Visualisering af HIV-1 Gag binding til Giant unilamellare vesikel (GUV) Membraner

1Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School, 2Department of Biophysics, University of Michigan
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A. Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (113), e54293, doi:10.3791/54293 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den strukturelle protein af HIV-1, Pr55 Gag (eller Gag), binder til plasmamembranen i celler under virus samleprocessen. Membran binding af Gag er et vigtigt skridt for dannelse virus partikel, da en defekt i Gag membran bindende resultater i alvorlig svækkelse af viral produktion partikel. For at få mekanistiske detaljer om Gag-lipidmembran interaktioner, in vitro-metoder baseret på NMR, protein footprinting, overfladeplasmonresonans, liposom flotation centrifugering eller fluorescens lipid kuglebinding blevet udviklet hidtil. Men hver af disse in vitro-metoder har sine begrænsninger. For at overvinde nogle af disse begrænsninger og tilvejebringe en komplementær tilgang til de tidligere etablerede metoder, udviklede vi et in vitro assay, hvor interaktioner mellem HIV-1 Gag og lipidmembraner finder sted i en "celle-lignende" miljø. I dette assay Gag binding til lipidmembraner visuelt analyseret under anvendelse YFP-tagged Gag syntetiseret i en hvedekim-baserede in vitro translation system, og GUVs udarbejdet af en electroformation teknik. Her beskriver vi baggrunden og de protokoller, for at opnå Myristoylated fuld længde Gag proteiner og GUV membraner, der er nødvendige for analysen og opdage Gag-GUV binding ved mikroskopi.

Introduction

Humant immundefektvirus type 1 (HIV-1) er et kappebærende virus, der samler på og knopper fra plasmamembranen (PM) i de fleste celletyper. Samlingen af HIV-1 viruspartikler er drevet af 55 kDa viralt kerneprotein kaldet Pr55 Gag (Gag). Gag syntetiseres som en precursor polyprotein består af fire store strukturelle domæner, nemlig matrix, capsid, nucleocapsid og p6, samt to spacer peptider SP1 og SP2. Under montering, matricen (MA) domæne er ansvarlig for målretning af Gag til forsamlingen site, capsid (CA) domæne medierer Gag-Gag interaktioner, nucleocapsid (NC) domæne rekrutterer viralt genomisk RNA, og p6 rekrutter vært faktorer at støtten viruspartikel spaltning fra plasmamembranen. Gag undergår også en co-translationel modifikation ved tilsætning af en 14-carbon fedtsyre eller myristat-delen ved dens N-terminus.

Membran binding af Gag er en væsentlig forudsætning for den virale samling, da mutants der er defekt i membranen binding ikke producere viruspartikler. Vi og andre har vist, at membranen binding af Gag medieres af tosidede signaler i MA domæne: det N-terminale myristat-del, der medierer hydrofobe interaktioner med lipiddobbeltlaget og en klynge af basiske rester i MA domæne betegnes som stærkt basiske region ( HBR), der interagerer med sure lipider på PM 1-4. Studier af Gag-membran interaktioner under anvendelse ektopisk ekspression af polyphosphoinositide 5-phosphatase IV (5ptaseIV), et enzym, der katalyserer hydrolysen af PM-specifik surt phospholipid phosphatidylinositol- (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P2] til phosphatidylinositol-4-phosphat, i celler antydede, at Gag-PM lokalisering medieres af PI (4,5) P2 3,5. Men in vitro-undersøgelser med sigte på at forstå mere mekanistiske detaljer Gag-PI (4,5) P 2 interaktioner har vist sig at være en udfordring for en række årsager. TilEksempelvis har oprensning af fuld længde myristoylerede HIV-1 Gag til biokemiske eksperimenter været teknisk vanskeligt i det mindste delvis på grund af tendensen til, Gag at aggregere under oprensning. Derfor trunkerede former af HIV-1 gag, såsom Myr-MA eller Myr-MA-CA, eller den ikke-myristoylerede formular, er blevet hyppigt anvendt til undersøgelser, der kræver Gag oprensning (f.eks kernemagnetisk resonans, protein footprinting, og overfladen plasmonresonans 6-9). Alternativt koblet in vitro-transkription-translationsreaktioner er blevet anvendt til at producere fuld-længde myristoylerede HIV-1 Gag i andre biokemiske undersøgelser 1,2. Typisk i dette system, er en Gag-kodning plasmid transskriberet og oversat med eukaryote cellelysater (f.eks kanin reticulocytlysater), som er blottet for enhver cellemembraner og messenger RNA'er men indeholder maskiner til transskription og translation. Efter reaktionen er cellelysater indeholdende Gag blandet med migmbranes til analyse af GAG-interaktioner med lipider. Foruden den lette fremstilling fuld længde myristoylerede Gag, fremgangsmåder, der anvender in vitro-transskription translationssystem har en fordel, at Gag-syntese og efterfølgende membran bindingsreaktioner forekommer i en "eukaryot cytosol-lignende" miljø, der kan bedre repræsentere fysiologiske betingelser. Denne egenskab har bidraget til de undersøgelser, der viste, at RNA-molekyler bundet til MA domænet regulere Gag binding til sure lipider i et konkurrencepræget måde 1,2,10-12. Da den samlede mængde af Gag-proteiner opnået ved disse cellelysater er ikke høje, metabolisk mærkning af proteiner med radiomærkede aminosyrer er nødvendig for deres detektion.

Afhængig af fremgangsmåden til måling af Gag-lipid interaktioner, har en bred vifte af membranpræparater blevet anvendt. Hver af disse metoder har sine styrker og begrænsninger. De fleste NMR-baserede assays kræver anvendelsen af ​​lipider med korte acylkæder, der er vandopløselige (f.eks C4- og C8-PI (4,5) P2) 6,8. Mens NMR metoder til at teste binding af Gag til de lipider, der har lange acylkæder findes i cellerne der udvikles, er de blevet brugt kun med myristoyleret eller nonmyristoylated MA hidtil 8,13. Alternativt er liposomer fremstillet ud fra lipider, som har native længde acylkæder blevet anvendt i biokemiske fremgangsmåder, såsom liposom flotation eller fluorescerende liposom bead bindingsassays 2,3,10,14-16. Men liposomer anvendt i disse assays har små diametre, og dermed deres membraner har stejle og positive krumninger. I modsætning hertil i den tidlige fase af partikelsamling i HIV-1-inficerede celler, Gag binder til PM, som er næsten plane om omfanget af Gag, og efterfølgende inducerer negativ krumning under knopskydning. Derfor kan liposommembraner med stejle og positiv krumning ikke være ideel lipiddobbeltlag for at studere Gag-lipid interaktioner. Som for liposom Flotation analyser, en anden potentiel advarsel er, at eksponeringen af ​​Gag-lipidkomplekser til hypertonisk saccharosegradient under centrifugering kan påvirke den eksperimentelle resultat. At afhjælpe disse begrænsninger og tilvejebringe en komplementær eksperimentelle system, har assays for Gag-binding til giant unilamellare vesikler (GUVs) blevet udviklet i de senere år. GUVs er enkelte lipiddobbeltlagsvesikler hvis diametre udvides til flere snese mikrometer. Således krumning disse membraner ligner PM på omfanget af Gag. På grund af sin størrelse, som muliggør visuel inspektion under optiske mikroskoper, membran binding af fluorescerende mærkede eller mærkede Gag-proteiner til disse vesikler efter blanding kan let bestemmes uden efterfølgende bearbejdning af Gag-lipidkomplekser.

Vi her beskriver en protokol for at studere HIV-1 Gag membran binding ved hjælp GUVs opnået fra en electroformation metode. Forskellige metoder såsom blid hydrering, gel-assisteret hydrering, microfluidic jetting, og electroformation 17-22 er blevet anvendt til at opnå GUVs. For protokollen beskrevet her, er den electroformation anvendte primært på grund af dens effektivitet ved dannelse GUVs med sure lipider og dens relative anvendelse uden behov for dyre opsætninger. Da visualisering af Gag nødvendiggør en fluorescerende reporter, er gult fluorescerende protein (YFP) genetisk tilsat til C-terminalen af ​​Gag (Gag-YFP). Gag-YFP proteiner opnås ved in vitro-transskription og oversættelse reaktioner i hvedekim lysater baseret på den løbende udveksling-kontinuerlig strøm (CECF) teknologi. I denne teknologi er både fjernelse af inhiberende biprodukter af de reaktioner og levering af reaktionssubstrater og energikomponenter opnået i et dialyse-mekanisme. For disse reaktioner, er et plasmid, der koder Gag-YFP under kontrol af en T7-promotor anvendes. Notatet som vist tidligere, hvedekim lysater understøtter myristoylering uden yderligere komponenter 23,24. Ved hjælp af denne metode, har det været muligt at opnå tilstrækkelige mængder af fuld længde myristoylerede Gag-YFP til visualisering af Gag på GUV membraner 24. Her beskriver vi den protokol, hvormed HIV-1 Gag-binding til PI (4,5) P2-holdige GUV membraner kan undersøges uden langvarig efterfølgende bearbejdning efter bindingsreaktioner og foreslår, at denne metode supplerer allerede eksisterende Gag-membran bindingsassays og kan være udvides til yderligere at forstå HIV-1 Gag-membran-binding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dag 1: Angivelse af Gag proteiner Brug af Wheat Germ Lysat-baserede in vitro-transskription-translation System

1. Fremstilling af HIV-1 Gag

  1. Fjern alle reagenserne ifølge kommercielle hvedekim CECF kit fra frysere (hvedekim lysater opbevares ved -80 ºC andre reagenser ved -20 ºC). Tø dem på is og blandes komponenterne som vist i tabel 1.
Mix-1 (Fodring mix)
Fodring løsning 900 pi
Aminosyrer 80 pi
Methionin 20 pi
Total 1.000 pi
Mix-2 (Lysate mix)
Wheatgerm lysater 15 pi
RNase-frit vand 7 pi
Aminosyrer 4 pi
Methionin 1 pi
Plasmid-DNA i TE-buffer (1 pg / pl) ** 4 pi
reaktionsbuffer 15 pi
RNasin * 4 pi
Total 50 pi

Tabel 1: Sammensætninger af blandinger kræves for hvedekim reaktioner.
Bemærk: Hvis eksperimentet er designet til at undersøge effekten af ​​RNA fjernelse af RNase på Gag membran binding, erstatte ribonuklease-hæmmere med RNase-frit vand. Plasmid-DNA bør være fri for urenheder ifølge producentens anvisninger. Men plasmids fremstillet under anvendelse af konventionel, men ikke endotoksin-fri, plasmid isolation kits er blevet anvendt med succes. Fabrikantens anvisninger anbefaler desuden anvendelse af DNA opløst i nuklease-frit vand. Hvis anvendelse af DNA suspenderet i TE [10 mM Tris-HCI (pH 7,4) indeholdende 1 mM EDTA], undgå anvendelse af lavere koncentrationer af DNA, da EDTA i TE kan påvirke udbyttet. Plasmider opløst i TE-buffer ved et koncentrationsinterval på 0,8-1 pg / pl er med succes blevet brugt.

  1. Først tilføje Fodring blanding (Mix-1) i reaktionen kassetten (gennemsigtig kammer). Tilsæt derefter lysatet mix (Mix-2) til det andet kammer (rød). Må ikke indføre eventuelle bobler samtidig tilføje blandingerne i deres respektive kamre, da det kan føre til ineffektiv udveksling af løsningskomponenter og dermed reducere effektiviteten af ​​reaktionen.
  2. Dæk kamre med den selvklæbende film forsynet med sættet.
  3. Sæt reaktionen kassetten i kassetteholderen og INCUBAte samlingen i 24 timer ved 24 * C ved en konstant omrystning hastighed på 900 rpm i en Eppendorf thermomixer R.

Dag 2: Forbered GUVs ved Electroformation og Harvest Wheat Germ Lysater

2. Udarbejdelse af GUVs

  1. Alikvote lipider opløst i uorganiske opløsningsmidler såsom chloroform eller blandinger af chloroform og methanol i hætteglas med skruelåg foret med Teflon liners og indpakket med Parafilm. Håndter lipider med Hamilton-type glas sprøjter, eller hvis de er tilgængelige, chloroform-resistente plastik tip. Tag hætteglas med lipiderne, der skal anvendes til GUV præparat fra -20 ºC fryser.
    1. Når hætteglassene i ligevægt til stuetemperatur, skal du sørge for ved visuel inspektion, at lipid suspensioner er klare. Kvaliteten af lipider, især sure lipider, såsom palmitoyl-oleoyl phosphatidylserin (POPS) og PI (4,5) P2, er vigtig for en vellykket forsøg. Brug ikke lipider, der eri portioner i mere end 2 måneder.
  2. Pre-varme en varmeblok til den ønskede temperatur. Denne temperatur skal være mindst 5 ºC højere end smeltetemperaturen (T m) af lipid (er) med den højeste T m.
  3. Beregn lipid volumener nødvendige overensstemmelse med de ønskede molære lipid forhold. For at studere HIV-1 Gag binding her, bruge følgende molære forhold som vist i tabel 2.
Lipid mix molforhold Volumen (i pi) stamkoncentration
POPC + POPS + Chol 46,6 + 23,3 + 30 19,74 + 10,18 + 6,57 POPC, POPS, Chol: 10 mg / ml
POPC + POPS + Chol + Brain-PI (4,5) P2 16,11 + 8,3 + 6,25 + 58,19 POPC, POPS, Chol: 10 mg / ml
Hjerne-PI (4,5) P2: 1 mg / ml

Tabel 2: Mængder af forskellige lipider anvendes til at opnå GUVs.

  1. Tilføj de ønskede mængder af lipider i en ren skruelåg hætteglas glas.
  2. Brug ITO-overtrukket objektglas med dimensioner 25 x 50 x 1,1 mm 3 og modstand 70-100 w (som beskrevet i kataloget). Placer to ITO-coatede slides på en ren bænk. Hver electroformation kammer kræver to indium-tin-oxid (ITO) overtrukne objektglas. Kontroller, at den ledende side af objektglas vender opad ved at kontrollere modstanden ved hjælp af et multimeter. Det skal vise en værdi på ca. 200 Ω. Sørg for, at overfladen af ​​dias er rene ved forsigtigt aftørring med 70% ethanol ved hjælp fnugfri klude.
  3. Rens den ydre overflade af en nål af en sprøjte af Rinsing det med chloroform og læg sprøjten på varmen blokken.
  4. Placere en ny ITO-coated objektglas på varmeblokken med ledende side opad og tillader den at ækvilibrere til den ønskede temperatur sædvanligvis ca. 2-3 min. Genbrug ikke de ITO-coatede objektglas for en potentiel risiko for, at ITO-belægning på objektglas kan blive beskadiget under rengøring procedurer.
  5. Brug et volumen på 40-50 ul af lipidblandingen for hvert objektglas for ensartet og alligevel hurtig spredning af lipiderne på objektglasset. Juster det totale volumen med et passende organisk opløsningsmiddel, såsom chloroform.
    1. Placer halvdelen af ​​den samlede mængde af lipidblandingen på objektglas og straks sprede lipidet ved hjælp af den rensede sprøjten (trin 2.6) til at give en ensartet lipidfilm (flytte nålen 2-3 gange på tværs af slæden). Spred lipidfilmen forsigtigt (men hurtigt) for at undgå skader på den tynde ITO belægning. Ikke-ensartet spredning eller ru sprede kan føre til suboptimaludbytter eller beregningsmæssige uensartethed GUVs.
    2. Derfor sikre ensartet spredning ved at inspicere lipidfilmen efter spredt før man går videre til næste trin. Hvis opaciteten af ​​filmen vises overdrevent uensartet, gentage proceduren med en ny rutsjebane.
  6. Placer coatede objektglas i en petriskål med den coatede side opad.
  7. Gentag trin 2,6-2,9 for resten af ​​blandingen ved hjælp af en anden ITO-coated dias.
  8. Anbring petriskål indeholdende både objektglassene i en konventionel vakuum udtørring kammer i 60-90 min for at fjerne ethvert spor af organiske opløsningsmidler.
  9. Under denne proces indstille inkubatoren til samme temperatur som den for varmeblokken (65 ºC i de fleste tilfælde) og præ-varme 300 mM saccharoseopløsning i inkubatoren.
  10. Efter tørring bringe petriskål til bænken og placer objektglasset på en ren overflade.
  11. Rengør forsigtigt en PDMS pakning (figur 1) under anvendelse af 70% ethanol og tør det komplestændig.
  12. Placere den på lipid-coatede objektglas, som vist i figur 1 og blidt og fast trykke så at pakningen danner en vandtæt forsegling. Bekræft fraværet af huller mellem PDMS pakningen og dias. Dette resulterer i dannelsen af ​​en overfladisk kammer, som opbevarer den saccharoseopløsning.

figur 1
Figur 1:. Layoutet af ITO-coatede objektglas bruges til electroformation Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Fylde kammeret med foropvarmet saccharoseopløsning uden bobler.
  2. Læg den anden belagt slide på toppen for at gøre en tæt forsegling. Sørg for, at der ikke er nogen bobler. Den endelige samling skal vises som vist i figur 2. Fastgør kammeret using bindemiddel klip.

Figur 2
Figur 2:. Skematisk repræsentation af electroformation kammer (set fra siden) Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Fjern overskydende sucrose ved aspiration og rengør dias ved hjælp fnugfri klude. Fastgør dias til kobber bar, så at de ledende sider er i uniform kontakt med bar. Sikre, at kun én ledende side af objektglasset er i kontakt med en kobber bar.
  2. Slut kobber bar til funktionen generator output ved hjælp af krokodillenæb. Placer samlingen inde i inkubatoren for at tillade konstruktionen at ækvilibrere til den ønskede temperatur.
  3. Anvende en sinusbølge frekvens på 10 Hz og en spændingsforskel på 1 V i 90 min. ensure, at spændingen er 1 V af et multimeter, som vist i figur 3. Fortsæt processen i 90 min.

Figur 3
Figur 3:. Positionerne, hvor elektroderne fra multimeter er placeret til måling af frekvens og strøm Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Efter 90 min, langsomt nedsætte hyppigheden til 2 Hz og fortsætte electroformation i yderligere 10 min. I løbet af denne tid, høst in vitro translationsreaktioner (trin 3,1-3,2).
  2. Sluk for funktionen generator og lade forsamlingen til at køle ned til stuetemperatur langsomt (ved at slukke inkubatoren og forlader inkubatoren døren lidt åben).
  3. Efter afkøling frakoble kablerne til generatorenfra slide forsamlinger. GUVs kan være meget skrøbelige og skal derfor håndteres meget forsigtigt. bringe forsigtigt fast på bænken.
  4. Skil kammeret ved forsigtigt at fjerne det øverste dias ved hjælp af pincet. Høste saccharose suspension indeholdende GUVs bruger snit 1.000 pi spids og overførsel til et rent rør. Håndter røret forsigtigt for at forhindre forstyrrelse af GUVs.
  5. Brug GUVs straks. GUVs er stabile i mindst 90 min efter høst ved opbevaring ved stuetemperatur.

3. Harvest in vitro translation Reaktioner

  1. Høst in vitro translationsreaktioner indeholdende ønskede proteiner fra den røde kammer under anvendelse af en mikropipette til et rør.
  2. For at fjerne aggregerede proteiner, spin lysaterne ved 16.200 xg i 15 min på en bordplade centrifuge og overføre forsigtigt supernatanten til et andet rør.

4. GUV Bindingsassay

  1. Brug af et snit spids, bland 51 l af in vitro translationsreaktioner indeholdende oversatte proteiner og 5 pi GUVs i et rør og inkuberes ved stuetemperatur i 2-3 min.
  2. Vedhæft en PDMS plade med et lille hul (3-4 mm i diameter) på en ren dækglas og sikre tætning ved forsigtigt og fast trykke den mod dækglasset.
  3. Placer 10 pi blandingen fra trin 4.1 i det lille hul.
  4. Billede blandingen under en omvendt epi eller konfokal fluorescens mikroskop ved stuetemperatur.
    Bemærk: For at undgå fordampning, kan afbildningskammeret være dækket af et dækglas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af ovennævnte protokol, vi udarbejdet GUVs sammensat af POPC + POPS + Chol (molforholdet: 4,66: 2,33: 3). Denne sammensætning blev valgt til ca. afspejle PS og kolesterol koncentrationer af PM. Robust og effektiv binding af Gag blev kun observeret når hjerne-PI (4,5) P2 blev medtaget i POPC + POPS + Chol blanding (POPC + POPS + Chol + hjerne-PI (4,5) P2 [molforhold : 4: 2: 3: 1] i dette eksempel) (figur 4, sammenlign paneler B og D med A og C). Gag-YFP binding til GUVs sammensat af POPC + POPS + Chol + hjerne-PI (4,5) P2 er tydeligt ved stigningen i fluorescensintensiteten på membranoverfladen. Denne stigning kan også ses i fluorescens intensitet profiler (Figur 4, nederst) langs linjen krydser GUV grænse (XX 'i figur 4C og D).

belastning / 54293 / 54293fig4.jpg "/>
Figur 4: Gag binder til hjerne-PI (4,5) P2 -contianing GUVs Et konfokalt tværsnit af POPC + POPS + Chol (A og C) og POPC + POPS + Chol + PI (4,5) P2. GUVs (B og D). Fordeling af Gag-YFP er vist i grøn. Forstørrede billeder af de udvalgte GUVs (gule kasser) er vist i panelerne C og D. Fluorescensintensitet profiler sammen tilfældigt udvalgte linjer trukket til at krydse de modsatte sider af GUVs (X til X ') er vist nedenfor billederne. Bar = 5 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den GUV bindingsassay som beskrevet ovenfor giver et godt alternativ i scenarier, hvor andre protein-lipid interaktion assays har deres begrænsninger. Dette assay giver os mulighed for at undersøge interaktioner mellem myristoyleret fuldlængde Gag og sure lipider med nativ længde acylkæder i lipiddobbeltlaget kontekst og gøre det uden langvarig flotation centrifugering gennem high-density saccharosegradienter eller andre post-bindende forarbejdning af Gag-lipid komplekser. En anden fordel er, at opførslen af Gag kan undersøges i en kompleks blanding (fx i nærvær af cytosoliske bestanddele), som ikke let opnås i andre realtid teknikker, såsom overfladeplasmonresonans assays. Derfor kan man hævde, at den her beskrevne assay muliggør real-time vurdering af Gag-sure lipid interaktioner i en mere nativt kontekst end andre assays anvendes inden for området.

Der er dog begrænsninger forbundet med fremgangsmåden somgodt. For at sikre at GUVs i et givet præparat har lignende sammensætning til hinanden og til den oprindelige blanding, skal electroformation udføres langt over overgangstemperaturen af lipiderne, der har den højeste overgangstemperatur stede i blandingen 25,26. Det er imidlertid muligt, at eksponering af lipider til højere temperaturer i længere tid kan føre til lipid opdeling 25,27. Derfor, for at kontrollere kvaliteten af GUVs, foruden visuel inspektion aktiveret ved inklusion af fluorescerende lipid farvestoffer (f.eks gjorde), er det ønskeligt at teste funktionaliteten af lipidet af interesse [fx PI (4,5) P2 ] under anvendelse af et lipid-specifik probe. Derudover, med GUV sammensætninger, som giver anledning til faseadskillelse ved en bestemt temperatur, skal der drages omsorg for præcist at opretholde en ønsket temperatur, når observere protein-GUV interaktion. En anden begrænsning er, at løsninger med højere ionstyrke er uforenelige med elektrodannelse beskrevne protokol her, og derfor GUVs dyrkes og vedligeholdes i 300 mM saccharose løsning 26. Især dog nogle undersøgelser har med held brugt buffere ved fysiologiske ioniske styrker i deres modificerede electroformation protokoller 28.

Et kritisk aspekt er mængden af ​​Gag. En kaninreticulocytlysat-baseret system anvendes ofte til fremstilling af fuld-længde HIV-1 Gag i liposom flotation assays. Men mængden af ​​YFP-mærkede fuldlængde Gag opnået i dette system var utilstrækkelig til visualisering af Gag-binding til GUVs. For at løse dette problem, hvedekim lysat-baserede cellefri transskription-translationssystem, som giver ca. 8-10 gange højere mængde af Gag, blev anvendt i den aktuelle analyse. Men hvis Guv bindingseksperimenter skal udføres i fravær af eukaryote cellelysaturenheder komponenter, kan man anvende oprensede proteiner mærket med en fluorofor som det er sket for nylig (beskrevet nedenfor).

Det er blevet vist, at specifik og effektiv binding af Gag til membraner er en kooperativ proces reguleres af forskellige faktorer, såsom myristat, RNA, lipid hovedgrupper og acylkæder, og gag-GAG-interaktioner (gennemgået i henvisning 29). In vitro-systemet beskrives her, kan udvides til at tage fat på de roller faktorer enkeltvis eller i kombination til at forstå rækkefølgen af begivenheder i samarbejdet med Gag membranbinding. Hidtil har beskrevet assaysystem belyst en uventet rolle umættede PI (4,5) P2 acylkæder i binding af Gag, men ikke den for en kanonisk mammal celle-oprindelse PI (4,5) P2 -bindende domæne ( den pleckstrin homologi domæne phospholipase C delta 1) 24, en konstatering af, at der ikke var blevet afsløret ved liposom flotation analyser. GUV-baserede assaysystemer er også blevet anvendt til at forstå andre aspekter af Gag biologi. Ved hjælp af en Gag derivat indeholdende en kunstig inducerbar MMSerization motiv og GUVs med tømmerflåde-lignende og ikke-tømmerflåde lignende domæner, Keller et al. undersøgte sammenhængen mellem Gag fordeling til 'tømmerflåde-lignende domæner og multimerisering 30. En undersøgelse foretaget af Carlson et al. Har brugt GUV systemet og renset og fluorescerende mærket Gag at forstå den sekventielle rækkefølge af rekruttering af forskellige endosomale sortering komplekser, der kræves for transport (ESCRT) proteiner ved membranbundne Gag 31. For nylig, en anden undersøgelse rapporterede rekonstituering af Gag-inducerede vesikel celleafsnørringsproces på GUV hjælp Gag konjugeret med en fluorofor 32. HIV-1 Gag multimerisering fører til dannelse af submembrane Gag gitter, som menes at kurven membranerne under samlingen. Derfor, med yderligere forbedring i Gag-guv analysesystemer, forholdet mellem membranen krumning ændringer og Gag membran binding, som nok er den mindste godt forstået aspekt af HIV samling, kan analyseres som der bliver gjort for andre cellulære krumning-sensitive proteiner 33.

Sammenfattende ved hjælp af denne protokol, kan man opnå tilstrækkelige mængder af myristoylerede fuld længde Gag og visualisere Gag binding til GUV membraner. Denne protokol kan videreudvikles til at undersøge forskellige stadier af HIV-1 samling og spirende processer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Vi vil gerne takke Mohammad Saleem, Jing Wu og Krishnan Raghunathan for nyttige diskussioner. Vi takker også Priya Begani for hjælp under optagelserne. Dette arbejde er støttet af National Institutes of Health giver R01 AI071727 (til AO) og R01 GM110052 (til SLV).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digital Multimeter Meterman 30XR A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose.
Function Generator Instek GFG-8216A A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10 Hz and 1 V is sufficient.
ITO coated glass slides Delta Technologies, Loveland, CO CG-90IN
Incubator Hoefer Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient
Vacuum chamber Nalgene
Thermomixer R Eppendorf 21516-166
Syringe Hamilton 80400 Gauge 22S, Syringe number 702
PDMS Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning Sylgard, 184
RTS 100 Wheat Germ CECF Kit BiotechRabbit,
Berlin, Germany
BR1401001
DiD Life Technologies, Carlsbad, CA  D7757
POPC Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL  850457C
POPS Avanti Polar Lipids 840034C
Cholesterol Avanti Polar Lipids 700041P
Brain-PI(4,5)P2  Avanti Polar Lipids 840046X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells. J Virol. 87, (12), 7155-7159 (2013).
  2. Chukkapalli, V., Oh, S. J., Ono, A. Opposing mechanisms involving RNA and lipids regulate HIV-1 Gag membrane binding through the highly basic region of the matrix domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (4), 1600-1605 (2010).
  3. Chukkapalli, V., Hogue, I. B., Boyko, V., Hu, W. S., Ono, A. Interaction between the human immunodeficiency virus type 1 Gag matrix domain and phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate is essential for efficient gag membrane binding. J Virol. 82, (5), 2405-2417 (2008).
  4. Zhou, W., Parent, L. J., Wills, J. W., Resh, M. D. Identification of a membrane-binding domain within the amino-terminal region of human immunodeficiency virus type 1 Gag protein which interacts with acidic phospholipids. J Virol. 68, (4), 2556-2569 (1994).
  5. Ono, A., Ablan, S. D., Lockett, S. J., Nagashima, K., Freed, E. O. Phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate regulates HIV-1 Gag targeting to the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (41), 14889-14894 (2004).
  6. Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (30), 11364-11369 (2006).
  7. Shkriabai, N., et al. Interactions of HIV-1 Gag with assembly cofactors. Biochemistry. 45, (13), 4077-4083 (2006).
  8. Vlach, J., Saad, J. S. Trio engagement via plasma membrane phospholipids and the myristoyl moiety governs HIV-1 matrix binding to bilayers. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (9), 3525-3530 (2013).
  9. Anraku, K., et al. Highly sensitive analysis of the interaction between HIV-1 Gag and phosphoinositide derivatives based on surface plasmon resonance. Biochemistry. 49, (25), 5109-5116 (2010).
  10. Llewellyn, G. N., Grover, J. R., Olety, B., Ono, A. HIV-1 Gag associates with specific uropod-directed microdomains in a manner dependent on its MA highly basic region. J Virol. 87, (11), 6441-6454 (2013).
  11. Inlora, J., Chukkapalli, V., Derse, D., Ono, A. Gag localization and virus-like particle release mediated by the matrix domain of human T-lymphotropic virus type 1 Gag are less dependent on phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate than those mediated by the matrix domain of HIV-1 Gag. J Virol. 85, (8), 3802-3810 (2011).
  12. Inlora, J., Collins, D. R., Trubin, M. E., Chung, J. Y., Ono, A. Membrane binding and subcellular localization of retroviral Gag proteins are differentially regulated by MA interactions with phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate and RNA. MBio. 5, (6), e02202 (2014).
  13. Valentine, K. G., et al. Reverse micelle encapsulation of membrane-anchored proteins for solution NMR studies. Structure. 18, (1), 9-16 (2010).
  14. Dick, R. A., Goh, S. L., Feigenson, G. W., Vogt, V. M. HIV-1 Gag protein can sense the cholesterol and acyl chain environment in model membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (46), 18761-18766 (2012).
  15. Dick, R. A., Kamynina, E., Vogt, V. M. Effect of multimerization on membrane association of Rous sarcoma virus and HIV-1 MA proteins. J Virol. 87, (24), 13598-13608 (2013).
  16. Alfadhli, A., Still, A., Barklis, E. Analysis of human immunodeficiency virus type 1 matrix binding to membranes and nucleic acids. J Virol. 83, (23), 12196-12203 (2009).
  17. Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 42, (2), 125-130 (2005).
  18. Needham, D., McIntosh, T. J., Evans, E. Thermomechanical and transition properties of dimyristoylphosphatidylcholine/cholesterol bilayers. Biochemistry. 27, (13), 4668-4673 (1988).
  19. Darszon, A., et al. Reassembly of protein-lipid complexes into large bilayer vesicles: perspectives for membrane reconstitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, (1), 239-243 (1980).
  20. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discuss. Chem. Soc. (81), 303-311 (1986).
  21. Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P. h, Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Progr Colloid Polymer Sci. 89, 127-131 (1992).
  22. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (12), 4697-4702 (2008).
  23. Yamauchi, S., et al. The consensus motif for N-myristoylation of plant proteins in a wheat germ cell-free translation system. FEBS J. 277, (17), 3596-3607 (2010).
  24. Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A. Phosphatidylinositol-(4,5)-Bisphosphate Acyl Chains Differentiate Membrane Binding of HIV-1 Gag from That of the Phospholipase Cdelta1 Pleckstrin Homology Domain. J Virol. 89, (15), 7861-7873 (2015).
  25. Morales-Penningston, N. F., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim Biophys Acta. 1798, (7), 1324-1332 (2010).
  26. Veatch, S. L. Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases. Methods Mol Biol. 398, 59-72 (2007).
  27. Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. Lipid peroxides promote large rafts: effects of excitation of probes in fluorescence microscopy and electrochemical reactions during vesicle formation. Biophys J. 91, (6), 2172-2183 (2006).
  28. Montes, L. R., et al. Electroformation of giant unilamellar vesicles from native membranes and organic lipid mixtures for the study of lipid domains under physiological ionic-strength conditions. Methods Mol Biol. 606, 105-114 (2010).
  29. Olety, B., Ono, A. Roles played by acidic lipids in HIV-1 Gag membrane binding. Virus Res. 193, 108-115 (2014).
  30. Keller, H., Krausslich, H. G., Schwille, P. Multimerizable HIV Gag derivative binds to the liquid-disordered phase in model membranes. Cell Microbiol. 15, (2), 237-247 (2013).
  31. Carlson, L. A., Hurley, J. H. In vitro reconstitution of the ordered assembly of the endosomal sorting complex required for transport at membrane-bound HIV-1 Gag clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (42), 16928-16933 (2012).
  32. Gui, D., et al. A novel minimal in vitro system for analyzing HIV-1 Gag-mediated budding. J Biol Phys. 41, (2), 135-149 (2015).
  33. Prevost, C., et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nat Commun. 6, 8529 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics