通过玻璃表面功能靶细胞提取方法

Cancer Research

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Ansari, A., Patel, R., Schultheis, K., Naumovski, V., Imoukhuede, P. I. A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization. J. Vis. Exp. (115), e54315, doi:10.3791/54315 (2016).

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Abstract

Introduction

当前台式细胞分离方法( 荧光活化细胞分选1,激光捕获显微解剖2,免疫磁珠分离1)可能需要几个小时的准备和排序的。这些大的时间尺度可影响生理反应和表达水平,导致在不能代表生理反应3的分析。系统需要能够迅速和有效地分离出特定的细胞类型,而为了提高生物医学应用细胞分离和富集破坏细胞表面受体的水平。因此,我们的做法的理由是开发细胞分离温和的做法。

该“芯片实验室”的理念,提供更快的幅度(小时到分钟)细胞分离的订单的承诺,最经常涉及捕捉到细胞表面和释放细胞或细胞内的小故事通过物理4,5 NTS或化学方法6。虽然这些方法提供了一些优点,如鉴定蛋白质7,8-表达,识别RNA表达9-11,或甚至提供用于在体外培养12,13细胞,许多这些技术不能被转换为诊断如细胞受体分析因到它们的非生理环境。酶促起重剂如胶原酶也可影响这些受体数量14,15,这意味着使用这些起重剂不会产生准确的生理数据细胞受体定 ​​量技术。细胞裂解防止分化的原始表面受体之间,以及那些以前内在16。本协议描述了细胞分离快速,轻柔的手法。

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Protocol

1.清洁玻璃表面和试剂的准备

  1. 放置一个玻璃表面在氧等离子体机,在50%的功率进行清洁5分钟。
  2. 制作2.5毫升2-%重构(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)溶液中,加入APTES 50微升并在锥形管2.45毫升乙醇中。

2. APTES和DSB功能化

  1. 添加APTES溶液到表面。每孔吸取150微升8孔板。每孔移液器将100μl24孔板中。吸取1.1毫升60×15毫米的玻璃菜肴。覆盖表面,防止蒸发和APTES解决分配不均。放置在表面上的平台摇动器在室温下50分钟,它创建一个连APTES层的分布。
    注:APTES是形成表面的第一层的氨基硅烷。如果使用不同的表面,启发式决定的,以覆盖表面所需溶液的体积。
  2. 选择用于烤箱的温度,而表面上的摇床:热至55℃2小时的8孔平板和24孔平板中。热玻璃只菜至90℃1小时。
  3. 冲洗用乙醇的表面上。
    1. 辖的乙醇通过参考根据所用的表面上所需的量。添加150微升乙醇至每个孔8孔板中。添加125微升乙醇至每个孔24孔板中。加入1.1毫升乙醇玻璃菜肴。
    2. 通过排放和绘图从固定点的液体,如井的拐角冲洗表面。握住吸管以大约70°角,以便尖端不直接指向到表面。冲洗用乙醇两次。
      注意:如果任何玻璃底孔板的在其中有任何塑料,不加热它们高于65℃时,由于塑料会开始熔化和变形。
  4. 干与来自罐分配100%的氮气。放置在表面的OVEN。
  5. 通过在37.5微升二甲基亚砜(DMSO)的1.5毫克/毫升的DSB组合在2462.5制备2.5的d脱硫生物素(DSB)溶液中,和5毫克/毫升的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)的0.1M的4-吗啉乙磺酸水合物(MES)(pH值为6)缓冲液的微升。然后结合这两种解决方案。
  6. 加入1μl2-β巯基乙醇,15分钟后,在溶液中以骤冷DSB和EDC之间的反应。删除从烤箱功能化玻璃表面热APTES。等待5-10分钟的玻璃表面冷却。
  7. 添加MES缓冲表面冲洗,使用基于表面上的金额。添加150微升的MES缓冲液,以每孔8孔板中。添加125微升的MES缓冲液,以每孔24孔板中。加入1.1毫升MES缓冲玻璃菜肴。
  8. 通过排放和绘图从固定点的液体,如井的角落冲洗表面。握住吸管以大约70°角,以便尖端不直接指向入面。冲洗更多的MES缓冲两次。
  9. 申请所述DSB溶液到表面,以允许他们孵育。加入每孔150微升DSB解决方案8孔板。添加每孔100μl的DSB溶液中24孔板中。添加1.1毫升玻璃菜DSB解决方案。
  10. 放置DSB覆盖玻璃表面上的培养皿内的湿纸巾。盖上盖子,在4℃冰箱孵育18-24小时。

3.链霉亲和功能化

  1. 冲洗每个玻璃表面三次用1ml 1.0倍磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的。通过排放和绘图从固定点的液体,如井的角落冲洗表面。握住吸管以大约70°角,以便尖端不直接指向到表面。稀释链亲和素(SAV)原液0.4毫克/毫升(推荐)。
    注:PBS等渗因此它可以用作用于稀释和冲洗的介质。 PBS被用作为SA的溶剂v和因此,不会影响到SAV的结合到表面的能力。
  2. 均匀地涂0.4毫克/毫升的SAV溶液到表面,使得在玻璃的底部的形式的薄层,选择的溶液基于表面的量。对于8孔板,每孔加入150微升0.4毫克/毫升SAV解决方案。对于24孔板,每孔加入100微升0.4毫克/毫升SAV解决方案。对于玻璃菜,加1.1毫升0.4毫克/毫升SAV解决方案。
  3. 覆盖和移动板到14厘米培养皿中保持水分。孵育在冰箱培养皿18-24小时。
    注:重要的是要利用每一个表面上的APTES,DSB和SAV一致卷。
  4. 冲洗每个玻璃表面用150微升的PBS三次以除去SAV。通过排放和绘图从固定点的液体,如井的角落冲洗表面。握住吸管以大约70°角,以便尖端不直接指向到表面。
  5. 湿纸巾W¯¯第i个去离子水,并放置在纸巾平在围绕板中的孔中,以保持水分14厘米培养皿。覆盖包含井培养皿。直到需要孵化培养皿在4℃生物安全水平1(BSL-1)的冰箱。

4.细胞捕获和释放

  1. 开始与旨在用于实验的细胞T175烧瓶(多个)。从烧瓶(多个)吸媒体。洗出剩余介质用5ml室温PBS中。抽吸PBS从烧瓶(多个)。
  2. 加入10 mL的非酶起重剂,如细胞解离溶液,对细胞的T-175烧瓶中。把该烧瓶在孵化6分钟,以允许从烧瓶的细胞的升降。
  3. 6分钟后,加入10毫升冷汉克的平衡盐溶液(HBSS;见材料清单)灭活解除代理。取出20微升细胞计数使用血细胞计数器细胞在溶液中的数量。
    注:根据FUNCtionalized在捕获实验中所用的表面,所需的细胞数量不同而不同。对于官能8孔板,使用每孔30万细胞。对于功能化玻璃餐具,使用110万细胞。对于官能化24孔板,推荐125000细胞。对细胞计数的更多信息补充协议中找到。
  4. 重复步骤4.1- 4.3为细胞另一个烧瓶中,如果较少的细胞存在比需要的实验。结合细胞悬浮液和验票细胞获得在溶液中的细胞总数。
  5. 降速细胞悬浮液在离心机中,在500×g离心5分钟,在4℃以获得浓缩的细胞的沉淀。找到的HBSS适量添加到细胞悬浮液以获得每毫升1×10 6个细胞的浓度,然后从纺丝向下细胞吸出上清液,并添加计算量。这个体积可使用在补充的公式计算。
  6. 移液器上下(磨碎)重悬日E细胞在溶液中并且降低的解决方案,可以减少抗体结合的细胞聚集。拆分移动解决方案到独立的控制和实验方案。查看组件和计算补充文件。
  7. 添加生物素化的抗体在补充文件描述的各个小区的解决方案。在4℃孵育30分钟上的端过端混频器。
    注:对于MCF7GFP细胞,0.5毫克/毫升hIgG或0.5毫克/毫升HLA-ABC抗体建议。对于RAW巨噬细胞,1毫克/毫升mCD11b以一半体积推荐占稀释差异。对于人脐静脉内皮细胞(HUVEC),0.5毫克/推荐毫升hCD31。
  8. 用HBSS洗官能玻璃表面。对于这个实验中,一个8孔板被劝告。
    1. 添加150微升HBSS至每个孔8孔板中。用HBSS清洗两次。通过排放和绘图从固定点的液体,如井的角落冲洗表面。握住吸管以大约70°角,以便尖端不直接指向到表面。冷保存在4℃。
  9. 添加细胞溶液至孔,等待45分钟的细胞上的振动筛冰上孵育。通过使用如在补充所述计算的体积使得在无菌HBSS生物素的溶液中。
  10. 通过使用HBSS除去从玻璃井细胞溶液。
    1. 轻轻吸取150微升HBSS到每个孔中。然后吸取了HBSS。通过排放和绘图从固定点的液体,如井的角落冲洗表面。握住吸管以大约70°角,以便尖端不直接指向到表面。
    2. 重复两次以上。清洗后,加入HBSS到孔,以保持湿润的细胞。
  11. 加入150微升20毫米生物素溶液各有关释放好,然后等待20分钟,以便反应。
  12. 回忆非特异性结合的细胞如上所述S按用HBSS洗涤,然后如果使用荧光标记的细胞,进行荧光图像的细胞。此外,在一烧瓶图像活细胞(作为对照,以与孔中的细胞比较)。如果使用绿色荧光蛋白(GFP)转染的细胞中,激励将470纳米,和发射将515纳米。

5.抗体优化:抗体滴定

  1. 通过解除从T75或T175烧瓶中的细胞作为在步骤4.1- 4.3解释开始。
    注意:这些卷校准24孔板,但可以改变,以适应通过启发式检测任何玻璃官能表面。代表性抗体滴定如图1所示。
  2. 算使用血细胞计数器细胞,然后在500 xg离心在4℃下降速细胞溶液中的圆锥形管5分钟。重组细胞每毫升1-百万细胞,使用在补充所述的计算。
  3. 拆分1米100万年细胞每毫升溶液注入500微升在不同离心管的抗体(抗体)溶液六个不同的解决方案。
    1. 稀释抗体原液至10微克/毫升,1微克/毫升,100纳克/毫升,10纳克/毫升,1毫微克/毫升。通过使用100微升染色缓冲液(PBS + 1%叠氮化钠+ 1%BSA)中,并加入500μl的细胞与没有抗体在它的控制创建控件。对于空白对照(无Ab和无细胞),使用300微升的PBS中的溶液。
      注意:注意:叠氮化钠是剧毒,易爆,并格外小心,必须使用时服用。请参考材料安全数据表(MSDS),并使用适当的安全设备。
  4. 结合,并在4℃下孵育,在最终过端混合器的电池溶液的抗体溶液30分钟。冲洗用HBSS三次官能24孔板中。通过排放和绘图从固定点的液体,如井的拐角冲洗表面。按住PI佩特以大约70°角,以便尖端不直接指向到表面。
  5. 分装125微升每种样品溶液到相应的APTES,DSB和SAV功能化的很好。孵育在4℃下或在冰上在玻璃表面上45分钟。用HBSS冲洗表面三次以除去非特异性附着的细胞。通过排放和绘图从固定点的液体,如井的角落冲洗表面。握住吸管以大约70°角,以便尖端不直接指向到表面。不要冲洗底部的行,因为这些是对照。
  6. 添加150微升的HBSS每个充分洗涤后,把24孔平板在冰上,然后用读板器测量GFP细胞(励磁485纳米/发射528纳米)的荧光。

6.单元优化:细胞滴定

  1. 提起细胞步骤4.1 -4.3提及。
  2. 算使用血细胞计数器细胞。降速细胞等等lution在500×g离心5分钟,锥形管在4℃下。重组细胞每毫升1-百万个细胞。
    注:更多关于使用血细胞计数器的信息可以在补充协议中找到。
  3. 吸取从锥形管的160万股票的细胞和地点细胞溶液1.6毫升。从锥形管800,000细胞股票和地点细胞溶液吸取800微升细胞。吸管从细胞股票80微升了在锥形管80,000个细胞股票和地点。移液器从8000细胞股票和地点细胞股票8微升的锥形管。
    注:浓度是每8孔板测量给出,根据需要进行复制。板输出的一例示于图2。
  4. 采取四种储备液,并在4℃下以500 xg离心在离心机中旋转5分钟。重新暂停所有股票的解决方案,400微升HBSS的。
  5. 加入1.6微升100毫微克/毫升抗体,以1.6亿的股票,0.8μl至80万细胞原液,0.5微升到所有其他股票。温育30分钟,抗体在最终过端混合器在4℃,30分钟。洗用HBSS三倍官能玻璃表面。
    注:建议显微镜定量的官能8孔板,同时建议酶标仪定量功能化的24孔板。对于8000细胞库存抗体浓度没有降低,以允许捕获表面的限制因素,以不缺乏溶液抗体,而是表面的捕获性能。
  6. 应用150微升样品溶液的各孔中。应用160万细胞库存到孔在左边的第一列。申请800,000细胞库存从左侧的第二列。申请80,000细胞库存从左侧第三列。最后套用8000细胞股票的最后一列。在4℃下孵育45分钟的摇动。
    注:160万细胞库存作为待测试的最高浓度,并且是通常用于细胞分离的实验(每孔600,000个单元格)800,000细胞库存用作实验中的控制,因为它是在典型的蜂窝浓度细胞的双重量即在细胞分离实验中使用的(每孔3000000细胞)。 80000细胞库存用作稀释10倍,以测试较低浓度为蜂窝捕获(每孔30,000个细胞)。 8000细胞库存用作百倍稀释到作为测试来检查细胞的分离的下限(每孔3000个细胞)。
  7. 用HBSS三次冲洗。通过排放和绘图从固定点的液体,如井的角落冲洗表面。握住吸管以大约70°角,以便尖端不直接指向到表面。收集所有的洗涤。
  8. 图象上荧光显微镜的细胞,如果使用8孔板,取各拍照河畔面,并在4℃下在摇动器应用150微升生物素以每面为一小时。一小时后,冲洗生物素释放孔用HBSS 3倍之前。收集井全部用于洗涤与血球和图像释放井计数。
  9. 应用150微升的20mM过量的生物素的溶液,以适当的生物素释放孔1小时,如果使用24孔板,然后用HBSS冲洗这些油井的3倍。定量用酶标仪24孔板中。使用血球到所有收集以及洗涤细胞计数。

7.图像分析

注意:斐济软件包(http://fiji.sc/Fiji)被推荐用于图像分析。最初,图像转换成灰度图像,然后将该亮度/对比度改变为带出的细胞。

  1. 加载图像,并转换通过单击图像选项卡,然后向下滚动到“类型”,然后单击灰度4,8位“。
  2. 通过单击图像选项卡,然后滚动到“调整”增加图像的对比度。点击“亮度和对比度”,然后使用滚动条,使细胞中脱颖而出。如果使用荧光图像,反转图像,使更多的定义的细胞。
  3. 加载插件ImageJ的上称为ITCN(http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html)来分析图像。
  4. 打开ITCN。当出现一个对话框,提示与多个参数的用户估计单元的尺寸,第一组感兴趣的细胞的最小宽度。如果图像是荧光灯和将细胞变暗点击“检测暗峰”选项。
  5. 初始设定为2的阈值,然后打“计数”按钮。画面的一个新版本的计会出现红点划定在哪里细胞已被计算在内。
  6. 调整阈值和宽度参数度日defini更准确的蜂窝数据纳克“小区”的大小。注意:计算将在右边的对话框细胞的数目。更改参数将给予不同数量的计数的细胞。
  7. 继续通过阈值和宽度参数,直至达到对细胞数目的良好估计迭代。

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Representative Results

使用该协议,我们表明细胞捕获( 图3A)和MCF7GFP细胞的细胞释放( 图3C)以及活细胞对照( 图4)。我们量化的细胞捕获为60%和80%被释放( 图3C)。当我们扩展这种方法的RAW 264.7巨噬细胞和MCF7GFP细胞的混合物,RAW巨噬细胞的50%被捕获( 图3D)和RAW巨噬细胞有80%是释放用20mM生物素( 图3B)。因为过量的抗体能够降低细胞捕获,我们通过滴定0-10,000纳米的HLA抗体的优化,并观察了理想的抗体浓度为100-1,000毫抗体( 图1)之间。同样地,我们确定了可被捕获的细胞的理想浓度为1×10 5和1×10 6,因为低于该数量的细胞,值比背景17下( 图2)。从每个孔中的荧光数据如下所述进行处理。

式(1)

这里,3次重复的平均值从与无抗体(空白)的样品取和是从每个样品获得的荧光减去。这个值然后归一化到平均最大荧光。该处理允许研究者清楚地观察细胞的检测的下限。

图1
图1. 归冲裁抗体滴定。人HLA-ABC跨MCF7GFP细胞的恒定数量(每孔125000个细胞)和捕获的细胞的荧光滴定使用板读数器定量。先暴露于功能化表面,将细胞和抗体进行离心以除去非特异性抗体附着。没有该离心分离,多余的抗体将饱和表面和防止细胞下拉,如图10,000纳克/毫升,其中离心不足以防止表面的抗体过饱和,从而导致更少的细胞结合于表面的浓度。灰线代表控制。误差棒代表平均值的标准误差。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2. 归中空白单元格滴定。从抗体滴定使用优化的抗体浓度,MCF7GFP细胞滴定找到优化的捕获浓度而科eping功能化表面抗体浓度不变。这可以用来校准为不同的应用细胞捕获。在该图中列重复,而行改变细胞的浓度,以找到用于蜂窝捕获的想法的范围。灰线代表控制和误差棒代表平均值的标准差。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3. 捕获和释放实验。单细胞混合物,暴露在表面功能化(A),捕捉使用HLA-ABC抗体MCF7GFP细胞。当用HBSS(B)洗涤,细胞仍然捕获,但是当暴露于20mM的生物素(C)的溶液中,将细胞RELEASED。 MCF7GFP细胞和RAW 264.7巨噬细胞的蜂窝混合物,暴露于功能化表面,并使用mCD11b抗体(D)被抓获。非特异性MCF7GFP细胞被标记为绿色。当暴露于中性清洗(E),这意味着表面没有针对他们MCF7GFP细胞的荧光强度下降,而他们重视非特异性。当暴露于生物素洗涤(F)中 ,有针对性的RAW巨噬细胞从表面释放出来。比例尺为250微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
对于双细胞分离 图4. 阳性和阴性细胞控制,阳性对照RAW巨噬细胞成像Ø呐荧光显微镜,表示没有荧光活性以及细胞的相对大小。明的RAW巨噬细胞表现出细胞大小(A)中,而下的GFP激励,没有荧光(B),其合并后的图像(C)的中示出。阴性对照MCF7GFP细胞成像在荧光显微镜示出大荧光活性,以及​​MCF7GFP细胞的相对大小。细胞被成像在明(D)中 ,示出的大小,并且当根据GFP激发(E)表示的大的荧光,其可以合并图像(F)中清楚地示出。比例尺为250微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
Figure 5. 在标准纯化技术离心机的使用的比较。预分析离心步骤是在样品制备保守的。磁珠隔离以及FACS涉及几个额外的离心步骤,它引入了压力到细胞和可能改变的表达水平。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充代码文件。计算。 请点击此处下载此文件。

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Discussion

在细胞分离技术的进步,进一步加强结构与功能的关系科学的研究在神经科学18,遏制再生生物学血管生物学19单元编程和血管生成的信号。事实上,原代细胞培养20( 例如 ,内皮细胞)在血管生物学主要通过使用细胞分离技术进行。细胞分离最近还被用于细胞膜受体3,14,15,19,21定量流量(qFlow)仪分析。但是,现有的细胞分离方法,影响细胞表面受体的水平,并在人员和试剂昂贵。我们有先进的表面官能17,其允许建立一个单一的细胞类型的可再现捕获的温和系统从细胞类型的混合物,以满足这些缺点的新方法。这种技术可以被集成到一个迭代系统,使C的可能性在使用特定的抗体阶段apturing不同的细胞类型。为了进一步澄清的过程中,一些疑难问题及解答提供如下:

官能优化:功能化进程已改进的均匀性进行了优化,并拉下MCF7gfp细胞。这个协议可以替代地优化和定制的任何细胞类型和抗体的配置。这可以通过改变碱成分的浓度在捕获表面,或者通过改变类型或该抗体的浓度来实现。大多数抗体类型可以使用上述协议是生物素化。一旦生物素,它们可以被滴定( 图1)找到拉下理想的浓度。将细胞浓度可滴定( 图2),以找到细胞捕获的理想浓度。使用此,捕捉目标的细胞类型与盖的可行性TURE表面能来确定。例如,如果感兴趣的细胞类型为每百万个细胞100个细胞的比例,使用功能化表面将是理想的捕获细胞的浓度在该范围内。如果滴定过程中,表面不能捕获小的浓度的细胞,然后在表面或抗体的优化是必要的,以便能够在该浓度范围内筛选出的细胞。

哪种类型的细胞在本协议中使用?别人是如何修改该协议使用一个不同的细胞类型?

目前,这个协议使用MCF7-GFP细胞和RAW 264.7巨噬细胞通常包括显示拉出一种细胞类型的双小区混合物的能力。选择这些细胞,因为它们是两个最相关的细胞类型小鼠异种移植模型(鼠环境中的人类肿瘤)的。为了校准的过程为多种其它的细胞,抗体藻ecificity是至关重要的。有可用于选择抗体的22多种在线资源。

什么是这种方法的优点?

轻柔的手法:缺乏力量使得这种方法的温柔。事实上,我们的计算剪切力最大,24×10 -6 PN 17,其不应该引起显著破坏生物标志物,因为2.09 Pa的流体力学应力(656 PN假设314 PM 2细胞的表面积)诱导坏死而低于应力的值0.59帕(185 PN假设314 PM 2细胞表面积)没有23。这种温柔的做法是对一些市售的选项,如离心型接近24,这产生高达0.78的峰值剪应力霸25从而有利,由于在大约600克值的突然加速,这可能会改变蛋白质的表达模式和形态的25 ,26 23。从而能够降低离心机用途的量的过程将减少这些细胞将通过纯化体验并最终确保更多的生理数据的应力的量。我们目前的协议使用离心机来纯化和重组捕获之前的细胞浓度,但是,该制备过程是在许多纯化技术标准,如磁珠隔离27,28,流式细胞仪29,和FACS 30( 图5)。我们的方法可以减少在其他技术除了在制备步骤中使用的所有下游离心过程。

生物素抗生物素蛋白的方法:常用的生物材料(DSB-SAV和生物素SAV)的应用也使得这种方法有利31,32。抗生物素蛋白家族的蛋白质结合非常有选择地将生物素家族的蛋白质和可用于一系列施恩的IFIC和医疗应用中,包括:抗体-荧光附件33,定量的Qdot -聚苯乙烯珠附着34,并且响应于环境的刺激以释放包封的药物32的水凝胶的创建。此外,相对容易获得生物素的抗体,使这种做法普及和可定制的。

无珠脱硫生物素的方法:该捕获表面是能够实现不使用苛刻的试剂和力以释放细胞使用脱硫生物素的。 DSB已被用于在与DSB-抗体和磁珠35结合可逆细胞附着和释放由其他系统。然而,与制备样品27,28结果在差动受体和趋化因子表达28,36相关的分离技术的严酷效果以及大蜂窝损失。这一措施旨在缓解并通过消除使用磁铁和珠子双方创造一个更加温和的清洗和释放方法克服这些限制。

什么是该协议的关键步骤?什么会导致变异?怎么可能变化进行控制?

此过程有可能导致在捕捉表面的效率降低四个关键步骤。第一个关键步骤是在APTES官能的步骤,这将导致自组装表面的破坏防止水至APTES表面。这是通过在烘箱中使用乙醇作为溶剂和烘烤APTES以减少从后面水溶液水解补救。第二个关键步骤是在其中的EDC催化DSB与APTES反应的EDC反应步骤:使两个层的交联。如果EDC被排除或不充分地增加,所述DSB将不能附着在地板上,whic h会危及释放机制。第三个关键的一步是SAV功能化过程中,为保持SAV层是至关重要的。在捕获效率的降低的链霉层导致的非均匀性。第四关键步骤是在抗体的生物素化,因为抗体与捕获表面的结合是通过捕获表面和抗体的生物素 - 链霉亲和相互作用促进。如果抗体是非生物素化,然后将链霉抗层将无法捕获它拉下来,使捕获表面无用。变性和不一致的表面捕获可以归因于浓度的非规律性以及层附着的随机性。该变化可通过使用校准到表面层组分和捕获的预定目标的精确浓度来控制。在这种设计中,浓度是专门校准到MCF7-GFP细胞的捕获。

e_content“> 什么是这种方法的一些缺点?

目前,APTES官能通过使用表面55分钟,随后为2个小时的烘烤工序的液相浸渍完成。虽然这允许绑定到表面APTES硅烷的完整层,更均匀的处理将是气相硅烷化37。这减少APTES接触时间,从而节省了研究者时间,以及增加的均匀性。此外,改进的下拉已经观察到17时使用SAV的过夜培养,目前,在表面功能需要两个,一夜之间孵化,使得整个过程需要三天。因此,优化化学将提供显著的时间节省了研究员。

什么是一些警告和注意事项,可能会有帮助?

时官能化的表面,它是即时perative,适当的护理是采取呼吸道受损的风险。既APTES和巯基乙醇可能是极其危险的肺和相关器官,因此有必要做在化学罩的官能化过程,以减少与化学烟雾相互作用。巯基乙醇是硫醇这在气味特别刺鼻。当使用巯基乙醇,允许污染废物在引擎盖坐处置前一两天。

什么是未来的这种表面的目的和应用程序?

我们未来的目标涉及定制该表面具有多种相关的细胞类型为血管生成相关疾病的工作。特别是,我们打算把重点放在人脐静脉内皮细胞,以Segue公司使用的血液样本,并从那里分离出感兴趣的细胞。此外,我们计划整合分离方式,如适体进入官能面传热设计E要进一步提高我们的捕获和释放百分比。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) Acros Organics 919-30-2 Used to make 2% APTES solution
Plasma Cleaner Pico Diener Model 1 Cleans surfaces and allows for bonding of PDMS to glass
d-Desthiobiotin (DSB) Sigma D20655 Used as the releasing mechanism in the cellular capture surface. 
dimethyl sulfoxide (DMSO) British Drug Houses (BDH) BDH1115-1LP Dissolves the DSB into solution
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) Thermo-Scientific 5g: 22980
25g: 22981
Activates carboxylic acids and allows binding of proteins to glass surface.
uncoated 8-well culture slide BD Falcon Case of 24: 354118
Case of 96: 354108
Used in cellular experiments involving Zeiss fluorescence microscope such as initial capture and release quantification experiments
Glass bottom 24-well plates MatTek P24G-0-13-F Used in cellular experiments involving the plate reader such as antibody and cellular titration experiments
Mercaptoethanol Science Lab 60-24-2 Used to quench reaction between EDC and DSB
4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate
(MES Hydrate 99%)
Fisher Scientific AC172590250 Used to make 0.1 M MES Buffer for use in EDC reaction
Precision Oven Thermo Scientific 11-475-153 Used in curing of PDMS and APTES layer.
Titramax 1000 Shaker Heidolph 13-889-420 Used to ensure even distribution of APTES on surfaces.
1x Streptavidin 5 mg [e7105-5mg] Proteo Chem 9013-20-1 Biotin-binding protein. May cause irritation.
5 cm Glass Dish Fisher Scientific 08748A Used in HUVEC studies as well as future profiling studies.
14 cm Petri Dish with Cover Sigma-Aldrich Z717231 Used to hold samples being functionalized and transport them.
MCF7-GFP cells Cell Biolabs AKR211 Stored in liquid nitrogen
RAW264.7 mouse macrophages ATCC TIB-71 Gifted to us from Smith lab at the University of Illinois. Stored in liquid nitrogen.
TrypLE Life Technologies 12605036 Stored in 100 ml at room temperature
Dulbecco’s modified Eagle medium Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC 50003PC Supplier: Corning
Nonessential amino acids Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC 25-025-CI Already added into DMEM by facility. Supplier: Corning.
Cell scraper Fisher Scientific 12-565-58 Small 23 cm 50 pack
Cell Dissociation Solution Corning MT-25-056CI Used to lift cells non-enzymatically for the use in cell experiments
Hemacytometer Hausser 02-671-54 Used to count cells for quantification of cell solutions and capture and release effectivity.
Biotin Amresco 58-85-5 Used to release cells from surface.
HBSS Created from Recipe N/A Used to keep cells alive in suspension as well as wash surfaces of non-specific binding. Adapted from Cold Spring Harbor Protocols: In 500 ml, use 4 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.0402 g Na2PO4•7H2O, 0.03 g KH2PO4 and 0.5 g glucose. Add DI water to get to 500 ml, filter, and then refrigerate.
HLA-ABC Antibody BioLegend 311402 Antibody used to capture MCF7gfp cells
hIgG Antibody BioLegend HP6017 Antibody used to capture MCF7gfp cells
MCF7 GFP cells Cell Biolabs AKR-211 Luminal Breast Cancer line that has been transfected with green fluorescent protein.
Assorted Conicals Thermo-Scientific 15mL: 12-565-268 50/15 ml plastic conicals for storing solutions and aliquots.
Mini-Tube Rotators (End over End Mixer) Fisher Scientific 05-450-127 Used to incubate antibody and mix other cellular solutions in order to mix
Axiovert 200M (Fluorescence Microscope) Zeiss N/A Zeiss Axiovert 200 M inverted florescence microscope.
Zeba Desalting columns Thermo-Scientific PI-87770 Used to purify newly biotinylated antibodies after the use of the Biotinylation Kit. Instructions provided at: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf
EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation Kit Thermo- Scientific Used to biotinylate antibodies to allow them to integrate with the capture surface
Plate Reader BioTek Synergy HTX Multimode Reader Used to quantitatively measure fluorescent intensity in the titration experiments.

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