Visualisatie van HIV-1 Gag Binding aan Giant Unilamellaire bolletjes (GUV) Membranen

1Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School, 2Department of Biophysics, University of Michigan
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A. Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (113), e54293, doi:10.3791/54293 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De structurele eiwitten van HIV-1, Pr55 Gag (of Gag), bindt aan het plasmamembraan van cellen tijdens de virus assemblageproces. Membraanbinding van Gag is een essentiële stap voor de vorming virusdeeltje, omdat een defect in Gag membraan binding resulteert in een ernstige vermindering van virale deeltjes productie. Mechanistisch data van Gag-lipide membraaninteracties krijgen, in vitro methoden op basis van NMR, eiwit voetafdruk, oppervlakte plasmon resonantie, liposoom flotatie centrifugatie of fluorescentie lipide bead binding tot dusver ontwikkeld. Echter, elk van deze in vitro werkwijzen zijn beperkingen. Sommige van deze beperkingen te overwinnen en zorgen als aanvulling op de eerder vastgestelde methoden, ontwikkelden we een in vitro assay waarbij interacties tussen HIV-1 Gag en lipidemembranen plaatsvinden in een "cel-achtige" omgeving. In deze test, Gag binding aan lipide membranen visueel geanalyseerd met YFP-Tagged Gag gesynthetiseerd in een tarwekiemen-gebaseerde in vitro translatie-systeem en GUVs voorbereid door een electroformation techniek. Hier beschrijven we de achtergrond en de protocollen gemyristoyleerde full-length Gag eiwitten en GUV membranen die nodig zijn voor de test te verkrijgen en om binding door microscopie detecteren Gag-GUV.

Introduction

Humaan immunodeficiëntievirus type 1 (HIV-1) is een omhuld virus dat assembleert op en knoppen van de plasmamembraan (PM) in de meeste celtypen. Het samenstel van HIV-1 virusdeeltjes wordt aangedreven door de 55 kDa viruskern eiwit Pr55 Gag (Gag). Gag wordt gesynthetiseerd als een precursor polyeiwit uit vier belangrijke structurele domeinen, namelijk matrix, capside, nucleocapside, en p6, evenals twee afstandhouder peptiden SP1 en SP2. Bij de montage, de matrix (MA) domein is verantwoordelijk voor het richten van Gag aan de plaats, het capside (CA) domein bemiddelt Gag-Gag interacties, het nucleocapside (NC) domein werft viraal genoom RNA en p6 rekruten gastheer factoren die steun virusdeeltje splitsing van het plasmamembraan. Gag ondergaat een co-translationele modificatie door de toevoeging van een 14-koolstof vetzuur of myristaat deel aan zijn N-terminus.

Membraanbinding van Gag is een essentiële voorwaarde voor de virale assemblage, aangezien mutants dat defect is in membraan binding zijn niet aan virusdeeltjes te produceren. Wij en anderen hebben aangetoond dat membraanbinding van Gag wordt gemedieerd door tweedelige signalen in de MA domein: het N-terminale myristaat groep die hydrofobe wisselwerkingen medieert de lipide bilaag en een cluster van basische resten in de MA domein aangeduid als zeer basisgebied ( HBR) die interageert met zure lipiden op de PM 1-4. Studies van Gag-membraaninteracties behulp ectopische expressie van polyphosphoinositide 5-fosfatase IV (5ptaseIV), een enzym dat de hydrolyse van PM-specifieke zure fosfolipiden phosphatidylinositol- katalyseert (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P2] aan fosfatidylinositol-4-fosfaat, in cellen suggereerde dat Gag-PM lokalisatie wordt gemedieerd door PI (4,5) P2 3,5. In vitro studies uitvoeren om meer inzicht mechanistische informatie van Gag-PI (4,5) P2 interacties bewezen uitdagend om een aantal redenen. VoorZo is zuivering van volledige lengte gemyristoyleerde HIV-1 Gag biochemische experimenten technisch moeilijk ten minste gedeeltelijk als gevolg van de neiging van Gag te aggregeren tijdens de zuivering. Derhalve afgeknotte vormen van HIV-1 Gag, zoals Myr-MA of Myr-MA-CA, of niet-gemyristoyleerde vorm zijn veelvuldig bij studies die Gag zuivering vereisen (bijvoorbeeld kernmagnetische resonantie, eiwitten footprinting en oppervlak plasmon resonance 6-9). Als alternatief gekoppelde in vitro transcriptie-translatie reacties zijn gebruikt om full-length gemyristoyleerde HIV-1 Gag in andere biochemische studies 1,2 produceren. Typisch in dit systeem wordt een Gag-coderende plasmide getranscribeerd en getranslateerd met eukaryote cellysaten (bijvoorbeeld konijn reticulocyten-lysaten) die zonder enige celmembranen en messenger RNAs zijn maar bevatten de machines voor transcriptie en translatie. Na de reactie worden cellysaten bevattende Gag gemengd met membranes voor de analyse van de Prop van de interacties met lipiden. Naast het gemak van het bereiden van volledige lengte gemyristoyleerde Gag, methoden waarbij de in vitro transcriptie translatiesysteem een voordeel dat Gag synthese en daaropvolgende membraan bindingsreacties plaatsvinden in een 'eukaryote cytosol-achtige "milieu die beter kunnen vormen fysiologische omstandigheden. Deze eigenschap heeft bijgedragen aan de studies waaruit bleek dat RNA-moleculen gebonden aan de MA-domein te reguleren Gag binding aan zure lipiden in een competitieve manier 1,2,10-12. Aangezien de totale hoeveelheid eiwitten verkregen Gag deze cellysaten zijn niet hoog, metabolisch merken van eiwitten met radioactief gemerkte aminozuren nodig voor de signalering.

Afhankelijk van de methode Gag-lipide interacties te meten, hebben diverse membraan preparaten gebruikt. Elk van deze methoden heeft zijn sterke en zwakke punten. De meeste NMR-gebaseerde testen vereisen het gebruik van lipiden met korte acylgroepketens die in water oplosbare (bijvoorbeeld C4 en C8-PI (4,5) P2) 6,8 zijn. Terwijl NMR methoden voor binding van Gag testen om de lipiden die lange acylketens in cellen ontwikkeld hebben, zijn zij gebruikt alleen of gemyristoyleerde nonmyristoylated MA dusver 8,13. Als alternatief hebben liposomen bereid van lipiden die inheemse lengte acylketens zijn gebruikt in biochemische methoden, zoals liposoom beursgang of fluorescerende liposoom bead bindingstesten 2,3,10,14-16. Echter, liposomen gebruikt in deze testen hebben kleine diameters, en zo hun membranen steile positieve krommingen. Daarentegen, tijdens de vroege fase van deeltjes samenstel in HIV-1-geïnfecteerde cellen, Gag bindt aan de PM, die nagenoeg planair is op de schaal van Gag en vervolgens induceert negatieve kromming tijdens dop. Daarom zou liposoom membranen met steile en positieve kromming niet ideaal lipidendubbellagen aan Gag-lipide interacties te bestuderen. Zoals voor liposoom flotatie testen andere potentiële nadeel is dat blootstelling van Gag-lipidecomplexen hypertone sucrosegradiënt centrifugatie kan tijdens de experimentele resultaat beïnvloeden. Om deze beperkingen te verlichten en een aanvullend experimenteel systeem, zijn assays voor Gag binding aan grote unilamellaire vesicles (GUVs) zijn ontwikkeld in de afgelopen jaren. GUVs zijn enkele lipide dubbellaag vesicles waarvan de diameters vergroten tot enkele tientallen micrometers. Dus de kromming van deze membranen lijkt de PM op de schaal van Gag. Bovendien, vanwege de grote omvang, die visuele inspectie mogelijk maakt onder Optische microscopen, membraan binding van fluorescent gelabeld of gemerkt Gag proteïnen deze blaasjes na mengen kan gemakkelijk worden bepaald zonder verdere behandeling van Gag-lipidecomplexen.

We beschrijven hier een protocol bij HIV-1 Gag membraan binding met behulp van GUVs verkregen uit een electroformation methode te bestuderen. Verschillende methoden zoals zachte hydratatie-gel bijgestaan ​​hydratatie, microfluidic jetting en electroformation 17-22 zijn gebruikt om GUVs verkrijgen. Voor de hier beschreven protocol, wordt de electroformation methode vooral vanwege zijn efficiëntie bij het vormen GUVs met zure lipiden en het relatieve gemak van gebruik zonder de noodzaak van dure opstellingen. Aangezien visualisatie van Gag vereist een fluorescerende reporter wordt geel fluorescerend eiwit (YFP) genetisch toegevoegd aan de C-terminus van Gag (Gag-YFP). Gag-YFP eiwitten verkregen door in vitro transcriptie en translatie reacties tarwekiemen lysaten basis van de voortdurende uitwisseling continue stroom (CECF) technologie. In deze techniek, zowel verwijderen van remmende bijproducten van de reacties en de levering van de reactie substraten en energiecomponenten worden bereikt in een dialyse-gebaseerde mechanisme. Voor deze reacties, wordt een plasmide coderend Gag-YFP onder de controle van een T7 promoter gebruikt. Van de nota, zoals eerder aangegeven, tarwekiemen lysaten ondersteunen myristoylatie zonder extra componenten 23,24. Deze methode is het mogelijk om voldoende hoeveelheden full-length gemyristoyleerde Gag-YFP voor visualisatie van Gag op GUV membranen 24 te verkrijgen. Hier beschrijven we het protocol waarmee HIV-1 Gag binding aan PI (4,5) P2 bevattende GUV membranen kan worden onderzocht zonder langdurige verdere verwerking volgende bindende reacties en voor te stellen dat deze methode een aanvulling op reeds bestaande Gag-membraan binding assays en kan uitgebreid tot verder te begrijpen HIV-1-Gag-membraan bindend.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dag 1: Expressie van Gag eiwitten met behulp van de Wheat Germ Lysate-gebaseerde in vitro transcriptie-translatie System

1. Bereiding van HIV-1 Gag

  1. Verwijder alle reagentia van de commerciële tarwekiemen CECF kit van vriezers (tarwekiemen lysaten worden opgeslagen bij -80 ° C, en andere reagentia bij -20 ºC). Hen ontdooien op ijs en meng de bestanddelen zoals weergegeven in tabel 1.
Mix-1 (Feeding mix)
voedingsoplossing 900 ul
Aminozuren 80 ul
methionine 20 gl
Totaal 1000 gl
Mix-2 (Lysate mix)
tarwekiemen lysaten 15 ul
RNase vrij water 7 pl
Aminozuren 4 gl
methionine 1 pi
Plasmide DNA in TE-buffer (1 ug / ul) ** 4 gl
reactiebuffer 15 ul
RNasin * 4 gl
Totaal 50 gl

Tabel 1: Samenstellingen van mengsels vereist tarwekiemen reacties.
Opmerking: Als het experiment is ontworpen om het effect van RNA verwijderd door RNase op Gag membraanbindende onderzoeken vervangen ribonuclease inhibitoren met RNase-vrij water. Plasmide DNA moet vrij zijn van verontreinigingen volgens de instructies van de fabrikant. Echter, plasmids bereid met gebruikelijke, maar niet endotoxine-vrij plasmide isolatie kits succes gebruikt. instructies van de fabrikant adviseert ook met behulp van DNA opgelost in nuclease-vrij water. Bij gebruik van DNA gesuspendeerd in TE [10 mM Tris-HCl (pH 7,4) bevattende 1 mM EDTA] Vermijdt lagere concentraties van DNA, omdat EDTA in TE de opbrengst kunnen beïnvloeden. Plasmiden opgelost in TE buffer bij een concentratiebereik van 0,8-1 ug / ul succes gebruikt.

  1. Voeg eerst de Feeding mengsel (Mix-1) in de reactie cassette (transparante kamer). Voeg dan het lysaat mix (Mix-2) naar de andere kamer (rood). Gebruik geen luchtbellen niet invoeren tijdens het toevoegen van het mengsel in hun respectievelijke kamers, aangezien dit kan leiden tot inefficiënte uitwisseling oplossingsonderdelen en derhalve de efficiëntie van de reactie te verminderen.
  2. Bedek de kamers met de klevende film die bij de kit.
  3. Plaats de reactie cassette in de cassettehouder en incubate het samenstel voor 24 uur bij 24 ° C met een constante schudsnelheid van 900 rpm in een Eppendorf thermomixer R.

Dag 2: Bereid GUVs door Electroformation en Harvest Wheat Germ Lysaten

2. Voorbereiding van GUVs

  1. Aliquot lipiden opgelost in anorganische oplosmiddelen zoals chloroform of mengsels van chloroform en methanol in glazen flesjes met schroefdoppen bekleed met Teflon liners en omwikkeld met Parafilm. Behandel lipiden met Hamilton-type glas spuiten, of indien beschikbaar, chloroform-bestendige kunststof tips. Neem glazen flesjes met daarin de lipiden te worden gebruikt voor GUV voorbereiding van de -20 ° C vriezer.
    1. Zodra de flesjes worden op kamertemperatuur, ervoor te zorgen dat door middel van visuele inspectie die de lipide schorsingen zijn duidelijk. De kwaliteit van lipiden, met name zure lipiden, zoals palmitoyl-oleoyl fosfatidylserine (POP's) en PI (4,5) P2, is belangrijk voor een succesvolle experimenten. Niet lipiden die zijn gebruiktin porties langer dan 2 maanden.
  2. Pre-warm een ​​verwarmingsblok op de gewenste temperatuur. Deze temperatuur moet ten minste 5 ° C boven de smelttemperatuur (Tm) van het lipide (en) met de hoogste Tm zijn.
  3. Bereken de lipide benodigde volumes volgens de gewenste molaire verhoudingen lipide. Voor het bestuderen van HIV-1-Gag bindend hier Gebruik de volgende molverhoudingen zoals weergegeven in tabel 2.
Lipid mix molaire verhouding Volume (in pl) voorraadconcentratie
POPC + POPS + Chol 46,6 + 23,3 + 30 19.74 + 10.18 + 6.57 POPC, POPS, Chol: 10 mg / ml
POPC + POPS + Chol + Brain-PI (4,5) P2 16,11 + 8,3 + 6,25 + 58,19 POPC, POPS, Chol: 10 mg / ml
Brain-PI (4,5) P2: 1 mg / ml

Tabel 2: Volumes van verschillende lipiden gebruikt GUVs verkrijgen.

  1. Voeg de gewenste volumes van lipiden in een schone-schroef bedekte glazen flacon.
  2. Gebruik ITO-gecoate glaasjes met afmetingen 25 x 50 x 1,1 mm 3 en weerstand 70-100 Ω (zoals beschreven in de catalogus). Plaats twee ITO-gecoate glaasjes op een schone bank. Elke kamer electroformation vereist twee indium-tin-oxide (ITO) gecoate glaasjes. Controleer of de geleidende zijde van het glaasje naar boven door eerst de weerstand met een multimeter. Het moet een waarde van circa 200 Ω tonen. Zorg ervoor dat het oppervlak van de dia's zijn schoon door het voorzichtig af te vegen met 70% ethanol met behulp van niet-pluizende doekjes.
  3. Reinig het buitenoppervlak van een naald van een spuit door rinsing het met chloroform en leg de spuit op de hitte blok.
  4. Plaats een nieuwe ITO-gecoate glasplaatje op het verwarmingsblok met geleidende zijde naar boven en laat de temperatuur ervan op de gewenste temperatuur gewoonlijk ongeveer 2-3 min. Niet opnieuw de ITO-gecoat glas dia's voor een potentieel risico dat de ITO-coating op het glas dia's kunnen worden beschadigd tijdens het schoonmaken procedures.
  5. Gebruik een volume van 40-50 gl van het lipide mengsel per dia uniforme en toch snelle verspreiding van de lipiden op de glasplaatje. Stel het totale volume met een geschikt organisch oplosmiddel zoals chloroform.
    1. Plaats de helft van het totale volume van het lipide mengsel op het glaasje en onmiddellijk verspreid het lipide met de gereinigde injectiespuit (stap 2,6) een gelijkmatige lipidefilm reactie (verplaatsen van de naald 2-3 keer in de dia). Spreid de lipide film voorzichtig (maar snel) om schade aan de dunne ITO coating te voorkomen. Non-uniform verspreiden of ruw verspreiden kan leiden tot suboptimaleopbrengsten of computationele heterogeniteit van GUVs.
    2. Daarom zorgen voor een gelijkmatige spreiding van het inspecteren van de lipide film na te verspreiden voordat wordt overgegaan tot de volgende stap. Indien de opaciteit van de film verschijnt overmatig niet-uniform, opnieuw de procedure met een nieuwe dia.
  6. Plaats de gecoate glijbaan in een petrischaal met de gecoate zijde naar boven.
  7. Herhaal stap 2,6-2,9 voor de rest van het mengsel een andere ITO-gecoate slide.
  8. Plaats de petrischaal die zowel de objectglaasjes in een conventionele vacuüm uitdroging kamer gedurende 60-90 min om alle sporen van organische oplosmiddelen te verwijderen.
  9. Tijdens dit proces zet de incubator tot dezelfde temperatuur als die van het verwarmingsblok (65 ° C in de meeste gevallen) en voorverwarmen 300 mM sucrose oplossing in de incubator.
  10. Na het drogen, breng de petrischaal naar de bank en zet het glaasje op een schone ondergrond.
  11. Reinig een PDMS pakking (figuur 1) met behulp van 70% ethanol en droog het completely.
  12. Plaats het op de lipide gecoat glasplaatje zie figuur 1 en zacht en stevig op, zodat de pakking vormt een waterdichte afdichting. Bevestigen de afwezigheid van spleten tussen de PDMS pakking en de glijbaan. Dit resulteert in de vorming van een ondiepe kamer die de sucrose oplossing bevat.

Figuur 1
Figuur 1:. De lay-out van de ITO-gecoate glasplaatje gebruikt voor electroformation Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Vul de kamer met voorverwarmde sucrose-oplossing zonder bubbels.
  2. Plaats de andere gecoate slide op de top om een ​​goede afdichting te maken. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen. De eindassemblage moet verschijnen zoals weergegeven in figuur 2. Bevestig de kamer using bindmiddel clips.

Figuur 2
Figuur 2:. Schematische weergave van de electroformation kamer (zijaanzicht) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Verwijder het teveel aan sucrose door aspiratie en het reinigen van de dia's met behulp van niet-pluizende doekjes. Bevestig de dia's om de koperen staaf, zodat de geleidende zijkanten zijn in uniform contact met de bar. Gewaarborgd dat slechts één geleidende zijde van het glaasje in contact met een koperen staaf.
  2. Sluit de koperen bar om de functie generator uitgang met behulp van de alligator clips. Plaats het geheel in de incubator zodat het samenstel de temperatuur ervan op de gewenste temperatuur.
  3. Breng een sinusgolf frequentie van 10 Hz en een potentiaalverschil van 1 V gedurende 90 min. Ensure of de spanning V 1 een multimeter zie figuur 3. Voortzetten van 90 min.

figuur 3
Figuur 3:. De posities waar de elektroden van de multimeter voor het meten van frequentie en stroom zijn geplaatst Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Na 90 min langzaam verminderen de frequentie 2 Hz en verder electroformation nog eens 10 min. Gedurende deze tijd, oogst in vitro translatiereacties (stappen 3.1-3.2).
  2. Schakel de functiegenerator en laat het geheel afkoelen tot kamertemperatuur langzaam (door het uitschakelen van de incubator en laat de incubator deur iets open).
  3. Na afkoeling, ontkoppel de kabels aan de generatorde schuifsamenstellen. GUVs kan heel kwetsbaar zijn en daarom moeten zeer voorzichtig worden omgegaan. breng het geheel voorzichtig naar de bank.
  4. Demonteer de kamer door voorzichtig verwijderen van de bovenste dia behulp van een tang. Oogst de sucrose suspensie die GUVs met behulp van een cut 1000 ul tip en transfer naar een schone buis. Behandel de buis voorzichtig om verstoring van GUVs voorkomen.
  5. Gebruik de GUVs onmiddellijk. GUVs stabiel gedurende ten minste 90 min na de oogst indien bewaard bij kamertemperatuur.

3. Oogst In Vitro Vertaling Reacties

  1. Oogst de in vitro translatie reacties die gewenste eiwitten van de rode kamer met behulp van een micropipet in een buis.
  2. Geaggregeerde eiwitten te verwijderen, draai de lysaten bij 16.200 xg gedurende 15 minuten op een tafelblad centrifuge en voorzichtig de bovenstaande vloeistof over te dragen naar een andere buis.

4. GUV Binding Assay

  1. Met behulp van een cut tip, meng 51, l in vitro translatie reacties die vertaald eiwitten en 5 gl GUVs in een buis en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2-3 min.
  2. Bevestig een PDMS plaat met een klein gaatje (3-4 mm diameter) op een schoon dekglas en zorgen voor afdichting door voorzichtig en stevig aan te drukken tegen de dekglaasje.
  3. Plaats de 10 pi mengsel uit stap 4.1 in het gaatje.
  4. Beeld van het mengsel onder een geïnverteerde epi of confocale fluorescentiemicroscoop bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Om verdamping te voorkomen, kan de beeldvorming kamer worden gedekt door een dekglaasje.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Onder toepassing van bovenstaande protocol bereidden wij GUVs samengesteld uit POPC + + pops Chol (molverhouding: 4,66: 2,33: 3). Deze samenstelling werd gekozen benadering de PS en cholesterol concentraties van de PM. Robuuste en efficiënte binding van Gag werd alleen waargenomen wanneer brain-PI (4,5) P2 werd opgenomen in de POPC + POPS + Chol mengsel (POPC + POPS + Chol + brain-PI (4,5) P2 [molverhouding : 4: 2: 3: 1] in dit voorbeeld) (Figuur 4, vergelijk kaders B en D met A en C). Gag-YFP binding aan GUVs samengesteld uit POPC POPS + + + Chol brain-PI (4,5) P2 duidelijk door de toename in fluorescentie-intensiteit op het membraanoppervlak. Deze toename kan ook worden gezien in fluorescentie intensiteitprofielen (Figuur 4, bodem) langs de lijn die de GUV begrenzing (XX in figuur 4C en D).

load / 54293 / 54293fig4.jpg "/>
Figuur 4: Gag bindt aan brain-PI (4,5) P2 -contianing GUVs Een confocale doorsnede van POPC + + pops Chol (A en C) en POPC pops + + + Chol PI (4,5) P2. GUVs (B en D). Verdeling van Gag-YFP wordt getoond in groen. Vergrotingen van de geselecteerde GUVs (gele kaders) getoond in panels C en D fluorescentie intensiteitprofielen langs willekeurig gekozen lijn getrokken naar de tegenoverliggende zijden van GUVs (X X ') steken worden weergegeven onder de afbeeldingen. Bar = 5 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De GUV bindingstest zoals hierboven beschreven is, een goed alternatief scenario waar andere eiwit-lipide interacties assays hebben hun beperkingen. Deze test laat ons toe om interacties tussen gemyristoyleerde full-length Gag en zure lipiden met native-length acylketens in de lipide bilaag context te onderzoeken en doen dat zonder langdurige beursgang centrifugeren door middel van high-density sucrose gradiënten of andere post-bindende verwerking van Gag-lipide complexen. Een ander voordeel is dat het gedrag van Gag in een complex mengsel kan worden onderzocht (bijvoorbeeld bij aanwezigheid van cytosolische componenten), die niet gemakkelijk in andere real-time technieken bereikt zoals oppervlakte plasmon resonantie gebaseerde testen. Derhalve kan worden gesteld dat de hier beschreven test maakt real-time evaluatie van Gag-zuur lipide interacties in een natieve context dan andere testen die in het vakgebied.

Er zijn echter beperkingen in verband met de werkwijzegoed. Opdat GUVs in een gegeven preparaat vergelijkbare samenstelling met elkaar en met het oorspronkelijke mengsel moet electroformation worden uitgevoerd ruim boven de overgangstemperatuur van de lipiden die de hoogste overgangstemperatuur die in het mengsel 25,26 hebben. Het is echter mogelijk dat blootstelling van lipiden aan hogere temperaturen gedurende langere tijd kan leiden tot lipide afbraak 25,27. Daarom, om de kwaliteit van GUVs, naast visuele inspectie mogelijk gemaakt door opname van fluorescente kleurstoffen lipide (bijvoorbeeld deed), is het wenselijk om de functionaliteit van het lipide van belang [bijvoorbeeld PI (4,5) P2 testcontrole ] in een lipide-specifieke probe. Bovendien GUV samenstellingen die tot fasescheiding bij een bepaalde temperatuur te geven, voorzichtigheid geboden tot een gewenste temperatuur nauwkeurig te handhaven wanneer het waarnemen van de eiwit-interactie GUV. Een andere beperking is dat de oplossingen van hogere ionensterkte onverenigbaar zijn met de electrovorming protocol hier beschreven, en daarom GUVs worden gekweekt en onderhouden in 300 mM sucrose oplossing 26. Met name echter sommige studies hebben met succes gebruik buffers bij fysiologische ionensterkte in hun gewijzigde electroformation protocollen 28.

Een kritisch aspect is de hoeveelheid Gag. Een konijn reticulocyten lysaat-systeem wordt vaak gebruikt voor de bereiding van volledige lengte HIV-1 Gag in liposoom flotatie assays. De hoeveelheid YFP-gelabeld volle-lengte Gag verkregen in dit systeem onvoldoende voor visualisatie van Gag binding aan GUVs. Om dit probleem aan te pakken, de tarwekiem-lysaat gebaseerde celvrije transcriptie-translatiesysteem, dat levert ongeveer 8-10 grotere hoeveelheid opgeklapt Gag, werd gebruikt in de huidige assay. Indien GUV bindingsexperimenten moeten worden uitgevoerd in afwezigheid van eukaryote cellysaat componenten, kan gezuiverde eiwitten gemerkt met een fluorofoor gebruiken bijvoorbeeld recentelijk gedaan (hieronder).

Het is aangetoond dat specifieke en efficiënte binding van Gag aan membranen is een coöperatieve proces geregeld door verschillende factoren zoals myristaat, RNA, lipiden en kopgroepen acylketens en Gag Gag-interacties (besproken in referentie 29). De in vitro systeem te beschrijven hier kan worden uitgebreid tot de rol van factoren die afzonderlijk of in combinatie te pakken om de volgorde van de gebeurtenissen te begrijpen in het samenwerkingsproces van Gag membraan bindend. Tot dusver beschreven testsysteem een onverwachte rol onverzadigde PI (4,5) P2 acylketens toegelicht in binding van Gag, maar niet die van een canonieke zoogdiercellen oorsprong PI (4,5) P2 bindende domein ( de pleckstrin homologie domein van fosfolipase C delta 1) 24, een bevinding die niet was onthuld door liposoom beursgang assays. GUV-gebaseerde test systemen zijn ook gebruikt voor andere aspecten van Gag biologie begrijpen. Met behulp van een Gag-derivaat met een kunstmatige induceerbare multimerization motief en GUVs met raft-achtige en niet-raft achtige domeinen, Keller et al. onderzochten de relatie tussen Gag verdeling naar 'raft-achtige' domeinen en multimerizatie 30. Een onderzoek van Carlson et al. Heeft de GUV-systeem en gezuiverd en fluorescent gelabelde Gag gebruikt om de volgorde van de aanwerving van verschillende endosomale sortering complexen die nodig is voor het vervoer (ESCRT) eiwitten te begrijpen door membraangebonden Gag 31. Onlangs, een andere studie meldde reconstructie van de Gag-geïnduceerde blaasjes ontluikende proces op de GUV behulp Gag geconjugeerd met een fluorofoor 32. HIV-1 Gag multimerisatie leidt tot de vorming van submembrane Gag rooster waarvan wordt gedacht dat de curve membranen tijdens de montage. Daarom, met verdere verbetering van Gag-GUV testsystemen, de relatie tussen membraan kromming veranderingen en Gag membraan binding, die waarschijnlijk de minst begrepen aspect van HIV samenstel kan worden geanalyseerd zoals wordt gedaan for andere cellulaire kromming-gevoelig eiwitten 33.

Kortom, het gebruik van dit protocol, kan men voldoende hoeveelheden gemyristoyleerd full-length Gag verkrijgen en visualiseren Gag binding aan GUV membranen. Dit protocol kan verder worden ontwikkeld om verschillende stadia van HIV-1 montage en ontluikende processen te onderzoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

We willen graag Mohammad Saleem, Jing Wu en Krishnan Raghunathan bedanken voor nuttige discussies. We danken ook Priya Begani voor assistentie tijdens het filmen. Dit werk wordt ondersteund door de National Institutes of Health subsidies R01 AI071727 (AO) en R01 GM110052 (tot SLV).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digital Multimeter Meterman 30XR A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose.
Function Generator Instek GFG-8216A A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10 Hz and 1 V is sufficient.
ITO coated glass slides Delta Technologies, Loveland, CO CG-90IN
Incubator Hoefer Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient
Vacuum chamber Nalgene
Thermomixer R Eppendorf 21516-166
Syringe Hamilton 80400 Gauge 22S, Syringe number 702
PDMS Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning Sylgard, 184
RTS 100 Wheat Germ CECF Kit BiotechRabbit,
Berlin, Germany
BR1401001
DiD Life Technologies, Carlsbad, CA  D7757
POPC Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL  850457C
POPS Avanti Polar Lipids 840034C
Cholesterol Avanti Polar Lipids 700041P
Brain-PI(4,5)P2  Avanti Polar Lipids 840046X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells. J Virol. 87, (12), 7155-7159 (2013).
  2. Chukkapalli, V., Oh, S. J., Ono, A. Opposing mechanisms involving RNA and lipids regulate HIV-1 Gag membrane binding through the highly basic region of the matrix domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (4), 1600-1605 (2010).
  3. Chukkapalli, V., Hogue, I. B., Boyko, V., Hu, W. S., Ono, A. Interaction between the human immunodeficiency virus type 1 Gag matrix domain and phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate is essential for efficient gag membrane binding. J Virol. 82, (5), 2405-2417 (2008).
  4. Zhou, W., Parent, L. J., Wills, J. W., Resh, M. D. Identification of a membrane-binding domain within the amino-terminal region of human immunodeficiency virus type 1 Gag protein which interacts with acidic phospholipids. J Virol. 68, (4), 2556-2569 (1994).
  5. Ono, A., Ablan, S. D., Lockett, S. J., Nagashima, K., Freed, E. O. Phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate regulates HIV-1 Gag targeting to the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (41), 14889-14894 (2004).
  6. Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (30), 11364-11369 (2006).
  7. Shkriabai, N., et al. Interactions of HIV-1 Gag with assembly cofactors. Biochemistry. 45, (13), 4077-4083 (2006).
  8. Vlach, J., Saad, J. S. Trio engagement via plasma membrane phospholipids and the myristoyl moiety governs HIV-1 matrix binding to bilayers. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (9), 3525-3530 (2013).
  9. Anraku, K., et al. Highly sensitive analysis of the interaction between HIV-1 Gag and phosphoinositide derivatives based on surface plasmon resonance. Biochemistry. 49, (25), 5109-5116 (2010).
  10. Llewellyn, G. N., Grover, J. R., Olety, B., Ono, A. HIV-1 Gag associates with specific uropod-directed microdomains in a manner dependent on its MA highly basic region. J Virol. 87, (11), 6441-6454 (2013).
  11. Inlora, J., Chukkapalli, V., Derse, D., Ono, A. Gag localization and virus-like particle release mediated by the matrix domain of human T-lymphotropic virus type 1 Gag are less dependent on phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate than those mediated by the matrix domain of HIV-1 Gag. J Virol. 85, (8), 3802-3810 (2011).
  12. Inlora, J., Collins, D. R., Trubin, M. E., Chung, J. Y., Ono, A. Membrane binding and subcellular localization of retroviral Gag proteins are differentially regulated by MA interactions with phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate and RNA. MBio. 5, (6), e02202 (2014).
  13. Valentine, K. G., et al. Reverse micelle encapsulation of membrane-anchored proteins for solution NMR studies. Structure. 18, (1), 9-16 (2010).
  14. Dick, R. A., Goh, S. L., Feigenson, G. W., Vogt, V. M. HIV-1 Gag protein can sense the cholesterol and acyl chain environment in model membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (46), 18761-18766 (2012).
  15. Dick, R. A., Kamynina, E., Vogt, V. M. Effect of multimerization on membrane association of Rous sarcoma virus and HIV-1 MA proteins. J Virol. 87, (24), 13598-13608 (2013).
  16. Alfadhli, A., Still, A., Barklis, E. Analysis of human immunodeficiency virus type 1 matrix binding to membranes and nucleic acids. J Virol. 83, (23), 12196-12203 (2009).
  17. Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 42, (2), 125-130 (2005).
  18. Needham, D., McIntosh, T. J., Evans, E. Thermomechanical and transition properties of dimyristoylphosphatidylcholine/cholesterol bilayers. Biochemistry. 27, (13), 4668-4673 (1988).
  19. Darszon, A., et al. Reassembly of protein-lipid complexes into large bilayer vesicles: perspectives for membrane reconstitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, (1), 239-243 (1980).
  20. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discuss. Chem. Soc. (81), 303-311 (1986).
  21. Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P. h, Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Progr Colloid Polymer Sci. 89, 127-131 (1992).
  22. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (12), 4697-4702 (2008).
  23. Yamauchi, S., et al. The consensus motif for N-myristoylation of plant proteins in a wheat germ cell-free translation system. FEBS J. 277, (17), 3596-3607 (2010).
  24. Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A. Phosphatidylinositol-(4,5)-Bisphosphate Acyl Chains Differentiate Membrane Binding of HIV-1 Gag from That of the Phospholipase Cdelta1 Pleckstrin Homology Domain. J Virol. 89, (15), 7861-7873 (2015).
  25. Morales-Penningston, N. F., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim Biophys Acta. 1798, (7), 1324-1332 (2010).
  26. Veatch, S. L. Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases. Methods Mol Biol. 398, 59-72 (2007).
  27. Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. Lipid peroxides promote large rafts: effects of excitation of probes in fluorescence microscopy and electrochemical reactions during vesicle formation. Biophys J. 91, (6), 2172-2183 (2006).
  28. Montes, L. R., et al. Electroformation of giant unilamellar vesicles from native membranes and organic lipid mixtures for the study of lipid domains under physiological ionic-strength conditions. Methods Mol Biol. 606, 105-114 (2010).
  29. Olety, B., Ono, A. Roles played by acidic lipids in HIV-1 Gag membrane binding. Virus Res. 193, 108-115 (2014).
  30. Keller, H., Krausslich, H. G., Schwille, P. Multimerizable HIV Gag derivative binds to the liquid-disordered phase in model membranes. Cell Microbiol. 15, (2), 237-247 (2013).
  31. Carlson, L. A., Hurley, J. H. In vitro reconstitution of the ordered assembly of the endosomal sorting complex required for transport at membrane-bound HIV-1 Gag clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (42), 16928-16933 (2012).
  32. Gui, D., et al. A novel minimal in vitro system for analyzing HIV-1 Gag-mediated budding. J Biol Phys. 41, (2), 135-149 (2015).
  33. Prevost, C., et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nat Commun. 6, 8529 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics