कांच की सतह functionalization के माध्यम से लक्षित सेल अलगाव की एक विधि

1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Liberal Arts & Sciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Biomedical Engineering, Illinois Institute of Technology
Cancer Research

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Ansari, A., Patel, R., Schultheis, K., Naumovski, V., Imoukhuede, P. I. A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization. J. Vis. Exp. (115), e54315, doi:10.3791/54315 (2016).

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Abstract

Introduction

वर्तमान पीठ टॉप सेल जुदाई दृष्टिकोण (जैसे, प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई 1, लेजर कब्जा सूक्ष्म विच्छेदन 2, इम्युनो-चुंबकीय मनका जुदाई 1) तैयार करने और छँटाई के कई घंटे लग सकते हैं। ये बड़े समय तराजू शारीरिक प्रतिक्रिया और अभिव्यक्ति के स्तर को प्रभावित कर सकते हैं, विश्लेषण करती है कि शारीरिक प्रतिक्रिया 3 के प्रतिनिधि नहीं हैं, जिसके परिणामस्वरूप। सिस्टम है कि तेजी से और कुशलता से सेल अलगाव और जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए संवर्धन में सुधार करने के क्रम में सेल सतह रिसेप्टर स्तरों में बाधा पहुँचा के बिना विशेष प्रकार की कोशिकाओं को अलग कर सकते हैं की जरूरत है। इसलिए, हमारे दृष्टिकोण के लिए तर्क सेल अलगाव के लिए एक सौम्य दृष्टिकोण विकसित करना है।

"एक चिप पर प्रयोगशाला 'की अवधारणा परिमाण तेज (घंटे के लिए मिनट) सेल अलगाव के आदेश का वादा करता है, और सबसे अधिक बार एक सतह पर कोशिकाओं पर कब्जा करने और कोशिकाओं या intracellular Conte को रिहा करना शामिलशारीरिक 4,5 के माध्यम से एनटीएस या रासायनिक विधियों 6। हालांकि इन तरीकों ऐसे प्रोटीन 7.8 अभिव्यक्ति की पहचान, आरएनए अभिव्यक्ति 9-11, की पहचान करने या यहां तक कि इन विट्रो संस्कृति 12,13 के लिए कोशिकाओं प्रदान करने के रूप में कुछ लाभ प्रदान करते हैं, इन तकनीकों के कई तरह के सेल रिसेप्टर की रूपरेखा कारण के रूप में निदान करने के लिए अनुवाद नहीं किया जा सकता उनकी गैर शारीरिक वातावरण के लिए। ऐसे collagenases भी इन रिसेप्टर मात्रा 14,15 प्रभावित कर सकते हैं, जिसका अर्थ है सेल रिसेप्टर मात्रा का ठहराव तकनीक है कि इन एजेंटों का उपयोग उठाने सटीक शारीरिक डेटा उत्पन्न नहीं होगा के रूप में एंजाइमी उठाने एजेंटों। सेलुलर सेल मूल निवासी सतह रिसेप्टर्स के बीच भेदभाव को रोकता है, और उन लोगों के जो पहले 16 भाँति थे। इस प्रोटोकॉल सेल अलगाव के लिए एक तेजी से और कोमल दृष्टिकोण का वर्णन है।

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Protocol

1. ग्लास की सतह की सफाई और तैयारी अभिकर्मकों

  1. 50% बिजली इसे साफ करने के लिए 5 मिनट के लिए एक ऑक्सीजन प्लाज्मा मशीन में एक कांच की सतह पर रखें।
  2. एक शंक्वाकार ट्यूब में इथेनॉल के 2.45 मिलीलीटर 50 APTES के μl और जोड़कर, 2.5 मिलीलीटर 2% का पुनर्गठन (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES) समाधान तैयार है।

2. APTES और डीएसबी functionalization

  1. सतहों के लिए APTES समाधान जोड़ें। पिपेट 150 8 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए अच्छी तरह से प्रति μl। पिपेट 100 24 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए अच्छी तरह से प्रति μl। 60 x 15 मिमी कांच के बर्तन के लिए 1.1 मिलीलीटर पिपेट। सतहों वाष्पीकरण और APTES समाधान के असमान वितरण को रोकने के लिए कवर। कमरे के तापमान पर 50 मिनट, जो APTES परत का एक भी वितरण बनाता है के लिए एक मंच पर एक प्रकार के बरतन सतहों रखें।
    नोट: APTES एक aminosilane कि सतह की पहली परत रूपों है। एक अलग सतह का उपयोग करते हैं, तो heuristically सतह को कवर करने के लिए जरूरी समाधान की मात्रा का निर्धारण।
  2. 8 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए 2 घंटा और 24 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए 55 डिग्री सेल्सियस के लिए हीट: ओवन के लिए तापमान का चयन करते हुए सतहों प्रकार के बरतन पर हैं। गर्मी गिलास केवल 1 घंटे के लिए 90 डिग्री सेल्सियस के लिए व्यंजन।
  3. इथेनॉल के साथ सतहों कुल्ला।
    1. इस्तेमाल किया सतह पर आधारित संदर्भित द्वारा आवश्यक इथेनॉल की राशि प्रशासन। 8 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 150 μl इथेनॉल जोड़ें। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 24 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए 125 μl इथेनॉल जोड़ें। कांच के बर्तन के लिए 1.1 मिलीलीटर इथेनॉल जोड़ें।
    2. निर्वहन और इस तरह के कोने के रूप में एक निश्चित बिंदु से तरल ड्राइंग द्वारा सतह कुल्ला। लगभग एक 70 डिग्री के कोण पिपेट पकड़ो तो टिप सीधे सतह में नहीं बताया है। दो बार अधिक इथेनॉल का उपयोग कुल्ला।
      नोट: गिलास नीचे अच्छी तरह से प्लेटों के किसी भी उन में किसी भी प्लास्टिक है, तो, ऊपर 65 डिग्री सेल्सियस उन्हें गर्मी नहीं है के रूप में प्लास्टिक पिघल और ताना करने के लिए शुरू हो जाएगा।
  4. 100% नाइट्रोजन गैस के एक टैंक से तिरस्कृत के साथ सूखी। ओ में सतहों की जगहवेंचर।
  5. 2462.5 में डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) की 37.5 μl में 1.5 मिलीग्राम / एमएल डीएसबी के संयोजन के द्वारा डी-desthiobiotin (डीएसबी) समाधान के 2.5 मिलीलीटर की तैयारी, और 5 मिलीग्राम / एमएल 1-इथाइल-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (ईडीसी) 0.1 एम 4-morpholinoethanesulfonic एसिड हाइड्रेट (एमईएस) (पीएच 6) बफर के μl। तब दोनों के समाधान गठबंधन।
  6. 2-β mercaptoethanol के 1 μl, डीएसबी और ईडीसी के बीच प्रतिक्रिया बुझाने के समाधान में, 15 मिनट के बाद जोड़ें। गर्म APTES ओवन से गिलास सतहों क्रियाशील निकालें। कांच सतहों शांत करने के लिए 5-10 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  7. एमईएस सतह बफर कुल्ला करने के लिए, सतह पर आधारित मात्रा का उपयोग जोड़ें। 150 μl एमईएस 8 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए बफर जोड़ें। 125 μl एमईएस 24 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए बफर जोड़ें। कांच के बर्तन के लिए 1.1 मिलीलीटर एमईएस बफर जोड़ें।
  8. निर्वहन और इस तरह के कोने के रूप में एक निश्चित बिंदु से तरल ड्राइंग द्वारा सतह कुल्ला। पिपेट लगभग एक 70 डिग्री के कोण पकड़ो तो टिप सीधे इशारा नहीं कर रहा हैसतह में। दो बार एमईएस बफर के साथ और अधिक कुल्ला।
  9. सतहों के लिए डीएसबी समाधान लागू उन्हें सेते करने की अनुमति। 8 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए अच्छी तरह से प्रति 150 μl डीएसबी समाधान जोड़ें। 24 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए अच्छी तरह से प्रति 100 μl डीएसबी समाधान जोड़ें। कांच के बर्तन डीएसबी समाधान के लिए 1.1 मिलीलीटर जोड़ें।
  10. एक पेट्री डिश के अंदर एक नम कागज तौलिया पर रखें डीएसबी कवर गिलास सतहों। कवर और 18-24 घंटे के लिए एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में सेते हैं।

3. Streptavidin functionalization

  1. प्रत्येक कांच की सतह 1.0x फॉस्फेट खारा बफर (पीबीएस) के 1 मिलीलीटर के साथ तीन बार कुल्ला। निर्वहन और इस तरह के कोने के रूप में एक निश्चित बिंदु से तरल ड्राइंग द्वारा सतह कुल्ला। लगभग एक 70 डिग्री के कोण पिपेट पकड़ो तो टिप सीधे सतह में नहीं बताया है। 0.4 मिलीग्राम streptavidin (बचत) शेयर समाधान पतला / एमएल (अनुशंसित)।
    नोट: पीबीएस isotonic तो यह कमजोर पड़ने और rinsing के लिए एक माध्यम के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। पीबीएस एसए के लिए एक विलायक के रूप में प्रयोग किया जाता हैवी, और इसलिए, सतह के लिए बाध्य करने के लिए बचत की क्षमता को प्रभावित नहीं करेगा।
  2. सतहों के लिए समान रूप से बचत समाधान के 0.4 मिलीग्राम / एमएल लागू करें ताकि कांच के नीचे रूपों की एक पतली परत, सतह के आधार पर समाधान की राशि का चयन करें। 8 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए, अच्छी तरह से प्रति 150 μl 0.4 मिलीग्राम / एमएल बचत समाधान जोड़ें। 24 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए, अच्छी तरह से प्रति 100 μl 0.4 मिलीग्राम / एमएल बचत समाधान जोड़ें। कांच के बर्तन के लिए, 1.1 मिलीग्राम 0.4 मिलीग्राम / एमएल बचत समाधान जोड़ें।
  3. कवर और एक 14 सेमी पेट्री डिश के लिए प्लेटों के लिए कदम नमी बनाए रखने के लिए। 18-24 घंटे के लिए फ्रिज में पेट्री डिश सेते हैं।
    नोट: यह प्रत्येक सतह पर APTES, डीएसबी, और बचत के अनुरूप मात्रा में उपयोग करने के लिए आवश्यक है।
  4. प्रत्येक कांच की सतह पीबीएस के 150 μl के साथ तीन बार कुल्ला बचत हटा दें। निर्वहन और इस तरह के कोने के रूप में एक निश्चित बिंदु से तरल ड्राइंग द्वारा सतह कुल्ला। लगभग एक 70 डिग्री के कोण पिपेट पकड़ो तो टिप सीधे सतह में नहीं बताया है।
  5. एक कागज तौलिया w गीलेith de-ionized पानी और कागज तौलिया 14 सेमी पेट्री प्लेटों के आसपास के कुओं में नमी बनाए रखने के लिए पकवान में फ्लैट जगह है। कुओं युक्त पेट्री डिश को कवर किया। एक 4 डिग्री सेल्सियस जैव सुरक्षा स्तर 1 (बीएसएल 1) फ्रिज में पेट्री डिश सेते हैं जब तक की जरूरत है।

4. सेल पर कब्जा और रिलीज

  1. प्रयोग के लिए इरादा कोशिकाओं के T175 कुप्पी (एस) के साथ शुरू करो। कुप्पी (एस) से मीडिया aspirate। कमरे के तापमान पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ शेष मीडिया बाहर धो लें। कुप्पी (एस) से महाप्राण पीबीएस।
  2. कोशिकाओं की टी-175 फ्लास्क, इस तरह के सेल हदबंदी समाधान के रूप में गैर एंजाइमी उठाने एजेंट के 10 मिलीलीटर, जोड़ें। 6 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में कुप्पी रखो कुप्पी से कोशिकाओं के उठाने के लिए अनुमति देने के लिए।
  3. 6 मिनट के बाद, ठंड हांक बैलेंस्ड नमक समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ने (HbSS, सामग्री की सूची देखें) उठाने एजेंट निष्क्रिय करने के लिए। एक hemacytometer का उपयोग कर समाधान में कोशिकाओं की संख्या गिनने के लिए कोशिकाओं के 20 μl बाहर ले जाओ।
    नोट: समारोह पर निर्भर करता हैtionalized कब्जा प्रयोग में इस्तेमाल सतहों, जरूरत कोशिकाओं की संख्या में बदलता है। क्रियाशील 8 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए, अच्छी तरह से प्रति 300,000 कोशिकाओं का उपयोग करें। क्रियाशील कांच के बर्तन के लिए, 11 लाख की कोशिकाओं का उपयोग करें। क्रियाशील 24 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए, 125,000 कोशिकाओं सिफारिश कर रहे हैं। सेल गिनती के बारे में अधिक जानकारी के अनुपूरक में पाया जाता है।
  4. कोशिकाओं का एक और कुप्पी के लिए चरणों को दोहराएँ 4.1- 4.3, अगर कम कोशिकाओं के प्रयोग के लिए जरूरत से मौजूद हैं। सेल निलंबन और ब्योरा कोशिकाओं गठबंधन समाधान में कोशिकाओं की कुल संख्या पाने के लिए।
  5. नीचे सेल निलंबन 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर एक अपकेंद्रित्र में स्पिन केंद्रित कोशिकाओं का एक गोली पाने के लिए। सेल निलंबन में जोड़ने के लिए मिलीलीटर प्रति 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं के एक एकाग्रता प्राप्त करना है, तो नीचे काता कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला aspirate, और गणना की मात्रा जोड़ने HBSS की उचित मात्रा का पता लगाएं। यह मात्रा अनुपूरक में समीकरण का उपयोग कर की गणना की जा सकती है।
  6. पिपेट ऊपर और नीचे (Triturate) वें resuspend करने के लिएसमाधान में ई कोशिकाओं और समाधान एंटीबॉडी बाध्यकारी कम कर सकते हैं कि में सेलुलर clumping को कम। अलग नियंत्रण और प्रयोगात्मक समाधान में सेलुलर समाधान विभाजित। घटकों और गणना के लिए पूरक फ़ाइल देखें।
  7. संबंधित सेल समाधान पूरक फ़ाइल में वर्णित के रूप में biotinylated एंटीबॉडी जोड़ें। एक छोर से अधिक अंत मिक्सर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    नोट: MCF7GFP कोशिकाओं, 0.5 मिलीग्राम / एमएल hIgG या 0.5 मिलीग्राम / एमएल एचएलए-एबीसी एंटीबॉडी के लिए सिफारिश कर रहे हैं। रॉ मैक्रोफेज के लिए, 1 मिलीग्राम / एमएल mCD11b आधी मात्रा में सिफारिश कर रहे हैं कमजोर पड़ने मतभेद के लिए खाते। मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं (HUVECs), 0.5 मिलीग्राम के लिए / एमएल hCD31 की सिफारिश की है।
  8. HBSS के साथ क्रियाशील कांच की सतह से धो लें। इस प्रयोग के लिए, एक 8 अच्छी तरह से थाली की सलाह दी है।
    1. 8 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 150 μl HBSS जोड़ें। HBSS का उपयोग करते हुए दो बार अधिक कुल्ला। निर्वहन और इस तरह के कोने के रूप में एक निश्चित बिंदु से तरल ड्राइंग द्वारा सतह कुल्ला।लगभग एक 70 डिग्री के कोण पिपेट पकड़ो तो टिप सीधे सतह में नहीं बताया है। 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा रखें।
  9. कुओं के लिए सेल समाधान जोड़ें और कोशिकाओं प्रकार के बरतन पर बर्फ पर सेते करने के लिए 45 मिनट तक प्रतीक्षा करें। अनुपूरक में वर्णित के रूप में गणना की मात्रा का उपयोग करके बाँझ HBSS में बायोटिन के समाधान करें।
  10. HBSS का उपयोग करके कांच कुओं से सेल समाधान निकालें।
    1. धीरे अच्छी तरह से प्रत्येक में 150 μl HBSS पिपेट। फिर HBSS बाहर पिपेट। निर्वहन और इस तरह के कोने के रूप में एक निश्चित बिंदु से तरल ड्राइंग द्वारा सतह कुल्ला। लगभग एक 70 डिग्री के कोण पिपेट पकड़ो तो टिप सीधे सतह में नहीं बताया है।
    2. दो बार दोहराएँ। धोने के बाद, कोशिकाओं को गीला रखने के लिए कुओं के लिए HBSS जोड़ें।
  11. प्रत्येक संबंधित रिहाई अच्छी तरह से करने के लिए 20 मिमी बायोटिन समाधान के 150 μl जोड़ें, और तब प्रतिक्रिया के लिए अनुमति देने के लिए 20 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  12. याद गैर विशेष रूप से बाध्य सेलHBSS के साथ धोने से रों ऊपर कहा गया है, और फिर fluorescently लेबल कोशिकाओं का उपयोग करते हैं, तो छवि कोशिकाओं प्रतिदीप्ति के लिए आगे बढ़ना है। इसके अलावा एक कुप्पी में छवि जीवित कोशिकाओं (एक नियंत्रण के रूप में, अच्छी तरह से कोशिकाओं के साथ तुलना करने के लिए)। हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं का उपयोग करते हैं, तो उत्तेजना 470 एनएम हो जाएगा, और उत्सर्जन 515 एनएम होगा।

5. एंटीबॉडी अनुकूलन: एंटीबॉडी अनुमापन

  1. के रूप में कदम 4.1- 4.3 में विस्तार से बताया T75 या T175 कुप्पी से कोशिकाओं को उठाने के द्वारा शुरू करो।
    नोट: इन संस्करणों 24 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए calibrated हैं, लेकिन अनुमानी परीक्षण के माध्यम से किसी भी कांच क्रियाशील सतहों के अनुरूप बदला जा सकता है। एक प्रतिनिधि एंटीबॉडी अनुमापन चित्र 1 में दिखाया गया है।
  2. hemacytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना, और फिर नीचे सेल समाधान के लिए एक शंक्वाकार ट्यूब में 500 XG पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन। मिलीलीटर प्रति 1 लाख कोशिकाओं के लिए कोशिकाओं Reconstitute, गणना अनुपूरक में वर्णित का उपयोग कर।
  3. 1 मीटर विभाजितएंटीबॉडी (अब) के समाधान के लिए विभिन्न सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 500 μl के छह अलग अलग समाधान में एमएल समाधान प्रति illion कोशिकाओं।
    1. 10 माइक्रोग्राम / एमएल, 1 माइक्रोग्राम / एमएल, 100 एनजी / एमएल, 10 एनजी / एमएल, 1 एनजी / एमएल के लिए एंटीबॉडी शेयर समाधान पतला। दाग बफर (पीबीएस + 1% सोडियम azide + 1% बीएसए) के 100 μl, और इसमें कोई एबी के साथ नियंत्रण के लिए कोशिकाओं के 500 μl का उपयोग करके नियंत्रण बनाएँ। खाली नियंत्रण के लिए (कोई अटल बिहारी और कोई कोशिकाओं), 300 μl पीबीएस के एक समाधान का उपयोग करें।
      ध्यान दें: चेतावनी: सोडियम azide अत्यंत जहरीले विस्फोटक है, और चरम देखभाल जब यह प्रयोग में लिया जाना चाहिए। सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (MSDS) से परामर्श और उचित सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करें।
  4. गठबंधन और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंत से अधिक अंत मिक्सर में सेल के समाधान के साथ Ab समाधान सेते हैं। HBSS तीन बार के साथ क्रियाशील 24 अच्छी तरह प्लेटें कुल्ला। निर्वहन और इस तरह के कोने के रूप में एक निश्चित बिंदु से तरल ड्राइंग द्वारा सतह कुल्ला। गड़बड़ी पकड़ोPette पर लगभग एक 70 डिग्री के कोण इसलिए टिप सीधे सतह में नहीं बताया है।
  5. अशेष 125 उचित APTES में प्रत्येक नमूना समाधान के μl, डीएसबी, और बचत में अच्छी तरह से क्रियाशील। 4 डिग्री सेल्सियस पर या कांच की सतह पर 45 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं। HBSS के साथ सतह कुल्ला तीन बार गैर विशेष रूप से जुड़ी कोशिकाओं को हटाने के लिए। निर्वहन और इस तरह के कोने के रूप में एक निश्चित बिंदु से तरल ड्राइंग द्वारा सतह कुल्ला। लगभग एक 70 डिग्री के कोण पिपेट पकड़ो तो टिप सीधे सतह में नहीं बताया है। नीचे पंक्ति कुल्ला नहीं है, उन के रूप में नियंत्रण कर रहे हैं।
  6. अच्छी तरह से धोया प्रत्येक के लिए HBSS के 150 μl जोड़ें, बर्फ पर 24 अच्छी तरह प्लेटें डाल दिया, और फिर GFP कोशिकाओं (उत्तेजना 485 एनएम / उत्सर्जन 528 एनएम) के प्रतिदीप्ति मापने के लिए एक प्लेट रीडर का उपयोग करें।

6. सेल अनुकूलन: सेल अनुमापन

  1. के रूप में कदम 4.1 -4.3 में उल्लेख कोशिकाओं लिफ्ट।
  2. एक hemacytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना। नीचे सेल इसलिए स्पिन4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर शंक्वाकार ट्यूब में lution। मिलीलीटर प्रति 1 लाख कोशिकाओं के लिए कोशिकाओं Reconstitute।
    नोट: hemacytometer के उपयोग पर अधिक जानकारी के अनुपूरक में पाया जा सकता है।
  3. पिपेट एक शंक्वाकार ट्यूब में 1.6 मिलियन कोशिकाओं शेयर और जगह के लिए सेल के समाधान से 1.6 मिलीलीटर। एक शंक्वाकार ट्यूब में 800,000 कोशिकाओं शेयर और जगह के लिए सेल के समाधान से कोशिकाओं के 800 μl पिपेट। पिपेट 80,000 कोशिकाओं शेयर और एक शंक्वाकार ट्यूब में जगह के लिए सेल स्टॉक से 80 μl। पिपेट एक शंक्वाकार ट्यूब में 8,000 कोशिकाओं शेयर और जगह के लिए सेल स्टॉक से 8 μl।
    नोट: सांद्रता प्रति 8 अच्छी तरह से थाली माप दिया जाता है, को दोहराने के रूप में की जरूरत है। प्लेट उत्पादन का एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है।
  4. चार स्टॉक समाधान ले लो और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर एक अपकेंद्रित्र में स्पिन। HBSS के 400 μl में सभी शेयर समाधान फिर से निलंबित।
  5. 1.6 मिलियन सेल के शेयर के लिए 100 एनजी / एमएल एंटीबॉडी के 1.6 μl जोड़ें, 0.8 μ800,000 सेल शेयर करने के लिए एल, और अन्य सभी कंपनियों के शेयरों को 0.5 μl। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए अंत से अधिक अंत मिक्सर में 30 मिनट के लिए एंटीबॉडी सेते हैं। HBSS तीन बार के साथ क्रियाशील कांच की सतह से धो लें।
    नोट: क्रियाशील 8 अच्छी तरह से थाली, माइक्रोस्कोपी मात्रा का ठहराव के लिए सिफारिश की है, जबकि क्रियाशील 24 अच्छी तरह से थाली प्लेट पाठक मात्रा का ठहराव के लिए सिफारिश की है। 8000 सेल के शेयर के लिए एंटीबॉडी एकाग्रता कब्जा सतह के सीमित कारक अनुमति देने के लिए समाधान में एंटीबॉडी की कमी नहीं होने की कम नहीं था, बल्कि सतह का कब्जा गुण।
  6. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए नमूना समाधान के 150 μl लागू करें। बाईं तरफ के कुओं के पहले स्तंभ के लिए 1.6 लाख सेल के शेयर को लागू करें। बाएं से दूसरे स्तंभ के लिए 800,000 सेल के शेयर को लागू करें। बाएं से तीसरे स्तंभ के लिए 80,000 सेल के शेयर को लागू करें। अंत में पिछले स्तंभ के लिए 8,000 सेल शेयर लागू होते हैं। प्रकार के बरतन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए सेते हैं।
    नोट: 1.6 मिलियनसेल के शेयर सर्वोच्च एकाग्रता का परीक्षण किया जा करने के रूप में कार्य करता है, और उस (अच्छी तरह से प्रति 600,000 कोशिकाओं) सेल जुदाई प्रयोगों में आम तौर पर प्रयोग किया जाता है के रूप में यह ठेठ सेलुलर एकाग्रता है 800,000 सेल शेयर प्रयोग के लिए नियंत्रण के रूप में कार्य करता है कोशिकाओं की मात्रा दोगुनी है कि (अच्छी तरह से प्रति 3,000,000 कोशिकाओं) सेल जुदाई प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाता है। 80,000 सेल के शेयर एक दस गुना कमजोर पड़ने सेलुलर को पकड़ने के लिए कम सांद्रता (अच्छी तरह से प्रति 30,000 कोशिकाओं) के लिए परीक्षण करने के लिए के रूप में कार्य करता है। के रूप में एक सौ गुना कमजोर पड़ने (अच्छी तरह से प्रति 3,000 कोशिकाओं) सेलुलर जुदाई की निचली सीमा की जांच के लिए एक परीक्षण के रूप में उपयोग करने के लिए 8,000 सेल के शेयर में कार्य करता है।
  7. HBSS तीन बार से कुल्ला। निर्वहन और इस तरह के कोने के रूप में एक निश्चित बिंदु से तरल ड्राइंग द्वारा सतह कुल्ला। लगभग एक 70 डिग्री के कोण पिपेट पकड़ो तो टिप सीधे सतह में नहीं बताया है। सभी washes लीजिए।
  8. छवि एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर कोशिकाओं, 8 अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग करते हैं, तो प्रत्येक की तस्वीरें लेने के लिए सुरचेहरे, और 150 μl बायोटिन प्रत्येक सतह के लिए एक घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रकार के बरतन पर लागू होते हैं। एक घंटे के बाद, पहले के रूप में HBSS 3 बार के साथ बायोटिन रिलीज कुओं कुल्ला। hemocytometer और छवि रिलीज कुओं के साथ गिनती के लिए कुओं से सभी washes लीजिए।
  9. , 1 घंटे के लिए बायोटिन रिलीज कुओं उपयुक्त करने के लिए यदि 24 अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग कर, और फिर HBSS के साथ उन कुओं 3 बार कुल्ला 20 मिमी अतिरिक्त बायोटिन समाधान के 150 μl लागू करें। 24 अच्छी तरह से एक प्लेट रीडर का उपयोग प्लेटों quantitate। सभी एकत्र अच्छी तरह से washes से कोशिकाओं की गिनती करने के लिए एक hemacytometer का प्रयोग करें।

7. छवि विश्लेषण

नोट: फिजी सॉफ्टवेयर पैकेज (http://fiji.sc/Fiji) छवि विश्लेषण के लिए सिफारिश की है। प्रारंभ में, छवियों स्केल छवि में परिवर्तित किया गया है, और फिर चमक / विपरीत कोशिकाओं को बाहर लाने के लिए बदल गया था।

  1. छवि को लोड, और फिर छवि टैब पर क्लिक करके "प्रकार" के लिए नीचे स्क्रॉल और फिर क्लिक करके स्केल कन्वर्ट करने के लिए4, 8 बिट "।
  2. छवि टैब पर क्लिक करें और फिर "समायोजित" स्क्रॉल करके छवि के विपरीत बढ़ाएँ। "चमक और विपरीत" पर क्लिक करें और फिर कोशिकाओं को बाहर खड़ा करने के लिए स्क्रॉल पट्टियों का उपयोग करें। प्रतिदीप्ति छवियों का उपयोग करते हैं, कोशिकाओं को और अधिक परिभाषित करने के लिए छवियों को पलटना।
  3. एक प्लगइन लोड पर ImageJ ITCN बुलाया (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) छवियों का विश्लेषण करने के लिए।
  4. ITCN खोलें। एक संवाद बॉक्स प्रकट होता है कि सेल के आकार का अनुमान करने के लिए कई मानकों के साथ उपयोगकर्ता का संकेत देता है, पहले ब्याज की सेल की न्यूनतम चौड़ाई निर्धारित किया है। "पता लगाने डार्क चोटियों" विकल्प पर क्लिक करें अगर छवि फ्लोरोसेंट है और कोशिकाओं अन्धेरा कर रहे हैं।
  5. शुरू में 2 पर सीमा मूल्य निर्धारित करें, और उसके बाद "गणना" बटन मारा। तस्वीर का एक नव गिना संस्करण का वर्णन जहां कोशिकाओं को गिना दिया है लाल डॉट्स के साथ दिखाई देंगे।
  6. परिभाषा के द्वारा और अधिक सटीक सेलुलर डेटा प्राप्त करने के लिए सीमा और चौड़ाई पैरामीटर समायोजित करेंएक "सेल" के आकार एनजी। नोट: गिना सही पर एक संवाद बॉक्स में होगा कोशिकाओं की संख्या। बदलने के मापदंडों में गिना कोशिकाओं के विभिन्न नंबर दे देंगे।
  7. सीमा और चौड़ाई मानकों के माध्यम से पुनरावृति करने के लिए जब तक एक अच्छा अनुमान कोशिकाओं की संख्या के लिए पहुँच जाता है जारी रखें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल हम सेल पर कब्जा (चित्रा 3 ए) और MCF7GFP कोशिकाओं की कोशिका रिहाई (चित्रा -3 सी) के साथ ही जीना सेल नियंत्रण (चित्रा 4) दिखाने का उपयोग करना। हम सेल पर कब्जा मात्रा निर्धारित के रूप में 60% और 80% जारी किए गए थे (चित्रा 3 सी)। जब हम रॉ 264.7 मैक्रोफेज और MCF7GFP कोशिकाओं का एक मिश्रण के लिए इस दृष्टिकोण बढ़ाया, रॉ मैक्रोफेज के 50% पर कब्जा कर लिया गया था (छवि। 3 डी) और रॉ मैक्रोफेज का 80% 20 मिमी बायोटिन (चित्रा 3 बी) के साथ रिलीज किया गया। चूंकि अतिरिक्त एंटीबॉडी सेल पर कब्जा कम कर सकते हैं, हम एचएलए एंटीबॉडी के 0-10,000 एनएम titrating के माध्यम से अनुकूलित किया है, और पालन कि आदर्श एंटीबॉडी एकाग्रता 100-1,000 मिमी एंटीबॉडी (छवि। 1) के बीच है। इसी तरह, हम यह निर्धारित करता है कि कब्जा किया जा सकता कोशिकाओं के आदर्श एकाग्रता 1 एक्स 10 5 और 1 एक्स 10 6 है, कोशिकाओं की संख्या से नीचे के बाद से, मूल्यों पृष्ठभूमि 17 की तुलना में कम कर रहे हैं(चित्रा 2)। प्रत्येक अच्छी तरह से प्रतिदीप्ति डेटा के रूप में नीचे वर्णित कार्रवाई की है।

1 समीकरण

इधर, 3 प्रतिकृति की औसत संख्या एंटीबॉडी (खाली) के साथ एक नमूना से लिया जाता है और प्रतिदीप्ति प्रत्येक नमूने से प्राप्त से घटाया जाता है। यह मान तो औसत अधिकतम प्रतिदीप्ति सामान्यीकृत है। इस प्रसंस्करण शोधकर्ता स्पष्ट रूप से सेलुलर का पता लगाने के कम सीमा का पालन करने की अनुमति देता है।

आकृति 1
चित्रा 1. सामान्यीकृत खाली एंटीबॉडी अनुमापन। मानव एचएलए-एबीसी MCF7GFP कोशिकाओं की एक निरंतर मात्रा (अच्छी तरह से प्रति 125,000 कोशिकाओं) और कब्जा कर लिया कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति भर titrated एक प्लेट रीडर का उपयोग मात्रा निर्धारित किया गया है। पूर्वक्रियाशील सतह के लिए प्रदर्शन करने के लिए, कोशिकाओं और एंटीबॉडी गैर विशिष्ट एंटीबॉडी लगाव को दूर करने के centrifuged थे। इस centrifugation के बिना, अतिरिक्त एंटीबॉडी सतह तर और के रूप में 10,000 एनजी / एमएल जहां centrifugation सतह के एंटीबॉडी oversaturation कम कोशिकाओं की सतह के लिए बाध्य है, जिसके परिणामस्वरूप को रोकने के लिए पर्याप्त नहीं थी की सांद्रता के साथ दिखाया गया है, सेल अधोगामी पाएगा। ग्रे लाइन नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करता है। त्रुटि सलाखों मतलब की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. सामान्यीकृत खाली सेल अनुमापन। एंटीबॉडी अनुमापन से अनुकूलित एंटीबॉडी एकाग्रता का प्रयोग, MCF7GFP कोशिकाओं अनुकूलित एकाग्रता जबकि Ke कब्जा लगाने के लिए titrated थेक्रियाशील सतह और एंटीबॉडी सांद्रता eping निरंतर। यह विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए सेल पर कब्जा जांचना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। पंक्तियों कोशिकाओं की एकाग्रता बदलने जबकि सेलुलर को पकड़ने के लिए विचार सीमा खोजने के लिए इस आंकड़े में कॉलम, प्रतिकृति हैं। ग्रे लाइन नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करता है, और त्रुटि सलाखों के मतलब की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. कब्जा है और प्रयोगों रिलीज। एक एकल सेल मिश्रण क्रियाशील सतह (ए) के संपर्क में था, एचएलए-एबीसी एंटीबॉडी का उपयोग MCF7GFP कोशिकाओं पर कब्जा। जब HBSS (बी) के साथ धोया, कोशिकाओं पर कब्जा कर लिया बने रहे, लेकिन जब 20 मिमी बायोटिन (सी) का एक समाधान से अवगत कराया, कोशिकाओं rele थेased। MCF7GFP कोशिकाओं और रॉ 264.7 मैक्रोफेज के एक सेलुलर मिश्रण एक क्रियाशील सतह के लिए खुल गए थे और mCD11b एंटीबॉडी (डी) का उपयोग कर कब्जा कर लिया गया। गैर विशिष्ट MCF7GFP कोशिकाओं हरे रंग में चिह्नित कर रहे हैं। जब एक तटस्थ धोने (ई), निकलता है जो कि सतह उन्हें लक्ष्य नहीं था से अवगत कराया MCF7GFP कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति तीव्रता में कमी आई है, और वे गैर विशेष रूप से जुड़ी है। जब एक बायोटिन धोने (एफ) के संपर्क में, लक्षित रॉ मैक्रोफेज सतह से रिहा कर दिया गया। स्केल सलाखों 250 माइक्रोन कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. दोहरी सेल अलगाव के लिए सकारात्मक और नकारात्मक सेल नियंत्रण। सकारात्मक नियंत्रण रॉ मैक्रोफेज ओ imaged हैंna माइक्रोस्कोप प्रतिदीप्ति, कोई फ्लोरोसेंट गतिविधि के रूप में अच्छी तरह से कोशिकाओं के रिश्तेदार नौकरशाही का आकार घटाने दिखा। Brightfield रॉ मैक्रोफेज, सेल आकार (ए) दिखाने GFP उत्तेजना के तहत, वहाँ कोई प्रतिदीप्ति (बी), जो मर्ज किए गए छवि (सी) में दिखाया गया है, जबकि। नकारात्मक नियंत्रण MCF7GFP कोशिकाओं बड़े फ्लोरोसेंट गतिविधि दिखा एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी, साथ ही MCF7GFP 'कोशिकाओं के सापेक्ष आकार पर imaged हैं। प्रकोष्ठों brightfield (डी) पर imaged हैं, नौकरशाही का आकार घटाने दिखा रहा है, और जब तक GFP उत्तेजना के तहत (ई) बड़े प्रतिदीप्ति, जो स्पष्ट रूप से मर्ज किए गए छवि (एफ) में दिखाया जा सकता है दिखाने के लिए। स्केल सलाखों 250 माइक्रोन कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
एफigure 5. मानक शोधन तकनीक में सेंट्रीफ्यूज के उपयोग की तुलना। पूर्व विश्लेषण centrifugation कदम नमूना तैयार करने में संरक्षित है। चुंबकीय मनका अलगाव के रूप में अच्छी तरह से FACS शामिल कई अतिरिक्त centrifugation कदम है, जो कोशिकाओं पर तनाव का परिचय और अभिव्यक्ति के स्तर को बदल सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

सेल अलगाव की तकनीक में सुधार तंत्रिका विज्ञान में 18 में संरचना समारोह रिश्तों में वैज्ञानिक अध्ययन को आगे, पुनर्योजी जीव विज्ञान में सेल प्रोग्रामिंग, और नाड़ी जीवविज्ञान 19 में एन्जियोजेनिक सिगनल स्टेम। दरअसल, प्राथमिक सेल संस्कृति 20 (जैसे, HUVECs) संवहनी जीव विज्ञान में मुख्य रूप से सेल अलगाव तकनीकों के उपयोग के माध्यम से किया जाता है। सेल अलगाव भी हाल ही में मात्रात्मक प्रवाह (qFlow) प्लाज्मा झिल्ली रिसेप्टर्स 3,14,15,19,21 की cytometry विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था। हालांकि, मौजूदा सेल अलगाव के तरीके में सेल सतह रिसेप्टर के स्तर को प्रभावित और दोनों कर्मियों और अभिकर्मकों में महंगी हैं। हम सतह functionalization 17 है, जो इन कमियों को पूरा करने के लिए सेल प्रकार के मिश्रण से एक एकल कोशिका प्रकार की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कब्जा के एक सज्जन प्रणाली के निर्माण के लिए अनुमति देता है में एक नई विधि उन्नत है। इस तकनीक में एक चलने प्रणाली में एकीकृत किया जा सकता है, ग की संभावना की अनुमतिविभिन्न प्रकार की कोशिकाओं apturing विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग चरणों में। आगे की प्रक्रिया को स्पष्ट करने के लिए, समस्या निवारण सवाल और जवाब के एक नंबर से नीचे पेशकश कर रहे हैं:

Functionalization अनुकूलन: functionalization प्रक्रियाओं में सुधार एकरूपता के लिए अनुकूलित किया गया है और MCF7gfp कोशिकाओं के नीचे खींच। इस प्रोटोकॉल वैकल्पिक रूप से अनुकूलित और किसी भी प्रकार की कोशिका और एंटीबॉडी विन्यास के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस आधार घटकों की सांद्रता में फेरबदल पर कब्जा सतह में, या प्रकार या एंटीबॉडी की सांद्रता बदलने के द्वारा के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। अधिकांश एंटीबॉडी प्रकार के ऊपर प्रोटोकॉल का उपयोग biotinylated जा सकता है। एक बार जब biotinylated, वे तो नीचे खींच लिए आदर्श एकाग्रता लगाने के लिए (चित्रा 1) titrated जा सकता है। सेल एकाग्रता पर कब्जा करने की कोशिकाओं के आदर्श एकाग्रता लगाने के लिए (चित्रा 2) titrated जा सकता है। इस टोपी के साथ एक खास प्रकार की कोशिका पर कब्जा करने की व्यवहार्यता का प्रयोगऊपरी सतह का पता लगाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, अगर ब्याज की एक सेल प्रकार, मिलियन कोशिकाओं प्रति 100 कोशिकाओं के स्तर पर है क्रियाशील सतह का उपयोग आदर्श होगा कि सीमा में कोशिकाओं की सांद्रता पर कब्जा। अनुमापन के दौरान, सतह कि छोटे एक एकाग्रता की कोशिकाओं पर कब्जा नहीं कर सकते, तो सतह या एंटीबॉडी के अनुकूलन आदेश है कि एकाग्रता सीमा के भीतर कोशिकाओं को बाहर फिल्टर करने के लिए सक्षम होने के लिए आवश्यक है।

जो सेल प्रकार इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल कर रहे हैं? कैसे किसी को इस प्रोटोकॉल एक अलग सेल प्रकार का उपयोग करने के लिए संशोधित कर सकता है?

वर्तमान में, इस प्रोटोकॉल MCF7-GFP कोशिकाओं का उपयोग करता है, और रॉ 264.7 मैक्रोफेज अक्सर एक दोहरे सेल मिश्रण में एक प्रकार की कोशिका से बाहर खींच करने की क्षमता दिखाने के लिए शामिल किए गए हैं। इन कोशिकाओं को चयन किया गया था के रूप में वे माउस जेनोग्राफ्ट मॉडल (murine वातावरण के भीतर मानव ट्यूमर) के लिए सबसे अधिक प्रासंगिक प्रकार की कोशिकाओं में से दो थे। आदेश में अन्य कोशिकाओं की एक किस्म है, एंटीबॉडी सपा के लिए प्रक्रिया जांचना करने के लिएecificity सर्वोपरि है। वहाँ कई ऑनलाइन संसाधनों एंटीबॉडी 22 के चयन के लिए उपलब्ध हैं।

इस विधि के कुछ फायदे क्या हैं?

कोमल दृष्टिकोण: बल की कमी के कारण इस दृष्टिकोण कोमल बनाता है। दरअसल, हमारी गणना की कतरनी बल, ज़्यादा से ज़्यादा है 24 x 10 -6 पी.एन. 17 है, जो बायोमार्कर के लिए महत्वपूर्ण व्यवधान पैदा नहीं करना चाहिए, 2.09 पा के hydrodynamic तनाव के बाद से (656 पी.एन. 314 PM 2 कोशिका की सतह क्षेत्र संभालने) प्रेरित गल जाना है, जबकि नीचे तनाव के मूल्यों 0.59 Pa (185 पी.एन. संभालने 314 pM 2 कोशिका की सतह क्षेत्र) नहीं 23 से करते हैं। इस कोमल दृष्टिकोण के आसपास 600 ग्राम मूल्यों में अचानक त्वरण, जो प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न और morphologies 25 को बदल सकता है के कारण इस प्रकार इस तरह centrifugation आधारित दृष्टिकोण के रूप में 24 है, जो शिखर कतरनी तनाव के पीए 25 0.78 के लिए ऊपर खींचना कुछ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विकल्पों पर फायदेमंद है 26 23 प्रेरित। इस प्रकार एक प्रक्रिया है कि सेंट्रीफ्यूज प्रयोगों की मात्रा को कम कर सकता है जोर दिया है कि कोशिकाओं शुद्धि के माध्यम से अनुभव और अंत में अधिक शारीरिक डेटा यह सुनिश्चित करना होगा की राशि को कम करेगा। हमारे वर्तमान प्रोटोकॉल सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करता शुद्ध और सेल एकाग्रता पर कब्जा करने से पहले पुनर्गठित करने के लिए, हालांकि, इस तैयार करने की प्रक्रिया में कई शोधन तकनीक में मानक जैसे चुंबकीय मनका अलगाव 27,28 के रूप में है, cytometry 29 प्रवाह, और FACS 30 (चित्रा 5)। हमारा दृष्टिकोण सब नीचे की ओर centrifugation प्रक्रियाओं है कि अन्य तकनीकों तैयारी कदम के अलावा उपयोग कम कर देता है।

बायोटिन avidin दृष्टिकोण: आमतौर पर इस्तेमाल biomaterials (डीएसबी बचत और बायोटिन-बचत) के आवेदन भी इस दृष्टिकोण लाभप्रद 31,32 प्रदान करता है। Avidin परिवार प्रोटीन बायोटिन परिवार प्रोटीन के लिए बेहद चुनिंदा बाँध और scient की एक श्रृंखला के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंific और चिकित्सा अनुप्रयोगों सहित: एंटीबॉडी fluorophore लगाव 33, मात्रात्मक Qdot-polystyrene मनका लगाव 34, और हाइड्रोजेल कि समझाया दवाओं 32 को रिहा करने के वातावरण में उत्तेजनाओं का जवाब का निर्माण। इसके अतिरिक्त, biotinylated एंटीबॉडी प्राप्त करने के सापेक्ष कम इस दृष्टिकोण व्यापक रूप से सुलभ और अनुकूलन बनाता है।

मोती के बिना Desthiobiotin दृष्टिकोण: कब्जा सतह कठोर अभिकर्मकों और बलों का उपयोग कोशिकाओं को रिहा करने के लिए बिना desthiobiotin के उपयोग को लागू करने में सक्षम है। डीएसबी DSB-एंटीबॉडी और चुंबकीय मोती 35 के साथ संयोजन के रूप में प्रतिवर्ती सेल लगाव और अन्य प्रणालियों से रिहाई के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, जुदाई तकनीक के कठोर प्रभाव के साथ ही बड़े सेलुलर नुकसान नमूने अंतर रिसेप्टर और केमोकाइन अभिव्यक्ति 28,36 27,28 में परिणाम की तैयारी के साथ जुड़े। इस दृष्टिकोण को कम करना हैऔर दोनों चुंबक और मोतियों के उपयोग को नष्ट करने के लिए एक बहुत अधिक कोमल धोने और रिहाई कार्यप्रणाली बनाने के द्वारा इन सीमाओं को पार।

इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम क्या हैं? क्या परिवर्तनशीलता पैदा कर सकता है? कि परिवर्तनशीलता कैसे नियंत्रित किया जा सकता है?

यह प्रक्रिया चार महत्वपूर्ण कदम है कि कब्जा की सतह की कमी आई है दक्षता में परिणाम कर सकते हैं। पहला महत्वपूर्ण कदम APTES functionalization कदम है, जो आत्म इकट्ठे सतह के विनाश में नतीजा होगा दौरान APTES सतह के लिए पानी की रोकथाम है। यह ओवन में एक विलायक के रूप में इथेनॉल का उपयोग और APTES पाक बाद में जलीय समाधान से हाइड्रोलिसिस को कम करने के द्वारा remedied है। दो परतों के पार से जोड़ने की अनुमति: दूसरा महत्वपूर्ण कदम ईडीसी प्रतिक्रिया कदम जिसमें ईडीसी APTES साथ डीएसबी की प्रतिक्रिया उत्प्रेरित है। ईडीसी बाहर रखा गया है या पर्याप्त रूप से नहीं जोड़ा है, तो डीएसबी जो, फर्श संलग्न करने के लिए सक्षम नहीं होगा ज जारी तंत्र समझौता होगा। तीसरा महत्वपूर्ण कदम है, बचत functionalization के दौरान होता है के रूप में बचत परत को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। कब्जा दक्षता में कमी में streptavidin परत परिणामों की गैर एकरूपता। कब्जा सतह के लिए एंटीबॉडी के बंधन के रूप में कब्जा सतह और एंटीबॉडी के बायोटिन streptavidin बातचीत के माध्यम से मदद की है चौथे महत्वपूर्ण कदम है, एंटीबॉडी के biotinylation में है। तो एंटीबॉडी गैर biotinylated है, तो streptavidin परत यह कब्जा है और यह नीचे खींच करने में असमर्थ हो जाएगा, कब्जा सतह बेकार बना। परिवर्तनशीलता और सतह पर कब्जा में विसंगति एकाग्रता गैर नियमितता के साथ ही परत लगाव की stochasticity के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। इस बदलाव परत घटकों और कब्जा करने के इरादे से लक्ष्यों की सतह के लिए calibrated की सटीक सांद्रता का उपयोग करके नियंत्रित किया जा सकता है। इस डिजाइन में, सांद्रता MCF7-GFP कोशिकाओं के कब्जा करने के लिए विशेष रूप से calibrated हैं।

e_content "> इस विधि के कुछ कमियां क्या हैं?

वर्तमान में, APTES functionalization 55 मिनट से 2 घंटे के लिए एक पाक कदम के द्वारा पीछा के लिए सतह का एक तरल चरण विसर्जन का उपयोग करके किया जाता है। हालांकि इस APTES silane की एक पूरी परत सतह के लिए बाध्य करने के लिए अनुमति देता है, एक और अधिक समान प्रक्रिया भाप चरण silanization 37 होगा। यह कम हो जाती है APTES संपर्क समय है, इस प्रकार शोधकर्ता समय की बचत के साथ-साथ एकरूपता बढ़ रही है। इसके अतिरिक्त, पुल से नीचे में सुधार 17 जब बचत की रात ऊष्मायन प्रयोग किया जाता है देखा गया है, और वर्तमान में, सतह functionalization दो, रात भर incubations की आवश्यकता है, जिससे समग्र प्रक्रिया तीन दिन लग। तो, रसायन विज्ञान के अनुकूलन की पेशकश करेगा शोधकर्ता के लिए महत्वपूर्ण समय बचत।

कुछ चेतावनी या सावधानियों मददगार हो सकता है कि क्या कर रहे हैं?

जब सतहों functionalizing, यह IM हैperative कि उचित देखभाल सांस की क्षति के जोखिम के लिए लिया जाता है। दोनों APTES और mercaptoethanol फेफड़े और संबंधित अंगों के लिए बेहद खतरनाक हो सकता है, इस प्रकार यह एक रासायनिक हुड में functionalization प्रक्रिया करने के लिए रासायनिक धुएं के साथ बातचीत को कम करने के लिए आवश्यक है। Mercaptoethanol एक thiol जो गंध में विशेष रूप से तीखे है। mercaptoethanol का उपयोग करते हैं, दूषित कचरे के निपटान से पहले एक या दो दिन के लिए हुड में बैठने के लिए अनुमति देते हैं।

भविष्य लक्ष्य और इस सतह के अनुप्रयोगों क्या हैं?

हमारे भविष्य के उद्देश्य एन्जियोजेनिक संबंधित बीमारियों के लिए प्रासंगिक सेल प्रकार की एक किस्म के साथ काम करने के लिए इस सतह को अनुकूलित शामिल है। विशेष रूप से, हम आदेश रक्त के नमूनों का उपयोग करते हुए और वहां से ब्याज की कोशिकाओं को अलग करने के लिए segue करने के लिए मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करने का इरादा रखते हैं। इसके अतिरिक्त, हम इस तरह क्रियाशील surfac के डिजाइन में aptamers के रूप में जुदाई के तौर तरीकों को एकीकृत करने की योजनाई आगे हमारे पकड़ने और रिहाई प्रतिशत वृद्धि हुई है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) Acros Organics 919-30-2 Used to make 2% APTES solution
Plasma Cleaner Pico Diener Model 1 Cleans surfaces and allows for bonding of PDMS to glass
d-Desthiobiotin (DSB) Sigma D20655 Used as the releasing mechanism in the cellular capture surface. 
dimethyl sulfoxide (DMSO) British Drug Houses (BDH) BDH1115-1LP Dissolves the DSB into solution
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) Thermo-Scientific 5g: 22980
25g: 22981
Activates carboxylic acids and allows binding of proteins to glass surface.
uncoated 8-well culture slide BD Falcon Case of 24: 354118
Case of 96: 354108
Used in cellular experiments involving Zeiss fluorescence microscope such as initial capture and release quantification experiments
Glass bottom 24-well plates MatTek P24G-0-13-F Used in cellular experiments involving the plate reader such as antibody and cellular titration experiments
Mercaptoethanol Science Lab 60-24-2 Used to quench reaction between EDC and DSB
4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate
(MES Hydrate 99%)
Fisher Scientific AC172590250 Used to make 0.1 M MES Buffer for use in EDC reaction
Precision Oven Thermo Scientific 11-475-153 Used in curing of PDMS and APTES layer.
Titramax 1000 Shaker Heidolph 13-889-420 Used to ensure even distribution of APTES on surfaces.
1x Streptavidin 5 mg [e7105-5mg] Proteo Chem 9013-20-1 Biotin-binding protein. May cause irritation.
5 cm Glass Dish Fisher Scientific 08748A Used in HUVEC studies as well as future profiling studies.
14 cm Petri Dish with Cover Sigma-Aldrich Z717231 Used to hold samples being functionalized and transport them.
MCF7-GFP cells Cell Biolabs AKR211 Stored in liquid nitrogen
RAW264.7 mouse macrophages ATCC TIB-71 Gifted to us from Smith lab at the University of Illinois. Stored in liquid nitrogen.
TrypLE Life Technologies 12605036 Stored in 100 ml at room temperature
Dulbecco’s modified Eagle medium Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC 50003PC Supplier: Corning
Nonessential amino acids Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC 25-025-CI Already added into DMEM by facility. Supplier: Corning.
Cell scraper Fisher Scientific 12-565-58 Small 23 cm 50 pack
Cell Dissociation Solution Corning MT-25-056CI Used to lift cells non-enzymatically for the use in cell experiments
Hemacytometer Hausser 02-671-54 Used to count cells for quantification of cell solutions and capture and release effectivity.
Biotin Amresco 58-85-5 Used to release cells from surface.
HBSS Created from Recipe N/A Used to keep cells alive in suspension as well as wash surfaces of non-specific binding. Adapted from Cold Spring Harbor Protocols: In 500 ml, use 4 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.0402 g Na2PO4•7H2O, 0.03 g KH2PO4 and 0.5 g glucose. Add DI water to get to 500 ml, filter, and then refrigerate.
HLA-ABC Antibody BioLegend 311402 Antibody used to capture MCF7gfp cells
hIgG Antibody BioLegend HP6017 Antibody used to capture MCF7gfp cells
MCF7 GFP cells Cell Biolabs AKR-211 Luminal Breast Cancer line that has been transfected with green fluorescent protein.
Assorted Conicals Thermo-Scientific 15mL: 12-565-268 50/15 ml plastic conicals for storing solutions and aliquots.
Mini-Tube Rotators (End over End Mixer) Fisher Scientific 05-450-127 Used to incubate antibody and mix other cellular solutions in order to mix
Axiovert 200M (Fluorescence Microscope) Zeiss N/A Zeiss Axiovert 200 M inverted florescence microscope.
Zeba Desalting columns Thermo-Scientific PI-87770 Used to purify newly biotinylated antibodies after the use of the Biotinylation Kit. Instructions provided at: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf
EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation Kit Thermo- Scientific Used to biotinylate antibodies to allow them to integrate with the capture surface
Plate Reader BioTek Synergy HTX Multimode Reader Used to quantitatively measure fluorescent intensity in the titration experiments.

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