एचआईवी -1 चुप के दृश्य विशालकाय unilamellar पुटिका (GUV) झिल्ली के लिए बाइंडिंग

Immunology and Infection

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Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A. Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (113), e54293, doi:10.3791/54293 (2016).

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Abstract

एचआईवी -1 के संरचनात्मक प्रोटीन, Pr55 चुप (या झूठ), वायरस विधानसभा की प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं में प्लाज्मा झिल्ली को बांधता है। झिल्ली चुप के बंधन वायरस कण गठन के लिए एक आवश्यक कदम है, वायरल कण उत्पादन की गंभीर हानि में चुप झिल्ली बाध्यकारी परिणाम में एक दोष के बाद से है। चुप-लिपिड झिल्ली बातचीत के यंत्रवत विवरण हासिल करने के लिए, एनएमआर, प्रोटीन footprinting, सतह plasmon अनुनाद, liposome तैरने की क्रिया centrifugation, या प्रतिदीप्ति लिपिड मनका के आधार पर इन विट्रो तरीकों बंधन इस प्रकार अब तक विकसित किया गया है। हालांकि, इन विट्रो में तरीकों में से प्रत्येक की अपनी सीमाएं हैं। इन सीमाओं से कुछ दूर और पहले से स्थापित तरीकों के लिए एक पूरक दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए, हम इन विट्रो परख जिसमें एचआईवी -1 चुप और लिपिड झिल्ली के बीच बातचीत एक "सेल" की तरह वातावरण में जगह ले विकसित की है। इस परख में, चुप लिपिड झिल्ली के लिए बाध्य नेत्रहीन YFP-tagge का उपयोग कर विश्लेषण किया जाता हैइन विट्रो अनुवाद प्रणाली और एक electroformation तकनीक द्वारा तैयार GUVs में आधारित रोगाणु डी चुप एक गेहूं में संश्लेषित। यहाँ हम पृष्ठभूमि का वर्णन है और प्रोटोकॉल myristoylated पूर्ण लंबाई चुप प्रोटीन और परख के लिए आवश्यक GUV झिल्ली प्राप्त करने के लिए और माइक्रोस्कोपी द्वारा बाध्यकारी चुप-GUV पता लगाने के लिए।

Introduction

मानव इम्यूनो वायरस टाइप 1 (एचआईवी -1) एक छा वायरस है कि प्लाज्मा झिल्ली (प्रधानमंत्री) से कलियों पर assembles और सबसे प्रकार की कोशिकाओं में है। एचआईवी -1 वायरस कणों की विधानसभा के 55 केडीए वायरल कोर प्रोटीन Pr55 झूठ (झूठ) कहा जाता है से प्रेरित है। झूठ का पूर्वाभ्यास चार प्रमुख संरचनात्मक डोमेन, अर्थात्, मैट्रिक्स, कैप्सिड, न्युक्लियोकैप्सिड, और पी 6, साथ ही दो स्पेसर पेप्टाइड्स SP1 और SP2 से बना polyprotein के रूप में संश्लेषित है। विधानसभा के दौरान, मैट्रिक्स (एमए) डोमेन विधानसभा साइट के लिए झूठ का लक्षित करने के लिए जिम्मेदार है, कैप्सिड (सीए) डोमेन चुप-चुप बातचीत में मध्यस्थता, न्युक्लियोकैप्सिड (नेकां) डोमेन रंगरूटों वायरल जीनोमिक शाही सेना, और पी 6 रंगरूटों मेजबान कारकों है कि सहायता प्लाज्मा झिल्ली से वायरस कण तराश। चुप भी एक 14 कार्बन फैटी एसिड या उसके एन टर्मिनस पर myristate आधा भाग के अलावा द्वारा एक सह translational संशोधन आए।

झिल्ली चुप के बंधन, वायरल विधानसभा के लिए एक अनिवार्य आवश्यकता है के बाद से मीटरutants कि झिल्ली बंधन में खराब कर रहे हैं वायरस कणों का उत्पादन करने में विफल है। एन टर्मिनल myristate आधा भाग कि लिपिड bilayer और एमए डोमेन अत्यधिक बुनियादी क्षेत्र के रूप में कहा भीतर बुनियादी अवशेषों के एक समूह के साथ (हाइड्रोफोबिक बातचीत में मध्यस्थता: हम और दूसरों है कि झिल्ली चुप के बंधन एमए डोमेन के भीतर द्विपक्षीय संकेतों द्वारा मध्यस्थता है पता चला है HBR) कि प्रधानमंत्री 1-4 पर अम्लीय लिपिड के साथ सूचना का आदान प्रदान। Polyphosphoinositide 5-फॉस्फेट चतुर्थ (5ptaseIV), एक एंजाइम है कि प्रधानमंत्री के विशेष अम्लीय फॉस्फोलिपिड phosphatidylinositol- की hydrolysis उत्प्रेरित के अस्थानिक अभिव्यक्ति का उपयोग कर चुप-झिल्ली बातचीत के अध्ययन (4,5) -bisphosphate [पीआई (4,5) पी 2] phosphatidylinositol-4-फॉस्फेट के लिए, कोशिकाओं में सुझाव दिया है कि चुप-PM स्थानीयकरण द्वारा पीआई (4,5) पी 2 3,5 मध्यस्थता है। हालांकि, इन विट्रो अध्ययन चुप पीआई (4,5) पी के अधिक यंत्रवत विवरण को समझने में लक्ष्य 2 बातचीत कारणों में से एक नंबर के लिए चुनौती साबित किया है। के लियेउदाहरण के लिए, जैव रासायनिक प्रयोगों के लिए पूर्ण लंबाई की शुद्धि myristoylated एचआईवी -1 चुप चुप की प्रवृत्ति शुद्धि के दौरान कुल करने के कारण तकनीकी रूप से कठिन कम से कम हिस्से में किया गया है। इसलिए, इस तरह Myr-एमए या Myr-MA-सीए, या गैर myristoylated फार्म के रूप में एचआईवी -1 झूठ का छोटा रूपों, अक्सर अध्ययन है कि चुप शुद्धि की जरूरत में इस्तेमाल किया गया है (जैसे, परमाणु चुंबकीय अनुनाद, प्रोटीन footprinting, और सतह plasmon अनुनाद 6-9)। वैकल्पिक रूप से, इन विट्रो प्रतिलेखन अनुवाद प्रतिक्रियाओं में मिलकर अन्य जैव रासायनिक अध्ययन 1,2 में पूर्ण लंबाई myristoylated एचआईवी -1 चुप उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस प्रणाली में आम तौर पर, एक ढकोसला एन्कोडिंग प्लाज्मिड लिखित और यूकेरियोटिक सेल lysates (जैसे, खरगोश reticulocyte lysates) है कि किसी भी सेलुलर झिल्ली और मैसेंजर आरएनए से रहित हैं लेकिन प्रतिलेखन और अनुवाद के लिए मशीनरी को रोकने के साथ अनुवाद किया है। प्रतिक्रिया के बाद, सेल चुप युक्त lysates मेरे साथ मिश्रित कर रहे हैंलिपिड के साथ चुप बातचीत के विश्लेषण के लिए mbranes। पूर्ण लंबाई myristoylated चुप तैयारी में आसानी के अलावा, इन विट्रो प्रतिलेखन अनुवाद प्रणाली का उपयोग करने के तरीकों के लिए एक लाभ यह है कि चुप संश्लेषण और बाद झिल्ली बाध्यकारी प्रतिक्रियाओं एक 'यूकेरियोटिक cytosol' की तरह वातावरण है कि बेहतर शारीरिक शर्तों का प्रतिनिधित्व कर सकते में होते है। इस संपत्ति के अध्ययन से पता चला है कि शाही सेना अणु एमए डोमेन के लिए बाध्य को विनियमित चुप एक प्रतिस्पर्धी तरीके से 1,2,10-12 में अम्लीय लिपिड के लिए बाध्य करने के लिए योगदान दिया। हालांकि, बाद से इन सेल lysates में प्राप्त चुप प्रोटीन की कुल राशि अधिक नहीं हैं, radiolabeled एमिनो एसिड के साथ प्रोटीन के चयापचय लेबलिंग उनका पता लगाने के लिए आवश्यक है।

विधि पर निर्भर करता है चुप-लिपिड बातचीत को मापने के लिए, झिल्ली की तैयारियों की एक किस्म का इस्तेमाल किया गया है। इन तरीकों में से प्रत्येक अपनी शक्तियों और सीमाएँ हैं। अधिकांश एनएमआर आधारित assays कम एसाइल साथ लिपिड के उपयोग की आवश्यकताश्रृंखला है कि पानी में घुलनशील (जैसे, C4- और सी 8 पीआई (4,5) पी 2) 6.8 रहे हैं। एनएमआर तरीकों लिपिड है कि कोशिकाओं में पाया लंबे एसाइल चेन विकसित किया जा रहा करने के लिए झूठ के बंधन परीक्षण करने के लिए है, वे केवल myristoylated या nonmyristoylated एमए के साथ इस प्रकार अब तक 8,13 इस्तेमाल किया गया है। वैकल्पिक रूप से, लिपिड से तैयार liposomes मूल निवासी लंबाई एसाइल चेन है कि इस तरह के liposome तैरने की क्रिया या फ्लोरोसेंट liposome मनका बाध्यकारी assays 2,3,10,14-16 के रूप में जैव रासायनिक तरीकों में इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, इन assays में इस्तेमाल किया liposomes छोटे व्यास है, और इस तरह उनके झिल्ली खड़ी है और सकारात्मक curvatures है। इसके विपरीत, एचआईवी -1 से संक्रमित कोशिकाओं में कण विधानसभा के प्रारंभिक चरण के दौरान, चुप PM, जो लगभग चुप के पैमाने पर तलीय है को बांधता है, और बाद में नवोदित दौरान नकारात्मक वक्रता लाती है। इसलिए, खड़ी है और सकारात्मक वक्रता के साथ liposome झिल्ली चुप लिपिड बातचीत का अध्ययन करने के लिए आदर्श लिपिड bilayers नहीं हो सकता है। liposome flot लिए के रूप मेंव्यावहारिक assays, एक और संभावित चेतावनी centrifugation के दौरान अतितनावी सूक्रोज ढाल करने के लिए चुप लिपिड परिसरों की है कि जोखिम प्रयोगात्मक परिणाम को प्रभावित कर सकता है। इन सीमाओं को कम करने और एक पूरक प्रायोगिक प्रणाली प्रदान करने के लिए, चुप विशाल unilamellar पुटिकाओं (GUVs) करने के लिए बाध्य करने के लिए assays के हाल के वर्षों में विकसित किया गया है। GUVs एकल लिपिड bilayer पुटिकाओं जिसका व्यास माइक्रोमीटर के कई दसियों के लिए विस्तार कर रहे हैं। इस प्रकार, इन झिल्लियों की वक्रता चुप के पैमाने पर प्रधानमंत्री जैसा दिखता है। इसके अलावा, अपने बड़े आकार, जो ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत दृश्य निरीक्षण के लिए सक्षम बनाता है, के कारण झिल्ली के fluorescently टैग या लेबल चुप प्रोटीन इन पुटिकाओं करने के लिए मिश्रण आसानी से चुप लिपिड परिसरों के बाद के प्रसंस्करण के बिना निर्धारित किया जा सकता पर बाध्यकारी।

हम यहां एचआईवी -1 चुप झिल्ली एक electroformation विधि से प्राप्त GUVs का उपयोग कर बाध्यकारी अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस तरह कोमल हाइड्रेशन, जेल की मदद से हाइड्रेशन, mic के रूप में विभिन्न तरीकोंrofluidic jetting, और electroformation 17-22 GUVs प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल के लिए, electroformation विधि अम्लीय लिपिड और महंगी setups की आवश्यकता के बिना प्रयोग के अपने रिश्तेदार आसानी से GUVs बनाने में मुख्य रूप से अपनी क्षमता की वजह से किया जाता है। चूंकि चुप के दृश्य एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जरूरी है, पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) आनुवंशिक रूप से झूठ (झूठ-YFP) के सी टर्मिनस से जोड़ा जाता है। चुप-YFP प्रोटीन निरंतर आदान-निरंतर प्रवाह (CECF) प्रौद्योगिकी पर आधारित गेहूं के बीज lysates में इन विट्रो प्रतिलेखन और अनुवाद प्रतिक्रियाओं से प्राप्त कर रहे हैं। इस प्रौद्योगिकी में, प्रतिक्रियाओं और प्रतिक्रिया substrates और ऊर्जा घटकों की आपूर्ति की निरोधात्मक उपोत्पाद के दोनों हटाने की एक डायलिसिस आधारित तंत्र में प्राप्त कर रहे हैं। इन प्रतिक्रियाओं के लिए, एक प्लाज्मिड एक T7 प्रमोटर के नियंत्रण में चुप-YFP एन्कोडिंग प्रयोग किया जाता है। ध्यान से, पहले के रूप में दिखाया, गेहूं के बीज lysates myristoylation अतिरिक्त घटकों 2 के बिना समर्थन3,24। इस विधि का प्रयोग, यह संभव हो गया है पूर्ण लंबाई GUV झिल्ली 24 पर चुप-चुप YFP myristoylated के दृश्य के लिए के लिए पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के लिए। यहाँ हम प्रोटोकॉल के साथ जो एचआईवी -1 चुप पीआई के लिए बाध्य वर्णन (4,5) पी 2 GUV झिल्ली युक्त लंबा बाद के प्रसंस्करण के बिना बाध्यकारी प्रतिक्रियाओं के बाद और प्रस्ताव है कि इस पद्धति का पूरक पहले से मौजूद चुप-झिल्ली बाध्यकारी assays और हो सकता है की जांच की जा सकती है आगे बाध्यकारी समझने के लिए एचआईवी -1 चुप-झिल्ली बढ़ाया।

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Protocol

दिन 1: चुप प्रोटीन गेहूं के बीज Lysate आधारित इन विट्रो प्रतिलेखन-अनुवाद प्रणाली का उपयोग करते हुए की अभिव्यक्ति

1. एचआईवी -1 झूठ की तैयारी

  1. (; -20 डिग्री सेल्सियस पर अन्य अभिकर्मकों गेहूं के बीज lysates -80 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है) फ्रीजर से वाणिज्यिक गेहूं के बीज CECF किट के सभी अभिकर्मकों निकालें। बर्फ पर उन्हें गला लें और जैसा कि तालिका 1 में दिखाया घटकों का मिश्रण।
मिक्स-1 (दूध पिलाने मिक्स)
दूध पिलाने समाधान 900 μl
अमीनो अम्ल 80 μl
methionine 20 μl
कुल 1,000 μl
मिक्स -2 (Lysate मिक्स)
wheatgerm lysates 15 μl
RNase मुक्त पानी 7 μl
अमीनो अम्ल 4 μl
methionine 1 μl
ते बफर में प्लास्मिड डीएनए (1 माइक्रोग्राम / μl) ** 4 μl
प्रतिक्रिया बफर 15 μl
RNasin * 4 μl
कुल 50 μl

तालिका 1: गेहूं के बीज प्रतिक्रियाओं के लिए आवश्यक मिश्रण की रचनाएँ।
नोट: प्रयोग चुप झिल्ली बंधन पर RNase द्वारा शाही सेना हटाने के प्रभाव की जांच करने के लिए बनाया गया है, तो RNase मुक्त पानी के साथ ribonuclease अवरोधकों की जगह। प्लास्मिड डीएनए निर्माता अनुदेश के अनुसार दोष से मुक्त होना चाहिए। हालांकि, पीlasmids पारंपरिक का उपयोग कर तैयार है, लेकिन endotoxin मुक्त, प्लाज्मिड अलगाव किट नहीं सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है। निर्माता के निर्देश भी nuclease मुक्त पानी में भंग डीएनए का उपयोग की सिफारिश की। ते [10 मिमी Tris एचसीएल (7.4 पीएच) युक्त 1 मिमी EDTA] में निलंबित डीएनए का उपयोग करते हैं, तो डीएनए की कम सांद्रता का उपयोग कर, क्योंकि ते में EDTA उपज को प्रभावित कर सकता से बचें। 0.8-1 माइक्रोग्राम / μl की एकाग्रता रेंज में ते बफर में भंग प्लास्मिड सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है।

  1. पहली प्रतिक्रिया कैसेट (पारदर्शी कक्ष) में खिला मिश्रण (मिक्स -1) जोड़ें। फिर दूसरे चैम्बर (लाल) के लिए lysate मिश्रण (मिक्स -2) जोड़ें। जबकि उनके संबंधित कक्षों में मिश्रण को जोड़ने के लिए किसी भी बुलबुले, परिचय के बाद से है कि समाधान के घटकों का अकुशल आदान प्रदान करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और इसलिए प्रतिक्रिया की क्षमता को कम मत करो।
  2. किट के साथ प्रदान चिपकने वाली फिल्म के साथ कक्षों को कवर किया।
  3. कैसेट धारक और incuba में प्रतिक्रिया कैसेट डालेंते एक Eppendorf thermomixer आर में 900 आरपीएम की एक निरंतर झटकों गति से 24 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए विधानसभा

दिन 2: Electroformation और फसल गेहूं रोगाणु lysates द्वारा तैयार GUVs

2. GUVs की तैयारी

  1. अशेष लिपिड ऐसे क्लोरोफॉर्म या क्लोरोफॉर्म के मिश्रण और Teflon लाइनर्स के साथ खड़े हैं और parafilm के साथ लिपटे पेंच टोपी के साथ कांच की शीशियों में मेथनॉल के रूप में अकार्बनिक सॉल्वैंट्स में भंग कर दिया। हैमिल्टन प्रकार कांच सीरिंज के साथ लिपिड संभाल लेना, या उपलब्ध हैं, क्लोरोफॉर्म प्रतिरोधी प्लास्टिक टिप्स। कांच लिपिड युक्त -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से GUV तैयारी के लिए इस्तेमाल किए जाने की शीशियों बाहर ले जाओ।
    1. एक बार शीशियों कमरे के तापमान को equilibrated कर रहे हैं, दृश्य निरीक्षण है कि लिपिड निलंबन स्पष्ट कर रहे हैं द्वारा सुनिश्चित करें। ऐसे palmitoyl-oleoyl phosphatidylserine (पीओपी) और पीआई (4,5) पी 2 के रूप में लिपिड, विशेष रूप से अम्लीय लिपिड, की गुणवत्ता, सफल प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है। लिपिड हैं कि प्रयोग न करेंअब से 2 महीने के लिए aliquots में।
  2. वांछित तापमान के लिए एक गर्मी ब्लॉक पूर्व गर्म। इस तापमान पर कम से कम 5 डिग्री सेल्सियस तापमान के पिघलने (टी एम) लिपिड (s) उच्चतम टी मीटर के साथ की तुलना में अधिक होना चाहिए।
  3. वांछित दाढ़ लिपिड अनुपातों के अनुसार जरूरत लिपिड की मात्रा की गणना। यहाँ बाध्यकारी एचआईवी -1 झूठ का अध्ययन करने के लिए, के रूप में तालिका 2 में दिखाया गया है निम्नलिखित दाढ़ अनुपात का उपयोग।
लिपिड मिश्रण दाढ़ अनुपात मात्रा (μl में) शेयर एकाग्रता
POPC + चबूतरे + चोल 46.6 + 23.3 + 30 19.74 + 10.18 + 6.57 POPC, चबूतरे, चोल: 10 मिलीग्राम / एमएल
POPC + चबूतरे + चोल + ब्रेन-पीआई (4,5) पी 2 16,11 + 8,3 + 6,25 + 58,19 POPC, चबूतरे, चोल: 10 मिलीग्राम / एमएल
ब्रेन-पीआई (4,5) पी 2: 1 मिलीग्राम / एमएल

तालिका 2: अलग लिपिड की मात्रा GUVs प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया।

  1. लिपिड की मात्रा में वांछित एक साफ पेंच से ढकी कांच की शीशी में जोड़ें।
  2. उपयोग आईटीओ लेपित आयाम 25 x 50 x 1.1 मिमी 3 और प्रतिरोध 70-100 Ω (सूची में वर्णित) की स्लाइड। एक साफ बेंच पर दो आईटीओ लेपित स्लाइड रखें। प्रत्येक electroformation चैम्बर दो इंडियम टिन ऑक्साइड (आईटीओ) लेपित गिलास स्लाइड की आवश्यकता है। सत्यापित करें कि गिलास स्लाइड के प्रवाहकीय पक्ष प्रतिरोध की जाँच के लिए एक मल्टीमीटर का उपयोग करके सामना करना पड़ रहा है। यह लगभग 200 Ω के एक मूल्य दिखाना चाहिए। सुनिश्चित करें कि स्लाइड की सतह धीरे 70% इथेनॉल प्रकार का वृक्ष मुक्त पोंछे का उपयोग के साथ पोंछते द्वारा साफ कर रहे हैं।
  3. री द्वारा एक सिरिंज के एक सुई की बाहरी सतह को साफक्लोरोफॉर्म के साथ यह nsing और गर्मी ब्लॉक पर सिरिंज जगह है।
  4. सामना करना पड़ रहा प्रवाहकीय पक्ष के साथ गर्मी ब्लॉक पर एक नया आईटीओ लेपित गिलास स्लाइड प्लेस और यह वांछित तापमान आमतौर पर के बारे में 2-3 मिनट के लिए संतुलित करने के लिए अनुमति देते हैं। एक संभावित खतरा है कि कांच की स्लाइड्स पर आईटीओ कोटिंग प्रक्रियाओं सफाई के दौरान क्षतिग्रस्त हो सकता है के लिए आईटीओ लेपित गिलास स्लाइड पुनः प्रयोग न करें।
  5. वर्दी और अभी तक त्वरित गिलास स्लाइड पर लिपिड के प्रसार के लिए प्रत्येक स्लाइड के लिए लिपिड मिश्रण के 40-50 μl की एक मात्रा का प्रयोग करें। ऐसे क्लोरोफॉर्म के रूप में एक उचित कार्बनिक विलायक के साथ कुल मात्रा समायोजित करें।
    1. लिपिड मिश्रण की कुल मात्रा में से एक आधा गिलास स्लाइड पर रखें और तुरंत साफ सिरिंज (2.6 चरण) का उपयोग कर एक समान लिपिड फिल्म छोड़ने के लिए (स्लाइड भर में 2-3 बार सुई चलती) लिपिड फैल गया। लिपिड फिल्म बिखरा धीरे (लेकिन जल्दी) पतली आईटीओ कोटिंग करने के लिए किसी भी नुकसान से बचने के लिए। गैर वर्दी प्रसार या किसी न किसी तरह से फैल उप इष्टतम करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैंपैदावार या GUVs के कम्प्यूटेशनल विविधता।
    2. इसलिए, यह सुनिश्चित वर्दी प्रसार के बाद अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले फैल लिपिड फिल्म का निरीक्षण किया। फिल्म की अस्पष्टता दिखाई देता है तो जरूरत से ज्यादा गैर वर्दी, एक नई स्लाइड का उपयोग कर प्रक्रिया फिर से करना।
  6. लेपित पक्ष का सामना करना पड़ के साथ एक पेट्री डिश के अंदर लेपित स्लाइड रखें।
  7. दोहराएँ एक और आईटीओ लेपित स्लाइड का उपयोग कर मिश्रण के आराम के लिए 2.6-2.9 कदम।
  8. 60-90 मिनट के लिए एक पारंपरिक वैक्यूम सुखाना कक्ष में दोनों स्लाइड युक्त कार्बनिक सॉल्वैंट्स के किसी भी निशान को हटाने के लिए पेट्री डिश रखें।
  9. इस प्रक्रिया के दौरान, गर्मी ब्लॉक (ज्यादातर मामलों में 65 डिग्री सेल्सियस) और पूर्व गर्म 300 मिमी इनक्यूबेटर में sucrose के समाधान के रूप में ही तापमान को इनक्यूबेटर निर्धारित किया है।
  10. सूखने के बाद, पीठ को पेट्री डिश लाने के लिए और एक स्वच्छ सतह पर कांच स्लाइड जगह।
  11. धीरे एक PDMS गैसकेट (चित्रा 1) 70% इथेनॉल और सूखी यह comple का उपयोग कर साफtely।
  12. यह लिपिड लेपित गिलास स्लाइड पर जगह के रूप में चित्र 1 में दिखाया गया है और धीरे से और मजबूती से इतना है कि गैसकेट रूपों एक पानी तंग सील दबाएँ। PDMS गैस्केट और स्लाइड के बीच अंतराल के अभाव की पुष्टि करें। यह एक उथले चैम्बर कि सूक्रोज समाधान धारण के गठन में यह परिणाम है।

आकृति 1
चित्रा 1:। आईटीओ लेपित गिलास electroformation के लिए इस्तेमाल किया स्लाइड के लेआउट यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. किसी भी बुलबुले बिना पूर्व गर्म sucrose के समाधान के साथ चैम्बर भरें।
  2. शीर्ष पर अन्य लेपित स्लाइड प्लेस एक तंग सील बनाने के लिए। सुनिश्चित करें कोई बुलबुले देखते हैं कि। के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया अंतिम विधानसभा दिखाई देनी चाहिए। चैम्बर usin जकड़नाजी बांधने की मशीन क्लिप।

चित्र 2
चित्रा 2:। Electroformation चैम्बर (ओर देखने) की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. आकांक्षा से अतिरिक्त सुक्रोज निकालें और प्रकार का वृक्ष मुक्त पोंछे का उपयोग कर स्लाइड साफ। तांबा पट्टी करने के लिए स्लाइड जकड़ना इतना है कि प्रवाहकीय पक्षों पट्टी के साथ वर्दी संपर्क में हैं। सुनिश्चित करें कि केवल एक गिलास स्लाइड के प्रवाहकीय ओर एक तांबे पट्टी के साथ संपर्क में है।
  2. मगरमच्छ क्लिप का उपयोग कर समारोह जनरेटर उत्पादन करने के लिए तांबे बार कनेक्ट करें। विधानसभा मशीन के अंदर की जगह विधानसभा वांछित तापमान को संतुलित करने के लिए अनुमति देने के लिए।
  3. 10 हर्ट्ज की एक साइन लहर आवृत्ति और 90 मिनट के लिए 1 वी के एक संभावित अंतर लागू करें। ensurई है कि वोल्टेज के रूप में 3 चित्र में दिखाया एक मल्टीमीटर द्वारा 1 वी है। 90 मिनट के लिए प्रक्रिया जारी है।

चित्र तीन
चित्रा 3:। पदों पर जो मल्टीमीटर से इलेक्ट्रोड आवृत्ति और वर्तमान को मापने के लिए रखा जाता है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. 90 मिनट के बाद, धीरे-धीरे 2 हर्ट्ज आवृत्ति कम होती है और एक और 10 मिनट के लिए electroformation जारी है। इस समय के दौरान, इन विट्रो अनुवाद प्रतिक्रियाओं में फसल (कदम 3.1-3.2)।
  2. बंद स्विच समारोह जनरेटर और विधानसभा (इनक्यूबेटर बंद करने और थोड़ा खोला इनक्यूबेटर दरवाजे को छोड़ कर) कमरे के तापमान धीरे धीरे करने के लिए नीचे शांत करने के लिए अनुमति देते हैं।
  3. ठंडा करने के बाद, जनरेटर के लिए केबल काटस्लाइड विधानसभाओं से। GUVs बहुत नाजुक हो सकता है और इसलिए बहुत धीरे से नियंत्रित किया जा करने की जरूरत है। ध्यान से बेंच करने के लिए विधानसभा में लाते हैं।
  4. धीरे शीर्ष स्लाइड संदंश का उपयोग कर हटाने के द्वारा चैम्बर साफ करें। एक कट 1,000 μl टिप और एक साफ ट्यूब को हस्तांतरण का उपयोग कर सुक्रोज GUVs निलंबन युक्त हार्वेस्ट। GUVs के विघटन को रोकने के लिए धीरे ट्यूब संभाल लेना।
  5. तुरंत GUVs का प्रयोग करें। जब कमरे के तापमान पर संग्रहित GUVs कटाई के बाद कम से कम 90 मिनट के लिए स्थिर रहे हैं।

3. फसल में इन विट्रो अनुवाद प्रतिक्रियाओं

  1. इन विट्रो अनुवाद लाल कक्ष से वांछित प्रोटीन युक्त एक ट्यूब में एक micropipette का उपयोग प्रतिक्रियाओं हार्वेस्ट।
  2. एकत्रित प्रोटीन को हटाने, एक tabletop अपकेंद्रित्र पर 15 मिनट के लिए 16,200 XG पर lysates स्पिन और ध्यान से एक और ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण करने के लिए।

4. GUV बाध्यकारी परख

  1. एक कट टिप का उपयोग करना, मिश्रण 51; इन विट्रो अनुवाद अनुवाद प्रोटीन और एक ट्यूब में GUVs के 5 μl युक्त प्रतिक्रियाओं के एल और 2-3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  2. एक छोटा सा छेद (3-4 मिमी व्यास) एक स्वच्छ कवर पर्ची पर साथ एक PDMS पत्र संलग्न हैं और यह सुनिश्चित तंग सील धीरे से और दृढ़ता coverslip के खिलाफ यह दबाकर।
  3. 4.1 कदम से 10 μl मिश्रण छोटे से छेद में रखें।
  4. छवि कमरे के तापमान पर एक औंधा महामारी या confocal प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे मिश्रण।
    नोट: वाष्पीकरण को रोकने के लिए, इमेजिंग कक्ष एक coverslip द्वारा कवर किया जा सकता है।

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Representative Results

ऊपर प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम POPC + चबूतरे + चोल से बना GUVs तैयार (: 4.66: 2.33: दाढ़ अनुपात 3)। इस रचना लगभग प्रधानमंत्री के पी एस और कोलेस्ट्रॉल की सांद्रता को प्रतिबिंबित करने के लिए चुना गया था। मजबूत और कुशल चुप के बंधन ही मनाया गया था जब मस्तिष्क पीआई (4,5) पी 2 POPC + चबूतरे + चोल मिश्रण में शामिल किया गया था (POPC + चबूतरे + चोल + मस्तिष्क पीआई (4,5) पी 2 [दाढ़ अनुपात : 4: 2: 3: 1] इस उदाहरण में) (चित्रा 4, ए और सी) के साथ पैनल बी और डी की तुलना करें। चुप-YFP POPC + से बना GUVs के लिए बाध्य चबूतरे + चोल + मस्तिष्क पीआई (4,5) पी 2 झिल्ली सतह पर प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि से स्पष्ट है। यह वृद्धि भी प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रोफाइल (चित्रा 4, नीचे) लाइन GUV सीमा (चित्रा 4C और डी में XX ') पार करने के साथ में देखा जा सकता है।

लोड / 54293 / 54293fig4.jpg "/>
चित्रा 4:। चुप मस्तिष्क पीआई (4,5) पी 2 GUVs -contianing POPC + चबूतरे + चोल (ए और सी) और POPC + चबूतरे + चोल + पीआई के एक confocal पार अनुभाग (4,5) पी 2 को बांधता GUVs (बी और डी)। चुप-YFP का वितरण हरे रंग में दिखाया गया है। चुने गए GUVs (पीले बॉक्स) के बढ़े हुए छवियों पैनलों सी और डी में दिखाया जाता है प्रतिदीप्ति तीव्रता GUVs (एक्स के लिए 'एक्स) की विपरीत दिशा में पार करने के लिए तैयार की बेतरतीब ढंग से चुना लाइनों छवियों नीचे दिखाई जाती हैं साथ प्रोफाइल। बार = 5 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

GUV बाध्यकारी परख के रूप में ऊपर वर्णित परिदृश्यों जहां अन्य प्रोटीन लिपिड बातचीत assays अपनी सीमाएं हैं में एक अच्छा विकल्प प्रदान करता है। इस परख हमें लिपिड bilayer संदर्भ में देशी-लंबाई एसाइल चेन के साथ myristoylated पूर्ण लंबाई चुप और अम्लीय लिपिड के बीच बातचीत की जांच करने और उच्च घनत्व सूक्रोज ढ़ाल या चुप लिपिड के अन्य पोस्ट बाध्यकारी प्रसंस्करण के माध्यम से लंबा तैरने की क्रिया centrifugation के बिना ऐसा करने के लिए अनुमति देता है परिसरों। एक और लाभ यह है कि झूठ के व्यवहार (जैसे साइटोसोलिक घटकों की उपस्थिति में) एक जटिल मिश्रण में जांच की जा सकती है, जो आसानी से इस तरह की सतह plasmon अनुनाद आधारित assays के रूप में अन्य वास्तविक समय में तकनीक को हासिल नहीं कर रही है। इसलिए, एक बहस कर सकते हैं कि परख यहाँ वर्णित अन्य क्षेत्र में इस्तेमाल किया assays की तुलना में एक अधिक देशी संदर्भ में चुप-अम्लीय लिपिड बातचीत की वास्तविक समय निर्धारण में सक्षम बनाता है।

हालांकि, वहाँ के रूप में विधि के साथ जुड़े सीमाएं हैंकुंआ। यह सुनिश्चित करने के लिए एक दिया तैयारी में GUVs एक दूसरे के समान रचना की है और मूल मिश्रण करने के लिए, electroformation अच्छी तरह से लिपिड है कि सबसे अधिक संक्रमण तापमान मिश्रण 25,26 में मौजूद संक्रमण तापमान ऊपर प्रदर्शन किया जाना चाहिए। हालांकि, यह है कि लंबे समय के लिए उच्च तापमान के लिए लिपिड के जोखिम लिपिड टूटने 25,27 को जन्म दे सकती संभव है। इसलिए, GUVs की गुणवत्ता, दृश्य निरीक्षण फ्लोरोसेंट रंगों लिपिड (जैसे, किया था), यह वांछनीय ब्याज के लिपिड [जैसे, पीआई (4,5) पी 2 की कार्यक्षमता का परीक्षण करने के लिए है के शामिल किए जाने से सक्षम करने के अलावा नियंत्रित करने के लिए ] एक लिपिड विशेष जांच का उपयोग। इसके अतिरिक्त, GUV रचनाओं कि एक निश्चित तापमान पर जुदाई चरण को जन्म देने के साथ, देखभाल ठीक एक वांछित तापमान बनाए रखने के लिए जब प्रोटीन GUV बातचीत को देख लिया जाना चाहिए। एक और सीमा है उच्च ईओण ताकत का समाधान इलेक्ट्रो के साथ असंगत हैं किगठन के प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित है, और इसलिए GUVs हो गई है और 300 मिमी sucrose के समाधान के 26 में रखा जाता है। विशेष रूप से, हालांकि, कुछ अध्ययनों से सफलतापूर्वक शारीरिक ईओण ताकत पर बफ़र्स उनके संशोधित electroformation प्रोटोकॉल 28 में इस्तेमाल किया है।

एक महत्वपूर्ण पहलू झूठ की राशि है। एक खरगोश reticulocyte lysate आधारित प्रणाली अक्सर liposome तैरने की क्रिया assays में पूर्ण लंबाई एचआईवी -1 झूठ की तैयारी के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि, YFP टैग पूर्ण लंबाई झूठ की राशि इस प्रणाली में प्राप्त चुप के दृश्य GUVs करने के लिए बाध्य करने के लिए अपर्याप्त था। इस समस्या का समाधान करने के लिए, गेहूं के बीज lysate आधारित सेल मुक्त प्रतिलेखन अनुवाद प्रणाली है, जो पैदावार लगभग 8-10 झूठ की उच्च राशि गुना, वर्तमान परख में इस्तेमाल किया गया था। हालांकि, GUV बाध्यकारी प्रयोगों यूकेरियोटिक सेल lysate घटकों के अभाव में प्रदर्शन करने की आवश्यकता है, एक एक fluorophore के साथ लेबल शुद्ध प्रोटीन का उपयोग कर सकते हैं के रूप में हाल ही में किया गया है (नीचे वर्णित)।

यह दिखाया गया है कि विशिष्ट और कुशल झिल्ली चुप के बंधन एक सहकारी प्रक्रिया ऐसी myristate रूप में विभिन्न कारकों द्वारा विनियमित है, आरएनए, लिपिड headgroups और एसाइल चेन, और चुप-चुप बातचीत (संदर्भ 29 में समीक्षा)। इन विट्रो प्रणाली में यहाँ का वर्णन व्यक्तिगत रूप से या संयोजन में कारकों की भूमिका को संबोधित करने के लिए चुप झिल्ली बंधन के सहकारी प्रक्रिया में घटनाओं के क्रम में समझने के लिए बढ़ाया जा सकता है। इस प्रकार अब तक, वर्णित परख प्रणाली चुप के लिए बाध्यकारी नहीं है लेकिन एक विहित स्तनधारी सेल मूल के पीआई के उस में असंतृप्त पीआई (4,5) पी 2 एसाइल चेन की एक अप्रत्याशित भूमिका elucidated (4,5) पी 2 डोमेन -binding ( phospholipase सी डेल्टा 1) 24, एक खोज है कि liposome तैरने की क्रिया संसाधनों द्वारा खुलासा नहीं किया गया था pleckstrin अनुरूपता डोमेन। GUV आधारित परख सिस्टम भी चुप जीव विज्ञान के अन्य पहलुओं को समझने के लिए इस्तेमाल किया गया है। एक कृत्रिम inducible Multim युक्त एक ढकोसला व्युत्पन्न का उपयोगerization मूल भाव और साथ बेड़ा-तरह और डोमेन की तरह गैर-बेड़ा, केलर एट अल। के लिए 'बेड़ा' की तरह डोमेन और multimerization 30 चुप विभाजन के बीच संबंधों की जांच की GUVs। कार्लसन एट अल द्वारा एक अध्ययन में। झिल्ली ही सीमित चुप 31 से विभिन्न endosomal छँटाई परिसरों परिवहन के लिए आवश्यक (ESCRT) प्रोटीन की भर्ती के अनुक्रमिक समझने के क्रम GUV प्रणाली और शुद्ध और fluorescently लेबल चुप इस्तेमाल किया गया है। हाल ही में, एक अन्य अध्ययन GUV चुप एक fluorophore 32 के साथ संयुग्मित के प्रयोग पर चुप प्रेरित पुटिका नवोदित प्रक्रिया के पुनर्गठन की सूचना दी। एचआईवी -1 चुप multimerization submembrane चुप जाली के गठन कि विधानसभा के दौरान वक्र करने के लिए झिल्ली सोचा है की ओर जाता है। इसलिए, चुप-GUV परख सिस्टम में और सुधार के साथ, झिल्ली वक्रता परिवर्तन और झूठ झिल्ली के बीच के रिश्ते बंधन, जो यकीनन एचआईवी विधानसभा के कम से कम अच्छी तरह से समझ पहलू है, के रूप में के लिए किया जा रहा है विश्लेषण किया जा सकताअन्य सेलुलर वक्रता के प्रति संवेदनशील प्रोटीन r 33।

सारांश में, इस प्रोटोकॉल का उपयोग, एक myristoylated पूर्ण लंबाई झूठ की पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने और झूठ GUV झिल्ली के लिए बाध्य कल्पना कर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल आगे एचआईवी -1 विधानसभा और नवोदित प्रक्रियाओं के विभिन्न चरणों की जांच करने के लिए विकसित किया जा सकता है।

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Acknowledgements

हम उपयोगी विचार विमर्श के लिए मोहम्मद सलीम, जिंग वू और कृष्णन रघुनाथन को धन्यवाद देना चाहूंगा। हम यह भी शूटिंग के दौरान सहायता के लिए प्रिया Begani धन्यवाद। इस काम के अनुदान के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के द्वारा समर्थित है R01 AI071727 (एओ) और R01 GM110052 (एसएलवी) है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digital Multimeter Meterman 30XR A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose.
Function Generator Instek GFG-8216A A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10 Hz and 1 V is sufficient.
ITO coated glass slides Delta Technologies, Loveland, CO CG-90IN
Incubator Hoefer Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient
Vacuum chamber Nalgene
Thermomixer R Eppendorf 21516-166
Syringe Hamilton 80400 Gauge 22S, Syringe number 702
PDMS Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning Sylgard, 184
RTS 100 Wheat Germ CECF Kit BiotechRabbit,
Berlin, Germany
BR1401001
DiD Life Technologies, Carlsbad, CA  D7757
POPC Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL  850457C
POPS Avanti Polar Lipids 840034C
Cholesterol Avanti Polar Lipids 700041P
Brain-PI(4,5)P2  Avanti Polar Lipids 840046X

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References

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