Visualisering av HIV-1 Gag Bindning Giant enlamellvesikel (GUV) Membran

1Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School, 2Department of Biophysics, University of Michigan
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A. Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (113), e54293, doi:10.3791/54293 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Strukturproteinet av HIV-1, Pr55 Gag (eller Gag), binder till plasmamembranet i celler under virussammansättningen processen. Membranbindning av Gag är ett viktigt steg för viruspartikelbildning, eftersom ett fel i Gag membran bindande resultat i allvarlig försämring av viruspartikelproduktion. För att få mekanistiska detaljer om Gag-lipidmembran interaktioner in vitro-metoder baserade på NMR, proteinavtryck, ytplasmonresonans, liposomer flotation centrifugering eller fluorescens lipid pärla bindning har utvecklats hittills. Emellertid har var och en av dessa in vitro-metoder sina begränsningar. För att övervinna några av dessa begränsningar och ge ett komplement till de tidigare etablerade metoder, utvecklade vi en analys in vitro i vilken interaktioner mellan HIV-1 Gag och lipidmembran äga rum i en "celliknande" miljö. I denna analys, Gag bindning till lipidmembran visuellt analyseras med hjälp YFP-tagged Gag syntetiseras i en vetegroddar-baserad i översättning vitro-system och GUVs utarbetats av en electroformation teknik. Här beskriver vi bakgrunden och protokollen för att erhålla Myristoylated fullängds Gag proteiner och GUV membran som är nödvändiga för analysen och för att upptäcka Gag-GUV bindning genom mikroskopi.

Introduction

Humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1) är ett höljevirus som monterar på och knoppar från plasmamembranet (PM) i de flesta celltyper. Aggregatet av HIV-1-viruspartiklar drivs av den 55 kDa viralt kärnprotein som kallas Pr55 Gag (Gag). Gag syntetiseras som en prekursor polyprotein består av fyra stora strukturella domäner, nämligen matris, kapsid, nukleokapsid, och P6, samt två distanspeptider SP1 och SP2. Vid montering, är matrisen (MA) domän som ansvarar för inriktning av Gag till monteringsplatsen, kapsiden (CA) domän förmedlar Gag-Gag interaktioner rekryterar nukleokapsid (NC) domän viral genomisk RNA, och p6 rekryterar värdfaktorer som stöd viruspartikel klyvning från plasmamembranet. Gag undergår också en co-translationell modifiering genom tillsats av en 14-kol-fettsyra eller myristat-del vid dess N-terminal.

Membranbindning av Gag är en viktig förutsättning för den virala montering, eftersom mutants som är defekta i membranbindning misslyckas att producera viruspartiklar. Vi och andra har visat att membranbindning av Gag förmedlas av bipartita signaler inom MA domain: den N-terminala myristat-del som medierar hydrofoba interaktioner med lipiddubbelskiktet och ett kluster av basiska rester inom MA-domänen betecknas som mycket basiska regionen ( HBR) som interagerar med sura lipider på PM 1-4. Studier av Gag-membran interaktioner med användning av ektopiskt uttryck av polyphosphoinositide 5-fosfatas IV (5ptaseIV), ett enzym som katalyserar hydrolysen av PM-specifik sur fosfolipid phosphatidylinositol- (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P2] till fosfatidylinositol-4-fosfat, i celler föreslog att Gag-PM lokalisering medieras av PI (4,5) P2 3,5. Men in vitro-studier som syftar till att förstå mer mekanistiska detaljer Gag-PI (4,5) P 2 interaktioner har visat sig vara en utmaning för ett antal skäl. FörExempelvis har rening av fullängds myristoylerade HIV-1 Gag för biokemiska experiment varit tekniskt svårt åtminstone delvis på grund av tendensen hos Gag att aggregera under rening. Därför, stympade former av HIV-1 Gag, såsom Myr-MA eller Myr-MA-CA, eller icke-myristoylerade formen har ofta använts i studier som kräver Gag rening (t.ex. kärnmagnetisk resonans, proteinavtryck, och yta plasmonresonans 6-9). Alternativt kopplad in vitro-reaktioner transkription-translations har använts för att producera fullängds myristoylerade HIV-1 Gag i andra biokemiska studier 1,2. Typiskt i detta system är en Gag-kodande plasmid transkriberas och översättas med eukaryota cellysat (t.ex. kanin retikulocyt lysat) som saknar alla cellmembran och budbärar-RNA men innehåller maskiner för transkription och translation. Efter reaktionen, är cellysat innehållande Gag blandat med migmbranes för analys av Gag interaktioner med lipider. Förutom lättheten att framställa fullängds myristoylerade Gag, metoder som använder transkriptionstranslationssystemet in vitro har en fördel att Gag-syntes och efterföljande membranbindningsreaktioner uppträder i en "eukaryot cytosol-liknande" miljö som bättre kan representera fysiologiska betingelser. Den här egenskapen har bidragit till de studier som visade att RNA-molekyler bundna till MA domänen reglera Gag bindning till sura lipider på ett konkurrenskraftigt sätt 1,2,10-12. Eftersom emellertid den totala mängden av Gag-proteiner som erhållits i dessa cell-lysat är inte höga, är nödvändig för deras detektering metabolisk märkning av proteiner med radiomärkta aminosyror.

Beroende på metoden för att mäta Gag-lipid-interaktioner, har en variation av membranpreparat använts. Var och en av dessa metoder har sina styrkor och begränsningar. De flesta NMR-baserade analyser kräver användning av lipider med korta acylkedjor som är vattenlösliga (t.ex., C4 och C8-PI (4,5) P2) 6,8. Medan NMR-metoder för att testa bindning av Gag till lipider som har långa acylkedjorna finns i celler håller på att utvecklas, har de använts endast med Myristoylated eller nonmyristoylated MA hittills 8,13. Alternativt har liposomer framställda från lipider som har infödda längd acylkedjorna använts i biokemiska metoder såsom liposomer flotation eller fluorescerande liposomer pärla bindningsanalyser 2,3,10,14-16. Men liposomer som används i dessa analyser har liten diameter, och därmed deras membran har branta och positiva krök. I motsats, under den tidiga fasen av partikelaggregatet i HIV-1-infekterade celler, binder Gag till PM, som nästan är plant på omfattningen av Gag, och därefter inducerar negativ krökning under knoppning. Därför kan liposommembranen med brant och positiv krökning inte vara perfekt lipiddubbelskikt att studera Gag-lipid-interaktioner. Som för liposom flotation-analyser, är en annan potentiell förbehållet att exponering av Gag-lipidkomplex till hyperton sackarosgradient under centrifugering kan påverka experimentella resultat. För att lindra dessa begränsningar och ge en kompletterande experimentella system, har analyser för Gag-bindning till jätte unilamellära vesiklar (GUVs) utvecklats under senare år. GUVs är enstaka lipiddubbelskikt vesiklar vars diameter sträcker sig till flera tiotals mikrometer. Således, krökningen hos dessa membran liknar PM på skalan av Gag. Vidare, på grund av dess stora storlek, vilket möjliggör visuell inspektion enligt optiska mikroskop, membranbindning av fluorescensetiketterade eller märkta Gag proteiner till dessa vesiklar vid blandning kan enkelt bestämmas utan efterföljande bearbetning av Gag-lipidkomplex.

Vi beskriver här ett protokoll för att studera HIV-1 Gag membranbindning med hjälp av GUVs erhållits från en electroformation metod. Olika metoder, såsom mild hydrering, gel-assisterad hydratisering, microfluidic jetting, och electroformation 17-22 har använts för att erhålla GUVs. För det protokoll som beskrivs här, är den electroformation metod som används främst på grund av dess effektivitet i att bilda GUVs med sura lipider och dess relativa användarvänlighet utan behov av dyra uppställningar. Eftersom visualisering av Gag nödvändiggör en fluorescerande reporter, är gult fluorescerande protein (YFP) genetiskt adderas till C-terminalen av Gag (Gag-YFP). Gag-YFP proteiner erhålls genom transkription in vitro och translationsreaktioner i vetegroddar lysat baserad på kontinuerligt utbyte-kontinuerligt flöde (CECF) teknologi. I denna teknik, finns både avlägsnande av hämmande biprodukter av de reaktioner och tillförsel av reaktionssubstrat och energikomponenter uppnås i en dialysbaserad mekanism. För dessa reaktioner, är en plasmid som kodar för Gag-YFP under kontroll av en T7-promotor användas. Notera som visas tidigare vetegroddar lysat stöd myristoylering utan ytterligare komponenter 23,24. Med denna metod har det varit möjligt att erhålla tillräckliga mängder av full längd myristoylerade Gag-YFP för visualisering av Gag på guv membran 24. Här beskriver vi protokoll med vilken HIV-1 Gag-bindning till PI (4,5) P2-innehållande GUV membran kan undersökas utan långa efterföljande bearbetning efter bindningsreaktioner och föreslår att denna metod kompletterar preexisting Gag-membranbindningsanalyser och kan vara utvidgas till att ytterligare förstå HIV-1 Gag-membranbindning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dag 1: Expression av Gag proteiner Använda vetegroddar Lysate-baserade transkription in vitro-translation System

1. Framställning av HIV-1 Gag

  1. Ta bort alla reagens i den kommersiella vetegroddar CECF kit från frysar (vetegroddar lysat förvaras vid -80 ° C, andra reagens vid -20 ° C). Tina dem på is och blanda komponenterna som visas i Tabell 1.
Mix-1 (Feeding mix)
matningslösning 900 | il
Aminosyror 80 ul
metionin 20 ^
Total 1000 | al
Mix-2 (Lysate mix)
vetegroddar lysat 15 ^ il
RNas fritt vatten 7 il
Aminosyror 4 | j, l
metionin 1 pl
Plasmid-DNA i TE-buffert (1 ^ g / ^ il) ** 4 | j, l
reaktionsbuffert 15 ^ il
RNasin * 4 | j, l
Total 50 ^

Tabell 1: Kompositioner av blandningar krävs för vetegroddar reaktioner.
Obs: Om försöket är utformad för att undersöka effekten av RNA-avlägsnande av RNas på Gag membranbindning, byt ribonukleas-hämmare med RNas-fritt vatten. Plasmid-DNA bör vara fri från föroreningar i enlighet med tillverkarens instruktioner. Emellertid plasmids ställdes med användning av konventionellt, men inte endotoxin-fri, plasmid-isoleringssatser har med framgång använts. Tillverkarens anvisningar rekommenderar även användning av DNA upplöst i nukleasfritt vatten. Om användning av DNA suspenderas i TE [10 mM Tris-HCl (pH 7,4) innehållande 1 mM EDTA], undvika att använda lägre koncentrationer av DNA, eftersom EDTA i TE kan påverka utbytet. Plasmider löst i TE-buffert vid ett koncentrationsintervall av 0,8-1 | ig / | il har framgångsrikt använts.

  1. Först till Feeding blandning (mix-1) i reaktionskassetten (transparent kammare). Lägg sedan till lysat-blandning (mix-2) till den andra kammaren (röd). Inte införa några bubblor samtidigt lägga blandningarna i sina respektive kammare, eftersom det kan leda till ineffektiv utbyte av lösningskomponenter och därmed minska effektiviteten av reaktionen.
  2. Täcka kamrarna med den adhesiva filmen försedd med satsen.
  3. Sätt reaktionskassetten i kassetthållaren och incubate aggregatet under 24 h vid 24 ° C vid en konstant skakning hastighet på 900 varv per minut i en Eppendorf Thermomixer R.

Dag 2: Förbered GUVs av Electroformation och Harvest Wheat Germ Lysat

2. Beredning av GUVs

  1. Alikvotera lipider lösta i oorganiska lösningsmedel såsom kloroform eller blandningar av kloroform och metanol i glasflaskor med skruvlock fodrade med Teflon liners och inslagna med Parafilm. Hantera lipider med Hamilton-typ glassprutor, eller om sådana finns, kloroform tålig plast tips. Ta ut glasflaskor som innehåller lipider som skall användas för GUV beredning från -20 ° C frys.
    1. När ampullerna ekvilibrerades till rumstemperatur, se till genom visuell inspektion att lipidsuspensioner är tydliga. Kvaliteten på lipider, i synnerhet sura lipider, såsom palmitoyl-oleoyl fosfatidylserin (POPS) och PI (4,5) P2, är viktigt för framgångsrika experiment. Använd inte lipider som äri portioner under längre tid än 2 månader.
  2. Pre-värma ett värmeblock till den önskade temperaturen. Denna temperatur måste vara minst 5 ° C högre än smälttemperaturen (Tm) för lipiden (er) med den högsta Tm.
  3. Beräkna lipid volymer som krävs enligt de önskade molära lipidkvoter. För att studera HIV-1 Gag bindning här, använd följande molförhållanden som visas i tabell 2.
lipid blandning molförhållande Volym (i | j, l) förrådskoncentration
POPC + POPS + Chol 46,6 + 23,3 + 30 19,74 + 10,18 + 6,57 POPC, POPS, Chol: 10 mg / ml
POPC + POPS + Chol + Brain-PI (4,5) P2 16,11 + 8,3 + 6,25 + 58,19 POPC, POPS, Chol: 10 mg / ml
Brain-PI (4,5) P2: 1 mg / ml

Tabell 2: Volymer av olika lipider användas för att erhålla GUVs.

  1. Lägg till önskade volymer av lipider i en ren skruvlock glasflaska.
  2. Använd ITO-belagda objektglas med dimensionerna 25 x 50 x 1,1 mm 3 och motstånd 70-100 Q (som beskrivs i katalogen). Placera två ITO-belagda objektglas på en ren bänk. Varje electroformation kammare kräver två indium-tenn-oxid (ITO) belagda glasskivor. Kontrollera att den ledande sidan av glasskiva uppåt genom att kontrollera motståndet med hjälp av en multimeter. Det ska visa ett värde på cirka 200 Ω. Se till att ytan av bilderna är rena genom att försiktigt torka med 70% etanol med hjälp av luddfria våtservetter.
  3. Rengöra den yttre ytan av en nål hos en spruta genom rinsing den med kloroform och placera sprutan på värmeblocket.
  4. Placera en ny ITO-belagt glasskivan på värmeblocket tillsammans med elektriskt ledande sidan upp och låt det utjämna till önskad temperatur vanligen ca 2-3 min. Återanvänd inte ITO-belagda objektglas för en potentiell risk att ITO-beläggning på objektglas kan skadas under städrutiner.
  5. Använda en volym av 40-50 | il av lipidblandningen för varje bild för enhetlig och ändå snabb spridning av lipiderna på objektglas. Justera totalvolym med ett lämpligt organiskt lösningsmedel, såsom kloroform.
    1. Placera en halv av den totala volymen av lipidblandningen på objektglas och omedelbart sprida lipiden med den rengjorda sprutan (steg 2,6) för att lämna en enhetlig lipidfilm (flyttar nålen 2-3 gånger tvärs över sliden). Sprid lipidfilmen försiktigt (men snabbt) för att undvika skador på den tunna ITO beläggningen. Oenhetlig spridning eller grov spridning kan leda till suboptimalavkastning eller beräknings heterogenitet GUVs.
    2. Därför säkerställa en enhetlig spridning genom att inspektera lipidfilmen efter sprids innan du fortsätter med nästa steg. Om opaciteten av filmen visas överdrivet oenhetlig, gör om proceduren med en ny bild.
  6. Placera det belagda objektglaset inuti en petriskål med den belagda sidan vänd uppåt.
  7. Upprepa steg 2,6-2,9 för resten av blandningen med en annan ITO-belagda bild.
  8. Placera petriskålen innehållande båda glasen i en konventionell vakuumuttorkningskammare för 60-90 minuter för att avlägsna alla spår av organiska lösningsmedel.
  9. Under denna process, ställa inkubatorn till samma temperatur som värmeblocket (65 ° C i de flesta fall) och pre-varm 300 mM sackaros lösning i inkubatorn.
  10. Efter torkning, bringa petriskål till bänken och placera objektglaset på en ren yta.
  11. Rengör försiktigt en PDMS packning (figur 1) med 70% etanol och torka den komplethållet.
  12. Placera den på lipid-belagda glasskiva som visas i figur 1 och försiktigt och tryck fast så att packningen bildar en vattentät tätning. Bekräfta frånvaron av gap mellan PDMS packningen och sliden. Detta resulterar i bildandet av en grund kammare, som innehar den sackaroslösning.

Figur 1
Figur 1:. Layouten på ITO-belagda glasskivan används för electroformation Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Fyll kammaren med förvärmda sackaroslösning utan bubblor.
  2. Placera den andra belagda glida ovanpå för att göra en tät förslutning. Se till att det inte finns några bubblor. Slutmonteringen ska visas som visas i figur 2. Fäst kammaren usinclips g bindemedel.

figur 2
Figur 2:. Schematisk bild av electroformation kammaren (från sidan) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Ta bort överflödig sackaros genom aspiration och rengör bilderna med hjälp av luddfria våtservetter. Fäst objektglasen till koppar bar så att de ledande sidorna är i jämn kontakt med stången. Säkerställa att endast en ledande sida av glasskivan är i kontakt med en kopparstång.
  2. Anslut kopparstång till funktionsgeneratorn utgång med de krokodilklämmor. Placera aggregatet inuti inkubatorn för att medge monteringen komma i jämvikt till den önskade temperaturen.
  3. Tillämpa en sinusvåg frekvens av 10 Hz och en potentialskillnad av 1 V under 90 min. Ensure att spänningen är en V genom en multimeter som visas i figur 3. Fortsätt processen under 90 min.

Figur 3
Figur 3:. Positionerna vid vilka elektroderna från multimetern är placerade för att mäta frekvens och ström klicka god här för att se en större version av denna siffra.

  1. Efter 90 min, långsamt minska frekvensen till 2 Hz och fortsätta electroformation under ytterligare 10 min. Under denna tid, skörd in vitro translationsreaktioner (steg från 3,1 till 3,2).
  2. Stänga av funktionen generator och låta enheten svalna till rumstemperatur långsamt (genom att stänga av inkubatorn och lämnar inkubatorn dörren på glänt).
  3. Efter kylning, koppla kablarna till generatornfrån skensatserna. GUVs kan vara mycket sköra och därför måste hanteras mycket försiktigt. Försiktigt föra enheten till bänken.
  4. Demontera kammaren genom att försiktigt ta bort det översta bilden med hjälp av pincett. Skörda sackaros suspension innehållande GUVs använder ett snitt 1000 l spets och överföring till ett rent rör. Hantera röret försiktigt för att förhindra störningar av GUVs.
  5. Använd GUVs omedelbart. GUVs är stabila under minst 90 min efter skörd då de lagras vid rumstemperatur.

3. Skörd i Vitro Translation Reactions

  1. Skörda translationsreaktioner in vitro innehållande önskade proteiner från den röda kammaren med hjälp av en mikropipett i ett rör.
  2. För att ta bort aggregerade proteiner, snurra lysaten vid 16.200 xg under 15 minuter på en bordscentrifug och försiktigt överföra supernatanten i ett annat rör.

4. GUV Bindningsanalys

  1. Med användning av en skuren spets, blanda 51; l av in vitro translationsreaktioner innehållande översatta proteiner och 5 pl av GUVs i ett rör och inkubera vid rumstemperatur i 2-3 min.
  2. Bifoga en PDMS ark med ett litet hål (3-4 mm diameter) på en ren täckglas och säkerställa tätning genom att försiktigt och stadigt trycka den mot täck.
  3. Placera 10 | il blandningen från steg 4,1 i det lilla hålet.
  4. Bild blandningen under en inverterad epi- eller konfokalt fluorescensmikroskop vid rumstemperatur.
    Obs! För att förhindra avdunstning, kan avbildning kammare täckas av en täck.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med hjälp av ovanstående protokoll, beredd vi GUVs bestående av POPC + POPS + Chol (molförhållande: 4,66: 2,33: 3). Denna komposition valdes för att approximativt spegla PS- och kolesterolkoncentrationer av PM. Robust och effektiv bindning av Gag observerades endast när hjärn PI (4,5) P2 ingick i POPC + POPS + Chol blandning (POPC + POPS + Chol + brain-PI (4,5) P2 [molförhållande : 4: 2: 3: 1] i detta exempel) (Figur 4, jämför panelerna B och D med A och C). Gag-YFP bindning till GUVs sammansatta av POPC + POPS + Chol + hjärna-PI (4,5) P2 är uppenbar genom ökningen i fluorescensintensitet på membranytan. Denna ökning kan även ses i fluorescensintensitetsprofiler (Figur 4, nederst) längs linjen korsar GUV gränsen (XX 'i figur 4C och D).

belastning / 54293 / 54293fig4.jpg "/>
Figur 4: Gag binder till hjärnan-PI (4,5) P2 -contianing GUVs Ett konfokalt tvärsnitt av POPC + POPS + Chol (A och C) och POPC + POPS + Chol + PI (4,5) P2. GUVs (B och D). Fördelning av Gag-YFP visas i grönt. Förstorade bilder av de markerade GUVs (gula boxar) visas i panelerna C och D. Fluorescensintensitet profiler längs slumpmässigt valda linjer dragna för att korsa de motsatta sidorna av GUVs (X till X ') visas nedan bilderna. Bar = 5 um. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den GUV bindningsanalys som beskrivits ovan ger ett bra alternativ i situationer där andra protein lipid interaktionsanalyser har sina begränsningar. Denna analys tillåter oss att undersöka interaktioner mellan Myristoylated fullängds Gag och sura lipider med infödda längd acylkedjor i lipiddubbelskiktet sammanhang och gör det utan långa flytcentrifugering genom hög densitet sackarosgradienter eller annan efter bindande bearbetning av gag-lipid komplex. En annan fördel är att beteendet hos Gag kan undersökas i en komplex blandning (t.ex. i närvaro av cytosoliska komponenter), som inte uppnås enkelt i andra realtidstekniker såsom ytplasmonresonans-baserade analyser. Därför kan man hävda att den analys som beskrivs här möjliggör realtids bedömning av Gag-sura lipid interaktioner i en mer infödd sammanhang än andra analyser som används inom området.

Det finns emellertid begränsningar som är förknippade med den metod somväl. För att säkerställa att GUVs i en given beredning har liknande sammansättning till varandra och till den ursprungliga blandningen, måste electroformation utföras väl över övergångstemperaturen för de lipider som har den högsta övergångstemperaturen närvarande i blandningen 25,26. Det är emellertid möjligt att exponering av lipider till högre temperaturer för längre tid kan leda till lipid fördelning 25,27. Därför, för att kontrollera kvaliteten på GUVs, förutom visuell inspektion möjliggörs genom införandet av fluorescerande lipid färgämnen (t.ex. DiD), är det önskvärt att testa funktionaliteten av lipiden av intresse [t.ex., PI (4,5) P2 ] med användning av en lipid-specifik sond. Dessutom, med GUV kompositioner som ger upphov till fasseparation vid en viss temperatur, måste man vara försiktig för att exakt upprätthålla en önskad temperatur när man observerar den protein GUV interaktion. En annan begränsning är att lösningar med högre jonstyrka är oförenliga med den elektrobildandet Protokollet som beskrivs här, och därför GUVs odlas och upprätthålls i 300 mM sukroslösning 26. Noterbart är dock vissa studier har framgångsrikt använt buffertar vid fysiologiska jonstyrkor i sina modifierade electroformation protokoll 28.

En kritisk aspekt är mängden Gag. En kaninretikulocytlysat baserat system används ofta för framställning av fullängds HIV-1 Gag i liposom flotation analyser. Emellertid mängden av YFP-märkt fullängds Gag erhållna i detta system var otillräcklig för visualisering av Gag-bindning till GUVs. För att ta itu med detta problem, vetegroddar lysatet baserade cellfritt transkriptions-translations-system, som ger ungefär 8-10 gånger högre mängd av Gag, användes i den aktuella analysen. Om emellertid CHEF bindningsexperiment behöver utföras i frånvaro av eukaryota cellysat komponenter, kan man använda renade proteiner märkta med en fluorofor såsom har gjorts nyligen (beskrivs nedan).

Det har visat sig att specifik och effektiv bindning av Gag till membran är en samarbetsprocess regleras av olika faktorer såsom myristat, RNA, lipider huvudgrupper och acylkedjor, och Gag-Gag interaktioner (översikt i referens 29). Den in vitro-system beskriver här kan utökas för att hantera de roller faktorer för sig eller i kombination för att förstå ordningen av händelser i den kooperativa processen för Gag membranbindning. Hittills klar den beskrivna analyssystemet en oväntad roll omättade PI (4,5) P 2 acylkedjor i bindning av Gag men inte det av en kanonisk däggdjurscellsursprungs PI (4,5) P2 -bindande domänen ( den pleckstrinhomologidomän av fosfolipas C delta 1) 24, ett konstaterande som inte hade avslöjats av liposomer flyt analyser. GUV baserade analyssystem har också använts för att förstå andra aspekter av Gag biologi. Med användning av en Gag-derivat innehållande en artificiell inducerbar multimed.motterization motiv och GUVs med flotte-liknande och icke-flotte liknande domäner, Keller et al. undersökte sambandet mellan Gag separationen för "flotte-liknande domäner och multimerise 30. En studie av Carlson et al. Har använt GUV systemet och renas och fluorescerande Gag att förstå ordningsföljden för rekrytering av olika endosomala sorteringskomplex som krävs för transport (ESCRT) proteiner genom membranbundna Gag 31. Nyligen rapporterade en annan studie beredning av Gag-inducerad vesikel spirande processen på GUV använder Gag konjugerad med en fluorofor 32. HIV-1 Gag multimerise leder till bildandet av submembrane Gag gitter som är tänkt att kurvan membranen under monteringen. Därför, med ytterligare förbättring av Gag-CHEF analyssystem, förhållandet mellan membran krökning förändringar och Gag membranbindning, som är utan tvekan den minst väl förstått aspekt av HIV montering, kan analyseras som görs for andra cellulära krökning känsliga proteiner 33.

I sammanfattning, användning av detta protokoll, kan man erhålla tillräckliga mängder av myristoylerade fullängds Gag och visualisera Gag-bindning till guv membran. Detta protokoll kan utvecklas ytterligare för att undersöka olika stadier av HIV-1 montering och spirande processer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Vi vill tacka Mohammad Saleem, Jing Wu och Krishnan Raghunathan för bra diskussioner. Vi tackar också Priya Begani för assistans under inspelningen. Detta arbete stöds av National Institutes of Health bidrag R01 AI071727 (till AO) och R01 GM110052 (till SLV).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digital Multimeter Meterman 30XR A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose.
Function Generator Instek GFG-8216A A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10 Hz and 1 V is sufficient.
ITO coated glass slides Delta Technologies, Loveland, CO CG-90IN
Incubator Hoefer Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient
Vacuum chamber Nalgene
Thermomixer R Eppendorf 21516-166
Syringe Hamilton 80400 Gauge 22S, Syringe number 702
PDMS Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning Sylgard, 184
RTS 100 Wheat Germ CECF Kit BiotechRabbit,
Berlin, Germany
BR1401001
DiD Life Technologies, Carlsbad, CA  D7757
POPC Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL  850457C
POPS Avanti Polar Lipids 840034C
Cholesterol Avanti Polar Lipids 700041P
Brain-PI(4,5)P2  Avanti Polar Lipids 840046X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells. J Virol. 87, (12), 7155-7159 (2013).
  2. Chukkapalli, V., Oh, S. J., Ono, A. Opposing mechanisms involving RNA and lipids regulate HIV-1 Gag membrane binding through the highly basic region of the matrix domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (4), 1600-1605 (2010).
  3. Chukkapalli, V., Hogue, I. B., Boyko, V., Hu, W. S., Ono, A. Interaction between the human immunodeficiency virus type 1 Gag matrix domain and phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate is essential for efficient gag membrane binding. J Virol. 82, (5), 2405-2417 (2008).
  4. Zhou, W., Parent, L. J., Wills, J. W., Resh, M. D. Identification of a membrane-binding domain within the amino-terminal region of human immunodeficiency virus type 1 Gag protein which interacts with acidic phospholipids. J Virol. 68, (4), 2556-2569 (1994).
  5. Ono, A., Ablan, S. D., Lockett, S. J., Nagashima, K., Freed, E. O. Phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate regulates HIV-1 Gag targeting to the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (41), 14889-14894 (2004).
  6. Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (30), 11364-11369 (2006).
  7. Shkriabai, N., et al. Interactions of HIV-1 Gag with assembly cofactors. Biochemistry. 45, (13), 4077-4083 (2006).
  8. Vlach, J., Saad, J. S. Trio engagement via plasma membrane phospholipids and the myristoyl moiety governs HIV-1 matrix binding to bilayers. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (9), 3525-3530 (2013).
  9. Anraku, K., et al. Highly sensitive analysis of the interaction between HIV-1 Gag and phosphoinositide derivatives based on surface plasmon resonance. Biochemistry. 49, (25), 5109-5116 (2010).
  10. Llewellyn, G. N., Grover, J. R., Olety, B., Ono, A. HIV-1 Gag associates with specific uropod-directed microdomains in a manner dependent on its MA highly basic region. J Virol. 87, (11), 6441-6454 (2013).
  11. Inlora, J., Chukkapalli, V., Derse, D., Ono, A. Gag localization and virus-like particle release mediated by the matrix domain of human T-lymphotropic virus type 1 Gag are less dependent on phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate than those mediated by the matrix domain of HIV-1 Gag. J Virol. 85, (8), 3802-3810 (2011).
  12. Inlora, J., Collins, D. R., Trubin, M. E., Chung, J. Y., Ono, A. Membrane binding and subcellular localization of retroviral Gag proteins are differentially regulated by MA interactions with phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate and RNA. MBio. 5, (6), e02202 (2014).
  13. Valentine, K. G., et al. Reverse micelle encapsulation of membrane-anchored proteins for solution NMR studies. Structure. 18, (1), 9-16 (2010).
  14. Dick, R. A., Goh, S. L., Feigenson, G. W., Vogt, V. M. HIV-1 Gag protein can sense the cholesterol and acyl chain environment in model membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (46), 18761-18766 (2012).
  15. Dick, R. A., Kamynina, E., Vogt, V. M. Effect of multimerization on membrane association of Rous sarcoma virus and HIV-1 MA proteins. J Virol. 87, (24), 13598-13608 (2013).
  16. Alfadhli, A., Still, A., Barklis, E. Analysis of human immunodeficiency virus type 1 matrix binding to membranes and nucleic acids. J Virol. 83, (23), 12196-12203 (2009).
  17. Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 42, (2), 125-130 (2005).
  18. Needham, D., McIntosh, T. J., Evans, E. Thermomechanical and transition properties of dimyristoylphosphatidylcholine/cholesterol bilayers. Biochemistry. 27, (13), 4668-4673 (1988).
  19. Darszon, A., et al. Reassembly of protein-lipid complexes into large bilayer vesicles: perspectives for membrane reconstitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, (1), 239-243 (1980).
  20. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discuss. Chem. Soc. (81), 303-311 (1986).
  21. Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P. h, Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Progr Colloid Polymer Sci. 89, 127-131 (1992).
  22. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (12), 4697-4702 (2008).
  23. Yamauchi, S., et al. The consensus motif for N-myristoylation of plant proteins in a wheat germ cell-free translation system. FEBS J. 277, (17), 3596-3607 (2010).
  24. Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A. Phosphatidylinositol-(4,5)-Bisphosphate Acyl Chains Differentiate Membrane Binding of HIV-1 Gag from That of the Phospholipase Cdelta1 Pleckstrin Homology Domain. J Virol. 89, (15), 7861-7873 (2015).
  25. Morales-Penningston, N. F., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim Biophys Acta. 1798, (7), 1324-1332 (2010).
  26. Veatch, S. L. Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases. Methods Mol Biol. 398, 59-72 (2007).
  27. Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. Lipid peroxides promote large rafts: effects of excitation of probes in fluorescence microscopy and electrochemical reactions during vesicle formation. Biophys J. 91, (6), 2172-2183 (2006).
  28. Montes, L. R., et al. Electroformation of giant unilamellar vesicles from native membranes and organic lipid mixtures for the study of lipid domains under physiological ionic-strength conditions. Methods Mol Biol. 606, 105-114 (2010).
  29. Olety, B., Ono, A. Roles played by acidic lipids in HIV-1 Gag membrane binding. Virus Res. 193, 108-115 (2014).
  30. Keller, H., Krausslich, H. G., Schwille, P. Multimerizable HIV Gag derivative binds to the liquid-disordered phase in model membranes. Cell Microbiol. 15, (2), 237-247 (2013).
  31. Carlson, L. A., Hurley, J. H. In vitro reconstitution of the ordered assembly of the endosomal sorting complex required for transport at membrane-bound HIV-1 Gag clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (42), 16928-16933 (2012).
  32. Gui, D., et al. A novel minimal in vitro system for analyzing HIV-1 Gag-mediated budding. J Biol Phys. 41, (2), 135-149 (2015).
  33. Prevost, C., et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nat Commun. 6, 8529 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics