En High-indhold

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Kritiske udfordringer for diabetes forskningsfelt er at forstå de molekylære mekanismer, der regulerer holm β-celle replikation og at udvikle metoder til at stimulere β-celle regenerering. Heri et højt indhold screeningsmetode til at identificere og vurdere β-celle replikation-fremmende aktivitet af små molekyler er præsenteret.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zhao, Z., Abdolazimi, Y., Armstrong, N. A., Annes, J. P. A High-content In Vitro Pancreatic Islet β-cell Replication Discovery Platform. J. Vis. Exp. (113), e54298, doi:10.3791/54298 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Diabetes omfatter en samling af lidelser, der deler den fælles endepunkt af forstyrret glukose homøostase. Selvom de patogene mekanismer diabetes undertyper er forskellige, de deler konsekvensen af nedsat β-cellemasse, dvs. tab af insulin produktionskapacitet 1,2. I øjeblikket, diabetes behandlingsstrategier stole på kronisk tilføre insulin, farmakologiske stimulering af insulinproduktion eller forbedring af insulinfølsomheden, og sjældent, at transplantation af pancreas-øer eller hel bugspytkirtlen 3,4. Desværre succes af disse strategier er kortvarig og / eller ikke i tilstrækkelig grad rekapitulere funktionen af ​​endogene insulinproduktion. Trods nytten af ​​at udvikle en metode til at stimulere β-celle regenerering, findes der ingen sådan fremgangsmåde. Derfor er en større diabetesforskning mål er at udvikle metoder til at generere nye p-celler eller til at udvide endogen β-cellemasse 5 6,7. Vigtigt er det, den dominerende kilde til nye p-celler in vivo er allerede eksisterende p-celler frem for specialiserede stamceller 8,9. Selvom p-celler synes at have begrænset replikation kapacitet, en lille stigning i β-cellemasse (~ 30%) kan være tilstrækkelig til at genoprette glucosehomøostase i mange diabetikere. Endvidere in situ farmakologiske stimulering af β-cellemassen er en potentielt billig og skalerbar behandlingsstrategi. Heri et højt indhold screeningsfremgangsmåde til identifikation og karakterisering små molekyler, der stimulerer β-cellevækst præsenteres.

En række forskellige in vitro eksperimentelle fremgangsmåder kan anvendes til at identificere genprodukter og / eller molekyler that fremme primær β-cellereplikation. Tidlige indsats til måling β-celle replikation induktion brugt føtal gnaver pancreas kultur eller intakte isoleret ø kulturer til at måle [3H] thymidin, BrdU inkorporering eller mitotiske organer i aldehyd-thionin eller insulin farvede befolkning som reaktion på specifikke behandlingsmetoder vilkår 10, 11. Disse in vitro-metoder og varianter heraf har flere begrænsninger. Fremtrædende mangler omfatter (1) anvendelse af føtale celler, som, i modsætning til modne p-celler, udviser en høj basal β-celle replikation sats og er vækst reguleres i en særskilt måde 12; (2) den subjektive karakter af forsøgslederen-afhængige pådømmelse af β-celle replikation begivenheder; (3) arbejds- og tidskrævende karakter af forsøgslederen-afhængige optælling af β-celle replikation begivenheder forsinker eksperimentel gennemløb; (4) brugen af ​​nuklear iblanding / plet / udseende for at identificere replikation selvts og en ikke-overlappende cytoplasmatisk farvning til identifikation p-celler fører til misattribution af nærliggende ikke-β-celle replikeringsaktiviteter til p-celler.

For nylig modne primære P-celler er blevet anvendt til at vurdere konsekvenserne af transgen overekspression samt gen-produkt eller sammensatte behandling på β-celle replikation 13-16. Imidlertid har disse undersøgelser også påberåbes subjektive optælling af replikation begivenheder, cytoplasmatisk staining- eller ikke-specifikke metoder til β-celle identifikation og / eller arbejdsintensive trin, der begrænser gennemløb, fx individuel slide-brønd plating af celler eller intakte ø paraffinindlejring og forarbejdning 17. Især en billedbaseret human β-cellereplikation screening metode, der ligner den heri præsenterede, er blevet offentliggjort 18; imidlertid vellykkede anvendelse af dette assay ikke påvist, og anvendelsen af ​​humane øer til primær screening kan ikke være stort set fealigt.

En alternativ strategi til identificering replikations-fremmende stoffer er at vurdere væksten induktion af β-cellelinier. Indledende indsats brugt transformerede Ø-celle-linjer såsom min6 celler eller INS 832/13-celler 14,19-21. Men disse cellelinjer demonstrere uhæmmet vækst, og har megen lighed med godt differentierede P-celler 22. Derfor vækst-induktion kapacitet er minimal, af uklare relevans og til tider vanskeligt at rekapitulere. En forbedret strategi for celle-line baseret screening udnytter "reversibelt forvandlet" celler, der er vækst anholdt i fravær af tetracyclin (doxycyclin) -afhængig SV40 T-antigen udtryk 23,24. Det er imidlertid uklart, om disse celler tilbage til en "normal" β-celle-lignende tilstand efter doxycyclin fjernelse. Uheldigvis har anvendelse af disse celler gav generaliserede vækstfremmende forbindelser, der ikke synes at have umiddelbar anvendelighed24. Samlet set brugen af cellelinier til at undersøge vækstregulering af en celletype udviser minimal spontan replikationsaktivitet kan have begrænset anvendelighed.

Den β-cellereplikation screening platform præsenteret heri benytter modne primære rotte P-celler til at bibeholde i reguleringen vivo væksten i videst muligt omfang, islet-cellekulturer af sammensætningen blandet celletype at muliggøre identifikation af slægt-begrænset vækstfremmende aktiviteter, multi brønds formatering at maksimere gennemløb og automatiseret analyse at eliminere bias og lette gennemløb. Vellykket anvendelse af denne platform har muliggjort identifikation af adskillige forbindelser, der fremmer β-cellereplikation 25,26. Derudover er assayet blevet anvendt til struktur-aktivitets-relationer undersøgelser og kemiske epistasis eksperimenter for at tilvejebringe mekanistiske indsigt i den molekylære regulering af β-cellereplikation. Den præsenterede platform lykkedes tilpasset for lentivirale RNAi-baserede undersøgelse af β-celle replikation veje 25. Begrænsninger af assayet indbefatter begrænset skalerbarhed (anvendelse af primære celler), anvendelse af gnaver snarere end humane ø-celler (selvom assayet kan tilpasses for humane ø-undersøgelser), udgifter forbundet med antistof-baserede billeddannelse og primær holm brug, anvendelse af spredte holme (forstyrret holm arkitektur) for at lette automatiseret erhvervelse image og afhængighed af tilgængeligheden af ​​en automatiseret mikroskop med erhvervelse image og analysekapacitet. Selv om en let in vivo screening metode til identificering af genprodukter eller forbindelser, som stimulerer β-celle regenerering in situ ville være ideelt, sådan platform er endnu ikke tilgængelig 27. Følgelig den beskrevne platform er egnet til forsker interesseret i at undersøge de fleste aspekter af β-cellereplikation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokol blev udført i overensstemmelse med Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) fra Stanford University School of Medicine. Den beskrevne protokol er skaleret til holm isolation fra seks 250 - 300 g (8 - 9 uger gamle) Sprague Dawley-rotter, som er tilstrækkelig til at frembringe 228 brønde i en plade med 384 brønde for islet-cellereplikation vurdering.

1. Klargøring

  1. Forbered coating medier før initiering holm isolering ved opsamling af konditionerede medier af 804G rotte blærecarcinomceller holdt ved konfluens i 3 dage (20 ml RPMI1640) i en 15 cm vævskulturskål 28. Sterilt filter og opbevares (-20 ° C) de konditionerede medier til senere brug.
  2. Sterilisere kirurgiske værktøjer (en 12 cm tandede væv pincet, en 11,5 cm fine sakse, en 14,5 cm kirurgiske sakse, to 16 cm buet pincet, en 12 cm buet hæmostat, en 12 cm skalpel håndtag) og en 30 mesh væv si før initiating ø isolation.
  3. Forbered pancreas fordøjelse opløsning ved opløsning af en 60%: 40% blanding af oprenset klasse I: klasse II collagenaser (total collagenaseaktivitet på 300.000 - 400.000 enheder) i 60 ml 1x Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) suppleret med calcium og magnesium. Load 10 ml pancreas fordøjelse buffer i 10 ml sprøjter (seks) med en "22 G nål og sted på is.
    Bemærk: injiceres 10 ml fordøjelse opløsning pr rotte. Skalér overensstemmelse hermed.
  4. Forbered 4,5 ml anæstetisk cocktail i et ventileret stinkskab ved blanding 1,3 ml ketamin (100 mg / ml), 0,2 ml xylazin (100 mg / ml) og 3 ml PBS. Forbered bedøvelsesmiddel cocktail inden for 1 time for at indlede ø isolation.
  5. Forbered vaskebuffer ved tilsætning af 25 ml nyfødt kalveserum til 500 ml HBSS. Placer vaskebuffer på is til senere brug.
  6. Forberede 1 flaske holm medium, som er 500 ml lav glucose Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM), 50 ml føtalt bovint serum (FBS), 5.000 enheder / ml penicillin og 5.000 pg / ml streptomycin.
  7. Forbered holm funktion medium fra funktionalitet / levedygtighed opløsning (500 ml) med 2% FBS, 2 mM glutamin, 5 mM glucose, 5.000 enheder / ml penicillin og 5.000 pg / ml streptomycin. Opbevar islet funktionen medier (4 ° C) til senere brug.
  8. Forbered 40 ml blokerende puffer ved tilsætning af 2,5 ml æsel serum og 0,12 ml Triton X-100 til 37.38 ml 1x phosphatpufret saltvand (PBS). Store blokerende buffer (4 ° C) til senere brug.
  9. Opnå de nødvendige antistoffer før initiering af protokollen.
    Bemærk: PDX-1 (TRITC) og Ki-67 (FITC) co-farvning anvendes til primær β-cellereplikation screening. For afstamning-specifikke replikation analyse, udføre immunfluorescensfarvning for yderligere celle identitetsmarkører (insulin, glucagon, vimentin eller somatostatin; TRITC) sammen med nukleare (DAPI), PDX (Cy5) og Ki-67 (FITC) farvning. Alternativ repliggørelse markører, f.eks PCNA, kan også anvendes.
  10. Forbered en 228-brønd behandling plan med hver behandling tilstand udført i fire eksemplarer. Medtag styret (5-Iodotubercidin [1 pM] eller dipyridamol [15 uM]) og køretøj-kontrol (DMSO 1: 666 fortynding) brønde.

2. Perfusion af Pancreas

  1. Bedøver rotter ved ip injektion af fortyndet bedøvelsesmiddel cocktail opløsning (0,30 ml / 100 g legemsvægt). Når rotten er fuldt bedøvede og ikke reagerer på skadelige stimuli, udføre cervikal dislokation.
  2. Placer aflivet rotte i liggende stilling (kraniel-caudale orientering) på en stak papir håndklæde og spray maveregionen med 70% ethanol.
  3. Åbne bughulen med en U-indsnit (base ved pubic region) og trække huden i rostralt retning over brystet for at blotlægge den abdominale kavitet.
  4. Grib forsigtigt tolvfingertarmen bruger to par buede pincet, find den duodenale indtastning af den fælles bile kanal (sphincter Oddi) og klemme den duodenale åbning ved papilla med en buet hæmostat.
  5. Løft den buede hæmostat bruges til at klemme den fælles galdegang papilla og få fat i galdegang tæt på leveren ved hjælp af en buet pincet. Brug stump dissektion med de krumme pincet til at isolere og eksponere galdegang.
  6. Flyt rotten med hovedet proksimale og fødder distal.
  7. Kanyler den fælles galdegang (CBD) ved eller bare distalt for krydset af de cystiske og fælles hepatiske kanaler med en pancreas fordøjelse løsning -loaded 10 ml sprøjte og langsomt injicere 10 ml af pancreas fordøjelse løsning. Under injektion, støtter CBD med en skalpel håndtag. Flytte nålen, hvis kanalen og bugspytkirtlen undlader at puste.
  8. Fjern de oppustede pancreas under anvendelse af de buede pincet og fine sakse at adskille den fra den nedadgående colon, tarme, mave og milt. Placer de oppustede pancreas på is i et 50 ml rør indeholdende 5 ml Bemærk: For at opnå maksimal holm udbytte, indsamle alle pancreas inden for 30 min og sted kun 1 eller 2 pancreas i hver 50 ml fordøjelse rør.

3. Dissociation af Pancreas

  1. Når alle pancreas indsamles, placere fordøjelsen rør i et 37 ° C vandbad i 15 min. Vend forsigtigt rørene hver 3 min.
  2. Efter 15 min rystes kraftigt (lodret) rørene 10 gange, og der tilsættes 10 ml koldt vaskebuffer. Rystes kraftigt rørene yderligere 5 gange og placere på is.
  3. Fyld fordøjelsen rør til 50 ml med kold vaskebuffer og mix ved at vende rørene 5 gange.
  4. Centrifuger rørene ved 97 xg ved 4 ° C i 1 min og hæld supernatanten. Pas på ikke at løsne pelleteret væv.
  5. Tilsæt 25 ml vaskebuffer og re-suspendere vævet ved forsigtigt vortex. Gentag trin 3.4 og 3.5 to gange mere.
  6. Placer en 30 mesh væv si over en sterile 250 ml bægerglas og hæld vævet suspensionen på sigten. Skyl fordøjelse rør med yderligere 20 ml vaskebuffer og hæld på masken. De ufordøjede pancreas og fedtvæv fjernes på dette trin.
  7. Hæld det filtrerede materiale i to friske 50 ml rør og pelletere vævet ved centrifugering ved 97 x g i 1 min ved 4 ° C. Dekanter supernatanten og vend rør til at dræne overskydende buffer.

4. Oprensning af Islets

  1. Tilsættes 20 ml kold polysucrose / natrium diatrizoat løsning (1,119 g / ml tæthed) til pelleteret bugspytkirtlen væv. Homogent genopslæmmes indholdet af hvert rør ved forsigtigt at pipettere op og ned fem gange.
  2. Forsigtigt overlejre polysucrose / natrium diatrizoat løsning med 10 ml HBSS. Oprethold en skarp væske-grænseflade ved langsom tilsætning af HBSS langs rørvæggen.
  3. Centrifugeres det fordøjede pancreas ved 560 xg i 15 min (4 ° C) med langsom acceleration og ingen bremse.
  4. Collect holmen lag fra grænsefladen ved hjælp af en 10 ml pipette og sted holme i friske 50 ml rør. Må ikke pool holme på dette stadium.
  5. Tilsæt 40 ml vaskepuffer til hver 50 ml rør og centrifugering i 1 min ved 140 xg ved 4 ° C.
  6. Hæld supernatanten og resuspender poolede øer i 50 ml vaskepuffer ved at vende rørene flere gange. Centrifugeres rørene i 1 min ved 97 x g ved 4 ° C for at indsamle øer i en pellet.
  7. Hæld vaskepufferen og gentag vask. Bring øer i vævskultur hætte og aspirere supernatanten.
  8. Resuspender hvert rør af øer i 6 ml ø-medium.
  9. Overfør øerne fra hver 50 ml rør i en brønd af seks brønde vævskulturskål. Swirl 6-brønds skål til at indsamle øer i midten af ​​brønden og observere holm kvalitet og renhed under et mikroskop.
  10. Manuelt indsamle øer under anvendelse af en 1 ml pipette og overføre de plukkede øer i den tilstødendebrønd indeholdende 6 ml ø-medier. Gentag islet hvirvlende og picking indtil> 90% renhed opnås.
  11. Overfør oprensede øer til en 10 cm vævskulturskål indeholdende 20 ml ø-medium.
  12. Placer øer i en vævsdyrkningsinkubator (37 ° C, 5% CO2) natten over (figur 1A).
  13. Som forberedelse til udpladning øceller, overtrække brøndene i en plade med 384 brønde med 40 pi 804G konditionerede medier per brønd. Inkuber natten over i en vævskultur-inkubator.

5. Spredning og Plating af ø-celler

  1. Den følgende dag, forsigtigt frigøre øer fra 10 cm skål med en celleskraber og overføre øer i et 50 ml rør.
  2. Pelletere øer ved centrifugering i 1 min ved 22 xg ved stuetemperatur. Aspirere supernatanten.
  3. Vask øerne med 20 ml varm PBS og dekanteres som ovenfor.
  4. Re-suspendere holme i 0,25% trypsin (150 pi per rotte pancreas) Og inkuberes ved 37 ° C i 10 min. Pipette holme op og ned 10 gange ved anvendelse af 1 ml pipette efter 5 og 10 minutters inkubation.
  5. Efter 10 min evaluere en 20 pi prøve af de trypsinerede øer under mikroskop for at sikre fuldstændig fordøjelse og at tælle de ø-celler under anvendelse af et hæmocytometer. Hvis ufordøjede øer forbliver fortsat inkubation i yderligere 3 - 5 min og pipette op og ned 10 gange mere. Gentag om nødvendigt.
    Bemærk: Den typiske udbytte er ~ 125.000 - 150.000 ø-celler pr rotte.
  6. Fjern 804G konditionerede medier-overtrukket plade med 384 brønde fra inkubatoren og fjerne mediet under anvendelse af en 12-brønds manifold aspirator.
  7. Suspendere øceller ved en densitet på 45.000 celler pr ml i Islet funktion medium og pladen 70 pi (3.150 celler) per brønd med en multikanalpipette (figur 1B).
    Bemærk: Da p-celler placeret i de ydre brønde tendens til at migrere til omkredsen af ​​pladen use rækker C til N og kolonner 4til 21 til pladen 228 brønde med ø--celler isoleret fra 6 rotter.
  8. Pladen anbringes i vævskultur inkubator i 48 timer for at tillade celleadhæsion.

6. Islet-celle kultur Behandling, fiksering og farvning

  1. Forbered 200 pi køretøjet og forbindelser (behandlingsbetingelser udføres firdobbelt) ved en 2x koncentration i Islet funktion medium. Arrangere forbindelser i en steril 96-brønds plade til at lette multi-brønd pipettering.
  2. Fjern forsigtigt islet medium med en 12-brønds manifold aspirator og erstat med ø-funktion medium (35 pl / brønd) under anvendelse af en 12-brønds pipette. Fjerne og udskifte medier fra én række ad gangen for at begrænse risikoen for tørring (figur 1C).
  3. Påbegynde behandling ved at overføre 35 pl / brønd af de 2x sammensatte løsninger. Retur pladen til inkubatoren til behandling varighed 48 timer.
  4. Efter 48 timers behandling, dekanteres behandling medier ved at vende pladen. </ Li>
  5. Forsigtigt vaske øceller med 50 pi per brønd af 1 x PBS (1 min). Tilsæt PBS under anvendelse af en multi-kanal pipette.
  6. Dekanteres PBS og fikseres cellerne ved tilsætning af 50 pi per brønd af kold 4% paraformaldehyd (PFA) fortyndet i 1x PBS. Cellerne inkuberes i 15 minutter ved 4 ° C.
  7. Vask cellerne tre gange (5 min hver) ved at vende pladen til fjernelse af PFA og forsigtigt at tilsætte 60 pi PBS per brønd som ovenfor.
  8. Forbered 15 ml antigen-genvinding opløsning ved at blande 14,25 ml formamid og 0,75 ml 0,15 M natriumcitrat (pH 6). Gøre antigenet hentning opløsning umiddelbart inden brug.
  9. Fjern PBS fra brønde ved at vende pladen og tilsættes 60 pi antigen-genvinding opløsning til hver brønd. Anbring pladen i 70 ° C vandbad i 45 minutter. Placer en varmeblok på toppen af ​​pladen under denne inkubation for at undgå vridning af multi-brønds plade.
    Bemærk: Vandet skal være halvvejs op pladen nederdel; pladen bør ikke nedsænkes.
  10. Vask cellerne med 60 pi per brønd af 1x PBS tre gange (5 min hver). Tilføj PBS med en multi-kanal pipette og dekanteres PBS ved at vende pladen.
  11. Brug en multi-kanal pipette til at tilføje 40 pi per brønd af blokerende buffer og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur. Fjern blokerende buffer ved at vende pladen og dekantering.
  12. Tilsæt 40 ​​pi muse-anti-humant Ki-67 (1: 200) og gede-anti-humant PDX-1 (1: 100) antistoffer fortyndet med blokerende buffer til hver brønd og inkuberes ved 4 ° C natten over.
  13. Den næste dag, dekanteres anti-body opløsning og vask af cellerne med 1x PBS tre gange (5 min hver) som beskrevet ovenfor. Dekanteres PBS.
  14. Tilsæt 40 ​​pi per brønd af fortyndet (1: 200) biotinyleret æsel-anti-muse IgG og rhodamin-konjugeret æsel-anti-gede-IgG i blokeringsbuffer. Der inkuberes i 1 timeved stuetemperatur.
  15. Vask cellerne med 1x PBS tre gange, 5 minutter hver. Tilsæt 40 ​​pi fortyndet (1: 400 i blokeringsbuffer) fluorescein-konjugeret streptavidin til hver brønd. Inkuber 30 min ved stuetemperatur.
  16. Vask cellerne med 1x PBS tre gange, 5 minutter hver. Tilsæt 40 ​​pi per brønd af DAPI (300 nM i blokerende buffer) og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur.
  17. Vask cellerne med 1x PBS to gange og efterlade celler i 40 pi 1x PBS. Pladen er nu klar til at blive analyseret.

7. β-cellereplikation Analyse

Bemærk: Der skal etableres et assay-protokol til det høje indhold screening mikroskop anvendes til at måle β-celle replikation. I sin enkleste sammensætning, denne protokol er en to-farve-assay, hvor en identitet markør anvendes til at definere p-celler (PDX-1 + -celler) og et replikation markør (Ki-67) anvendes til at definere celledeling begivenheder.

  1. Identificere objekter (p-celler) baseret på den average fluorescensintensitet af PDX-1-farvning (549 nm filter) i en omtrentlig cirkel (længde: bredde <1.6) inden for det forventede pixel arealet af en β-cellekerne (figur 2A).
  2. Dernæst etablere indstillinger til at identificere replikation begivenheder (Ki-67-positivitet) baseret på den gennemsnitlige fluorescensintensitet (485 nm-filter) inden for PDX-1 + område (figur 2B).
    Bemærk: Eksponeringstider skal fastsættes for at tillade pixel intensitet sammenligninger på tværs af billeder. Assay protokolparametre tilpasses, således at maskinen opkald konsekvent udelukke uspecifik farvning, vragrester og celleaggregater, som kan skade datakvaliteten.
  3. Analyser mindst 500 p-celler per brønd for at maksimere præcision og begrænse variabilitet.
    Bemærk: forventes basale β-celle replikation indeks i rotte-ø-kulturer til 0,5 - med 3%. Typisk 40 billeder per brønd er mere end tilstrækkelig til at identificere 500 p-celler.
  4. Forud for analyse afhele pladen, analysere udvalgte negativ-(DMSO-behandlet) og positiv kontrol (5-iodotubercidin [1 pM] eller dipyridamol [15 uM]) -behandlede brønde til at vurdere gyldigheden af ​​analysens protokollen. Når assayet er etableret korrekt, positive kontrolforbindelser inducerer mindst en to-fold stigning i procentdelen af ​​replikerende P-celler.
  5. Læs hele pladen, når analysen protokollen er valideret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at vurdere β-celle eller α-celle replikation, er en fire-farve assay-protokol kræves. For det første er objekter identificeret ved DAPI farvning (kanal 1, 386 nm). Dernæst p-celler (event 1) tælles: genstande, der co-udtrykker PDX-1 + (kanal 2, 650 nm) og peri-nuklear insulin (kanal 3, 549 nm). Efterfølgende replikerende p-celler (event 2) tælles: P-celler (event 1) at co-udtrykker Ki-67 (kanal 4, 485 nm) (figur 3). Procentdelen af ​​replikerende p-celler beregnes: (hændelse 2 / event 1) x 100. For at kvantificere α-cellereplikation forventes de samlede objekter identificeret af DAPI farvning (kanal 1) og derefter a-celler (event 1) optælles ved fravær af PDX-1-farvning (kanal 2) og tilstedeværelsen af ​​perinukleære glucagon-farvning (kanal 3). Replikerende a-celler (event 2) er antallet af a-celler, der co-express Ki-67 (kanal 4) (Figur 4).Procentdelen af ​​replikerende a-celler beregnes: (hændelse 2 / begivenhed 1) x 100.

Før påbegyndelse af forsøget, er en forbindelse behandlingsplan lavet (tabel 1A). Her blev en lille skala assay kørt under anvendelse negativ kontrol (DMSO-behandlet) og positiv kontrol (dipyridamol-behandlede [15 uM]) betingelser for at vurdere PDX-1, β-celle og α-celle replikation i en 384-brønds format ( 49 billeder per brønd). Eksperimentelle data viser dipyridamol til selektivt fremme PDX-1 +-celle og β-cellereplikation men ikke α-cellereplikation. Det gennemsnitlige antal identificerede PDX-1-celler per brønd var 5.541 ± 555 for DMSO-behandlede og 6.439 ± 363 for dipyridamol-behandlede betingelser (p <0,01); demonstrerer en dipyridamol-afhængig stigning i PDX-1 celleantal (tabel 1B, top). Den gennemsnitlige procent PDX-1 +-celle replikation (DMSO + PDX-1 + Ki-67 + </ sup> / DMSO + PDX-1 +) er 3,35 ± 0,50% for DMSO-behandlede og 10,10 ± 0,98% for dipyridamol-behandlede betingelser (p <0,01) (tabel 1 B, nederst). Vigtigere er det, der er lignende PDX-1 +-celle replikation satser i brønde efterfølgende analyseret for β-celle (rækker CF) og α-celle replikation (rækker GJ): DMSO = 3,3 ± 0,66 (rækker CF) og 3,4 ± 0,23 (rækker GJ) (p = 0,80); dipyridamol = 9,8 ± 0,86 (p CF) og 10,4 ± 0.1.1 (række GJ) (p = 0,43). Derfor er disse brønde, skønt farvet for forskellige celle-slægt markører (insulin og glucagon), svarede ligeledes til lægemiddelbehandling.

Næste replikation satser af p-celler og a-celler blev beregnet ud fra de rå data (tabel 2). Det gennemsnitlige antal p-celler (event 1) blev øget som reaktion på dipyridamol behandling: DMSO 3930 ± 488 vs. dipyridamol 4589 ± 218 (p <0,05). Især er der en signifikant reduktion i antallet af p-celler (3.930 ± 488) sammenlignet med PDX-1-celler (5.541 ± 555) (p <0,01). Dette er et resultat af at udelukke PDX-1 + -celler, der er insulin - fra β-celletal, f.eks δ-celler eller β-celle progenitorceller, og den yderligere stringens kræve p-celler til at være insulin +. Især gjorde antallet af a-celler (hændelse 1) ikke stige med dipyridamol behandling (DMSO 1465 ± 123 vs dipyridamol 1467 ± 74,7; p = 0,93). Derfor dipyridamol selektivt øger β-celleantal. Antallet af replikerende p-celler (hændelse 2) øges som respons på dipyridamol behandling (DMSO 131 ± 31 vs. dipyridamol 476,5 ± 39,6; p <0,01), men antallet af replikerende a-celler (hændelse 2) ikke (DMSO 10.25 ± 3 vs. dipyridamol 9,0 ± 1,6; p = 0,5). Endelig procentdelen af ​​replikerende β-ceLLS og a-celler beregnes ((hændelse 2 / begivenhed 1) x 100). Faktisk dipyridamol øger procentdelen af replikerende p-celler, men ikke a-celler (opsummeret i figur 5). Vigtigt er det, den basale β-celle replikation sats af en sund kultur varierer mellem eksperimenter (0,5 - med 3%), men bør være meget konsistent på tværs brønde inden et eksperiment. Fordi den basale replikation er variabel, forbindelsen inducerede β-celle replikation sats er også variabel tværs eksperimenter; imidlertid fold-induktion af β-celle replikation er konsistent på tværs eksperimenter og tillader sammensatte effekt troværdigt sammenlignes på tværs af eksperimenter. Især den α-cellereplikation sats er ~ 5 gange lavere end den β-celle-replikation sats og kulturer indeholder ~ 1/3 så mange a-celler som p-celler; følgelig finder α-cellereplikation indeks viser øget variabilitet sammenlignet med β-cellereplikation indeks. For at begrænse variabilitet, billederne per brøndøges fra 49 (bruges her) til et maksimum på 81.

figur 1
Figur 1: Isoleret og spredte Rotte holme. (A) En mikrograf af sunde isolerede rotteøer; 100 um skala bar vist. (B) Mikrografer (5X og 10X mål) for spredte rotteøer 1 time efter plettering; 100 um (til venstre) og 200 um (højre) skala barer vist. (C) Mikrografer (5X og 10X mål) af spredt rotte holme 48 timer efter plating; 100 um (til venstre) og 200 um (højre) skala barer vist. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Automatiseret Identifikation af PDX-1 + + ø-celler. (A) forbindelse-behandlede dispergeret rotte-ø-celler farvet for PDX-1. PDX-1 + objekter cirklede i blåt; udelukkede objekter cirklede i orange. Scale bar 150 um vist. (B) Det samme område af ø-celler farvet for Ki-67. PDX-1 + ki-67 + dobbelt-positive celler cirklede i grønt. Scale bar på 150 um vist. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3:. Automatiseret Identifikation af Replikerer p-celler Replikerer P-celler identificeres ved DAPI (venstre-øverste hjørne, blå cirkler), PDX-1 (højre øverste hjørne, grønne cirkler), insulin (venstre nederste hjørne, magenta cirkler) og Ki-67 (højre nederste hjørne, røde cirkler) co-eXPRESSION. Det flettede billede (højre) viser flere replikerende p-celler. Scale bar på 150 um vist. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4:. Automatiseret identifikation replikere a-celler Replikerer a-celler identificeres ved DAPI (venstre-øverste hjørne, blå cirkler), fraværet af PDX-1 (højre øvre hjørne, grønne cirkler), glucagon (venstre-lavere hjørne, magenta cirkler) og Ki-67 (højre nederste hjørne, rød cirkel) co-udtryk. Det flettede billede (højre) viser en sjælden replikerende dublet af a-celler (gul pil). Scale bar på 150 um vist. Klik her for at se en større version af dette tal.


Figur 5:. Dipyridamole inducerer PDX-1 + - og β-cellereplikation men ikke α-cellereplikation Grafisk fremstilling af PDX-1-celle (øverst til venstre), β-celle (øverst til højre) og α-celle (nederst til venstre) replikation i DMSO og dipyridamol-behandlede brønde er vist. Bjælkerne repræsenterer middelværdien af ​​uafhængigt behandlede brønde (PDX-1-replikation, n = 8; β-celle og α-cellereplikation, n = 4). Fejl søjler indikerer standardafvigelsen (* p <0,01). Klik her for at se en større version af dette tal.

<td> 3,77
EN. Behandling: Farvning:
4 5
C DMSO dipyridamol Insulin, DAPI, PDX-1, Ki-67
D DMSO dipyridamol Insulin, DAPI, PDX-1, Ki-67
E DMSO dipyridamol Insulin, DAPI, PDX-1, Ki-67
F DMSO dipyridamol Insulin, DAPI, PDX-1, Ki-67
G DMSO dipyridamol Glucagon, DAPI, PDX-1, Ki-67
H DMSO dipyridamol Glucagon, DAPI, PDX-1, Ki-67
jeg DMSO dipyridamol Glucagon, DAPI, PDX-1, Ki-67
J DMSO dipyridamol Glucagon, DAPI, PDX-1, Ki-67
B. Antal PDX-1 + -celler
DMSO dipyridamol
4 5
C 5158 6249
D 6365 6795
E 4830 6974
F 5988 6408
G 5574 6532
H 5939 6411
jeg 5612 6387
J 4862 5759
Procent af PDX-1 + Ki-67 + -celler
DMSO dipyridamol
4 5
C 3,04 9.99
D 3,91 10.57
E 2,51 8,58
F 10.14
G 3,44 10.1
H 3,06 10,69
jeg 3.58 9,07
J 3,52 11,74

Tabel 1: Repræsentant Eksperimentel Plan og PDX-1 +-Cell Replication data. (A) En oversigt over behandlingsplanen vises. Brønde blev behandlet med DMSO (kolonne 4) eller dipyridamol (kolonne 5). Farvning blev udført med DAPI, anti-PDX-1, anti-insulin (normal skrift) eller anti-glucagon (kursiv skrift) og Ki-67 (B) Samlet antal PDX-1 + celler (top, DAPI +PDX-1 +) per brønd og procentdelen af replikerende PDX-1-celler (nederst, DAPI + PDX-1 + Ki-67 + / DAPI + PDX-1 + x 100) per brønd er vist.

Begivenhed 1:
DMSO dipyridamol
4 5
C 3557 4352 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+)
D 4387 4542 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+)
E 3462 4879 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+)
F 4315 4585 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+)
G 1594 1567 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+)
H 1477 1439 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+)
jeg 1491 1390 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+)
J 1298 1474 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+)
Begivenhed 2:
DMSO dipyridamol
4 5
C 113 425 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+) Ki-67 (+)
D 152 511 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+) Ki-67 (+)
E 97 466 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+) Ki-67 (+)
F 163 504 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+) Ki-67 (+)
G 13 9 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+) Ki-67 (+)
H 10 9 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+) Ki-67 (+)
jeg 6 11 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+) Ki-67 (+)
J 12 </ Em> 7 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+) Ki-67 (+)
% Replikation:
DMSO dipyridamol
4 5
C 3.18 9,77
D 3,47 11.25
E 2.8 9,55
F 3,78 10.99
G 0,82 0,57
H 0,68 0,63
jeg 0.4 0,79
J 0,92 0,48

Tabel 2: Repræsentativ β-celle og α-cellereplikation data Den totale antal p-celler (hændelse 1: DAPI + PDX-1 + insulin +; top tabelrækker CF, normal skrift).), Α-celler (hændelse 1 : DAPI + PDX-1 + glucagon +; top tabelrækker GH, kursiv skrift), replikerende p-celler (begivenhed 2: DAPI + PDX-1 + insulin + Ki-67 +, midterste tabelrækker CF, normal bogstaver) og α -celler (begivenhed 2: DAPI + PDX-1 + glucagon + Ki-67 +, midterste tabelrækker GH, kursiv skrift)per brønd er vist. Derudover er procentdelen af replikerende p-celler (DAPI + PDX-1 + insulin + Ki-67 + / DAPI + PDX-1 + insulin + x 100; bottom tabelrækker CF, normal skrift) og a-celler (DAPI + PDX -1 + glucagon + Ki-67 + / DAPI + PDX-1 + glukagon + x 100; bund tabelrækker GJ, kursiv bogstaver) per brønd vises.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Eksperimentelle metoder til at studere de molekylære veje, der styrer β-celle vækst og regeneration er vigtige redskaber for diabetes forskere. Heri, at en rotte-ø-baserede screening platform identificere og karakterisere små molekyler stimulatorer af β-celle replikation præsenteres.

Mens de fleste aspekter af denne protokol nemt udføres af erfarne forskere, et par skridt kræver særlig teknik. Først under islet isolation, kanylering af galde-kanal uden at forstyrre dens integritet kræver øvelse. En nyttig strategi er at minimalt oppuste galdegang at sikre korrekt positionering af nålen før fuldt dispensering af pancreas fordøjelse opløsning. For det andet, effektiv holm isolation fra eksokrine væv kræver meget opmærksom på fordøjelsen varighed og passende omrøring. Der bør udvises omhu for at sikre jævn varme i hele digest gennem intermitterende hvirvlende. Tredje, eksperimentel succes afhængers på dygtige forskelsbehandling mellem holme og eksokrine vragrester under manuel ø plukning; denne færdighed forbedrer med praksis. For det fjerde er holm dispersion og plettering gjort sådan, at alle øer dispergeret i en blanding af enkelt-celler og små klynger af to eller tre celler. Over- og under-fordøjelse af øer før udpladning forstyrre eksperimentel ydeevne. Frisk pletterede ø-celler bør være ca. 50% sammenflydende før spredning og lodes binde over 48 timer uden at blive forstyrret. Figur 1 viser udseendet af succesfulde ø-cellekulturer på forskellige tidspunkter efter udpladning. For det femte er medierne ændringer for ø-cellekulturer udføres omhyggeligt for at undgå forstyrrelser af svagt klæbende celler. For det sjette skal antigen-genvinding gøres forsigtigt for at undgå vridning af multi-brønds plade, men tilstrækkeligt til at muliggøre en vellykket Ki-67-farvning som er følsom for både under- og overeksponering for temperaturforøgelse; bøjede plader kan ikke bruges tilautomatiseret erhvervelse billede. Bemærk, overdreven bugspytkirtel fordøjelse, udsættelse for eksokrine væv snavs og / eller trypsinisering er almindelige årsager til fiasko ø-cellekultur.

En begrænsning af denne protokol er tillid til specifikke udtryk markører for β-celle identitet og replikation begivenheder. Anvendelse af enkelte markører har potentiale til at være misvisende. For eksempel er PDX-1 udtrykt af p-celler, en delmængde af somatostatin-udtrykkende A-celler og β-celle progenitorer 29,30; Derfor kan forbindelser, der forøger PDX-1-cellereplikation være specielt virker på et ikke-β-celle population. Følgelig bekræftende undersøgelser, der anvender alternative β-cellemarkører er nødvendige. Tilsvarende Ki-67-ekspression er ikke en perfekt markør for replikation og yderligere indikatorer såsom BrdU og phospho-histon 3 skal anvendes 31. En anden begrænsning for denne test er, at stoffer, som inducerer β-cellereplikation kan simultanegere øge β-celle apoptose eller de-differentiering. Derfor er det vigtigt at evaluere, om en forbindelse inducerer en absolut stigning i β-celleantal og / eller inducerer β-celle apoptose og hvorvidt forbindelsesbehandlede P-celler bevarer normal funktion (glukose-stimuleret insulinsekretion) 32. En tredje begrænsning for denne test er den beskedne gennemløb forbundet med anvendelsen af ​​primære ø-celler; øer fra seks rotter genererer 228 eksperimentelle brønde, som tillader ~ 55 forbindelser, der skal screenes i fire eksemplarer (plus positive og negative kontroller). En yderligere begrænsning af den beskrevne β-cellereplikation screening platform er brugen af ​​rotteøer snarere end humane øer. Forskelle mellem humane og rotte holme er tilstrækkelige til at kræve, at alle replikation-fremmende forbindelser identificeret ved hjælp af rotte ø kulturer bekræftes ved hjælp af humane ø-kulturer. Men i betragtning af den begrænsede tilgængelighed, og høje omkostninger ved humane øer, primær screening med humant islets er upraktisk for de fleste forskere.

De primære fordele ved denne protokol er: 1) brug af frisk isolerede primære holme at opretholde normale vækst begrænsninger i videst muligt omfang, 2) anvendelsen af ​​en 384-brønds format for at tillade moderat throughput screening (typisk holme isoleret fra seks rotter er tilstrækkelige til 228 brønde) og 3) anvendelse af automatiseret indsamling og analyse billede for at øge tempoet i eksperimenter og begrænse bias. Derimod stole almindeligt anvendte alternative tilgange på manuel erhvervelse image og subjektiv vurdering af β-celle replikation begivenheder eller hel ø inkorporering af radioaktivt thymidin, som ikke diskriminerer mellem celle-linages, f.eks fibroblast versus β-celle replikation 15,17. Derfor er den præsenterede protokol udgør et vigtigt og forbedret værktøj til undersøgelse af vækst-regulering af P-celler.

Vi forestiller en række tilpassetbruger til denne screening platform. For det første kan en absolut stigning i β-celle nummer måles ved at tælle antallet af PDX-1 + - eller insulin + -celler. At tage højde for variation i antallet af celler udpladet pr godt et højere antal replikater for hver betingelse kan være indbefattet (typisk n = 8). For det andet kan platformen være tilpasset til lentivirus-baserede overekspression eller knock-out / ned eksperimenter for at identificere veje involveret i β-cellereplikation. Sammenfattende den beskrevne eksperimentelle teknik er bredt anvendelig til identifikation af forbindelser, og de molekylære veje, der regulerer β-cellereplikation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
250 g male Male Sprague Dawly Rat Charles River Stain # 400
12 cm teeth tisuue forceps Fine Science Tools 11021-12
11.5 cm fine scissors Fine Science Tools 14058-11
14.5 cm surgical scissors Fine Science Tools 14001-14
16 cm curved forceps Fine Science Tools 11003-16
12 cm curved hepostat Fine Science Tools 13011-12
12 cm scalpel handle Fine Science Tools 10003-12
Tissue sieve-30 mesh Bellco Glass 1985-85000
Cizyme RI, 375,000 CDA units VitaCyte 005-1030
Hanks' Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++) Gibco 24020-117
Ketamine HCl (200 mg/20 ml) JHP Pharmaceuticals NDC# 42023-113-10 to make anesthetic cocktail 
Xylazine (5 g/50 ml) LLOYD NADA# 139-236 to make anesthetic cocktail 
Histopaque 1077 Sigma H-1077 to make histopaque 1100
Histopaque 1119 Sigma H-1119 to make histopaque 1100
Newborn Calf Serum 500 ml Hyclone SH30118.03
Hanks' Balanced Salt solution Hyclone SH30268.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose  Hyclone SH30021.01
Functionality/Viability Solution  Mediatech 99-768-CV
RPMI1640 media  Hyclone SH30096.01 to make conditioned medium
804G rat bladder carcinoma cell-line Available upon request to make conditioned medium
Fetal Bovine Serum, Qualified Gibco 26160
GlutaMax-I Gibco 35050-061
Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml)  MP Biomedicals 1670049
Formamide 500 ml Fisher BioReagents BP227-500
Antigen Unmasking Solution 250 ml (pH 6.0) Vector Laboratories H-3300 to make 0.15 M Sodium Sitrate solution
Dextrose, Anhydrous EMD Chemicals DX0145-1 to make 1 M glucose solution
Nomal Donkey Serum (Powder) Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Triton X-100 Sigma T8787-100ML
Mouse anti-human Ki67 antibody BD Biosciences 556003
Goat anti-human PDX-1 antibody R&D Systems AF2419
Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody Dako 2016-08
Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody Dako 2014-06
Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody Dako 2011-08
Polyclonal chicken anti-vimentin antibody abcam ab24525
Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch 715-065-150
StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated  Invitrogen S32354
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG  Jackson ImmunoResearch 705-025-147
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG  Jackson ImmunoResearch 706-025-148
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-025-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG  Jackson ImmunoResearch 706-175-148
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG Jackson ImmunoResearch 705-175-147
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-175-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG Jackson ImmunoResearch 703-175-155
DAPI Millipore S7113
Disposable Reagent Reservoir 25 ml Sorenson BioScience 39900
384 well, black/clear, tissue culture treated plate BD Falcon 353962
96 well, black/clear, tissue culture treated plate Costar 3603
Multi-channel pipettor Costar 4880
12-channel vaccume aspirator Drummond 3-000-096
Cell Scraper Falcon 353085
Isotemp Water Bath Model 2223  Fisher Scientific
High-content screening instrument: ArrayScan VTI Thermo Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52, (1), 102-110 (2003).
  2. Kloppel, G., Lohr, M., Habich, K., Oberholzer, M., Heitz, P. U. Islet pathology and the pathogenesis of type 1 and type 2 diabetes mellitus revisited. Surv Synth Pathol Res. 4, (2), 110-125 (1985).
  3. Harlan, D. M., Kenyon, N. S., Korsgren, O., Roep, B. O. Current advances and travails in islet transplantation. Diabetes. 58, (10), 2175-2184 (2009).
  4. Nath, D. S., et al. Outcomes of pancreas transplants for patients with type 2 diabetes mellitus. Clin Transplant. 19, (6), 792-797 (2005).
  5. Nichols, R. J., New, C., Annes, J. P. Adult tissue sources for new beta cells. Transl Res. 163, (4), 418-431 (2014).
  6. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159, (2), 428-439 (2014).
  7. Kushner, J. A., MacDonald, P. E., Atkinson, M. A. Stem cells to insulin secreting cells: two steps forward and now a time to pause. Cell Stem Cell. 15, (5), 535-536 (2014).
  8. Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429, (6987), 41-46 (2004).
  9. Meier, J. J., et al. Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans. Diabetes. 57, (6), 1584-1594 (2008).
  10. Chick, W. L., Lauris, V., Flewelling, J. H., Andrews, K. A., Woodruff, J. M. Effects of glucose on beta cells in pancreatic monolayer cultures. Endocrinology. 92, (1), 212-218 (1973).
  11. Brelje, T. C., Sorenson, R. L. Role of prolactin versus growth hormone on islet B-cell proliferation in vitro: implications for pregnancy. Endocrinology. 128, (1), 45-57 (1991).
  12. Chen, H., et al. PDGF signalling controls age-dependent proliferation in pancreatic beta-cells. Nature. 478, (7369), 349-355 (2011).
  13. Liu, H., et al. Glycogen synthase kinase-3 and mammalian target of rapamycin pathways contribute to DNA synthesis, cell cycle progression, and proliferation in human islets. Diabetes. 58, (3), 663-672 (2009).
  14. Metukuri, M. R., et al. ChREBP mediates glucose-stimulated pancreatic beta-cell proliferation. Diabetes. 61, (8), 2004-2015 (2012).
  15. Wang, P., et al. A high-throughput chemical screen reveals that harmine-mediated inhibition of DYRK1A increases human pancreatic beta cell replication. Nat Med. 21, (4), 383-388 (2015).
  16. Schisler, J. C., et al. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol Cell Biol. 28, (10), 3465-3476 (2008).
  17. Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing replication and beta cell function in adenovirally-transduced isolated rodent islets. J Vis Exp. (64), (2012).
  18. Walpita, D., et al. A human islet cell culture system for high-throughput screening. J Biomol Screen. 17, (4), 509-518 (2012).
  19. Miyazaki, J., et al. Establishment of a pancreatic beta cell line that retains glucose-inducible insulin secretion: special reference to expression of glucose transporter isoforms. Endocrinology. 127, (1), 126-132 (1990).
  20. Song, W. J., et al. Phosphorylation and inactivation of glycogen synthase kinase 3beta (GSK3beta) by dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 1A (Dyrk1A). J Biol Chem. 290, (4), 2321-2333 (2015).
  21. Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49, (3), 424-430 (2000).
  22. Cozar-Castellano, I., et al. Lessons from the first comprehensive molecular characterization of cell cycle control in rodent insulinoma cell lines. Diabetes. 57, (11), 3056-3068 (2008).
  23. Efrat, S., Fusco-DeMane, D., Lemberg, H., aL Emran, O., Wang, X. Conditional transformation of a pancreatic beta-cell line derived from transgenic mice expressing a tetracycline-regulated oncogene. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (8), 3576-3580 (1995).
  24. Wang, W., et al. Identification of small-molecule inducers of pancreatic beta-cell expansion. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (5), 1427-1432 (2009).
  25. Annes, J. P., et al. Adenosine kinase inhibition selectively promotes rodent and porcine islet beta-cell replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (10), 3915-3920 (2012).
  26. Zhao, Z., et al. Repurposing cAMP-modulating medications to promote beta-cell replication. Mol Endocrinol. 28, (10), 1682-1697 (2014).
  27. Chen, C. A., Carolan, P. J., Annes, J. P. In vivo screening for secreted proteins that modulate glucose handling identifies interleukin-6 family members as potent hypoglycemic agents. PLoS One. 7, (9), e44600 (2012).
  28. Izumi, K., Hirao, Y., Hopp, L., Oyasu, R. In vitro induction of ornithine decarboxylase in urinary bladder carcinoma cells. Cancer Res. 41, (2), 405-409 (1981).
  29. Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochem J. 310, (Pt 3) 997-1003 (1995).
  30. Szabat, M., Luciani, D. S., Piret, J. M., Johnson, J. D. Maturation of adult beta-cells revealed using a Pdx1/insulin dual-reporter lentivirus. Endocrinology. 150, (4), 1627-1635 (2009).
  31. Rieck, S., et al. Overexpression of hepatocyte nuclear factor-4alpha initiates cell cycle entry, but is not sufficient to promote beta-cell expansion in human islets. Mol Endocrinol. 26, (9), 1590-1602 (2012).
  32. Wang, P., et al. Diabetes mellitus--advances and challenges in human beta-cell proliferation. Nat Rev Endocrinol. 11, (4), 201-212 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics