiske celler (modne og progenitorer / forstadier) i knoglemarv, de frekvenser af C1498-celler og modne hæmatopoietiske celler i blodet og en evaluering af orgel hævelse (i milten, lever og lunger) og cellulær sammensætning.

At karakterisere C1498 cellefænotyper in vitro blev cellerne mærket med antistoffer rettet mod molekyler, som udtrykkes af hæmatopoietiske prækursorer og modne celler (tabel 1), og resultaterne blev analyseret ved anvendelse flow cytometry. De C1498-celler var positive for celleoverfladeekspression af Mac-1 (CD11b / CD18) (~ 7%), B220 (> 25%), og de udviste intracellulær ekspression af CD3e, T-cellereceptor (TCR) Vp kæder og Mac -3 (figur 2A og B). Cellerne var negative for celleoverflademarkørerne Ly6G, Ly6C, CD115, CD21 / CD35, CD19, CD3, CD4, CD8, NK1.1 og pan-NK-molekyler og for den intracellulære ekspression af CD4 og CD8 (data ikke vist) . De blev derefter undersøgt for markører af hæmatopoietiske stamceller og progenitorceller (tabel 1). De var også negative for celleoverfladeekspression af CD117, CD34, Sca-1, CD150 og CD16 / 32 (data ikke vist). Disse leukæmiske celler blev derefter testet for at bestemme ekspressionen af ​​adhæsion, antigenpræsentation og co-stimulerende molekyler. Cellerne udtrykte overflademarkører LFA-1 (CD11a / CD18), CD44, CD31 (PECAM-1), og H-2Db og var negative for MHC klasse II, CD80, CD86 og CD274 (data ikke vist). C1498 celler therefore udtrykkes både myeloid (Mac-1, Mac-3) og lymfoide markører (B220, CD3, TCR).

For bedre at karakterisere sin hæmatopoietisk linje, blev myeloperoxidase ekspression vurderet ved anvendelse immunfluorescens mikroskopi. Alle cellerne var positive for myeloperoxidase, der har kontrolleret deres myeloid oprindelse (figur 3A). Et flertal af cellerne farvedes også positivt for α-naphthyl butyrat esteraser (figur 3B, venstre panel), og nogle af dem farvet for de naphthol AS-D chloracetat esteraser (sorte pile) (figur 3B, højre panel). Resultaterne indikerer, at cellerne indeholdt blandinger af monocytiske og granulocytiske celler. Efter May-Grünwald Giemsa farvning blev udført, blev C1498 cellerne observeret at vise en blast-lignende morfologi med en høj nucleo-cytoplasmatisk forhold, 3 til 5 nucleoli i kernen, et perinukleær halo, mange vakuoler og en basofile cytoplasma (figur 3C ). thos, er C1498-cellelinie bestående af monoblaster og myelobiaster.

De C1498 celler (CD45,2 +) blev derefter intravenøst injiceret i CD45,1 + mus. Musene bukkede under 17 til 19 dage efter at cellerne var injiceret. Disse mus blev aflivet, så deres leukæmi type kunne analyseres inden de døde af sygdommen. Kontrolmusene, som blev injiceret med PBS, blev analyseret ved de samme tidspunkter for sammenligning. Den C1498 celle-injicerede mus viste massiv infiltration af C1498-celler i deres knoglemarv som påvist ved eksplosionen udseende af cellerne efter maj-Grünwald Giemsa-farvning blev udført (figur 4A). De har også bevaret deres monocytisk og granulocytiske fænotyper (figur 4B og C), hvilket viser en akkumulering af monoblastic og myeloblastisk celler, der er karakteristisk for akut myelomonocytisk leukæmi.

Til determine hvorvidt medullære hæmatopoietiske celler numre var lavere efter leukæmiceller invasion, CD45,2 + C1498-celler, B lymfocytisk, monocytisk og granulocytiske populationer (herunder progenitorer, prækursorer og modne celler), blev kvantificeret under anvendelse af immunfluorescensfarvning og multi-parametrisk flowcytometrianalyse. Leukæmiceller udgjorde 16 til 36% af de hæmatopoietiske celler (data ikke vist). De andre celletyper alle blev fundet i betydeligt lavere antal i C1498-injicerede mus end i PBS-injicerede mus (med 5 gange i gennemsnit for B-celle delmængder, 4-fold i gennemsnit for granulocytiske celler og 3 gange i gennemsnit for monocytiske delmængder) (figur 5A til C).

En undersøgelse af hyppighederne af mononukleære celler i leukæmiske og kontrol mus blodprøver viste, at de indeholdt en sammenlignelig procentdel af lymfocytter (figur 6A), men en højere frekvens af monocytiskog leukæmiceller. Disse egenskaber er repræsentative for akut myelomonocytleukæmi 11 (figur 6B).

Blandt de andre funktioner i akut myelomonocytleukæmi 12 er C1498-injicerede mus præsenteret med hævede lever (hepatomegali), lunger og milt (splenomegali) (figur 7A). Blev påvist forskellige frekvenser af CD45,2 + C1498-celler i disse organer under anvendelse af immunfluorescensfarvning og flowcytometri analyse (figur 7B). Som splenomegali kan skyldes høje antal infiltrerede monocytter, vi anslået også andelene af milt-populationer. Antallet af celler i B lymfocytisk, monocytiske og granulocytiske cellefraktioner var betydeligt større, med gennemsnitligt 2 gange, 2,5 gange og 3 gange, respektivt, i leukæmiske milte end i kontroldyr milte (Figur 7C).

tynd-side = "1"> figur 1
Figur 1. Skematisk repræsentation af protokollen Set Up til karakterisering in vitro dyrkede C1498 cellelinier og in vivo Beskrivelser af akut leukæmi. Den hæmatopoietiske afstamning og differentiering etape af væv-dyrkes C1498 celler blev først bestemt. C1498 celler blev derefter injiceret i kongene mus for at inducere udvikling af akut leukæmi. Isoleringen af ​​knoglemarv, perifert blod, milt, lever og lungevæv blev udført for at bestemme frekvenserne, fænotyper og morfologiske ændringer efter C1498-celler infiltration. IV: Intravenøs MGG:. May-Grünwald Giemsa Klik her for at se en større version af dette tal.

annonce / 54270 / 54270fig2.jpg "/>
Figur 2. Fænotypisk analyse af C1498-celler efter in vitro kultur. Repræsentant flowcytometri dot plots og histogrammer af celleoverfladen (A) og intracellulære (B) C1498-udtrykte molekyler, der var forbundet med hæmatopoietisk modne celledifferentiering er vist. C1498-celler blev høstet fra kulturer, vasket og mærket under anvendelse af fluorescerende antistoffer, som var specifikke for celleoverfladen CD11b, CD18 og B220 markører eller deres isotypekontroller. Til intracellulær farvning blev cellerne fikseret, permeabiliseret og mærkes under anvendelse af antistoffer rettet mod Mac-3, CD3e, og en fælles epitop af TCR (T-celle-receptor) Vp kæde eller deres isotypekontroller. Analyser blev udført ved hjælp af gating med levende celler. Klik her for at se en større version af dette tal.

ntent "fo: holde-together.within-side =" 1 "> Figur 3
Figur 3. Funktionel og Morfologisk karakterisering af dyrkede C1498 celler. C1498-celler blev høstet fra kulturer og centrifugeret på objektglas til mikroskopi. (A) Farvning for myeloperoxidase-ekspression blev udført under anvendelse immunofluorescens. (B) cytokemiske reaktioner blev anvendt til at analysere α-naphthyl butyrat esterase (NBE) og naphthol AS-D chloracetat esterase (CAE) aktiviteter i C1498 celler. Cellerne blev anset for at være positiv for hver etiket, når brune og røde-lilla, store cytoplasmatiske granulat henholdsvis blev observeret. (C) May-Grünwald Giemsa (MGG) farvning af C1498 celler. For hvert farvning eksperiment er mikroskopi objektivforstørrelse angivet. Hvert billede repræsenterer tre separate forsøg.large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Bone Marrow morfologier i PBS og C1498-injicerede mus. Bone marv celler blev isoleret fra PBS og C1498 celle-injicerede mus og centrifugeres på dias for mikroskopi. (A) May-Grünwald Giemsa (MGG) farvning. (B ) α-naphthyl butyrat esterase (NBE) og (C) naphthol AS-D chloracetat esterase (CAE) funktioner blev vurderet ved anvendelse cytokemi. I felt A, båndet (umodne) eller segmenteret (modne) neutrofiler er mindre synlige i knoglemarven af ​​C1498-injicerede mus end de PBS-injicerede mus. Panel B og C viser, at der var en ophobning af monocytiske og granulocytiske celler i leukæmiske knoglemarven sammenlignet med de observerede i kontrolgruppen knoglemarven numre. Allemikroskopiske analyser blev udført ved hjælp af en 100X forstørrelse mål. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Kvantitativ analyse af Medullære populationer i PBS og C1498-injicerede mus. Knoglemarvsceller blev isoleret fra PBS og C1498 celle-injicerede mus og anslået efter celletælling blev udført. Blev bestemt Hyppigheden af de forskellige cellepopulationer efter immunfarvning og levende celler gated flowcytometri analyse. (A) De B-celle delmængder inkluderet CD19 + B220 + celler i etaper fra pro-B-celler til at modne B-lymfocytter (B) granulocytiske celler i CD3 - og CD11b + Ly6G + slægter, som omfattede forstadier en. nd umodne og modne granulocytter (C) De monocytiske delmængder blev defineret som CD3 - CD115 + og inkluderet celler i stamfader til modne monocyt stadier. n = 7 mus / gruppe, og data præsenteres som histogrammer, der viser de middelværdier ± SEM. ***, P <0,0001 og **, p <0,01, uparret Students t-test sammenligner PBS og C1498-injicerede mus. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. Blood Analyse af mononukleære celle-undergrupper i PBS og C1498-injicerede mus. Repræsentative flowcytometri dot plots af (A) T- og B lymfocytprocenter, der henholdsvis blev defineret som CD3 + og B220 + -celler i PBS og C1498 celle-injicerede. mus (B) monocytiske celle frekvenser i C1498 leukæmiske og kontrol (PBS) mus blev bestemt ved at analysere CD115 + Ly6C - og CD115 + Ly6C høje celler. Analysen blev udført ved gating levende celler. At sammenligne leukæmiske og kontrol mus, CD45,2 + C1498 celler blev udelukket. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7
Figur 7. Vurdering af Milt populationer i leukæmiske og kontrol mus. (A) Repræsentative fotografier af lever, lunge og milt hævelse i leukæmiske mus sammenlignet med kontrolmus. Milte blev opsamlet og vejet, og splenocytter blev talt efter vævsødelæggelse. (B) Histogram repræsenterer leukæmiceller frekvenser i different organer efter immunfarvning blev udført i CD45,2 + -celler, og resultaterne blev analyseret ved anvendelse af flowcytometri. (C) Skøn, milt B, granulocytiske og monocytiske celleantal efter immunfarvning og flowcytometrianalyse gating blev udført for at identificere levende CD19 + B220 + , CD3 - CD11 + Ly6G +, CD3 - CD11 + Ly6C - og CD3 - CD11b + Ly6C høje celler. Skalaen barer vist for lunger, milt og lever indikerer 1 cm. .. n = 5-8 mus / gruppe, og dataene er repræsenteret i histogrammer som middel ± SEM *, p <0,05; **, p = 0,0033, uparret Students t-test sammenligner PBS og C1498-injicerede mus venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Cell type Membran eller Intracellulære Molekyler
Prækursorer og modne celler
NK-celler NK1.1 +, pan-NK +
NKT-celler NK1.1 +, pan-NK +, TCR Vbeta + (8,2), CD3 +
T-lymfocytter TCR Vbeta +, CD3 +, CD4 +, CD8 +
B-celler prækursorer og B-lymfocytter B220 +, CD19 +, CD21 / 35 +
granulocytiske forstadier og granulocytter Ly6G +, Mac-1 +, CD11 +
monocytiske prækursorer og monocytter / makrofager CD11 +, Mac-1 +, Mac-3 +, CD21 / 35 +, CD115 +, Ly6Chi
stamfædre
multipotente progenitorer CD117 + Sca-1+ CD34 + (Lin- CD150-)
lymfoide-primet multipotente progenitorer CD117hi Sca-1hi CD127 + (Lin-)
fælles lymfoide progenitorer CD117lo Sca-1lo CD127 + (Lin-)
fælles myeloide stamceller CD16 / 32lo CD117 + CD34int (Lin- Sca-1-)
granulocyt-makrofag progenitorer CD16 / 32hi CD117 + CD34hi (Lin- Sca-1-)
megakaryocyt-erythroide progenitorer CD16 / 32lo CD117 + CD34lo (Lin- Sca-1-)
Hæmatopoietiske stamceller CD117 + Sca-1 + CD150 + (Lin- CD34-)

Tabel 1. Markører af hæmatopoietiske cellelinier og differentiering.
CD: klynge af differentiering; Lin: markører af modne celler; lo:lav udtryk; hi: høj ekspression; int: mellemliggende udtryk; NK: naturlige dræberceller; TCR: T-cellereceptor.

Discussion

I tidligere undersøgelser blev C1498 cellelinien beskrevet som en inducer af akut granulocytisk 5, myelomonocytisk 6 eller NKT 7 celleleukæmi. Men demonstrative data i litteraturen var enten fraværende eller ufuldstændige. Protokollen præsenteres her bruger forskellige teknikker, såsom flowcytometri, immunofluorescens, MGG farvning og cytokemiske assays, til at karakterisere dyrkede C1498 celler og til fastlæggelse af arten af ​​leukæmi, der induceres i mus efter de sprøjtes.

Når vi fænotypebestemt in vitro dyrkes C1498 celler efter immunfarvning og flowcytometri analyser blev udført, observerede vi nogle begrænsninger, fordi disse celler udtrykte par celleoverflade hæmatopoietiske markører, der tidligere er blevet beskrevet i litteraturen 6,7. Efter aftale med vores resultater, har Labelle et al. Ikke observere celleoverfladeekspression af moden TCR på C1498 celler ved hjælp flow cytometry farvning. Men de anså dem for at være en NKT cellelinje, efter at de har registreret CD3e og TCRVβ8.2 mRNA 7. Vi observerede også den intracellulære ekspression af TCRVβ kæder og CD3e molekyler i de fleste celler (> 70%), men deres hæmatopoietiske afstamninger kunne ikke bestemmes, fordi der var også en samtidig intracellulær ekspression af Mac-3-molekyle.

Myeloperoxidase, MGG farvning og vurderinger for at analysere funktionelle esteraser hjælp cytokemi vist, at C1498 cellelinie havde en myeloid oprindelse og var sammensat af monoblaster og myelobiaster. Disse resultater var overensstemmende med den procentdel Mac-3 + -celler, der blev opnået i flowcytometri farvning analyse. Selvom det ikke er kvantitativ, disse trin repræsenterer centrale eksperimenter, der skal udføres. De er faktisk stadig hidtil de bedste eksisterende metoder til karakterisering af afstamning og differentiering fase af hæmatopoietiske celler, der udtrykker ingen eller few specifikke fænotypiske markører.

Flowcytometri farvning var nyttigt for at demonstrere udvikling af akut leukæmi i kongene mus efter C1498 celler blev injiceret intravenøst. De CD45,2 + C1498 celler, der infiltrerede ind i perifert blod og forskellige organer blev isoleret, og deres frekvenser blev bestemt. Kvantificering blev også udført for at analysere iboende medullær og miltceller efter immunfænotypebestemmelse. Begrænsninger opstod da C1498-fænotype blev undersøgt i organer, som de udtrykte få bloddannende markører (kun nogle få af dem var B220 +). For at definere karakteren af ​​den observerede akut leukæmi, May-Grünwald Giemsa farvning og en analyse af aktiviteterne i monocytiske og granulocytiske esteraser blev udført ved hjælp af knoglemarv. Resultaterne viste, at C1498 celler bevaret deres myeloblastisk og monoblastic morfologi og funktion, afslører indtræden af ​​myelomonocytleukæmi.

(f.eks blod, knoglemarv og milt celler) holdes på is under proceduren. Hvis der ikke ses farvning i flowcytometri og / eller immunofluorescens eksperimenter, referencen for antistofferne, deres opbevaring reudmærkelser og deres fortyndinger bør kontrolleres. Henvisningerne specificeret i materialer / udstyr tabellen er udvalgt til flowcytometri eller immunofluorescens applikationer. De primære / sekundære antistoffer eller deres konjugerede fluoroforer måske har mistet deres aktivitet på grund af uhensigtsmæssig oplagring (f.eks, udsættelse for lys eller varme), forkert fortynding, omfattende frysning / optøning eller brug af forurenet buffere. Kør positive kontroller for at sikre, at de fungerer korrekt. Brug musen knoglemarv eller milt-afledte celler, som vides at udtrykke proteinerne af interesse. For at undgå høj baggrund og ikke-specifik farvning, skal du sørge for, at cellerne vaskes ordentligt og holdes ved høj luftfugtighed (for immunfluorescens), og at antistofferne fortyndes som anvist. Brug samme koncentration og fortynding for isotypekontrolantistof og det primære antistof til nøjagtig bestemmelse af baggrundsniveauet i prøven. For esterase cytokemi eksperimenterreagenser kan testes ved hjælp af positive og negative kontrolobjektglas indeholdende oprenset muse milt granulocytisk (Ly6G +) og monocytiske (CD115 +) celler.

Den i dette studie procedure viste, at mange af de leukæmiske funktioner observeret i mus efter injektion af C1498-celler delte fælles kendetegn med human akut myelomonocytleukæmi 11,12. De invaderet leukæmiceller resulterede i en reduktion af modne og umodne (stamfædre og prækursorer) medullær hæmatopoietiske celler. C1498 celler er til stede ved høj frekvens (> 20%) i det perifere blod, som er monocytiske celler. Hepatomegali og splenomegali blev observeret at skyldes infiltration af leukæmiceller, og betydelige stigninger i B-lymfocytter og myeloide celler blev også observeret at ledsage splenomegali. Trombopeni blev også observeret, når blodplader antallet blev anslået under anvendelse af en hæmatologianalysator.

Det var shown, anvendelse af in vitro eksperimenter, at C1498 celler inhiberer normal murin hæmatopoiese ved at udskille opløselige faktorer 13. I flere tumor musemodeller, har umodne myeloide celler (herunder monocytisk og granulocytiske celler) også vist sig at migrere fra knoglemarven til milten, hvor de inhiberer specifik T celle aktivering og proliferation 14 anti-tumor. Således kunne reduktion i hæmatopoietiske celler, der blev observeret i knoglemarven have resulteret fra enten en mangel i hæmatopoiese og / eller fra deres udvandring. Sidstnævnte mekanisme kunne forklare tilstedeværelsen af ​​monocytose i det perifere blod eller observation af forstørrede myeloide fraktioner i milten. Det er også tænkeligt, at disse celler kunne være blevet afledt af forbedret milt hæmatopoiese. Faktisk under steady-state betingelser, nogle delmængder af milt B-celler blev identificeret som prækursorer af modne B-lymfocytter 15. I henhold inflammatoriske tilstande, withullary stamceller og progenitorer celler er blevet vist at flytte til milten til at inducere produktion af modne monocytter 16. Denne protokol tillader os ikke at drage konklusioner vedrørende de mekanismer, der er involveret i udviklingen af ​​leukæmi, og yderligere funktionelle samt molekylære analyser bør anvendes til at gøre det. Men disse data omfatter nærmere oplysninger om de kliniske træk ved akut myelomonocytleukæmi, og vil hjælpe forskerne til at evaluere og forstå konsekvenserne af nye terapeutiske midler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C1498 cell line ATCC TIB 49
C57BL/6J-Ly5.1 Charles River B6.SJL-Ptprc a Pep3 b/BoyCrl
Cells culture reagents
2-Mercaptoethanol, Gibco ThermoFisher Scientific 21985
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10270
HEPES, Gibco (1 M) ThermoFisher Scientific 15630
Non-Essential Amino Acids Solution, Gibco   ThermoFisher Scientific 11140
Penicillin-Streptomycin, Gibco  ThermoFisher Scientific 15140
RPMI 1640 Medium (Gibco, GlutaMAX Supplement) ThermoFisher Scientific 61870
Sodium Pyruvate, Gibco (100 mM) ThermoFisher Scientific 11360
Flow cytometry staining reagents
anti-mouse B220 APC (1) ebiosciences 17-0452 clone RA3-6B2, final dilution 1/100
anti-mouse B220 biotin (2) ebiosciences 13-0452 clone RA3-6B2, 1/400
anti-mouse CD3 eFluor450 (1) ebiosciences 48-0032 clone 17A2, 1/100
anti-mouse CD3 PE (2) BD biosciences 555275 clone 17A2, 1/100
anti-mouse CD3 PE-Cy5 (3) ebiosciences 15-0031 clone 145-2C11, 1/100
anti-mouse CD4 APC (1) ebiosciences 17-0041 clone GK1.5, 1/500
anti-mouse CD4 PE (2) ebiosciences 12-0041 clone GK1.5, 1/200
anti-mouse CD8 biotin (1) ebiosciences 13-0081 clone 53-6.7, 1/100
anti-mouse CD8 eFluor450 (2) ebiosciences 48-0081 clone 53-6.7, 1/500
anti-mouse CD11a biotin ebiosciences 13-0111 clone M17/4, 1/100
anti-mouse CD11b PE  ebiosciences 12-0112 clone M1/70, 1/200
anti-mouse CD16/32 biotin ebiosciences 13-0161 clone 93, 1/400
purified anti-mouse CD16/32 (FcR blocking)  BD biosciences 553141 clone 2.4G2
anti-mouse CD18 biotin (1) ebiosciences 13-0181 clone M18/2, 1/100
anti-mouse CD18 FITC (2) ebiosciences 11-0181 clone M18/2, 1/50
anti-mouse CD19 PE ebiosciences 12-0193 clone 1D3, 1/200
anti-mouse CD21/35 PE ebiosciences 12-0211 clone 8D9, 1/50
anti-mouse CD31 PE ebiosciences 12-0311 clone 390, 1/100
anti-mouse CD34 eFluor660 ebiosciences 50-0341 clone RAM34, 1/20
anti-mouse CD44 PE BD biosciences 553134 clone IM7, 1/50
anti-mouse CD45.2 FITC  ebiosciences 11-0454 clone 104, 1/100
anti-mouse CD49b/Pan NK PE  BD biosciences 553858 clone DX5, 1/50
anti-mouse CD80 biotin ebiosciences 13-0801 clone 16-10A1, 1/200
anti-mouse CD86 biotin ebiosciences 13-0862 clone GL1, 1/200
anti-mouse CD107b (Mac-3) PE ebiosciences 12-5989 clone M3/84, 1/40
anti-mouse CD115 PE ebiosciences 12-1152 clone AFS98, 1/100
anti-mouse CD117 eFluor450 ebiosciences 48-1171 clone 2B8, 1/100
anti-mouse CD127 PE ebiosciences 12-1271 clone A7R34, 1/100
anti-mouse CD150 APC ebiosciences 17-1501 clone 9D1, 1/20
anti-mouse CD274 (PD-L1) biotin ebiosciences 13-5982 clone MIH5, 1/200
anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE ebiosciences 12-5981 clone D7, 1/100
anti-mouse Ly-6C APC ebiosciences 17-5932 clone HK1.4, 1/200
anti-mouse Ly-6G  (Gr-1) biotin (1) ebiosciences 13-5931 clone RB6-8C5, 1/400
anti-mouse Ly-6G FITC (2) ebiosciences 11-9668 clone 1A8, 1/50
anti-mouse MHC class I (H-2Db) biotin ebiosciences 13-5999 clone 28-14-8, 1/50
anti-mouse MHC class II (I-A/I-E) PE-Cy5 ebiosciences 15-5321 clone M5/114.15.2, 1/1000
anti-mouse NK1.1 PE BD biosciences 557391 clone PK136, 1/50
anti-mouse TCRVb FITC BD biosciences 553170 clone H57-597, 1/50
streptavidin PE-Cy5 ebiosciences 15-4317    1/200
Immunofluorescence staining reagents
Anti-mouse myeloperoxidase (heavy chain antibody)  Santa Cruz Biotechnology sc-16129 1/10 (20 µg/ml)
 anti-goat IgG (Texas Red coupled antibody) Jackson Immunoresearch 705-076-147 1/250
Normal donkey serum Jackson Immunoresearch 017-000-001
Hoechst solution BD Biosciences 561908 1/1000
Mounting medium 1 (Fluoromount)  Sigma-Aldrich F4680
Acetone VWR  20066
Methanol Merck Millipore 106009
Esterase cytochemical staining reagents
Naphtol AS-D chloroacetate solution Sigma-Aldrich 911
Dye solution (Fast Red Violet LB Base solution) Sigma-Aldrich 912
pH6.3 buffer concentrate (TRIZMAL) Sigma-Aldrich 913
Sodium nitrite solution Sigma-Aldrich 914
Citrate solution Sigma-Aldrich 915
Hematoxylin solution Sigma-Aldrich GHS3
Acetone VWR  20066
Formaldehyde solution, 37% Sigma-Aldrich F1635
α-naphthyl butyrate solution Sigma-Aldrich 1801
Phosphate buffer solution Sigma-Aldrich 1805
Sodium nitrite Tablet Sigma-Aldrich 1809
Pararosaniline solution Sigma-Aldrich 1804
Methylene blue solution Sigma-Aldrich 1808 1/10
mounting medium 2 (Clearmount) Invitrogen 00-8010
May-Grünwald Giemsa staining reagents
May-Grünwald solution RAL Diagnostics 320070
Giemsa R solution  RAL Diagnostics 320310    1/20
pH 6.8 buffer solution RAL Diagnostics 330368
Others materials, reagents and equipment
Ketamine 1000 (100 mg/ml) VIRBAC 3597132111010
Xylazine SEDAXYLAN (20 mg/ml) CEVA
Bovin albumin serum (BSA) powder ThermoFisher Scientific BP671
PBS solution (1x concentrate) ThermoFisher Scientific 14190
Paraformaldehyde (PFA)  Sigma-Aldrich 158127
Saponin  Sigma-Aldrich 47036
Ultra Pure 0.5 M EDTA solution, pH 8.0 ThermoFisher Scientific 15575
Separating solution (Pancoll Mouse) PANBIOTECH P04-64100
Lysis buffer (Red Blood Cells Lysing Buffer) (10x) BD Biosciences 555899 1/10
NaOH 10 N ThermoFisher Scientific SS267
Trypan blue solution (0.4 %) ThermoFisher Scientific 15250-061 1/2
50 ml tube (Falcon) Fisher Scientific 14-432-22
70 µm Cell Strainer (Falcon)  Corning Life Sciences 352350
 Chamber & filter card (EZ Cytofunnel Shandon) Thermo Scientific A78710003
Microscope Cover Glasses, 24 x 24mm Knittel Glass VD1 2424 Y100
Slides (Starfrost - ground edges 90) Knittel Glass VS1137# 077FKB
EDTA Tube Greiner Bio-One 454034
Pasteur Pipette 150 mm (capillary tube) Fisherbrand 1154-6963
26 G needle Terumo NN-2613R
 insulin syringe and needle 29 G Terumo BS05M2913
30 G needle  Becton & Dickinson 304000
Flow cytometry tubes (blue) Beckman Coulter 2523749
Water-repellent pen (Dakopen) Dako S200230
Sharp sterile scissors  Nessi-care SCI-01
Sterile forceps Dominique Dutscher 956506
Thoma cell counting chamber VWR 631-0397
Petri Dishes (Fisherbrand Plastic) ThermoFisher Scientific S33580A
Microcentrifuge tube (1.5 ml) ThermoFisher Scientific 05-408-129
Cylindrical Restrainer 15 - 30 gm Stoelting 51338
Shandon Cytospin 3 Cytocentrifuge ThermoFisher Scientific
10 ml syringe Terumo SS-10L
1 ml syringe Terumo SS-01T
Ethanol Merck 1.08543
Sterile gauze sponges URGO 501580

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forthun, R. B., Hinrichs, C., Dowling, T. H., Bruserud, Ø, Selheim, F. The past, present and future subclassification of patients with acute myeloid leukemia. Curr. Pharm. Biotechnol. 17, (1), 6-19 (2016).
  2. Goldie, H., Butler, C. H., Anderson, M. M., Maxwell, M. C., Hahn, P. F. Growth characteristics of free C1498 (granulocytic leukemia) tumor cells in the peritoneal fluid and the blood of C57 mice. Cancer Res. 13, (2), 125-129 (1953).
  3. Tanaka, K. K., Roberts, E. Biological studies of E.L.4 lymphoma and C Leukemia in susceptible (C57BL) and resistant (B10.D2) mice. Cancer Res. 24, (1498), 1785-1797 (1964).
  4. Law, L. W. Characterization of an influence affecting growth of transplantable leukemias in mice. Cancer Res. 4, 257-260 (1944).
  5. Graham, J. D., McMahon Welch, C., Patchen, M. L. Studies of an implanted murine myelogenous leukemia C1498. Ohio J. Sci. 75, (4), 202-208 (1975).
  6. Boyer, M. W., Orchard, P. J., Gorden, K. B., Anderson, P. M., Mclvor, R. S., Blazar, B. R. Dependency on intercellular adhesion molecule recognition and local interleukin-2 provision in generation of an in vivo CD8+ T-cell immune response to murine myeloid leukemia. Blood. 85, (9), 2498-2506 (1995).
  7. Labelle, J. L., Truitt, R. L. Characterization of a murine NKT cell tumor previously described as an acute myelogenous leukemia. Leuk. Lymphoma. 43, (8), 1637-1644 (2002).
  8. Bradner, W. T., Pindell, M. H. Myeloid leukemia as a screen for cancer chemotherapeutic agents. Cancer Res. 26, (4), Pt 2 375-390 (1966).
  9. Lin, J. M., Li, B., Rimmer, E., VanRoey, M., Jooss, K. Enhancement of the anti-tumor efficacy of a GM-CSF-secreting tumor cell immunotherapy in preclinical models by cytosine arabinoside. Exp. Hematol. 36, (3), 319-329 (2008).
  10. Robinson, J. P. Handbook of Flow Cytometry Methods. Wiley-Liss, Inc. New York, NY. (1993).
  11. Xu, Y., McKenna, R. W., Wilson, K. S., Karandikar, N. J., Schultz, R. A., Kroft, S. H. Immunophenotypic identification of acute myeloid leukemia with monocytic differentiation. Leukemia. 20, (7), 1321-1324 (2006).
  12. Hassan, K., Qureshi, M., Shafi, S., Ikram, N., Akhtar, M. J. Acute myeloid leukemia-FAB classification and its correlation with clinico-haematological features. J. Pak. Med. Assoc. 43, (10), 200-203 (1993).
  13. Quesenberry, P. J., Rappeport, J. M., Fountebouni, A., Sullivan, R., Zuckerman, K., Ryan, M. Inhibition of normal murine hematopoiesis by leukemic cells. N.Engl.J. Med. 299, (2), 71-75 (1978).
  14. Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Immunol. 181, (8), 5791-5802 (2008).
  15. Loder, F., et al. B cell development in the spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality of B cell receptor-derived signals. J. Exp. Med. 190, (1), 75-89 (1999).
  16. Robbins, C. S., et al. Extramedullary hematopoiesis generates Ly-6C(high) monocytes that infiltrate atherosclerotic lesions. Circulation. 125, (2), 364-374 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics