Een werkwijze van gerichte Cell Isolation via Glasoppervlak functionalisering

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ansari, A., Patel, R., Schultheis, K., Naumovski, V., Imoukhuede, P. I. A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization. J. Vis. Exp. (115), e54315, doi:10.3791/54315 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Huidige bench-top cel scheiding benaderingen (bijvoorbeeld fluorescentie-geactiveerde celsortering 1, laser capture micro-dissectie 2, immuno-magnetische kraal scheiding 1) kan enkele uren van voorbereiding en het sorteren te nemen. Deze grote tijdschalen kunnen beïnvloeden fysiologische respons en expressieniveaus, waardoor analyses die niet representatief zijn voor de fysiologische respons 3. Systemen nodig die snel en efficiënt specifieke celtypen isoleren zonder verstoring van celoppervlak receptor-niveaus om cel isolatie en verrijking voor biomedische applicaties te verbeteren. Daarom is de reden voor de aanpak is om een ​​zachte benadering voor celisolatie ontwikkelen.

De 'lab on a chip' concept biedt de belofte van ordes van grootte sneller (uren tot minuten) cel isolatie, en het vaakst gaat om het vastleggen van de cellen op een oppervlak en het vrijgeven van cellen of intracellulaire conteNTS door fysieke 4,5 of chemische methoden 6. Hoewel deze benaderingen bieden enkele voordelen zoals het identificeren van eiwit-expressie 7,8 identificeren RNA expressie 9-11, of waardoor zelfs cellen in vitro kweek 12,13, veel van deze technieken niet vertaald diagnostiek zoals celreceptor profilering wijten van de niet-fysiologische omgevingen. Enzymatische tillen middelen zoals collagenasen kan ook invloed hebben op deze receptor hoeveelheden 14,15, wat betekent cel receptor kwantificering technieken die deze opheffen van agenten zal niet het genereren van nauwkeurige fysiologische gegevens. Cellulaire lysis voorkomt differentiatie tussen de inheemse oppervlak receptoren, en degenen die voorheen werden geïnternaliseerd 16. Dit protocol beschrijft een snelle en zachte aanpak voor mobiele isolement.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Het schoonmaken van het glasoppervlak en het voorbereiden van reagentia

  1. Plaats een glazen oppervlak in een zuurstof plasma machine gedurende 5 minuten bij 50% macht om het schoon te maken.
  2. Bereid 2,5 ml 2% gereconstitueerd (3-aminopropyl) triethoxysilaan (APTES) oplossing door toevoeging van 50 pl APTES en 2,45 ml ethanol in een conische buis.

2. APTES en DSB functionalisering

  1. Voeg APTES oplossing op de oppervlakken. Pipetteer 150 ul per putje voor 8 well platen. Pipet 100 ul per putje voor 24 well platen. Pipet 1,1 ml voor 60 x 15 mm glazen schalen. Dek de oppervlakken verdamping en ongelijke verdeling van APTES oplossing te voorkomen. Plaats de oppervlakken op een platform schudmachine gedurende 50 minuten bij kamertemperatuur, waarbij een gelijkmatige verdeling van de APTES laag creëert.
    OPMERKING: APTES is een aminosilaan, dat de eerste laag het oppervlak vormt. Bij gebruik van een andere ondergrond, heuristisch het volume van de oplossing nodig bedekken bepalen.
  2. Temperatuur kiezen voor de oven, terwijl de oppervlakken van de schudinrichting: Verwarm tot 55 ° C gedurende 2 uur voor de 8 putjes en 24 putjes. Warmte glas alleen gerechten 90 ° C gedurende 1 uur.
  3. Spoel het oppervlak met ethanol.
    1. Dien de hoeveelheid ethanol vereist referencing basis van het gebruikte oppervlak. Voeg 150 ul ethanol aan elk putje voor 8 putjes. Voeg 125 ul ethanol aan elke well van 24 wells platen. Voeg 1,1 ml ethanol voor glas gerechten.
    2. Spoel het oppervlak ontladen en het trekken van de vloeistof uit een vast punt, zoals de hoek van de put. Houd de tube ongeveer een 70 ° hoek, zodat het uiteinde niet direct gericht op het oppervlak. Spoel tweemaal op ethanol.
      Opmerking: Als een van de glazen bodem putjesplaten nog plastic in hen, ze niet verhitten boven 65 ° C, daar de kunststof beginnen te smelten en warp.
  4. Droog met 100% stikstofgas vrijgesteld van een tank. Plaats de oppervlakken in de oven.
  5. Bereid 2,5 ml van d-desthiobiotine (DSB) -oplossing door het combineren van 1,5 mg / ml DSB 37,5 pl dimethylsulfoxide (DMSO), en 5 mg / ml 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) in 2462,5 ul van de 0,1 M 4-hydraat morfolinoethaansulfonzuur (MES) (pH 6) buffer. Dan combineer beide oplossingen.
  6. Voeg 1 pl 2-mercaptoethanol β na 15 min in de oplossing om de reactie tussen DSB en EDC blussen. Verwijder hot APTES gefunctionaliseerd glazen oppervlakken uit de oven. 5-10 min wachten voor glasoppervlakken afkoelen.
  7. Voeg MES buffer het oppervlak te spoelen, via bedragen op basis van het oppervlak. Voeg 150 ul MES buffer aan elk putje voor 8 putjes. Voeg 125 ul MES buffer aan elk putje voor 24 well platen. Voeg 1,1 ml MES buffer voor glas gerechten.
  8. Spoel oppervlak door ontladen en het trekken van de vloeistof uit een vast punt, zoals de hoek van de put. Houd de pipet op ongeveer een 70 ° hoek, zodat de tip is niet direct gerichtin het oppervlak. Spoel tweemaal meer met MES buffer.
  9. Breng de DSB oplossing op de oppervlakken om hen te incuberen. Voeg 150 ul DSB oplossing per goed voor 8 well platen. Voeg 100 ul DSB oplossing per goed voor 24 well platen. Voeg 1,1 ml voor glas gerechten DSB-oplossing.
  10. Plaats de DSB gedekt glasoppervlakken op een vochtige papieren handdoek in een petrischaal. Dek af en incubeer in een 4 ° C koelkast voor 18-24 uur.

3. Streptavidine functionalisering

  1. Spoel iedere glasoppervlakte driemaal met 1 ml 1,0x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Spoel oppervlak door ontladen en het trekken van de vloeistof uit een vast punt, zoals de hoek van de put. Houd de tube ongeveer een 70 ° hoek, zodat het uiteinde niet direct gericht op het oppervlak. Verdun de streptavidine (SAV) stockoplossing aan 0,4 mg / ml (aanbevolen).
    OPMERKING: isotoon PBS zodat het kan worden gebruikt als een medium voor verdunning en spoelen. PBS wordt gebruikt als oplosmiddel voor de SAv, en daarom heeft geen invloed op het vermogen van de SAV-te binden aan de oppervlakte.
  2. Toepassen 0,4 mg / ml SAv oplossing gelijkmatig op het oppervlak zodat een dunne laag vormt op de bodem van het glas, selecteert de hoeveelheid oplossing op basis van oppervlakte. Voor 8 putjes, voeg 150 ul 0,4 mg / ml SAv oplossing per well. Voor 24 well platen, voeg 100 ul 0,4 mg / ml SAv oplossing per well. Voor glazen schalen, voeg 1,1 ml 0,4 mg / ml SAv oplossing.
  3. Dek af en zet de platen om een ​​14 cm petrischaal om vocht vast te houden. Incubeer de petrischaal in de koelkast voor 18-24 uur.
    LET OP: Het is van essentieel belang om consistente volumes van APTES, DSB, en SAv gebruiken op elke ondergrond.
  4. Spoel iedere glasoppervlakte driemaal met 150 pl PBS om SAv verwijderen. Spoel oppervlak door ontladen en het trekken van de vloeistof uit een vast punt, zoals de hoek van de put. Houd de tube ongeveer een 70 ° hoek, zodat het uiteinde niet direct gericht op het oppervlak.
  5. Bevochtig een papieren handdoek wet gedeïoniseerd water en het papier handdoek flat in 14 cm Petrischaal rond de platen vochtigheid in de putjes te behouden. Dek de petrischaal met de putjes. Incubeer de petrischaal in een 4 ° C Biosafety 1 (BSL-1) koelkast totdat het nodig is.

4. Cell Capture and Release

  1. Begin met T175 kolf (en) van cellen bestemd voor het experiment. Zuig de media van kolf (s). Spoel de resterende media met 5 ml van de ruimtetemperatuur PBS. Zuig PBS uit de fles (s).
  2. Voeg 10 ml van niet-enzymatische lifting middel zoals cel dissociatie oplossing, de T-175 kolf cellen. Plaats de kolf in de incubator gedurende 6 min mogelijk te maken voor het optillen van de cellen van de fles.
  3. Na 6 minuten, voeg 10 ml koud Hank's Balanced Salt Solution (HBSS; zie lijst van Materials) om de opheffing agens te inactiveren. Neem 20 ul van cellen om het aantal cellen in een oplossing met behulp van een hemacytometer tellen.
    OPMERKING: Afhankelijk van de functionalized oppervlakken gebruikt bij het vangen experiment werd het aantal cellen nodig varieert. Voor gefunctionaliseerde 8 putjes, gebruiken 300.000 cellen per putje. Voor gefunctionaliseerde glazen schalen, gebruiken 1,1 miljoen cellen. Voor gefunctionaliseerde 24 putjes, worden 125.000 cellen aan te bevelen. Meer informatie over celtelling wordt gevonden in het supplement.
  4. Herhaal stappen 4.1- 4.3 voor andere kolf van cellen, als er minder cellen aanwezig zijn dan nodig is voor het experiment zijn. Combineer celsuspensies en hertelling cellen tot het totale aantal cellen in oplossing te krijgen.
  5. Spin down celsuspensie in een centrifuge bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C een pellet van geconcentreerde cellen krijgen. Zoek de juiste hoeveelheid HBSS te voegen aan de celsuspensie tot een concentratie van 1 x 10 6 cellen per ml te krijgen, dan zuig het supernatant van de cellen afgedraaid en voeg het berekende volume. Dit volume kan worden berekend met de vergelijkingen in het supplement.
  6. Pipet op en neer (vermaal) naar th mengene cellen in oplossing en vermindering van cellulaire klonteren in oplossing die kan verminderen antilichaambinding. Splits de mobiele oplossing in aparte controle en experimentele oplossingen. Bekijk Aanvullende File voor componenten en berekeningen.
  7. Voeg de gebiotinyleerde antilichamen tegen de betreffende cel bereid zoals vermeld in de Aanvullende File. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C aan een uiteinde-over-end mixer.
    OPMERKING: MCF7GFP cellen, 0,5 mg / ml hIgG of 0,5 mg / ml HLA-ABC antilichamen worden aanbevolen. Voor RAW macrofagen, 1 mg / ml mCD11b worden aanbevolen op de helft van het volume om rekening te houden voor de verdunning verschillen. Menselijke navelstrengader endotheliale cellen (HUVEC's), 0,5 mg / ml hCD31 aanbevolen.
  8. Was de gefunctionaliseerd glazen oppervlak met HBSS. Voor dit experiment, is een 8-well plaat geadviseerd.
    1. Voeg 150 ul HBSS aan elk putje voor 8 well platen. Spoel nog twee keer met behulp van HBSS. Spoel oppervlak door ontladen en het trekken van de vloeistof uit een vast punt, zoals de hoek van de put.Houd de tube ongeveer een 70 ° hoek, zodat het uiteinde niet direct gericht op het oppervlak. Houd koud bij 4 ° C.
  9. Voeg cel oplossingen aan de putjes en wacht 45 minuten voor de cellen te incuberen op ijs op de shaker. Maak de oplossing van biotine in steriele HBSS met berekende volumes zoals beschreven in het supplement.
  10. De cel oplossing uit de putjes glas met HBSS.
    1. Voorzichtig pipet 150 ul HBSS in elk putje. pipet vervolgens de HBSS. Spoel oppervlak door ontladen en het trekken van de vloeistof uit een vast punt, zoals de hoek van de put. Houd de tube ongeveer een 70 ° hoek, zodat het uiteinde niet direct gericht op het oppervlak.
    2. Herhaal dit nog twee keer. Na wassen, voeg HBSS aan de putjes om de cellen vochtig houden.
  11. Voeg 150 ul van 20 mM biotine oplossing voor elke respectieve vrijlating goed, en dan 20 minuten wachten om voor de reactie.
  12. Herinneren niet-specifiek gebonden cels door wassen met HBSS zoals hierboven vermeld, en bij gebruik van fluorescent gelabelde cellen, gaat het beeld aan fluorescentie van de cellen. Beeld ook levende cellen in een kolf (als controle, te vergelijken met de cellen in het putje). Bij gebruik van groen fluorescent eiwit (GFP) getransfecteerde cellen, zal de excitatie 470 nm en de emissie is 515 nm.

5. Antibody Optimization: titratie van antilichamen

  1. Begin met het optillen van de cellen van de T75 of T175 kolf zoals beschreven in stap 4.1- 4.3.
    LET OP: Deze volumes zijn gekalibreerd voor 24 putjes, maar kan worden gewijzigd in een glazen gefunctionaliseerde oppervlakken door middel van heuristische testen aan te passen. Een representatieve titratie van antilichamen wordt weergegeven in figuur 1.
  2. Aantal cellen met de hemacytometer en vervolgens spin down de cel oplossing in een conische buis bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Reconstitueren cellen tot 1 miljoen cellen per ml, volgens de in de Bijlage beschreven berekeningen.
  3. Splits de 1 million cellen per ml oplossing in zes verschillende oplossingen van 500 pl in verschillende centrifugebuizen van het antilichaam (Ab) oplossingen.
    1. Verdun het antilichaam stockoplossing aan 10 ug / ml, 1 ug / ml, 100 ng / ml, 10 ng / ml, 1 ng / ml. Maak de controles met 100 pl Stain buffer (PBS + 1% natriumazide + 1% BSA) en 500 pl van cellen voor de controle zonder Ab daarin. Voor de blanco controle (No Ab en geen cellen), gebruik dan een oplossing van 300 ul PBS.
      LET OP: LET OP: Natriumazide is uiterst giftig, explosief, en extreme zorg moeten worden genomen bij het gebruik ervan. Raadpleeg het veiligheidsinformatieblad (VIB) en gebruik de juiste beschermingsmiddelen.
  4. Combineer en incubeer de Ab oplossingen met de mobiele oplossingen in de end-over-end menger bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Spoel de gefunctionaliseerde 24 putjesplaten met HBSS driemaal. Spoel het oppervlak ontladen en het trekken van de vloeistof uit een vast punt, zoals de hoek van de put. Houd de piPette ongeveer een 70 ° hoek, zodat het uiteinde niet direct gericht op het oppervlak.
  5. Aliquot 125 ul van elk monster oplossing in de juiste APTES, DSB, en SAv gefunctionaliseerde goed. Incubeer bij 4 ° C of op ijs gedurende 45 min op het glasoppervlak. Spoel het oppervlak met HBSS driemaal aspecifiek gebonden cellen te verwijderen. Spoel oppervlak door ontladen en het trekken van de vloeistof uit een vast punt, zoals de hoek van de put. Houd de tube ongeveer een 70 ° hoek, zodat het uiteinde niet direct gericht op het oppervlak. Niet uitspoelen de onderste rij, als die zijn controles.
  6. Voeg 150 ul van HBSS aan elk putje gewassen, zet de 24 well platen op ijs, en vervolgens een bord lezer om fluorescentie van GFP-cellen (excitatie 485 nm / emissie 528 nm) te meten.

6. Cell Optimization: Cell titratie

  1. Til de cellen, zoals vermeld in de stappen 4.1 -4.3.
  2. Aantal cellen met een hemacytometer. Spin down cel zolutie in conische buis bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Reconstitueren cellen tot 1 miljoen cellen per ml.
    OPMERKING: Meer informatie over het gebruik van de hemacytometer is te vinden in het Supplement.
  3. Pipetteer 1,6 ml van de cel oplossing voor de 1,6 miljoen cellen voorraad en plaats in een conische buis. Pipet 800 ul van cellen uit de cel oplossing voor de 800.000 cellen stock en in een conische buis. Pipet 80 ul uit de cel voorraad voor de 80.000 cellen stock en in een conische buis. Pipette 8 ul van de cel voorraad voor 8.000 cellen stock en in een conische buis.
    LET OP: De concentraties zijn per 8 well plaat metingen, repliceren als dat nodig is. Een voorbeeld van output plaat wordt getoond in figuur 2.
  4. Neem de vier voorraadoplossingen en draaien in een centrifuge bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Re-schorten alle voorraad oplossingen in 400 ul van HBSS.
  5. Voeg 1,6 pl 100 ng / ml antilichaam aan de cel 1.600.000 stock, 0,8 μl op de 800.000 cel stock, en 0,5 pl voor alle andere bestanden. Incubeer het antilichaam gedurende 30 min in end-over-end mixer gedurende 30 min bij 4 ° C. Was de gefunctionaliseerd glazen oppervlak met HBSS driemaal.
    LET OP: De gefunctionaliseerde 8 wells plaat wordt aanbevolen voor microscopie kwantificering, terwijl de gefunctionaliseerde 24 wells plaat wordt aanbevolen voor plaatlezer kwantificering. Antilichaamconcentratie van 8000 cellen stock niet beperkt tot de beperkende factor van het opvangoppervlak laat het gebrek aan antilichamen in oplossing zijn, maar het vastleggen eigenschappen van het oppervlak.
  6. Toepassen 150 ul van de monsteroplossingen aan elk putje. Breng de 1,6 miljoen cel bouillon aan de eerste kolom van waterputten aan de linkerkant. Breng de 800.000 cel bouillon aan de tweede kolom van links. Breng de 80.000 cel bouillon aan de derde kolom van links. Ten slotte gelden de 8000 cel bouillon aan de laatste kolom. Incubeer gedurende 45 minuten bij 4 ° C op de shaker.
    OPMERKING: De 1,6 miljoencel stock dient als de hoogste concentratie te onderzoeken, en het dubbele van de hoeveelheid cellen die kenmerkend wordt gebruikt in mobiele scheidingsexperimenten (600.000 cellen per putje) De 800,000 cel stock is de plaats voor het experiment is de typische celconcentratie die wordt gebruikt in mobiele scheidingsexperimenten (3.000.000 cellen per putje). De 80.000 cel voorraad dient als een tienvoudige verdunning om te testen op lagere concentraties voor mobiele capture (30.000 cellen per well). De cel 8000 stock fungeert als een honderdvoudige verdunning te gebruiken als een test om de ondergrens van cellulaire afscheiding (3000 cellen per putje) controleren.
  7. Spoelen met HBSS drie keer. Spoel oppervlak door ontladen en het trekken van de vloeistof uit een vast punt, zoals de hoek van de put. Houd de tube ongeveer een 70 ° hoek, zodat het uiteinde niet direct gericht op het oppervlak. Verzamel alle wasbeurten.
  8. Het imago van de cellen op een fluorescentiemicroscoop, als het gebruiken van 8 putjes, neem foto's van elke surgezicht en toepassing 150 ul biotine elk oppervlak gedurende een uur bij 4 ° C op de shaker. Na één uur, spoel afgifte putjes biotine met HBSS 3 keer als voorheen. Verzamel alle wasbeurten uit putten voor het tellen van de hemocytometer en beeld de release putten.
  9. Solliciteer 150 ul van 20 mM overmaat biotine oplossing voor vrijlating putten biotine eigenen gedurende 1 uur, bij gebruik van 24 putjes en spoel dan die putjes 3 keer met HBSS. Kwantificeren 24 well platen met behulp van een plaat lezer. Gebruik een hemacytometer om cellen te tellen van alle verzamelde goed wast.

7. Beeldanalyse

Let op: de Fiji-softwarepakket (http://fiji.sc/Fiji) wordt aanbevolen voor beeldanalyse. Aanvankelijk werden de beelden omgezet in grijstinten afbeelding in, en vervolgens werd de helderheid / contrast aangepast om de cellen uit te brengen.

  1. Laad de afbeelding en om te zetten in grijswaarden door te klikken op de tab afbeelding vervolgens naar beneden scrollen naar 'Type' en vervolgens te klikken op4, 8 bit ".
  2. Verhoog het contrast van de afbeelding door te klikken op de tab afbeelding en vervolgens scrollen naar "Adjust". Klik op "Helderheid en contrast", en gebruik de schuifbalken om de cellen te onderscheiden. Bij gebruik van fluorescentie beelden, keren de beelden naar de cellen meer bepaald te maken.
  3. Laad een plugin op ImageJ ITCN genoemd (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) om de beelden te analyseren.
  4. Open ITCN. Wanneer een dialoogvenster waarin dwingt de gebruiker verschillende parameters om de grootte van de cel te schatten, de minimale breedte van de cel van belang als eerste. Klik op de optie "Detect Dark Peaks" als de afbeelding fluorescerende en de cellen worden verduisterd.
  5. Stel de drempelwaarde op 2 in eerste instantie, en dan druk op de knop "Count". Een nieuw telde versie van de foto zal verschijnen met rode stippen af ​​te bakenen waar de cellen werden geteld.
  6. Stel de parameter drempel en de breedte om meer accurate mobiele data door defini krijgenng groot als een "cel". Opmerking: Het aantal cellen geteld zal worden in een dialoogvenster aan de rechterkant. Het veranderen van parameters zal verschillend aantal cellen geteld geven.
  7. Blijf doorloopt de drempel en breedteparameters tot een goede schatting is bereikt voor het aantal cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Met dit protocol tonen wij cell capture (figuur 3A) en mobiele afgifte (figuur 3C) van MCF7GFP cellen en levende cellen (Afbeelding 4). We gekwantificeerd de cel vast te leggen als de 60% ​​en 80% werden vrijgegeven (figuur 3C). Wanneer we deze benadering uitgebreid tot een mengsel van RAW 264,7 macrofagen en MCF7GFP cellen, 50% RAW macrofagen werden vastgelegd (fig. 3D) en 80% van RAW macrofagen waren release met 20 mM biotine (Figuur 3B). Sinds overmaat antilichaam cel capture kan afnemen, we geoptimaliseerd via titratie 0-10.000 nM HLA-antilichaam, en constateren dat de ideale antilichaamconcentratie is tussen 100-1.000 mM antilichaam (afb. 1). Evenzo we vaststellen dat het ideale concentratie van cellen die kunnen worden vastgelegd is 1 x 10 5 en 1 x 10 6, aangezien daaronder aantal cellen, waarden hoger dan de achtergrond 17(Figuur 2). De fluorescentie data uit elk putje wordt verwerkt zoals hieronder beschreven.

vergelijking 1

Hier wordt het gemiddelde van 3 replicaten genomen uit een monster zonder antilichaam (blanco) en wordt afgetrokken van de fluorescentie verkregen uit elk monster. Deze waarde wordt dan genormaliseerd naar het gemiddelde maximale fluorescentie. Deze verwerking kan de onderzoeker aan de lage limiet van cellulaire detectie duidelijk te kunnen zien.

Figuur 1
Figuur 1. De genormaliseerde Blanked titratie van antilichamen. Human HLA-ABC is getitreerd over een constante hoeveelheid MCF7GFP cellen (125.000 cellen per putje) en de fluorescentie van de gevangen cellen werden gekwantificeerd met behulp van een plaat lezer. voorafgaandblootstelling aan het gefunctionaliseerde oppervlak, werden de cellen gecentrifugeerd en antilichamen die niet-specifiek antilichaam bijlage te verwijderen. Zonder deze centrifugatie wordt overmaat antilichaam verzadigen oppervlak voorkomen pulldown cel, zoals getoond met concentraties van 10.000 ng / ml wanneer centrifugering voldoende antilichaam oververzadiging kunnen raken, waardoor minder cellen binden aan het oppervlak niet. Grijze lijn stelt de controle. Fout balken geven standaardafwijking van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Genormaliseerde Blanked Cell titratie. Met behulp van geoptimaliseerde antilichaamconcentratie van de titratie van antilichamen, MCF7GFP cellen werden getitreerd om optimale concentratie vast te leggen, terwijl ke vindenEping gefunctionaliseerde oppervlak en antilichaamconcentraties constant. Dit kan worden gebruikt om mobiele vangen voor verschillende toepassingen kalibreren. Kolommen in deze figuur zijn replica's, terwijl de rijen van de concentratie van de cellen te veranderen om het idee bereik voor mobiele capture vinden. Grijze lijn staat voor controle en foutbalken vertegenwoordigen standaardafwijking van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. Opname en afgifte-experimenten. Eén celmengsel werd blootgesteld aan het gefunctionaliseerde oppervlak (A), het vastleggen MCF7GFP cellen via HLA-ABC-antilichaam. Na wassen met HBSS (B) bleef cellen gevangen, maar bij blootstelling aan een oplossing van 20 mM biotine (C) werden de cellen released. Een mengsel van cellulaire MCF7GFP cellen RAW 264,7 macrofagen werden blootgesteld aan een gefunctionaliseerd oppervlak werden gemaakt met mCD11b antilichaam (D). Niet-specifieke MCF7GFP cellen zijn gelabeld in het groen. Fluorescentie-intensiteit van de MCF7GFP cellen af bij blootstelling aan een neutraal was (E), wat impliceert dat het oppervlak hen niet gericht, en dat zij hechten aspecifiek. Bij blootstelling aan een biotine was (F), werden de beoogde RAW macrofagen vrijgegeven uit het oppervlak. Schaal bars zijn 250 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. Positieve en negatieve Cell Control for Dual Cell Isolation. De positieve controle RAW macrofagen worden afgebeeld ona fluorescentiemicroscoop, toont geen fluorescentie activiteit en de relatieve afmetingen van cellen. Helderveld RAW macrofagen vertonen cel sortering (A), terwijl onder GFP excitatie er geen fluorescentie (B), die in de samengevoegde afbeelding (C). De negatieve controle MCF7GFP cellen worden afgebeeld op een fluorescentiemicroscoop toont grote fluorescerende activiteit en de relatieve MCF7GFP cellen. Cellen worden afgebeeld op helderveld (D), met lijmen, en terwijl onder GFP excitatie (E) tonen grote fluorescentie, die duidelijk in de samengevoegde afbeelding (F) kan worden aangetoond. Schaal bars zijn 250 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
FIGUUR 5. Vergelijking van de centrifuge gebruik in standaard zuiveringstechnieken. De pre-analyse centrifugeren stap is geconserveerd in monstervoorbereiding. Magnetisch bolletje isolatie evenals FACS omvat verschillende extra centrifugeren stappen, waarin de nadruk introduceert op cellen en kunnen expressie niveaus veranderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende Code File. Berekeningen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Verbeteringen in cel isolatietechnieken bevordert wetenschappelijke studies in de structuur-functie relaties in Neuroscience 18, stamcel programmering regeneratieve biologie en angiogene signalering in vasculaire biologie 19. Inderdaad, primaire celkweek 20 (bijvoorbeeld HUVEC) vasculaire biologie voornamelijk plaatsvinden door gebruik van cel isolatietechnieken. Cell isolatie werd onlangs ook gebruikt voor de kwantitatieve flow (qFlow) cytometrie analyse van de plasmamembraan receptoren 3,14,15,19,21. De bestaande celisolatie methodologieën invloed celoppervlak receptor niveaus en zijn duur in personele en reagentia. We hebben geavanceerde een nieuwe werkwijze oppervlak functionalisering 17, waardoor het creëren van een zachte systeem reproduceerbaar vangst van één celtype uit een mengsel van celtypen aan deze tekortkomingen tegemoet. Deze techniek kan worden geïntegreerd in een iteratief systeem, waardoor de mogelijkheid capturing verschillende celtypen stapsgewijs met specifieke antilichamen. Om de procedure verder te verduidelijken, zijn een aantal vragen en antwoorden voor probleemoplossing hieronder aangeboden:

Functionalisering Optimization: De functionalisatie processen is geoptimaliseerd voor een verbeterde uniformiteit en pull-down van MCF7gfp cellen. Dit protocol kan ook worden geoptimaliseerd en aangepast voor elk type cel en configuratie antilichaam. Dit kan worden bereikt door het veranderen van de concentraties van de basiscomponenten van het opvangoppervlak, of door de soort of de concentratie van de antilichamen. Meeste types antilichaam kan worden gebiotinyleerd met de bovenstaande protocol. Eenmaal gebiotinyleerd, kunnen ze worden getitreerd (figuur 1) tot ideale concentratie voor pull-down vinden. De celconcentratie kan worden getitreerd (figuur 2) naar het ideale concentratie van cellen om te vangen. Gebruik wordt de haalbaarheid van het vastleggen van een bepaald celtype met de doptuur oppervlak kan worden vastgesteld. Als bijvoorbeeld een celtype van belang is op de schaal van 100 cellen per miljoen cellen vastleggen concentraties van cellen in dat bereik met het gefunctionaliseerde oppervlak zou ideaal zijn. Als tijdens de titratie, het oppervlak kan cellen van die kleine concentratie, en vervolgens over optimalisatie van het oppervlak of antilichaam nodig om te kunnen uitfilteren cellen in die concentratiebereik.

Welke cellen worden gebruikt in dit protocol? Hoe kan iemand dit protocol om een ander celtype te gebruiken aanpassen?

Momenteel is dit protocol gebruikt MCF7-GFP-cellen, en RAW 264,7 macrofagen worden vaak opgenomen om het vermogen om in een dual-celmengsel out getrokken één cel te laten zien. Deze cellen werden gekozen omdat zij twee van de belangrijkste celtypen muis xenograft model (humane tumor in muizen milieu) waren. Om de werkwijze te kalibreren voor diverse andere cellen, antilichaam specificity staat voorop. Er zijn verschillende online middelen die beschikbaar zijn voor het selecteren van antilichamen 22.

Wat zijn enkele voordelen van deze methode?

Gentle aanpak: Het ontbreken van kracht maakt deze aanpak zacht. Sterker nog, onze berekend dwarskracht is maximaal 24 x 10 -6 pN 17, die geen significante verstoring van biomarkers zou veroorzaken, aangezien hydrodynamische stress van 2,09 Pa (656 pN uitgaande van 314 pM 2 celoppervlak gebied) veroorzaken necrose, terwijl waarden van stress hieronder 0,59 Pa (185 pN uitgaande van 314 pM 2 celoppervlak gebied) niet 23. Deze zachte aanpak is dus voordelig ten opzichte van een aantal in de handel verkrijgbare opties zoals-centrifugeren gebaseerde benaderingen 24, die maximaal inspannen om 0.78 Pa 25 van de piek shear stress als gevolg van de plotselinge versnelling bij waarden rond 600 G, welk eiwit expressie patronen en morfologie 25 kan veranderen , 26 23 induceren. Zo een proces dat de hoeveelheid centrifuge toepassingen zou kunnen verminderen de hoeveelheid stress die de cellen zou ervaren door zuivering en uiteindelijk te komen fysiologische gegevens te verminderen. Onze huidige protocol gebruikt centrifuges te zuiveren en reconstrueren de celconcentratie voorafgaand aan vangst, maar dit bereidingsproces is standaard in veel zuiveringstechnieken zoals magnetische korrel scheiding 27,28 flowcytometrie 29, en FACS 30 (figuur 5). Onze aanpak reduceert alle daaropvolgende centrifugatie processen die de andere technieken naast de bereidingsstap.

Biotine-avidine aanpak: De toepassing van de meest gebruikte biomaterialen (DSB-SAv en biotine-SAV) maakt deze benadering ook voordelig 31,32. Avidine familie eiwitten binden zeer selectief aan de biotine Eiwitten en worden gebruikt voor diverse Scientific en medische toepassingen, waaronder: antilichaam-fluorofoor attachment 33, kwantitatieve Qdot-polystyreenparel attachment 34, en de oprichting van hydrogels die reageren op prikkels in de omgeving om ingekapselde geneesmiddelen 32 vrij te geven. Bovendien, het relatieve gemak van het verwerven van gebiotinyleerde antilichamen maakt deze aanpak breed toegankelijk en aanpasbaar.

Desthiobiotine aanpak zonder kralen: Het vangen oppervlak komen tot het gebruik van desthiobiotine zonder het gebruik van agressieve reagentia en krachten om de cellen los. DSB is gebruikt voor omkeerbare celhechting en afgifte van andere systemen in combinatie met DSB-antilichamen en magnetische korrels 35. De harde gevolgen van de scheidingstechniek en de grote cellulaire schade in verband met het bereiden van de monsters 27,28 resulteren in differentiële expressie chemokine receptor en 28,36. Deze aanpak heeft tot doel te verzachtenen deze beperkingen te overwinnen door het elimineren van het gebruik van zowel magneet en kralen een veel zachter wassen en afgifte methodologie creëren.

Wat zijn de kritische stappen in dit protocol? Wat kan variabiliteit veroorzaken? Hoe kan dat variabiliteit worden gecontroleerd?

Dit proces heeft vier belangrijke stappen die leiden tot de afname van de efficiëntie van het opvangoppervlak. De eerste belangrijke stap is het voorkomen van water op APTES het oppervlak tijdens de APTES functionalisering stappen, die zou leiden tot de vernietiging van de zelf samengestelde oppervlak. Dit wordt gecompenseerd door de ethanol als oplosmiddel en het bakken van de APTES in de oven voor hydrolyse van latere waterige oplossingen verminderen. De tweede kritische stap is de EDC reactiestappen waarin EDC katalyseert de reactie van de DSB met APTES: zodat verknoping van de twee lagen. Als de EDC wordt uitgesloten of onvoldoende toegevoegd, wordt het DSB niet in staat zijn om de vloer te bevestigen, whic h zal de release mechanisme in gevaar brengen. De derde belangrijke stap is in de loop van de SAV-functionalisering, het behoud van de SAV-laag is van cruciaal belang. Non-uniformiteit van de streptavidine laag resulteert in afname van vangdoelmatigheid. De vierde kritische stap in de biotinylering van het antilichaam, aangezien de binding van het antilichaam aan het opvangoppervlak wordt mogelijk gemaakt door de biotine-streptavidine interactie van de opvangoppervlak en antilichamen. Als het antilichaam niet-gebiotinyleerd, dan zal de streptavidine laag niet in staat om het te vangen en trek hem naar beneden, waardoor de vangst oppervlak nutteloos. Variabiliteit en inconsistentie in het oppervlak van een opname kan worden toegeschreven aan concentratie niet- regelmatigheid en stochasticiteit van de laag beslag. Deze variatie kan worden bestuurd door nauwkeurige concentraties laag gekalibreerde componenten aan het oppervlak en de beoogde doelstellingen van vangst. In dit ontwerp zijn de concentraties speciaal gekalibreerd om de vangst van MCF7-GFP-cellen.

e_content "> Wat zijn enkele nadelen van deze methode?

Momenteel is de APTES functionalisatie uitgevoerd door toepassing van een vloeibare fase onderdompeling van het oppervlak voor 55 minuten gevolgd door een bakstap tot 2 uur. Hoewel dit zorgt voor een volledige laag APTES silaan te binden aan het oppervlak, zou een meer uniforme werkwijze de dampfase silanisering 37 zijn. Dit vermindert APTES contacttijd, waardoor het opslaan van de onderzoeker tijd, evenals het verhogen van uniformiteit. Bovendien is verbeterd pull-down waargenomen 17 wanneer overnacht incubatie van SAv wordt gebruikt, en momenteel wordt het oppervlak functionalisering vereist twee, overnacht incubatie, waardoor het totale proces neemt drie dagen. Dus, het optimaliseren van de chemie zou aanzienlijke tijdswinst voor de onderzoeker te bieden.

Wat zijn sommige waarschuwingen of voorzorgsmaatregelen die nuttig kan zijn?

Wanneer functionaliseren oppervlakken, is imluut dat de juiste zorg wordt genomen om het risico van respiratoire beschadiging. Zowel APTES en mercaptoethanol kunnen zeer gevaarlijk zijn voor de longen en bijbehorende organen zijn, dus is het noodzakelijk de functionalisering proces in een chemische kap interactie terugloopt en chemische dampen. Mercaptoethanol een thiol wat vooral in scherpe geur. Bij het gebruik van mercaptoethanol, zorgen voor gecontamineerd afval te zitten in kap voor een dag of twee weg te doen.

Wat zijn de toekomstige doelstellingen en toepassingen van dit oppervlak?

Onze toekomstige doelen omvatten het aanpassen van het oppervlak met verschillende relevante celtypes voor angiogene gerelateerde ziekten. In het bijzonder, we zijn van plan om zich te concentreren op humane navelstreng endotheelcellen om segue aan het gebruik van bloedmonsters en het scheiden van cellen van belang vanaf daar. Daarnaast zijn we van plan om scheiding modaliteiten te integreren zoals aptameren in het ontwerp van de gefunctionaliseerde surface verder te verhogen onze vangst en vrijlating percentages.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) Acros Organics 919-30-2 Used to make 2% APTES solution
Plasma Cleaner Pico Diener Model 1 Cleans surfaces and allows for bonding of PDMS to glass
d-Desthiobiotin (DSB) Sigma D20655 Used as the releasing mechanism in the cellular capture surface. 
dimethyl sulfoxide (DMSO) British Drug Houses (BDH) BDH1115-1LP Dissolves the DSB into solution
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) Thermo-Scientific 5g: 22980
25g: 22981
Activates carboxylic acids and allows binding of proteins to glass surface.
uncoated 8-well culture slide BD Falcon Case of 24: 354118
Case of 96: 354108
Used in cellular experiments involving Zeiss fluorescence microscope such as initial capture and release quantification experiments
Glass bottom 24-well plates MatTek P24G-0-13-F Used in cellular experiments involving the plate reader such as antibody and cellular titration experiments
Mercaptoethanol Science Lab 60-24-2 Used to quench reaction between EDC and DSB
4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate
(MES Hydrate 99%)
Fisher Scientific AC172590250 Used to make 0.1 M MES Buffer for use in EDC reaction
Precision Oven Thermo Scientific 11-475-153 Used in curing of PDMS and APTES layer.
Titramax 1000 Shaker Heidolph 13-889-420 Used to ensure even distribution of APTES on surfaces.
1x Streptavidin 5 mg [e7105-5mg] Proteo Chem 9013-20-1 Biotin-binding protein. May cause irritation.
5 cm Glass Dish Fisher Scientific 08748A Used in HUVEC studies as well as future profiling studies.
14 cm Petri Dish with Cover Sigma-Aldrich Z717231 Used to hold samples being functionalized and transport them.
MCF7-GFP cells Cell Biolabs AKR211 Stored in liquid nitrogen
RAW264.7 mouse macrophages ATCC TIB-71 Gifted to us from Smith lab at the University of Illinois. Stored in liquid nitrogen.
TrypLE Life Technologies 12605036 Stored in 100 ml at room temperature
Dulbecco’s modified Eagle medium Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC 50003PC Supplier: Corning
Nonessential amino acids Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC 25-025-CI Already added into DMEM by facility. Supplier: Corning.
Cell scraper Fisher Scientific 12-565-58 Small 23 cm 50 pack
Cell Dissociation Solution Corning MT-25-056CI Used to lift cells non-enzymatically for the use in cell experiments
Hemacytometer Hausser 02-671-54 Used to count cells for quantification of cell solutions and capture and release effectivity.
Biotin Amresco 58-85-5 Used to release cells from surface.
HBSS Created from Recipe N/A Used to keep cells alive in suspension as well as wash surfaces of non-specific binding. Adapted from Cold Spring Harbor Protocols: In 500 ml, use 4 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.0402 g Na2PO4•7H2O, 0.03 g KH2PO4 and 0.5 g glucose. Add DI water to get to 500 ml, filter, and then refrigerate.
HLA-ABC Antibody BioLegend 311402 Antibody used to capture MCF7gfp cells
hIgG Antibody BioLegend HP6017 Antibody used to capture MCF7gfp cells
MCF7 GFP cells Cell Biolabs AKR-211 Luminal Breast Cancer line that has been transfected with green fluorescent protein.
Assorted Conicals Thermo-Scientific 15mL: 12-565-268 50/15 ml plastic conicals for storing solutions and aliquots.
Mini-Tube Rotators (End over End Mixer) Fisher Scientific 05-450-127 Used to incubate antibody and mix other cellular solutions in order to mix
Axiovert 200M (Fluorescence Microscope) Zeiss N/A Zeiss Axiovert 200 M inverted florescence microscope.
Zeba Desalting columns Thermo-Scientific PI-87770 Used to purify newly biotinylated antibodies after the use of the Biotinylation Kit. Instructions provided at: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf
EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation Kit Thermo- Scientific Used to biotinylate antibodies to allow them to integrate with the capture surface
Plate Reader BioTek Synergy HTX Multimode Reader Used to quantitatively measure fluorescent intensity in the titration experiments.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erdbruegger, U., Haubitz, M., Woywodt, A. Circulating endothelial cells: a novel marker of endothelial damage. Clin. Chim. Acta. 373, (1-2), 17-26 (2006).
  2. De Spiegelaere, W., Cornillie, P., Van Poucke, M., Peelman, L., Burvenich, C., Van den Broeck, W. Quantitative mRNA expression analysis in kidney glomeruli using microdissection techniques. Histol. Histopathol. 26, (2), 267-275 (2011).
  3. Chen, S., Guo, X., Imarenezor, O., Imoukhuede, P. I. Quantification of VEGFRs, NRP1, and PDGFRs on Endothelial Cells and Fibroblasts Reveals Serum, Intra-Family Ligand, and Cross-Family Ligand Regulation. Cell. Mol. Bioeng. 8, (3), 383-403 (2015).
  4. Cheung, L. S. L., et al. Detachment of captured cancer cells under flow acceleration in a bio-functionalized microchannel. Lab Chip. 9, (12), 1721-1731 (2009).
  5. Privorotskaya, N., et al. Rapid thermal lysis of cells using silicon-diamond microcantilever heaters. Lab Chip. 10, (9), 1135-1141 (2010).
  6. Park, K., Akin, D., Bashir, R. Electrical capture and lysis of vaccinia virus particles using silicon nano-scale probe array. Biomed. Microdevices. 9, (6), 877-883 (2007).
  7. Galletti, G., Sung, M., Vahdat, L. Isolation of breast cancer and gastric cancer circulating tumor cells by use of an anti HER2-based microfluidic device. Lab Chip. 14, (1), 147-156 (2014).
  8. Schudel, B. R., Choi, C. J., Cunningham, B. T., Kenis, P. J. A. Microfluidic chip for combinatorial mixing and screening of assays. Lab Chip. 9, (12), 1676-1680 (2009).
  9. Lien, K. Y., Chuang, Y. H., et al. Rapid isolation and detection of cancer cells by utilizing integrated microfluidic systems. Lab Chip. 10, (21), 2875-2886 (2010).
  10. Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a. PNAS. 107, (35), 18392-18397 (2010).
  11. Yu, M., Ting, D., Stott, S., Wittner, B., Ozsolak, F. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487, (7408), 510-513 (2012).
  12. Sheng, W., Ogunwobi, O., Chen, T., Zhang, J. >Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab Chip. 14, (1), 89-98 (2014).
  13. Zheng, X., Cheung, L. S. L., Schroeder, J. A., Jiang, L., Zohar, Y. A high-performance microsystem for isolating circulating tumor cells. Lab Chip. 11, (19), 3269-3276 (2011).
  14. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantification and cell-to-cell variation of vascular endothelial growth factor receptors. Exp. Cell Res. 317, (7), 955-965 (2011).
  15. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Expression of VEGF receptors on endothelial cells in mouse skeletal muscle. PLoS One. 7, (9), e44791 (2012).
  16. Ludwig, A., Kretzmer, G., Schügerl, K. Determination of a "critical shear stress level" applied to adherent mammalian cells. Enzyme Microb. Technol. 14, (3), 209-213 (1992).
  17. Ansari, A., Lee-Montiel, F. T., Amos, J., Imoukhuede, P. I. Secondary anchor targeted cell release. Biotechnol. Bioeng. 112, (11), 2214-2227 (2015).
  18. Drenan, R. M., Nashmi, R., Imoukhuede, P., Just, H., McKinney, S., Lester, H. A. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol. Pharmacol. 73, (1), 27-41 (2008).
  19. Imoukhuede, P. I., Dokun, A. O., Annex, B. H., Popel, A. S. Endothelial cell-by-cell profiling reveals temporal dynamics of VEGFR1 and VEGFR2 membrane-localization following murine hindlimb ischemia. Am J Physiol Hear. Circ Physiol. 4, (8), H1085-H1093 (2013).
  20. van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3, (6), 1085-1091 (2008).
  21. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantitative fluorescent profiling of VEGFRs reveals tumor cell and endothelial cell heterogeneity in breast cancer xenografts. Cancer Med. 3, (2), 225-244 (2014).
  22. BD Biosciences. CD Marker Handbook: Human and Mouse. at: https://www.bdbiosciences.com/documents/cd_marker_handbook.pdf (2010).
  23. Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows. Biotechnol. Bioeng. 104, (2), 360-370 (2009).
  24. Processing Blood. Perritt, D., Wong, P., Macpherson, J. L., Henrichsen, K., Symonds, G., Pond, S. at: https://www.google.com/patents/US20140030238 (2014).
  25. Fukuda, S., Schmid-Schönbein, G. W. Centrifugation attenuates the fluid shear response of circulating leukocytes. J. Leukoc. Biol. 72, (July), 133-139 (2002).
  26. dela Paz, N. G., Walshe, T. E., Leach, L. L., Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. Role of shear-stress-induced VEGF expression in endothelial cell survival. J. Cell Sci. 125, (Pt 4), 831-843 (2012).
  27. Allard, W. J., et al. Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant Diseases Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant diseases.". Clinical Cancer Research. 10, 6897-6904 (2005).
  28. Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450, (7173), 1235-1239 (2007).
  29. Chen, S., Weddel, J., Gupta, P., Conard, G., Parkin, J., Imoukhuede, P. I. QFlow Cytometer-Based Receptoromic Screening: A High-throughput Quantification Approach Informing Biomarker Selection and Nanosensor. Submiss. (2016).
  30. Vasa, M., et al. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease. Circ. Res. 89, (1), E1-E7 (2001).
  31. Hirsch, J. D., Eslamizar, L., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Anal. Biochem. 308, (2), 343-357 (2002).
  32. Wilchek, M., Bayer, E. A. Applications of Avidin-Biotin Technology: Literature Survey. Methods Enzymol. 152, (1), 183-189 (1987).
  33. Wu, X., et al. Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots. Nat. Biotechnol. 21, (1), 41-46 (2002).
  34. Lee-Montiel, F. T., Imoukhuede, P. I. Engineering quantum dot calibration standards for quantitative fluorescent profiling. J. Mater. Chem. B. 1, 6434 (2013).
  35. Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof. Hornes, E., Korsnes, L. Available from: http://www.google.com/patents/US5512439 (1996).
  36. Naranbhai, V., et al. Impact of blood processing variations on natural killer cell frequency, activation, chemokine receptor expression and function. J. Immunol. Methods. 366, (1-2), 28-35 (2011).
  37. Yadav, A. R., Sriram, R., Carter, J. A., Miller, B. L. Comparative study of solution-phase and vapor-phase deposition of aminosilanes on silicon dioxide surfaces. Mater. Sci. Eng. C. 35, (1), 283-290 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics