عزل الترشيح من الأحماض النووية: وبسيطة وسريعة استخراج الحمض النووي الطريقة

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

نحن هنا وصف الورقية طريقة استخراج الحمض النووي بسيطة وسريعة من فيروس نقص المناعة البشرية proviral DNA من الدم الكامل الكشف عنها بواسطة PCR الكمي. ويمكن تمديد هذا البروتوكول لاستخدامها في الكشف عن علامات وراثية أخرى أو استخدام أساليب التضخيم بديلة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

McFall, S. M., Neto, M. F., Reed, J. L., Wagner, R. L. Filtration Isolation of Nucleic Acids: A Simple and Rapid DNA Extraction Method. J. Vis. Exp. (114), e54289, doi:10.3791/54289 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الاتحاد الدولي للسباحة، والعزلة الترشيح من الأحماض النووية، هو طريقة استخراج الرواية التي تستخدم الترشيح الرأسي عن طريق الغشاء الفاصل وسادة ماصة لاستخراج الحمض النووي الخلوي من الدم كله في أقل من 2 دقيقة. يتم التعامل مع عينة الدم مع المنظفات، لفترة وجيزة مختلطة وتطبيقها بواسطة الماصة لغشاء الفصل. المحللة الفتائل في لوحة النشاف بسبب العمل الشعري، واستولت على الحمض النووي الجيني على سطح الغشاء الفاصل. يتم الاحتفاظ الحمض النووي المستخرج على الغشاء خلال خطوة غسل بسيطة حيث مثبطات PCR هي الشريرة في لوحة النشاف ماصة. ثم يتم إضافة غشاء التي تحتوي على الحمض النووي فخ للتفاعل PCR دون مزيد من التنقية. لا تتطلب هذه الطريقة البسيطة ومعدات المختبرات ويمكن تنفيذها بسهولة مع وازم المختبرات وغير مكلفة. نحن هنا تصف بروتوكول للكشف حساسة للغاية والكميات من HIV-1 proviral الحمض النووي من 100 ميكرولتر الدم كله كنموذج لفي وقت مبكرالتشخيص فانت من فيروس نقص المناعة البشرية يمكن أن بسهولة أن تتكيف مع أهداف وراثية أخرى.

Introduction

وناقش العديد من التقارير تطوير أساليب الاستخراج paper- أو التي تعتمد على الأغشية للاستخدام في نقطة من الرعاية (POC) الأجهزة 1-5 بهدف جعل حساسية رائعة وخصوصية التشخيص الجزيئي للجميع. صاغ منظمة الصحة العالمية (WHO) الأمراض التي تنتقل بالاتصال الجنسي مبادرة التشخيص على المدى ASSURED (بأسعار معقولة، الحساسة، محددة، وسريعة وقوية، خالية من المعدات وتسليمها لأولئك الذين في حاجة إليها المستخدم ودية) لوصف خصائص مثالية لPOC اختبار 6. من هذه المبادئ التوجيهية، فإن السمة خالية من المعدات تحديا من نوع خاص لتحقيق التشخيص الجزيئي. ومع ذلك، فإن كل الابتكار في مجال تحقيق هدف الوصول إلى من هم في أشد الحاجة، وليس هناك أمل في تحسن على المدى القريب في أداء الاختبار عن طريق التكيف مع التكنولوجيا الحالية 7.

نحن هنا وصف بروتوكول بسيط لاستخراج الحمض النووي من الدم الكاملالتي لا تتطلب الكيمياء المعقدة أو الأجهزة المخبرية. الاتحاد الدولي للسباحة (الترشيح عزل الأحماض النووية) طريقة تحضير العينة وضعت أصلا لاستخراج الحمض النووي الكريات البيض من الدم الكامل من أجل كشف طليعة الفيروس HIV-1 كجزء من عينة إلى الإجابة نقطة من الرعاية (POC) الكمي PCR (QPCR) الرضع في وقت مبكر للتشخيص (عيد) منصة للاستخدام في بيئات محدودة الموارد 8-11. استخراج الاتحاد الدولي للسباحة يختلف عن أساليب تنقية التقليدية التي تستخدم الأغشية السيليكا أو جزيئات ممغطس المغلفة السيليكا لربط عكسية الحمض النووي في حضور وكلاء chaotropic 12. بدلا من ذلك، يستخدم الاتحاد الدولي للسباحة الترشيح الرأسي عبر غشاء الفصل لاستخراج الحمض النووي الخلوي من الدم الكامل مباشرة. غشاء التي تحتوي على الحمض النووي شرك يمكن وضعها مباشرة في أنبوب PCR وإما استخدامها على الفور في تفاعل PCR أو الهواء المجفف لاحق التضخيم 9. تستخدم أي chaotropic وكلاء، والفينول، أو الكحول في استخراج عينة، eliminaتينغ خطوات الغسيل واسعة اللازمة لإزالة مثبطات QPCR قوية مستمدة من عملية الاستخراج 13،14.

غشاء الاتحاد الدولي للسباحة يمكن التقاط إما خلايا 9 أو الحمض النووي الجيني حررها خلية تحلل 11 قبل يتم إضافة العينة إلى الغشاء. لالتقاط الخلايا، يتم إضافة الدم الكامل مباشرة إلى الغشاء. وهي lysed الخلايا بعد ذلك في غشاء من خلال إضافة 10 ملي هيدروكسيد الصوديوم. ميزة لهذا الأسلوب هو أنه ينطوي فقط 3 خطوات: 1) عينة بالإضافة. 2) خلية تحلل / غسيل و 3) وضع القرص مرشح في أنبوب QPCR. العيب إلى هذا الأسلوب هو أن غشاء يمكن أن تعقد سوى عدد محدد من الخلايا يتناسب طرديا مع قطر القرص الغشاء. للوصول إلى الحد من الكشف المطلوبة للعيد، و 100 ميكرولتر من الدم الكامل هو مطلوب لإدخال عينة الذي ينطوي على مرشح كبير جدا بحيث يمكن وضعها في أنبوب QPCR. الناشر خلايا الدم مع المنظفات قبل إضافة العينة إلى جمعويضيف غشاء خطوة المعالجة، ولكن يسمح باستخدام مرشح أصغر لنفس حجم العينة. كنا قادرين على إثبات استنساخ عالية، والكشف عن نسخة واحدة، وتقدير حجم اقل من 10 نسخ من HIV-1 proviral الحمض النووي من 100 ميكرولتر من الدم باستخدام هذا التكوين اختبار 11.

في هذا التقرير، وصفنا بروتوكول الاتحاد الدولي للسباحة كما وضعت أصلا للاستخدامات المختبرية. شطيرة غشاء / فلتر المعروفة باسم وحدة إعداد نموذج الاتحاد الدولي للسباحة يمكن إعداد في دفعات كبيرة وتخزينها لاستخدامها لاحقا. عندما تكون العينات ليكون استخراجه هذه العملية تستغرق مدة 2 دقيقة، ويمكن أداؤها في متفاوتة دفعات الحجم. وQPCR يمكن تشغيلها مباشرة أو المرشحات التي تحتوي على الحمض النووي جزءا لا يتجزأ من يمكن تخزين حتى أنها مريحة لأداء QPCR. هذه الطريقة مناسبة جدا لتحليل الروتيني للعينات في كل من إعدادات الموارد المنخفضة والعالية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بيان الأخلاق: العينات الدموية بأكملها المستخدمة في هذه الدراسة لا تعتبر الأبحاث التي تجرى على البشر. وقد تم الحصول على عينات لأغراض التشخيص السريري، والذي كانوا راضين، وقدمت الجزء المتبقي من هذه العينات للفحص البحوث الاتحاد الدولي للسباحة. تم ترميز العينات من هذا القبيل أن المحققين لم يتمكنوا من التأكد بسهولة من هوية الأفراد.

1. إعداد وحدة إعداد الاتحاد الدولي للسباحة عينة

  1. إعداد النشاف لوحة عن طريق قطع 35 × 35 مم 2 من 2.6 مم وسادة من القطن 100٪. قطع منصة واحدة في العينة.
  2. إعداد فيلم البارافين البلاستيك مع شريط دعم ورقة بواسطة قطعة قطع فيلم البارافين (25 ملم (ح) بنسبة 50 ملم (ث)) ثم اللكم حفرة قطرها 7.14 ملم في وسط الشريط باستخدام مطرقة مدفوعة حفرة لكمة. إعداد شريط واحد لكل عينة.
  3. إعداد الغشاء الفاصل ملزمة الدم الزجاج (غشاء القبض) على القرص من خلال اللكم دائرة قطرها 8.35 ملمباستخدام مطرقة مدفوعة حفرة لكمة. لكمة قرص واحد لكل عينة. القرص لديه القدرة على الاحتفاظ الجسيمات من 2.3 ميكرون.
  4. تجميع عينة وحدة إعداد الاتحاد الدولي للسباحة خلال وضع القرص الالتقاط في وسط لوحة النشاف باستخدام ملقط. وضع شريط فيلم البارافين على القرص التقاط الصورة حتى يترك حفرة من الشريط البارافين وسط القرص القبض عرضة للخطر.
  5. ضمان أقصى قدر من الاتصال بين القرص ولوحة النشاف التي تمتد على الشريط البارافين قليلا لتغطية لوحة النشاف والضغط على الشريط البارافين بحزم التمسك بها إلى لوحة النشاف حول جميع حواف القرص.
  6. جعل العديد من وحدات حسب الحاجة للتجربة أو مخزون للاستخدام في المستقبل.

2. إعداد QPCR أنبوب

  1. إعداد قرص الشريط 5.1 ملم من شأنها ترسيخ غشاء القبض على الخلية إلى جانب أنبوب QPCR لمنع غشاء من عرقلة الكشف عن مضان من قبل اللكم دائرة بولي المغلفة المزدوجخاء الشريط التشخيص بمطرقة مدفوعة لكمة من ورقة الشريط. إعداد القرص شريط واحد لكل عينة.
  2. إزالة جانب واحد من الشريط اللاصق بطانة. ضع الشريط إلى 200 ميكرولتر أنبوب PCR، الشائكة على جانب واحد وباتجاه الجزء السفلي من الأنبوب. إزالة ملصق الثانية بطانة. الأنبوب هو الآن على استعداد لاستقبال القرص المعدة.
  3. إنتاج أكبر عدد ممكن من الأنابيب حسب الحاجة للتجربة أو مخزون للاستخدام في المستقبل.

3. دبر الدم عينة

ملاحظة: إذا كان يجري إعداد عينة اختبار حقيقية، انتقل إلى الخطوة 4.

  1. ذوبان الجليد الخلايا 8e5-LAV 15 بإيواء نسخة واحدة من طليعة الفيروس HIV-1 تم الحصول عليها من ضمان الجودة مختبر علم الفيروسات (VQA، راش المشيخية / سانت لوقا مركز الطبي، شيكاغو، IL).
    ملاحظة: يتم تخزينها كما الكريات الخلايا المجمدة بتركيز 4000 خلية / ميكروليتر. تم التحقق من عدد الخلايا كما هو موضح سابقا 9.
  2. إعداد سرالتخفيف الاتحاد العالمي للتعليم في تجميد المتوسطة (90٪ مصل بقري جنيني، و 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد) لتركيزات تتراوح 1-400 خلية / ميكروليتر.
  3. الماصة 10 خلايا ميكرولتر من كل من التخفيفات المسلسل إلى أنبوب microcentrifuge. إضافة 100 ميكرولتر من الطازجة HIV-1 EDTA سلبي تعامل عينة الدم الكامل لكل أنبوب لإنشاء منحنى قياسي من نسخة أرقام 8e5-LAV 10-4،000. مزيج من قبل عبها بلطف الجزء السفلي من الأنبوب 5 مرات.

4. تنفيذ الاتحاد الدولي للسباحة استخراج

  1. خلايا الدم ليز بإضافة تريتون-X100) إلى تركيز النهائي من 1٪ (11 ميكرولتر 10٪ تريتون-X100 إلى 110 ميكرولتر من الدم الكامل والخلايا من الخطوة 3.3).
  2. مزيج من قبل عبها بلطف الجزء السفلي من الأنبوب 5 مرات. الدم يجب أن تتحول الأحمر الشفاف.
  3. الماصة كل عينة دم على القرص القبض عليه.
    ملاحظة: ختم ضيق المياه بين الشريط البارافين والغشاء القبض يضمن تدفق الدم من خلال الغشاء، واتصالات جيدة بين القبض على مembrane والنشاف التجمع وحة يضمن عينة فتل السريع.
  4. السماح عينة لامتصاص من خلال مرشح.
    ملاحظة: الفتائل المحللة الدم إلى لوحة النشاف بسبب العمل الشعري، واستولت على الحمض النووي الجيني على سطح القرص القبض عليه. وقد غارقة المحللة في القرص عند ظهوره غير لامع.
  5. إضافة 600-1،000 ميكرولتر 10 ملي هيدروكسيد الصوديوم قطرة من الحكمة على القرص القبض عليه.
    ملاحظة: يمكن أيضا أن تضاف غسل العازلة بمثابة إضافة كبيرة الحجم من 600 ميكرولتر. سوف عازلة تشكل قطرات على الشريط البارافين مسعور والفتيل من خلال ثقب إلى القرص في حوالي 20 ثانية. سوف مرشح تغير من اللون الأحمر إلى إزالة مشيرا الأبيض من الهيموغلوبين.
  6. فصل القرص من لوحة النشاف مع ملقط وتطبيق القرص إلى الشريط في أنبوب PCR استعداد. إذا كان هناك أي لون أحمر اليسار على مرشح إضافة 50-100 ميكرولتر من غسل العازلة لمسح عامل التصفية قبل وضعه في أنبوب.
    ملاحظة: نادرا، الضغط الزائد تطبيقها أثناء إعدادالاتحاد الدولي للسباحة وحدات النتائج في تقسيم طبقات غشاء أثناء فصل من لوحة النشاف. تجاهل هذه الأقراص وإعداد عينة جديدة.
  7. بعد يتم وضع فلتر في أنبوب PCR، وتحليل عينات على الفور. بدلا من ذلك، بين عشية وضحاها الجاف في علبة تحتوي على الكالسيوم كبريتات المجففة، ثم سقف وضعها في الحقيبة احباط مع المجففة السيليكا ومخزن لتصبح جاهزة للتحليل.

5. QPCR رد الفعل

  1. إعداد 100 ميكرولتر مزيج الرئيسي QPCR في رد الفعل باستخدام فيروس نقص المناعة البشرية الاشعال وتحقيقات محددة كما هو موضح سابقا 9،11. تشمل عنصر تحكم التضخيم الداخلية لمراقبة وجود مثبطات التضخيم والتحقق من أن عينة سلبية هي سلبية حقيقية. مما لا شك فيه أن مرشح مغطاة بالكامل مع مزيج الرئيسي وأن المرشح يبقى ثابتة إلى جانب أنبوب في جميع أنحاء رد فعل.
  2. أداء التضخيم باستخدام الوقت الحقيقي جهاز PCR كما هو موضح سابقا 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد سير العمل لاستخراج الحمض النووي proviral من الدم الكامل ارتفعت مع خلايا 8e5-LAV في الشكل 1. ويبين الشكل 2 وحدة عينة الاتحاد الدولي للسباحة وإعداد أنبوب QPCR. وتسمح هذه الطريقة لتضخيم كفاءة HIV-1 طليعة الفيروس من خلايا 8e5-LAV في أعداد نسخة مختلفة، كما هو موضح في المنحنى القياسي العينات المفتعلة (الشكل 3). كان PCR كفاءة من 103٪، وتحسب من الكفاءة = -1 + 10 (-1 / المنحدر). كانت معادلة خط ذ = -3.25x + 27.95، مع وجود علاقة من R² = 0.996. منحنى proviral مستوى الحمض النووي فيروس نقص المناعة البشرية يتطابق أيضا التضخيم تكرار للغاية، كما يتضح في الجدول 1. بالإضافة إلى ذلك، الرقابة الداخلية من 500 نسخة Hydroxypyruvate اختزال موجودا لإظهار أنه لا يوجد تثبيط PCR الناتجة عن استخراج الدم مع الاتحاد الدولي للسباحة، بغض النظر عن عدد النسخ من HIV-1 طليعة الفيروس الحالية (الشكل 4). وقد حصلت IC التضخيم بكفاءة في جميع عينات 18 اختبار، بمتوسط ​​الكلوروكوين من 21.92 ± 0.25 و السيرة الذاتية من 1٪.

شكل 1
الشكل 1: سير العمل للكشف عن الحمض النووي proviral من الدم الكامل ارتفعت مع خلايا 8e5-LAV إلى QPCR. (A) من اليسار إلى اليمين، وحدة فينا مستعدة، بعد إضافة الدم إلى الغشاء التقاط وبعد العازلة أضيف غسل. أنابيب (ب) QPCR مع الأقراص القبض على تمسك الشريط المزدوج المغلفة مع مزيج QPCR سيد المضافة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: الاتحاد الدولي للسباحة في منزل وحدة وإعداد أنبوب QPCR. (A) وتقع قرص غشاء القبض قطرها 8.35 ملم بين مربع 707 لوحة النشاف ورقة رقيقة من الشريط البارافين تحتوي على ثقب 7.14 ملم القطر في وسط بحيث كان مركزه ثقب في الشريط البارافين على القرص القبض على التطبيق المباشر للدم هي lysed من قبل الماصة. (ب) عالق البوليستر الشريط التشخيص 5.1 ملم المغلفة المزدوج على جانب من 200 أنبوب QPCR ميكرولتر. تتم إزالة بطانة الثانية من الشريط إلى فضح سطح لزجة لتطبيق القرص التقاط عندما تصبح جاهزة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3: منحنى قياسي من HIV-1 proviral الحمض النووي العينات المفتعلة (A) المؤامرات التضخيم تم الحصول عليها من 100 ميكرولتر من 4 مكررات HIV-1 شمال شرقسلبية للالدم كله ارتفعت مع 4000 و 400 و 40 و 10 خلايا 8e5-LAV مع 500 نسخة / رد فعل الرقابة الداخلية خطوط الصلبة = المؤامرات التضخيم. خط منقط = عتبة. العمودي هو وحدة مضان والمحور السيني هو QPCR عدد دورة. (ب) منحنيات نموذجية من القيم الكلوروكوين تحسب من مؤامرة التضخيم مقابل عدد النسخ سجل الخلايا 8e5-LAV لكل 100 ميكرولتر من الدم الكامل. معادلة الخط: ص = -3.25x + 27.95. R² = 0.996. كفاءة PCR = 103.23٪ تحسب عن طريق الكفاءة = -1 + 10 (-1 / المنحدر) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: الرقابة الداخلية تشير إلى أي QPCR تثبيط 500 نسخة Hydroxypyruvate اختزال التضخيم السيطرة البلازميد وأضاف في رد الفعل. صلب خطوط = المؤامرات التضخيم. خط منقط = عتبة. متوسط ​​الكلوروكوين من IC = 21.92 ± 0.25. تراوحت CQS 21،21-22،32. معامل الاختلاف (CV٪) = 1٪، N = 18. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

خلايا 8e5-LAV /
100 ميكرولتر البنك الدولي افي. الكلوروكوين SD السيرة الذاتية (٪)
4000 16.27 0.14 1
400 19.54 0.15 1
40 22.56 0.3 1
10 24.83 0.15 1

جنرال الكتريك = "1"> الجدول 1: متوسط ​​الكلوروكوين والانحراف المعياري (SD) ومعامل الاختلاف (CV٪) من 4000، 400، 40 و 10 نسخة من منحنى معيار 8e5-LAV مع استخراج الاتحاد الدولي للسباحة وHIV-1 الاشعال محددة و تحقيقات. N = 4. WB = الدم الكامل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد تجلى عيد مرتبطة الحصول على العلاج السريع للحد من وفيات الأطفال بسبب عدوى فيروس نقص المناعة البشرية (16). بسبب استمرار الأجسام المضادة الأمهات في الدم الرضيع وسريعة اختبارات الأجسام المضادة بفيروس نقص المناعة البشرية محدودة فائدة في تحديد وضع الرضع الذين تعرضوا لفيروس نقص المناعة البشرية. وتوصي منظمة الصحة العالمية بأن جميع الأطفال الذين يولدون لHIV-1 الأمهات المصابات ينبغي اختبار في 4-6 أسابيع من العمر، وذلك باستخدام اختبار الفيروسي 17. لقد ذكرت في تطوير فحص للكشف وتحديد الكميات من HIV-1 proviral الحمض النووي في عينات الدم الكاملة التي هي قادرة على الكشف عن نسخة واحدة مع أظهرت حساسية 100٪ والدقة في تقييم حقل صغير من 61 الرضع في جنوب أفريقيا (11). مائة ميكرولتر أو أكثر من الدم الكامل يمكن جمعها عن طريق الإصبع أو كعب العصا ومعالجتها عن طريق وحدات الاتحاد الدولي للسباحة 18،19. ويمكن بعد هذه عينات من الدم يمكن تخزينها لمدة شهر واحد على الأقل قبل التضخيم جعل هذه الطريقة بيئة تطوير متكاملةآل لاختبار الأطفال الرضع التي هي بعيدة كل البعد عن المختبرات.

في الدراسة التي قدمت في الشكل 3، منحنى مستوى العينات المفتعلة من HIV-1 في الدم كله سلبي ارتفعت مع وصفت الخلايا إذابة إيواء HIV-1 proviral الحمض النووي. والتحذير من هذه الدراسة هو أن بعض الخلايا تضاف إلى عينة يمكن أن يكون هي lysed بالفعل بسبب تجميد / الذوبان، والتي كان من المحتمل تحسين مستوى الكشف عن الهدف. ومن شأن التصميم التجريبي أكثر صرامة كانت قد المفتعلة العينة باستخدام الخلايا المستزرعة حديثا والتي قد تحاكي بدقة أكبر الدم الكامل.

وقد صمم الاتحاد الدولي للسباحة طريقة العينة الإعدادية لإدراجها في جهاز عيد POC QPCR (قيد التطوير) للاستخدام في بيئات محدودة الموارد ومع ذلك، فإن شكل اليدوي الموصوفة هنا يمكن أيضا أن تكون إضافة مفيدة إلى محفظة عينة الإعدادية في المختبر. الاتحاد الدولي للسباحة لا يستخدم مأزق، وغسل وأزل الاستراتيجية المستخدمة في التجفيفإد بقع الدم وغيرها من نظم استخراج الورقية أن يخفف الأحماض النووية المستخرجة، مما قد يؤدي إلى حساسية الكشف دون المستوى الأمثل 5. نظام الاتحاد الدولي للسباحة هو درجة عالية من المرونة ويمكن أن تتكيف بسهولة لاختبارات جينية أخرى إلى جانب الكشف عن فيروس نقص المناعة البشرية proviral الحمض النووي. تراجع الكميات من الدم أو العينات البيولوجية الأخرى يمكن معالجتها لأهداف وفيرة وكميات أكبر لتلك أقل وفرة. لدينا في تجسيد الأصلي للنظام الاتحاد الدولي للسباحة، ونحن التقاط الخلايا من الدم الكامل باستخدام غشاء فصل الدم ومن ثم ليز لهم من خلال إضافة 10 ملي هيدروكسيد الصوديوم 9. هذا الإصدار لديه ميزة واحدة الخطوات المستعمل أقل، ولكن عدد الخلايا حجم / الدم التي يمكن معالجتها أصغر. بالإضافة إلى غشاء الزجاج ملزمة المستخدمة في هذا التقرير، وقد استخدمت غيرها من فصل الدم أو مرشح جمع الدم أوراق بنجاح مع هذا الأسلوب، وقد أظهرت العديد من الصكوك PCR الكمي مختلفة أيضا لتضخيم قالب جزءا لا يتجزأ من وإلتر القرص 9. والشرط الوحيد هو أن المرشح لا يمنع القراءة مضان من الوقت الحقيقي PCR الصك.

وجود قيود كبيرة من استخراج الاتحاد الدولي للسباحة هو أن هناك قيدا حجم على قطر الغشاء القبض عليه. قرص مع غشاء أكبر من 9 ملم لا يمكن وضعها في 200 ميكرولتر أنبوب QPCR دون تداخل الغشاء في الأنبوب الذي يحد من مساحة السطح المعرض للمزيج رد فعل. بالإضافة إلى ذلك، زاد قطر القرص، مطلوب المزيد من QPCR حجم رد الفعل لتغطية مرشح مما يزيد من التكلفة وبدوره حولها الوقت المحدد من الفحص. إذا كان المرشح هو صغير جدا لالتقاط بكفاءة الحمض النووي في العينة، فإنه قد تسد منع غسل كفاءة.

باستخدام ملزمة غشاء القبض على الزجاج، وكنا قادرين على التقاط الوحيد HIV-1 proviral الحمض النووي والحمض النووي الريبي لا الفيروسي من عينات الدم الكامل (لا تظهر البيانات). نحن لا نعرف إذا الأغشية أو مخازن بديلة يمكن أن تستخدم رس تعزيز عزل RNA بدلا من أو بالإضافة إلى الحمض النووي. إذا كان القارئ يود أن عزل فقط من الحمض النووي من العينة هذا البروتوكول لا يتطلب إزالة الأنزيمية من الحمض النووي الريبي المطلوبة مع بعض البروتوكولات. كشف كل من HIV-1 الحمض النووي الريبي والحمض النووي في العينات السريرية من شأنه أن يحسن حساسية العيد وهذا النقص في الكشف عن الحمض النووي الريبي وجود قيود على اختبار تشخيصي لدينا.

الخطوة الأكثر أهمية في التكيف مع عملية الاتحاد الدولي للسباحة لفحص الجديد هو للتحقق من حجم مرشح لاستيعاب كمية من الحمض النووي، أي عدد من الخلايا، في عينة لفحصها. في استخراج الاتحاد الدولي للسباحة العام يعمل بشكل أفضل مع العينات مع عدد أقل من الخلايا بحيث الأقراص التقاط أصغر يمكن استخدامها. لتحديد قدرة ملزم من مرشح، ببساطة إضافة قرص مرشح الثاني إلى وحدة فينا مكدسة تحت غشاء جمع. إضافة نموذج وغسل الأغشية كما في الخطوات 4،1-4،5. وضع كل من الأقراص القبض على الحمض النووي في أنابيب QPCR منفصلة وأمبيرlify. باستخدام منحنى قياسي، وتحديد في المئة من الحمض النووي المدخلات القبض على كل مرشح. يمكن أن يكون الأمثل حجم مرشح لاحتياجات الفحص. للمقايسة الاتحاد الدولي للسباحة proviral الحمض النووي الموصوفة هنا، يتم التقاط أكثر من 99٪ من الحمض النووي الجيني البشري عند إضافة المحللة خلية للمرشح (الملاحظات غير منشورة) تمكين قدرات الكشف متفوقة.

بالإضافة إلى عيد، قد التطبيقات المستقبلية من الاتحاد الدولي للسباحة يشمل كشف وتحديد الكميات من الحمض النووي proviral والعلامات البيولوجية لرصد مرض HIV-1 مع المرضى الذين حققوا قمع الفيروسي بسبب العلاج المضاد للفيروسات الرجعية. مراقبة المعالجة التي تهدف إلى القضاء على فيروس نقص المناعة البشرية يمكن أن يؤديها عن طريق فحص مدخلات أخرى إلى جانب الدم المحيطي للخزانات HIV-1 الخلايا المصابة. ويمكن أيضا أن تستخدم اختبار فيروس نقص المناعة البشرية proviral لفحص المواد محاكمة لقاح لعدوى حقيقية. عينات الدم مستقرة أثناء التخزين على وحدات الاتحاد الدولي للسباحة ويمكن جمعها تحت الظروف الحقلية للشحن لاحق لممختبرات ntral لتحليل PCR مما يجعل هذه الطريقة مثالية للدراسات وبائية. بالإضافة إلى الكشف عن HIV-1، ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة مرنة للغاية لتضخيم الأهداف الطب الدقة وجدت في العينات البيولوجية مثل علم الوراثة الدوائي فحص أو غيرها كشف SNP أو التنميط الجيني السريع من النماذج الحيوانية. أساليب التضخيم متساوي مثل هيليكاز التضخيم يعتمد (HDA) أو بوساطة حلقة التضخيم متساوي الحرارة (LAMP) ويمكن أيضا أن تستخدم مع الاتحاد الدولي للسباحة استخراج قالب أو الحمض النووي جزءا لا يتجزأ من على مرشح يمكن استخدامها كقالب لتضخيم PCR التقليدية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fusion 5 GE Healthcare Life Sciences 8151-9915
707 blotting pad VWR International 28298-014
PARAFILM M VWR International 52858-000
3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape  3M Medical Specialties 9965
200 µl qPCR strip tubes Agilent 401428
optical strip caps Agilent 401425
Mx3005p qPCR System Agilent 401456
sodium hydroxide Sigma-Aldrich 221465 A.C.S. Reagent
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284 BioXtra
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418 for molecular biology
fetal bovine serum, certified, U.S. origin Thermo Fisher Scientific 16000-044
Hammer driven small hole punch 3/16" hole diameter (5.1 mm) McMaster Carr 3424A16
Hammer driven small hole punch 1/4" hole diameter (7.14 mm) McMaster Carr 3424A19
Hammer driven small hole punch 5/16" hole diameter (8.35 mm) McMaster Carr 3424A23

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Byrnes, S. A., et al. One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications. Lab Chip. 15, (12), 2647-2659 (2015).
  2. Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. "Paper Machine" for Molecular Diagnostics. Anal Chem. 87, (15), 7595-7601 (2015).
  3. Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami. Lab Chip. 12, (1), 174-181 (2012).
  4. Linnes, J. C., et al. Paper-based molecular diagnostic for. RSC Adv. 4, (80), 42245-42251 (2014).
  5. Rodriguez, N. M., et al. Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens. Anal Chem. 87, (15), 7872-7879 (2015).
  6. Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward. Sex Transm Infect. 82, Suppl 5 1-6 (2006).
  7. Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. Diagnostics for the developing world. Nat Rev Microbiol. 2, (3), 231-240 (2004).
  8. Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings. Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).
  9. Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR. J Clin Microbiol. 47, (8), 2363-2368 (2009).
  10. Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. Google Patents. (2012).
  11. McFall, S. M., et al. A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR. Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).
  12. Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28, (3), 495-503 (1990).
  13. Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples. Mol Biotechnol. 26, (2), 133-146 (2004).
  14. Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113, (5), 1014-1026 (2012).
  15. Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. Google Patents. (1991).
  16. Violari, A., et al. Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants. N Engl J Med. 359, (21), 2233-2244 (2008).
  17. World Health Organization. World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2010).
  18. Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried blood spots--preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques. J Vis Exp. (97), (2015).
  19. Maiers, T. J., et al. An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa. S Afr Med J. 105, (3), 228-231 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics