Visualisering av HIV-1 Gag Binding til Giant unilamelære vesikkel (GUV) Membraner

1Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School, 2Department of Biophysics, University of Michigan
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A. Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (113), e54293, doi:10.3791/54293 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den strukturelt protein av HIV-1, Pr55 Gag (eller gag), binder til plasmamembranen i cellene under viruset monteringsprosessen. Membran binding av Gag er et vesentlig skritt for virus partikkeldannelse, siden en defekt i Gag membran bindende resulterer i alvorlig svekkelse av viral partikkel produksjon. For å få mekanistiske detaljer av Gag-lipid membran interaksjoner, in vitro fremgangsmåter basert på NMR, protein footprinting, overflate-plasmonresonans, liposom flotasjon sentrifugering, eller fluorescens lipid vulst-binding er blitt utviklet hittil. Men hver av disse in vitro metoder sine begrensninger. For å overvinne noen av disse begrensningene, og tilveiebringe en komplementær måte til den tidligere etablerte metoder, har vi utviklet en in vitro-analyse hvor interaksjoner mellom HIV-1 Gag og lipidmembraner finne sted i en "celle-liknende" miljø. I denne analysen Gag binding til lipidmembraner er visuelt analysert ved hjelp av YFP-tagged Gag syntetisert i en hvetespirer basert in vitro oversettelse system og GUVs utarbeidet av en electroformation teknikk. Her beskriver vi bakgrunnen og protokoller for å oppnå Myristoylated full-lengde Gag proteiner og Guv membraner som er nødvendig for analysen og å detektere Gag-GUV binding ved mikroskopi.

Introduction

Humant immunsviktvirus type 1 (HIV-1) er et omhyllet virus som samler ved og knopper fra plasmamembranen (PM) i de fleste celletyper. Sammenstillingen av HIV-1 viruspartikler er drevet av 55 kDa-viralt kjerne-protein som kalles gag Pr55 (gag). Gag blir syntetisert som en forløper polyprotein bestående av fire store strukturelle domener, nemlig matrise, kapsid, nukleokapsid, og p6, samt to avstands peptider SP1 og SP2. Under montering, er den matrise (MA) domenet er ansvarlig for målretting av Gag til sammenstillingen området, kapsidet (CA) domene medierer Gag-Gag interaksjoner, nukleokapsidet (NC) domene rekrutterer viralt genomisk RNA, og p6 rekrutterer vertsfaktorer som hjelpemiddel viruspartikkel spalting fra plasmamembranen. Gag undergår også en ko-translasjonell modifikasjon ved tilsetning av en 14-karbon fettsyre eller myristat-del ved sin N-terminale ende.

Membranbinding av Gag er en viktig forutsetning for den virale montering, ettersom mutants som er defekt i membranbinding ikke klarer å produsere viruspartikler. Vi og andre har vist at membranbinding av Gag er mediert av todelte signaler i MA domene: N-terminal myristat enhet som formidler hydrofobe interaksjoner med det ytre lipid bilaget og en klynge av basiske residuer innenfor MA domene betegnet som meget basisk region ( HBR) som samhandler med sure lipider på PM 1-4. Studier av Gag-membran interaksjoner ved hjelp ektopisk ekspresjon av polyphosphoinositide 5-fosfatase IV (5ptaseIV) et enzym som katalyserer hydrolysen av PM-spesifikk sure fosfolipid phosphatidylinositol- (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P 2] til fosfatidylinositol-4-fosfat, i celler antydet at Gag-PM lokalisering medieres av PI (4,5) P-2 3,5. Men in vitro-studier med sikte på å forstå mer mekanistiske detaljer om Gag-PI (4,5) P 2 interaksjoner har vist seg å være utfordrende for en rekke årsaker. TilEksempelvis har rensing av full-lengde Myristoylated HIV-1 Gag for biokjemiske forsøk vært teknisk vanskelig i det minste delvis på grunn av tendensen til Gag til å aggregere under rensingen. Derfor, avkortede former av HIV-1 Gag, slik som Myr-MA eller Myr-MA-CA, eller den ikke-Myristoylated formen er ofte blitt benyttet i studier som nødvendig Gag rensing (for eksempel kjernemagnetisk resonans, proteinspor, og overflate plasmonresonans 6-9). Alternativt koblet in vitro transkripsjon oversettings-reaksjoner har vært anvendt for å produsere fullengde Myristoylated HIV-1 Gag i andre biokjemiske studier 1,2. Typisk i dette system blir et gag-kodende plasmid transkribert og oversatt med eukaryote cellelysatene (f.eks kanin retikulocytt-lysater) som er blottet for enhver cellemembraner og messenger RNA, men inneholder maskineri for transkripsjon og translasjon. Etter reaksjonen blir cellelysater inneholdende gag blandet med megmbranes for analyse av Gag samhandling med lipider. I tillegg til den enkle fremstilling av full-lengde Myristoylated Gag, metoder ved hjelp av in vitro transkripsjon oversettelsessystem ha en fordel at Gag-syntesen og påfølgende membranbindings reaksjoner finner sted i en "eukaryot cytosol-lignende miljø som kan representere bedre fysiologiske betingelser. Denne egenskapen har bidratt til studier som viste at RNA-molekyler bundet til MA domene regulere Gag binding til sure lipider i en konkurransedyktig måte 1,2,10-12. Ettersom den totale mengde av Gag proteiner erholdt i disse cellelysatene er ikke høy, er nødvendig for deres påvisning metabolske merking av proteiner med radioaktivt merkede aminosyrer.

Avhengig av fremgangsmåten for å måle Gag-lipid interaksjonene, har en rekke membranpreparater blitt benyttet. Hver av disse metodene har sine styrker og begrensninger. De NMR-baserte analyser som krever bruk av lipider med korte acylkjettinger som er vannoppløselige (for eksempel, C4 og C8-PI (4,5) P 2) 6,8. Mens NMR-metoder for å teste bindingen av Gag til lipidene som har lang acylkjeder som finnes i celler som er under utvikling, har de vært benyttet bare med Myristoylated eller nonmyristoylated MA hittil 8,13. Alternativt kan liposomer fremstilt fra lipider som har tilpassede lengde acylkjeder er blitt anvendt i biokjemiske metoder som liposomer flotasjon eller fluorescerende liposom vulst bindingsanalyser 2,3,10,14-16. Imidlertid liposomene anvendt i disse analysene har små diametre, og dermed deres membraner har bratte og positivt kurvaturer. I motsetning til dette, i løpet av den tidlige fase av partikkelsammenstillingen i HIV-1-infiserte celler, Gag binder til PM, som er nesten plant på omfanget av Gag, og deretter induserer negativ krumning i løpet av spirende. Derfor kan liposommembranene med bratt og positiv krumning ikke være ideelt lipidbilagene å studere Gag-lipid interaksjoner. Som for liposom flotasjon analyser, er et annet potensielt forbeholdet at eksponering av Gag-lipidkomplekser til hyperton sukrose gradient under sentrifugering vil kunne påvirke den eksperimentelle utfallet. For å avhjelpe disse begrensningene og tilveiebringe en komplementær eksperimentelt system, er analyser for gag-binding til store unilamellære vesikler (GUVs) blitt utviklet i de senere år. GUVs er single lipidbllag vesikler som diameter utvide til flere titalls mikrometer. Således krumningen av disse membranene ligner PM på omfanget av Gag. Videre, på grunn av sin store størrelse som muliggjør visuell inspeksjon etter optiske mikroskoper, membran binding av fluorescerende merket eller merkede GAG-proteiner til disse vesiklene etter blanding kan lett bestemmes uten etterfølgende prosessering av gag-lipidkomplekser.

Vi her beskrive en protokoll for å studere HIV-1 Gag membranbinding ved hjelp GUVs hentet fra en electroformation metode. Ulike metoder som milde hydrering, gel-assistert hydrering, microfluidic jetting, og electroformation 17-22 har blitt brukt til å skaffe GUVs. For protokollen beskrevet her, er det electroformation metoden som brukes først og fremst på grunn av sin effektivitet i å danne GUVs med sure lipider og dens relative brukervennlighet uten behov for kostbare oppsett. Siden visualisering av Gag nødvendiggjør en fluorescerende reporter, blir gul fluorescerende protein (YFP) genetisk tilsatt til den C-terminale ende av Gag (Gag-YFP). Gag-YFP proteiner oppnås ved in vitro transkripsjon og oversettelse reaksjoner i hvetespirer lysatene basert på kontinuerlig utveksling-kontinuerlig strøm (CECF) teknologi. I denne teknologien, er begge fjerning av hemmende biprodukter av reaksjonene og tilførsel av reaksjons substrater og energikomponenter oppnådd i en dialysebasert mekanisme. For disse reaksjoner er et plasmid som koder for gag-YFP under kontroll av en T7-promoter anvendt. Av notatet, som vist tidligere, hvetekim lysatene støtter myristoylation uten tilleggskomponenter 23,24. Ved hjelp av denne metoden, har det vært mulig å få tilstrekkelige mengder av full lengde Myristoylated Gag-YFP til visualisering av Gag på GUV membraner 24. Her beskriver vi protokollen som HIV-1 Gag binding til PI (4,5) P 2-holdig GUV membraner kan bli undersøkt uten langvarig etterfølgende behandling etter bindende reaksjoner og foreslå at metoden utfyller allerede eksisterende Gag-membran bindingsanalyser og kan være utvidet til ytterligere å forstå HIV-1 Gag-membranbinding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dag 1: Uttrykk for Gag Proteiner Bruke Wheat Germ Lysate-basert in vitro transkripsjon-oversettelse System

1. Utarbeidelse av HIV-1 Gag

  1. Fjern alle reagensene for det kommersielle hvetekim CECF kit fra frysere (hvetekim lysatene blir lagret ved -80 ° C, andre reagenser ved -20 ° C). Tine dem på is og blande komponentene som vist i tabell 1.
Mix-en (Feeding mix)
fôring løsning 900 fil
Aminosyrer 80 mL
metionin 20 ul
Total 1000 mL
Mix-2 (Lysate mix)
hvetekim lysates 15 ul
RNase fritt vann 7 mL
Aminosyrer 4 pl
metionin 1 mL
Plasmid-DNA i TE-buffer (1 pg / pl) ** 4 pl
reaksjon buffer 15 ul
RNasin * 4 pl
Total 50 pl

Tabell 1: Preparater ifølge blandinger som kreves for hvetekim reaksjoner.
Merk: Hvis forsøket er designet for å undersøke effekten av RNA fjerning av RNase på Gag membran bindende, erstatte ribonuklease hemmere med RNase-fritt vann. Plasmid DNA bør være fri for urenheter i henhold til produsentens anvisninger. Men plasmids utarbeidet etter konvensjonell, men ikke endotoksin-frie, plasmid isolasjon kits har vært brukt med hell. Produsentens anvisninger anbefaler også å bruke DNA oppløst i nukleasefritt vann. Ved hjelp av DNA suspendert i TE [10 mM Tris-HCl (pH 7,4) inneholdende 1 mM EDTA], unngå å bruke lavere konsentrasjoner av DNA, siden EDTA i TE kan påvirke utbyttet. Plasmider som er oppløst i TE-buffer ved et konsentrasjonsområde på 0,8 til 1 pg / pl har med hell blitt brukt.

  1. Først legger Feeding blanding (Mix-1) inn i reaksjons kassetten (gjennomsiktig kammer). Deretter legger lysatet mix (mix-2) til det andre kammer (rød). Må ikke innføre noen bobler under tilsetning av blandingen inn i de respektive kamre, siden det kan føre til ineffektiv utveksling av løsnings komponenter og dermed redusere effektiviteten av reaksjonen.
  2. Dekk kamrene med selvklebende film som følger med i settet.
  3. Sett reaksjonen kassetten inn i kassettholderen og incubate sammenstillingen i 24 timer ved 24 ° C med konstant risting hastighet på 900 opm i en Eppendorf termomikser R.

Dag 2: Klar GUVs av Electroformation og høste hvete Germ Lysates

2. Utarbeidelse av GUVs

  1. Delmengde lipider oppløst i uorganiske oppløsningsmidler slik som kloroform eller blandinger av kloroform og metanol i glassflasker med skrukork foret med Teflon liners og pakket med Parafilm. Håndtak lipider med Hamilton-type glass sprøyter, eller hvis tilgjengelig, kloroform-motstandsdyktig plast tips. Ta ut hetteglass inneholdende lipidene som skal brukes for GUV preparatet fra -20 ° C fryseren.
    1. Når ampullene blir ekvilibrert til romtemperatur, sørge for at ved visuell inspeksjon at lipid suspensjoner som er klare. Kvaliteten av lipider, særlig sure lipider, for eksempel palmitoyl-oleoyl fosfatidylserin (SPRETTE) og PI (4,5) P-2, er viktig for vellykket forsøk. Ikke bruk lipider som eri porsjoner for lengre enn 2 månedene.
  2. Forvarm en varmeblokk til den ønskede temperatur. Denne temperaturen må være minst 5 ° C høyere enn smeltetemperaturen (T m) av lipid (er) med den høyeste T m.
  3. Beregn lipid volumer som trengs i henhold til de ønskede molare lipidforhold. For å studere HIV-1 Gag bindende her, kan du bruke følgende molforhold som vist i tabell 2.
lipid miks molar ratio Volum (i mL) Stock konsentrasjon
POPC + POPs + Chol 46.6 + 23.3 + 30 19,74 + 10,18 + 6,57 POPC, dukker, Chol: 10 mg / ml
POPC + POPs + Chol + Brain-PI (4,5) P 2 16.11 + 8,3 + 6,25 + 58,19 POPC, dukker, Chol: 10 mg / ml
Brain-PI (4,5) P 2: en mg / ml

Tabell 2: Volum av forskjellige lipider anvendt for å oppnå GUVs.

  1. Legg de ønskede mengder av lipider til et rent skrukork hetteglass.
  2. Bruk ITO-belagt lysbilder av dimensjoner 25 x 50 x 1,1 mm3 og motstand 70-100 ohm (som beskrevet i katalogen). Plasser to ITO-belagt lysbilder på en ren benk. Hver electroformation kammer krever to indium-tinn-oksid (ITO) -belagte glass. Kontroller at ledende siden av glasset lysbildet vender opp ved å kontrollere motstanden ved hjelp av et multimeter. Det skal ha en verdi på ca 200 Ω. Sørg for at overflaten av lysbildene er rene ved å tørke forsiktig med 70% etanol ved hjelp lofri våtservietter.
  3. Rens den ytre overflate av en nål av en sprøyte ved å rinsing det med kloroform og legg sprøyten på varmen blokken.
  4. Plasser en ny ITO-belagt glass lysbilde på varmeblokk med ledende siden vendt opp, og la det oppnå den ønskede temperatur vanligvis ca 2-3 min. Ikke bruk de ITO-belagte glassplater for en potensiell risiko for at ITO-belegg på glassplater kan bli skadet under rengjøring prosedyrer.
  5. Bruke et volum på 40-50 pl av lipidblandingen for hvert lysbilde for jevn og likevel rask spredning av lipidene på glass-slide. Juster det totale volumet med et egnet organisk løsningsmiddel slik som kloroform.
    1. Plasser en halvdel av det totale volum av lipidblandingen på objektglasset og umiddelbart spre lipid ved hjelp av renset sprøyten (trinn 2.6) til å forlate en ensartet lipidfilm (bevege nålen 2-3 ganger på tvers av lysbildet). Spre lipid filmen forsiktig (men raskt) for å unngå skade på den tynne ITO belegg. Ikke-uniform spredning eller grov spredning kan føre til suboptimalavkastning eller beregnings heterogenitet GUVs.
    2. Derfor sikre jevn spredning ved å undersøke lipid filmen etter spres før du fortsetter til neste trinn. Hvis tettheten av filmen vises overdrevent ujevn, gjenta prosedyren med en ny side.
  6. Plasser belagt lysbilde i en petriskål med den belagte siden opp.
  7. Gjenta trinn 2,6-2,9 for resten av blandingen med en annen ITO-belagt lysbilde.
  8. Sett petriskål som inneholdt begge sider i en konvensjonell vakuumkammer for uttørking på 60-90 minutter for å fjerne ethvert spor av organiske oppløsningsmidler.
  9. I løpet av denne prosessen, sett kuvøse til den samme temperatur som den for varmeblokk (65 ° C i de fleste tilfeller) og pre-varme 300 mM sukrose-løsning i inkubatoren.
  10. Etter tørking bringe petriskål til benken og plassere glass skyve på en ren overflate.
  11. Rengjør forsiktig en PDMS pakning (figur 1) med 70% etanol og tørr det completely.
  12. Sett den på lipid-belagt glass lysbilde som vist i figur 1 og forsiktig og bestemt trykk slik at pakningen danner en vanntett forsegling. Bekreft fravær av hull mellom PDMS pakning og lysbildet. Dette resulterer i dannelsen av et grunt kammer som inneholder sukrose-løsning.

Figur 1
Figur 1:. Utformingen av ITO-belagt glass lysbilde brukes for electroformation Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Fylle kammeret med forvarmet sukrose-løsning uten noen bobler.
  2. Legg den andre belagte skyv på toppen for å lage en tett forsegling. Pass på at det ikke er noen bobler. Den endelige monteringen skal vises som vist i figur 2. Fest kammeret using bindemiddel klipp.

Figur 2
Figur 2:. Skjematisk fremstilling av electroformation kammeret (sett fra siden) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Fjern overflødig sukrose ved aspirasjon og rengjør lysbilder ved hjelp lofri våtservietter. Fest lysbilder til kobberlinjen, slik at de ledende sidene er i jevn kontakt med bar. Sikre at bare en ledende side av objektglasset er i kontakt med en kobberskinnen.
  2. Koble kobberlinjen til funksjonen generator utgang ved hjelp av krokodilleklemmer. Plassere sammenstillingen inne i inkubatoren for å tillate sammenstillingen for å stabilisere til den ønskede temperatur.
  3. Anvende en sinusbølge frekvens på 10 Hz og en spenningsforskjell av en V i 90 min. ensure at spenningen er en V med en multimeter, som vist i figur 3. Fortsett prosessen i 90 min.

Figur 3
Figur 3:. Posisjonene hvor elektrodene fra multimeter er plassert for måling av frekvens og strøm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Etter 90 minutter ble langsomt senke frekvensen til to Hz og fortsette electroformation for ytterligere 10 min. I løpet av denne tiden, høste in vitro oversettings reaksjoner (trinn 3.1 til 3.2).
  2. Skru av funksjon generator og lar enheten avkjøles til romtemperatur, (ved å slå av inkubatoren og forlater inkubatoren døren litt åpnet).
  3. Etter avkjøling koble kablene til generatorenfra glide forsamlinger. GUVs kan være svært skjør, og derfor må håndteres svært forsiktig. Nøye bringe forsamlingen til benken.
  4. Demontere kammeret ved å forsiktig fjerne det øverste lysbildet ved hjelp av tang. Høste sukrose suspensjon inneholder GUVs bruker et kutt 1000 mL tips og overføring til et rent rør. Håndter rør forsiktig for å unngå forstyrrelser av GUVs.
  5. Bruk GUVs umiddelbart. GUVs er stabile i minst 90 minutter etter høsting ved lagring ved romtemperatur.

3. Harvest-In Vitro Oversettelses Reaksjoner

  1. Høste in vitro translasjonsprodukter reaksjoner inneholdende ønskede proteiner fra røde kammeret ved hjelp av en mikropipette til et rør.
  2. For å fjerne aggregerte proteiner, spinner lysatene på 16 200 xg i 15 min på en tabletop sentrifuge og nøye overføre supernatanten til et annet rør.

4. GUV bindingsanalyse

  1. Ved hjelp av et kutt spissen, bland 51; l av in vitro translasjonsprodukter reaksjoner inneholdende oversatte proteiner og 5 ul av GUVs i et rør og inkuber ved værelsestemperatur i 2-3 min.
  2. Feste en PDMS ark med et lite hull (3-4 mm diameter) på en ren dekkglass og sikrer tett forsegling ved å forsiktig og fast trykke den mot dekkglass.
  3. Plasser 10 ul blandingen fra trinn 4.1 inn i det lille hullet.
  4. Bilde av blandingen under et invertert epi- eller konfokal fluorescens mikroskop ved romtemperatur.
    Merk: For å hindre fordamping, kan bilde kammer være dekket av et dekkglass.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjelp av ovennevnte protokoll ble det fremstilt GUVs sammensatt av POPC + SPRETTE + Chol (molforhold: 4,66: 2,33: 3). Dette preparat ble valgt for å reflektere ca. PS og kolesterolkonsentrasjoner av PM. Robust og effektiv binding av Gag observert kun når hjerne-PI (4,5) P 2 ble inkludert i POPC + POPs + Chol blanding (POPC + POPs + Chol + hjerne-PI (4,5) P 2 [molarforhold : 4: 2: 3: 1] i dette eksempel) (Figur 4, sammenlign panelene B og D med A og C). Gag-YFP binding til GUVs sammensatt av POPC + POPS + Chol + hjerne-PI (4,5) P2 er tydelig ved økning i fluorescens intensitet på membranoverflaten. Denne økningen kan også sees i fluorescensintensitet profiler (figur 4, bunn) langs linjen krysser GUV grense (XX 'i figur 4C og D).

belastning / 54293 / 54293fig4.jpg "/>
Figur 4: Gag bindes til hjerne-PI (4,5) P 2 -contianing GUVs Et konfokalt tverrsnitt av POPC + + SPRETTE Chol (A og C), og POPC + + SPRETTE Chol + PI (4,5) P-2. GUVs (B og D). Fordeling av Gag-YFP vises i grønt. Forstørrede bilder av de valgte GUVs (gule bokser) er vist i panelene C og D. fluorescens intensitet profiler sammen tilfeldig utvalgte linjer trukket krysse motsatt side av GUVs (X til X ') er vist under bildene. Bar = 5 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den GUV bindingsanalysen som beskrevet ovenfor gir et godt alternativ i situasjoner hvor andre protein-lipid-interaksjonsanalyser har sine begrensninger. Denne analysen kan vi undersøke interaksjoner mellom Myristoylated helaftens Gag og sure lipider med mors lengde acylkjeder i lipid bilaget sammenheng og gjøre det uten lang flytesentrifugering gjennom høy tetthet sukrosegradienter eller andre post-bindende behandling av Gag-lipid komplekser. En annen fordel er at virkemåten til Gag kan undersøkes i en kompleks blanding (for eksempel i nærvær av cytosoliske komponenter), noe som ikke lett kan oppnås i andre sanntids teknikker som overflate-plasmonresonans-baserte analyser. Derfor kan man hevde at analysen beskrevet her muliggjør sanntidsvurdering av Gag-sure lipid interaksjonene i en mer naturlig sammenheng enn andre analyser som brukes på området.

Det er imidlertid begrensninger i forbindelse med fremgangsmåten somgodt. For å sikre at GUVs i et gitt preparat har lignende sammensetning hverandre og til det opprinnelige blanding, må electroformation utføres godt over overgangstemperaturen av lipidene som har høyest overgangstemperaturen til stede i blandingen 25,26. Det er imidlertid mulig at eksponering av lipidene til høyere temperaturer for lengre tid, kan føre til sammenbrudd lipid 25,27. Derfor å kontrollere kvaliteten på GUVs, i tillegg til visuell inspeksjon aktivert ved inkludering av fluorescerende lipid fargestoffer (f.eks gjorde), er det ønskelig å teste funksjonaliteten til lipid av interesse [f.eks PI (4,5) P 2 ] ved hjelp av en lipid-spesifikk probe. I tillegg, med Guv sammensetninger som gir opphav til faseseparasjon ved en viss temperatur, forsiktighet må utvises for å nøyaktig opprettholde en ønsket temperatur ved iakttagelse av det protein GUV interaksjon. En annen begrensning er at oppløsninger med høyere ionestyrke er uforenlig med den elektrodannelsen protokoll beskrevet her, og derfor GUVs dyrkes og vedlikeholdes i 300 mM sukrose løsnings 26. Spesielt, men noen studier har med hell brukt buffere ved fysiologiske ioniske styrker i sine modifiserte electroformation protokoller 28.

Ett viktig aspekt er mengden av Gag. En kanin retikulocyttlysat-basert system er ofte brukt for utarbeidelse av full-lengde HIV-1 Gag i liposomer flyte analyser. Men mengden av YFP-merket i full lengde Gag oppnådd i dette systemet var utilstrekkelig for visualisering av Gag binding til GUVs. For å løse dette problemet, hvetekim-lysat-baserte cellefrie transkripsjons-translasjonssystem, som gir omtrent 8-10 ganger høyere mengde av Gag, ble brukt i den nåværende analysen. Men hvis Guv bindingseksperimenter må utføres i fravær av eukaryote celle lysat-komponenter, kan man bruke rensede proteiner merket med en fluorofor som er blitt gjort nylig (beskrives nedenfor).

Det er blitt vist at spesifikk og effektiv binding av Gag til membraner er et samarbeidende prosess reguleres av forskjellige faktorer slik som myristat, RNA, lipid hodegrupper og acylkjeder, og Gag-Gag vekselvirkninger (oversikt i referanse 29). In vitro system beskrive her kan utvides til å ivareta de rollene faktorer enkeltvis eller i kombinasjon for å forstå rekkefølgen av hendelser i samarbeidsprosessen Gag membran bindende. Så langt det beskrevne analysesystem belyst en uventet rolle umettede PI (4,5) P 2 acylkjedene i binding av Gag men ikke som en kanonisk pattedyr-celle-opprinnelse PI (4,5) P 2 -binding domene ( den pleckstrin homologi domene av fosfolipase C delta 1) 24, et funn som ikke hadde blitt avslørt av liposomer flyte analyser. Guv-baserte assay-systemer er også blitt anvendt for å forstå andre aspekter av Gag biologi. Ved hjelp av en Gag derivat som inneholder en kunstig induserbar multim.mottakerization motiv og GUVs med flåte-like og ikke-flåte som domenene, Keller et al. undersøkte forholdet mellom Gag partisjone til 'flåte-lignende domener, og multimerization 30 dollar. En studie av Carlson mfl. Har brukt GUV systemet og renset og fluorescensmerkede Gag å forstå den sekvensielle rekkefølgen på rekruttering av ulike endosomal sortering komplekser som kreves for transport (ESCRT) proteiner av membranbundne Gag 31. Nylig, en annen studie rapporterte tilberedning av Gag-indusert vesikkel spirende prosessen på GUV bruker Gag konjugert med en fluorophore 32. HIV-1 Gag multimerization fører til dannelse av submembrane Gag gitteret som er tenkt å bøye membraner under montering. Derfor, med ytterligere forbedring i Gag-Guv bestemmelsessystemer, forholdet mellom membranen krumningsendringer og Gag membranbindende, noe som er uten tvil det minste godt forstått aspekt av HIV montering, kan analyseres som blir gjort for andre cellulære kurvatur følsomme proteiner 33.

I sammendraget, ved hjelp av denne protokollen, kan man skaffe tilstrekkelige mengder av Myristoylated helaftens Gag og visual Gag binding til GUV membraner. Denne protokollen kan videreutvikles til å undersøke ulike stadier av HIV-en sammenstilling og spirende prosesser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Vi vil gjerne takke Mohammad Saleem, Jing Wu og Krishnan Raghunathan for nyttige diskusjoner. Vi takker også Priya Begani for assistanse under filmingen. Dette arbeidet er støttet av National Institutes of Health gir R01 AI071727 (AO) og R01 GM110052 (til SLV).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digital Multimeter Meterman 30XR A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose.
Function Generator Instek GFG-8216A A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10 Hz and 1 V is sufficient.
ITO coated glass slides Delta Technologies, Loveland, CO CG-90IN
Incubator Hoefer Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient
Vacuum chamber Nalgene
Thermomixer R Eppendorf 21516-166
Syringe Hamilton 80400 Gauge 22S, Syringe number 702
PDMS Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning Sylgard, 184
RTS 100 Wheat Germ CECF Kit BiotechRabbit,
Berlin, Germany
BR1401001
DiD Life Technologies, Carlsbad, CA  D7757
POPC Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL  850457C
POPS Avanti Polar Lipids 840034C
Cholesterol Avanti Polar Lipids 700041P
Brain-PI(4,5)P2  Avanti Polar Lipids 840046X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells. J Virol. 87, (12), 7155-7159 (2013).
  2. Chukkapalli, V., Oh, S. J., Ono, A. Opposing mechanisms involving RNA and lipids regulate HIV-1 Gag membrane binding through the highly basic region of the matrix domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (4), 1600-1605 (2010).
  3. Chukkapalli, V., Hogue, I. B., Boyko, V., Hu, W. S., Ono, A. Interaction between the human immunodeficiency virus type 1 Gag matrix domain and phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate is essential for efficient gag membrane binding. J Virol. 82, (5), 2405-2417 (2008).
  4. Zhou, W., Parent, L. J., Wills, J. W., Resh, M. D. Identification of a membrane-binding domain within the amino-terminal region of human immunodeficiency virus type 1 Gag protein which interacts with acidic phospholipids. J Virol. 68, (4), 2556-2569 (1994).
  5. Ono, A., Ablan, S. D., Lockett, S. J., Nagashima, K., Freed, E. O. Phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate regulates HIV-1 Gag targeting to the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (41), 14889-14894 (2004).
  6. Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (30), 11364-11369 (2006).
  7. Shkriabai, N., et al. Interactions of HIV-1 Gag with assembly cofactors. Biochemistry. 45, (13), 4077-4083 (2006).
  8. Vlach, J., Saad, J. S. Trio engagement via plasma membrane phospholipids and the myristoyl moiety governs HIV-1 matrix binding to bilayers. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (9), 3525-3530 (2013).
  9. Anraku, K., et al. Highly sensitive analysis of the interaction between HIV-1 Gag and phosphoinositide derivatives based on surface plasmon resonance. Biochemistry. 49, (25), 5109-5116 (2010).
  10. Llewellyn, G. N., Grover, J. R., Olety, B., Ono, A. HIV-1 Gag associates with specific uropod-directed microdomains in a manner dependent on its MA highly basic region. J Virol. 87, (11), 6441-6454 (2013).
  11. Inlora, J., Chukkapalli, V., Derse, D., Ono, A. Gag localization and virus-like particle release mediated by the matrix domain of human T-lymphotropic virus type 1 Gag are less dependent on phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate than those mediated by the matrix domain of HIV-1 Gag. J Virol. 85, (8), 3802-3810 (2011).
  12. Inlora, J., Collins, D. R., Trubin, M. E., Chung, J. Y., Ono, A. Membrane binding and subcellular localization of retroviral Gag proteins are differentially regulated by MA interactions with phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate and RNA. MBio. 5, (6), e02202 (2014).
  13. Valentine, K. G., et al. Reverse micelle encapsulation of membrane-anchored proteins for solution NMR studies. Structure. 18, (1), 9-16 (2010).
  14. Dick, R. A., Goh, S. L., Feigenson, G. W., Vogt, V. M. HIV-1 Gag protein can sense the cholesterol and acyl chain environment in model membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (46), 18761-18766 (2012).
  15. Dick, R. A., Kamynina, E., Vogt, V. M. Effect of multimerization on membrane association of Rous sarcoma virus and HIV-1 MA proteins. J Virol. 87, (24), 13598-13608 (2013).
  16. Alfadhli, A., Still, A., Barklis, E. Analysis of human immunodeficiency virus type 1 matrix binding to membranes and nucleic acids. J Virol. 83, (23), 12196-12203 (2009).
  17. Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 42, (2), 125-130 (2005).
  18. Needham, D., McIntosh, T. J., Evans, E. Thermomechanical and transition properties of dimyristoylphosphatidylcholine/cholesterol bilayers. Biochemistry. 27, (13), 4668-4673 (1988).
  19. Darszon, A., et al. Reassembly of protein-lipid complexes into large bilayer vesicles: perspectives for membrane reconstitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, (1), 239-243 (1980).
  20. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discuss. Chem. Soc. (81), 303-311 (1986).
  21. Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P. h, Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Progr Colloid Polymer Sci. 89, 127-131 (1992).
  22. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (12), 4697-4702 (2008).
  23. Yamauchi, S., et al. The consensus motif for N-myristoylation of plant proteins in a wheat germ cell-free translation system. FEBS J. 277, (17), 3596-3607 (2010).
  24. Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A. Phosphatidylinositol-(4,5)-Bisphosphate Acyl Chains Differentiate Membrane Binding of HIV-1 Gag from That of the Phospholipase Cdelta1 Pleckstrin Homology Domain. J Virol. 89, (15), 7861-7873 (2015).
  25. Morales-Penningston, N. F., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim Biophys Acta. 1798, (7), 1324-1332 (2010).
  26. Veatch, S. L. Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases. Methods Mol Biol. 398, 59-72 (2007).
  27. Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. Lipid peroxides promote large rafts: effects of excitation of probes in fluorescence microscopy and electrochemical reactions during vesicle formation. Biophys J. 91, (6), 2172-2183 (2006).
  28. Montes, L. R., et al. Electroformation of giant unilamellar vesicles from native membranes and organic lipid mixtures for the study of lipid domains under physiological ionic-strength conditions. Methods Mol Biol. 606, 105-114 (2010).
  29. Olety, B., Ono, A. Roles played by acidic lipids in HIV-1 Gag membrane binding. Virus Res. 193, 108-115 (2014).
  30. Keller, H., Krausslich, H. G., Schwille, P. Multimerizable HIV Gag derivative binds to the liquid-disordered phase in model membranes. Cell Microbiol. 15, (2), 237-247 (2013).
  31. Carlson, L. A., Hurley, J. H. In vitro reconstitution of the ordered assembly of the endosomal sorting complex required for transport at membrane-bound HIV-1 Gag clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (42), 16928-16933 (2012).
  32. Gui, D., et al. A novel minimal in vitro system for analyzing HIV-1 Gag-mediated budding. J Biol Phys. 41, (2), 135-149 (2015).
  33. Prevost, C., et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nat Commun. 6, 8529 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics