Un metodo di isolamento delle cellule mirata tramite Glass funzionalizzazione superficiale

1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Liberal Arts & Sciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Biomedical Engineering, Illinois Institute of Technology
Cancer Research

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Ansari, A., Patel, R., Schultheis, K., Naumovski, V., Imoukhuede, P. I. A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization. J. Vis. Exp. (115), e54315, doi:10.3791/54315 (2016).

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Abstract

Introduction

Da banco approcci separazione cella corrente (ad esempio, la fluorescenza delle cellule attivate di smistamento 1, cattura laser micro-dissezione 2, immuno-magnetico tallone di separazione 1) può richiedere diverse ore di preparazione e smistamento. Questi grandi scale temporali possono influenzare i livelli di risposta e di espressione fisiologici, con conseguente analisi che non sono rappresentativi della risposta fisiologica 3. I sistemi sono necessari che possono rapidamente ed efficacemente isolare specifici tipi cellulari senza interrompere recettore livelli di superficie cellulare per migliorare l'isolamento delle cellule e arricchimento per applicazioni biomediche. Pertanto, il razionale per il nostro approccio è quello di sviluppare un approccio dolce per l'isolamento delle cellule.

Il "lab on a chip" concetto offre la promessa di ordini di grandezza più veloce di isolamento cellulare (ore-to-minuti), e coinvolge più frequentemente catturare cellule su una superficie e rilasciare cellule o conte intracellularenti attraverso fisico 4,5 o metodi chimici 6. Anche se questi approcci offrono alcuni vantaggi, quali l'identificazione dell'espressione proteica 7,8, individuando espressione di RNA 9-11, o addirittura fornire cellule per coltura in vitro 12,13, molte di queste tecniche non può essere tradotto per la diagnostica, come recettore delle cellule profilatura a causa ai loro ambienti non fisiologici. Agenti di sollevamento enzimatici come la collagenasi può colpire anche queste quantità del recettore 14,15, cioè le tecniche di quantificazione recettore delle cellule che utilizzano questi agenti di sollevamento non genererà dati fisiologici precisi. Lisi cellulare impedisce differenziazione tra i recettori di superficie nativi e quelli precedentemente internalizzato 16. Questo protocollo descrive un approccio rapido e delicato per l'isolamento delle cellule.

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Protocol

1. Pulizia della superficie di vetro e Preparazione Reagenti

  1. Inserire una superficie di vetro in una macchina di plasma di ossigeno per 5 min a 50% di potenza per pulirlo.
  2. Preparare ricostituito (3-amminopropil) trietossisilano (APTES) soluzione 2,5 ml 2%, con l'aggiunta di 50 ml di APTES e 2,45 ml di etanolo in un tubo conico.

2. APTES e DSB Funzionalizzazione

  1. Aggiungere la soluzione APTES alle superfici. Dispensare 150 ml per pozzetto per 8 pozzetti. Pipettare 100 ul per pozzetto per 24 pozzetti. Pipettare 1,1 ml per piatti di vetro 60 x 15 mm. Coprire le superfici per evitare l'evaporazione e la distribuzione non uniforme della soluzione APTES. Collocare le superfici su un agitatore piattaforma per 50 min a temperatura ambiente, che crea una distribuzione uniforme dello strato APTES.
    NOTA: APTES è un aminosilane che forma il primo strato di superficie. Se si utilizza una superficie diversa, euristicamente determinare il volume di soluzione necessario per coprire la superficie.
  2. Selezionare la temperatura del forno, mentre le superfici sono shaker: Riscaldare a 55 ° C per 2 ore per gli 8 pozzetti e 24 pozzetti. vetro di calore solo piatti a 90 ° C per 1 ora.
  3. Lavare le superfici con etanolo.
    1. Somministrare la quantità di etanolo richiesto facendo riferimento basato sulla superficie utilizzata. Aggiungere 150 ml di etanolo a ciascun pozzetto per 8 pozzetti. Aggiungere 125 ml di etanolo a ciascun pozzetto per 24 pozzetti. Aggiungere 1,1 ml di etanolo per piatti di vetro.
    2. Risciacquare la superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l'angolo del pozzo. Tenere la pipetta in un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie. Risciacquare altre due volte con etanolo.
      NOTA: Se uno dei fondo di vetro piatti e hanno alcuna plastica in loro, non li riscaldare superiore a 65 ° C, come la plastica inizierà a sciogliersi e ordito.
  4. Lavaggio con gas 100% di azoto erogato da un serbatoio. Mettere le superfici in oVen.
  5. Preparare 2,5 ml di soluzione di d-desthiobiotin (DSB) combinando 1,5 mg / ml DSB in 37,5 ml di dimetilsolfossido (DMSO), e 5 mg / ml-etil-1 3- (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDC) in 2462,5 microlitri della (pH 6) tampone 0,1 M di acido 4-morpholinoethanesulfonic hydrate (MES). Poi combinare entrambe le soluzioni.
  6. Aggiungere 1 ml di 2-mercaptoetanolo β, dopo 15 minuti, nella soluzione di estinguere la reazione tra DSB e EDC. Rimuovere APTES calde funzionalizzati superfici di vetro dal forno. Attendere 5-10 min per le superfici in vetro a raffreddarsi.
  7. Aggiungere MES tampone la superficie da lavare, utilizzando importi basati sulla superficie. Aggiungere 150 ml MES tampone di 8 pozzetti. Aggiungere 125 microlitri MES tampone di per 24 pozzetti. Aggiungere 1,1 ml MES buffer per piatti di vetro.
  8. Risciacquare superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l'angolo del pozzo. Tenere la pipetta ad un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamentenella superficie. Risciacquare altre due volte con tampone MES.
  9. Applicare la soluzione DSB alle superfici da consentire loro di incubare. Aggiungere 150 microlitri soluzione DSB per ben 8 pozzetti. Aggiungere 100 pl per soluzione DSB bene per 24 pozzetti. Aggiungere 1,1 ml di soluzione di vetro piatti DSB.
  10. Posizionare le superfici in vetro DSB coperti su un tovagliolo di carta umido all'interno di una capsula di Petri. Coprire e incubare in un C frigo a 4 ° C per 18-24 ore.

3. Streptavidina Funzionalizzazione

  1. Risciacquare ogni superficie di vetro tre volte con 1 ml di 1.0x tampone fosfato (PBS). Risciacquare superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l'angolo del pozzo. Tenere la pipetta in un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie. Diluire la soluzione streptavidina (SAV) stock di 0,4 mg / ml (consigliato).
    NOTA: PBS isotonica modo che possa essere utilizzato come mezzo per diluizione e risciacquo. PBS è usato come solvente per il SAv, e quindi, non influenzerà la capacità del SAv per legarsi alla superficie.
  2. Applicare 0,4 mg / ml di soluzione di SAv uniformemente alle superfici in modo che un sottile strato di forme sul fondo del bicchiere, selezionare la quantità di soluzione basata sulla superficie. Per 8 pozzetti, aggiungere la soluzione SAv 150 ml 0,4 mg / ml per pozzetto. Per 24 pozzetti, aggiungere la soluzione SAv 100 ml 0,4 mg / ml per pozzetto. Per i piatti di vetro, aggiungere la soluzione SAv / ml 1,1 ml 0,4 mg.
  3. Coprire e spostare le piastre a 14 cm capsula di Petri di trattenere l'umidità. Incubare la piastra di Petri in frigorifero per 18-24 ore.
    NOTA: E 'essenziale utilizzare volumi consistenti di APTES, DSB, e SAV su ogni superficie.
  4. Risciacquare ogni superficie di vetro per tre volte con 150 ml di PBS per rimuovere SAv. Risciacquare superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l'angolo del pozzo. Tenere la pipetta in un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie.
  5. Bagnare un tovagliolo di carta wesimo acqua deionizzata e posizionare il tovagliolo di carta appartamento a 14 centimetri Petri che circonda le piastre per trattenere l'umidità nei pozzetti. Coprire la piastra di Petri contenente i pozzi. Incubare la piastra di Petri in un livello 1 (BSL-1) frigorifero 4 ° C fino al momento biosicurezza.

4. Acquisizione delle cellule e di uscita

  1. Inizia con pallone T175 (s) di cellule destinati per l'esperimento. Aspirare il supporto dal pallone (s). Lavare i media rimanenti con 5 ml di temperatura ambiente PBS. Aspirare PBS dal pallone (s).
  2. Aggiungere 10 ml di agente di sollevamento non enzimatica, come cellule dissociazione Solution, al pallone T-175 delle cellule. Mettere il pallone in incubatrice per 6 minuti per consentire il sollevamento delle cellule dal pallone.
  3. Dopo 6 minuti, aggiungere 10 ml di soluzione salina bilanciata freddo di Hank (HBSS; Vedi elenco dei materiali) per inattivare l'agente di sollevamento. Estrarre 20 ml di cellule per contare il numero di cellule in soluzione utilizzando un emocitometro.
    NOTA: A seconda del funcsuperfici utilizzate nell'esperimento cattura tionalized, il numero di cellule necessaria varia. Per funzionalizzati 8 pozzetti, utilizzare 300.000 cellule per pozzetto. Per i piatti di vetro funzionalizzati, utilizzare 1,1 milioni di cellule. Per funzionalizzati 24 pozzetti, sono raccomandati 125.000 cellule. Maggiori informazioni sul conteggio delle cellule si trova nel Supplemento.
  4. Ripetere i punti 4.1- 4.3 per un altro fiasco di cellule, se un numero inferiore di cellule sono presenti quanto necessario per l'esperimento. Unire sospensioni cellulari e cellule raccontano per ottenere il numero totale di cellule in soluzione.
  5. Centrifugare sospensione di cellule in una centrifuga a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C per ottenere un pellet di cellule concentrate. Trova la quantità appropriata di HBSS aggiungere alla sospensione cellulare per ottenere una concentrazione di 1 x 10 6 cellule per ml, quindi aspirare il supernatante dalle cellule centrifugare e aggiungere il volume calcolato. Questo volume può essere calcolata utilizzando le equazioni nel supplemento.
  6. Pipetta su e giù (triturare) per risospendere °e le cellule in soluzione e ridurre aggregazione cellulare in soluzione che può ridurre legame degli anticorpi. Dividere la soluzione cellulare in soluzioni sperimentali di controllo separata e. Visualizza File supplementare per i componenti e calcoli.
  7. Aggiungere gli anticorpi biotinilati alle rispettive soluzioni di cellule, come descritto nel file supplementare. Incubare per 30 minuti a 4 ° C in un mixer end-over-end.
    NOTA: Per le cellule MCF7GFP, 0,5 mg / ml hIgG o 0,5 mg anticorpi / ml HLA-ABC sono raccomandati. Per macrofagi RAW, 1 mg / ml mCD11b sono raccomandati a metà del volume per tenere conto delle differenze di diluizione. Per le cellule ombelicale Vena endoteliali (HUVEC), 0,5 mg / ml hCD31 è raccomandato.
  8. Lavare la superficie di vetro funzionalizzata con HBSS. Per questo esperimento, si consiglia una piastra 8 bene.
    1. Aggiungere 150 microlitri HBSS ad ogni pozzetto per 8 pozzetti. Risciacquare altre due volte con HBSS. Risciacquare superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l'angolo del pozzo.Tenere la pipetta in un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie. Mantenere freddo a 4 ° C.
  9. Aggiungere le soluzioni cellulari ai pozzetti ed attendere 45 min per le cellule di incubare su ghiaccio sul shaker. Effettuare la soluzione di biotina in sterili HBSS utilizzando volumi calcolati come descritto nel supplemento.
  10. Rimuovere la soluzione di cellule dai pozzetti vetro utilizzando HBSS.
    1. Delicatamente pipetta 150 microlitri HBSS in tutti i pozzetti. Pipettare quindi il HBSS. Risciacquare superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l'angolo del pozzo. Tenere la pipetta in un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie.
    2. Ripetere altre due volte. Dopo il lavaggio, aggiungere HBSS ai pozzetti per mantenere le cellule bagnato.
  11. Aggiungere 150 ml di soluzione di biotina 20 mm a ogni rispettivo rilascio bene, e poi attendere 20 minuti per consentire la reazione.
  12. Ricordare cellule non specificamente, legatos mediante lavaggio con HBSS come detto sopra, e quindi se si utilizza cellule fluorescente, procedere alla fluorescenza immagine cellule. Anche immagine cellule vive in un pallone (come controllo, per confrontare con le cellule nel pozzo). Se si utilizza verdi proteina fluorescente (GFP), le cellule trasfettate, l'eccitazione sarà 470 nm, e l'emissione sarà 515 nm.

5. Anticorpo Ottimizzazione: la titolazione degli anticorpi

  1. Iniziare sollevando le cellule dal pallone T75 o T175, come spiegato al punto 4.1- 4.3.
    NOTA: Questi volumi sono tarati per 24 pozzetti, ma possono essere modificati per adattarsi a qualsiasi superficie di vetro funzionalizzati attraverso test euristico. Una titolazione rappresentante anticorpo è mostrato in Figura 1.
  2. Contare le cellule utilizzando l'emocitometro e quindi centrifugare la soluzione di cellule in una provetta conica a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Ricostituire cellule di 1 milione di cellule per ml, utilizzando i calcoli descritti nel supplemento.
  3. Dividere il 1 mcellule ilioni per ml di soluzione in sei diverse soluzioni di 500 ml in diverse provette da centrifuga per l'anticorpo (Ab) soluzioni.
    1. Diluire la soluzione di anticorpi stock da 10 mg / ml, 1 mg / ml, 100 ng / ml, 10 ng / ml, 1 ng / ml. Creare i controlli utilizzando 100 ml di Stain tampone (PBS + 1% di sodio azide + 1% BSA), e 500 microlitri di cellule per il controllo senza Ab in esso. Per il controllo in bianco (No Ab e non le cellule), utilizzano una soluzione di 300 l di PBS.
      NOTA: ATTENZIONE: La sodio azide è estremamente tossici, esplosivi, e l'estrema cura deve essere presa quando lo si utilizza. Si prega di consultare la scheda di sicurezza (SDS) e utilizzare l'equipaggiamento di sicurezza appropriato.
  4. Combinare e incubare le soluzioni Ab con le soluzioni di cellule del mixer end-over-end a 4 ° C per 30 min. Sciacquare i funzionalizzati 24 pozzetti con HBSS tre volte. Risciacquare la superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l'angolo del pozzo. Tenere il pi grecopipetta ad un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie.
  5. Aliquota 125 ml di ogni soluzione campione nelle APTES appropriati, DSB, e SAV funzionalizzati bene. Incubare a 4 ° C o su ghiaccio per 45 min sulla superficie del vetro. Risciacquare la superficie con HBSS tre volte per rimuovere le cellule non specificamente collegati. Risciacquare superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l'angolo del pozzo. Tenere la pipetta in un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie. Non sciacquare la riga inferiore, come quelli sono i controlli.
  6. Aggiungere 150 ml di HBSS ad ogni lavato bene, mettere i 24 piastre e su ghiaccio, e quindi utilizzare un lettore di piastre per misurare la fluorescenza delle cellule GFP (eccitazione 485 nm / emissione 528 nm).

6. cellulare Ottimizzazione: Titolazione cellulare

  1. Sollevare le cellule di cui al punti 4.1 -4.3.
  2. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Spin giù cellulare in modoluzione in tubo conico a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Ricostituire le cellule a 1 milione di cellule per ml.
    NOTA: Ulteriori informazioni sull'uso del emocitometro può essere trovato nel supplemento.
  3. Pipettare 1,6 ml della soluzione di cellule per lo stock di 1,6 milioni di cellule e mettere in un tubo conico. Pipetta 800 ml di cellule dalla soluzione di cellule per lo stock di 800.000 cellule e mettere in un tubo conico. Pipettare 80 microlitri dal magazzino delle cellule per lo stock di 80.000 cellule e mettere in un tubo conico. Dispensare 8 microlitri dal magazzino cella per 8.000 cellule magazzino e posto in un tubo conico.
    NOTA: Le concentrazioni sono date per 8 misure pozzetti, replicare, se necessario. Un esempio di output piastra è illustrata nella Figura 2.
  4. Prendere le soluzioni quattro Stock e spin in una centrifuga a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Risospendere tutte le soluzioni azionari in 400 ml di HBSS.
  5. Aggiungere 1,6 microlitri di 100 anticorpi ng / ml per lo stock 1,6 milioni di cellule, 0,8 μl allo stock 800.000 cellule, e 0,5 ml a tutti gli altri stock. Incubare l'anticorpo per 30 minuti nel mixer end-over-end per 30 minuti a 4 ° C. Lavare la superficie di vetro funzionalizzato con HBSS tre volte.
    NOTA: La piastra ben funzionalizzati 8 è consigliato per la microscopia quantificazione, mentre il 24 pozzetti funzionalizzato è raccomandato per lettore di piastre quantificazione. concentrazione dell'anticorpo per 8.000 cellule azione non è stata ridotta per consentire il fattore limitante della superficie cattura di non essere la mancanza di anticorpi in soluzione, ma piuttosto le proprietà cattura della superficie.
  6. Applicare 150 ml di soluzioni campione in ciascun pozzetto. Applicare lo stock 1,6 milioni cella alla prima colonna di pozzi a sinistra. Applicare lo stock 800.000 cella alla seconda colonna da sinistra. Applicare lo stock di 80.000 cellule per la terza colonna da sinistra. Infine applicare lo stock di 8.000 cellule per l'ultima colonna. Incubare per 45 minuti a 4 ° C su shaker.
    NOTA: Il 1,6 milionicella stock serve come la più alta concentrazione da testare, ed è il doppio della quantità di cellule che viene tipicamente utilizzato in esperimenti di separazione cellulare (600.000 cellule per pozzetto) Lo stock 800.000 cellule serve come controllo per l'esperimento come è tipico concentrazione cellulare che viene utilizzato in esperimenti di separazione cellulare (3.000.000 cellule per pozzetto). Lo stock di 80.000 cellule serve come una diluizione di dieci volte per verificare le concentrazioni più basse per la cattura cellulare (30.000 cellule per pozzetto). Lo stock 8.000 cellule serve come una diluizione cento volte da utilizzare come un test per verificare il limite inferiore della separazione cellulare (3.000 cellule per pozzetto).
  7. Risciacquare con HBSS tre volte. Risciacquare superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l'angolo del pozzo. Tenere la pipetta in un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie. Raccogliere tutti i lavaggi.
  8. Immagine le cellule su un microscopio a fluorescenza, se si utilizza 8 piastre e, scattare foto di ogni survolto, e applicare 150 microlitri biotina per ogni superficie per un'ora a 4 ° C su shaker. Dopo un'ora, risciacquare pozzetti rilascio biotina con HBSS 3 volte come prima. Raccogliere tutti i lavaggi da pozzi per il conteggio con l'emocitometro e l'immagine dei pozzi di rilascio.
  9. Applicare 150 ml di 20 mM soluzione biotina in eccesso nei relativi pozzetti di rilascio di biotina per 1 ora, se si utilizza 24 tavole bene, e poi sciacquare quei pozzetti 3 volte con HBSS. Quantificare 24 pozzetti utilizzando un lettore di piastre. Utilizzare un emocitometro per contare le cellule da tutti i lavaggi e raccolti.

Analisi 7. Immagine

Nota: Si raccomanda Il pacchetto software FIJI (http://fiji.sc/Fiji) per l'analisi delle immagini. Inizialmente, le immagini sono state convertite in scala di grigi in, e quindi la luminosità / contrasto è stato modificato per portare fuori le cellule.

  1. Caricare l'immagine, e convertire in scala di grigi facendo clic sulla scheda immagine poi scorrendo verso il basso per "Tipo" e quindi facendo clic4; 8 bit ".
  2. Aumentare il contrasto dell'immagine facendo clic sulla scheda immagine e poi scorrendo a "Regola". Clicca su "Luminosità e Contrasto", e quindi utilizzare le barre di scorrimento per rendere le cellule spiccano. Se si utilizza immagini di fluorescenza, invertire le immagini per rendere le cellule più definiti.
  3. Caricare un plugin su ImageJ chiamato ITCN (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) per analizzare le immagini.
  4. Aprire ITCN. Quando viene visualizzata una finestra di dialogo che richiede all'utente con diversi parametri per valutare la dimensione della cella, impostare la larghezza minima della cella di interesse prima. Selezionare l'opzione "Rileva scuri Peaks" se l'immagine è a fluorescenza e le cellule sono oscurati.
  5. Impostare il valore soglia a 2 inizialmente, e poi premere il pulsante "Count". Una nuova versione contato dell'immagine apparirà con puntini rossi che delineano in cui le cellule sono state contate.
  6. Regolare il parametro di soglia e la larghezza per ottenere dati cellulare più precise defining le dimensioni di una "cella". Nota: Il numero di cellule contate sarà in una finestra di dialogo sulla destra. Modifica dei parametri daranno diverso numero di cellule contate.
  7. Continuare a scorrere attraverso i parametri di soglia e larghezza fino a raggiungere una buona stima del numero di cellule.

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Representative Results

Usando questo protocollo mostriamo cattura cellule (Figura 3A) e il rilascio di cellule (Figura 3C) di cellule MCF7GFP nonché controlli cellule vive (Figura 4). Abbiamo quantificato la cattura cella come 60% ​​e 80% sono stati rilasciati (Figura 3C). Quando abbiamo esteso questo approccio ad una miscela di RAW 264.7 macrofagi e cellule MCF7GFP, il 50% dei macrofagi RAW sono stati catturati (Fig. 3D) e l'80% dei macrofagi RAW erano stampa con 20 mM biotina (Figura 3B). Dal momento che l'eccesso di anticorpi in grado di diminuire la cattura delle cellule, abbiamo ottimizzato tramite titolazione 0-10.000 nM di anticorpi HLA, e osserviamo che la concentrazione di anticorpi ideale è tra 100-1.000 mM anticorpi (Fig. 1). Allo stesso modo, si determina che la concentrazione ideale di celle che possono essere catturati è 1 x 10 5 e 1 x 10 6, poiché sotto quel numero di celle, valori inferiori sfondo 17(Figura 2). I dati di fluorescenza di ciascun pozzetto vengono trattati come descritto di seguito.

Equazione 1

Qui, la media di 3 repliche è presa da un campione senza anticorpi (vuoto) e viene sottratta dalla fluorescenza ottenute da ciascun campione. Questo valore è poi normalizzati alla fluorescenza media massima. Questo trattamento permette al ricercatore di osservare chiaramente il limite inferiore di rilevazione cellulare.

Figura 1
Figura 1. normalizzato Oscurato titolazione degli anticorpi. Umano HLA-ABC è titolato in una quantità costante di cellule MCF7GFP (125.000 cellule per pozzetto) e la fluorescenza delle cellule catturati sono stati quantificati tramite un lettore di piastre. precedenteall'esposizione alla superficie funzionalizzata, le cellule e gli anticorpi sono stati centrifugati per rimuovere attaccamento anticorpo non specifico. Senza questa centrifugazione, anticorpo in eccesso saturerà superficie e prevenire pulldown cella, come mostrato con concentrazioni di 10.000 ng / ml dove centrifugazione non era sufficiente per impedire anticorpi sovrasaturazione della superficie, con conseguente minore cellule di legame alla superficie. linea grigia rappresenta il controllo. Barre di errore rappresentano l'errore standard della media. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. normalizzato Oscurato cella di titolazione. Usando concentrazione di anticorpi ottimizzato dalla titolazione di anticorpi, le cellule sono state MCF7GFP titolata per trovare la concentrazione di cattura ottimizzati mentre keEping superficie funzionalizzati e le concentrazioni di anticorpi costante. Questo può essere usato per calibrare cattura cella per diverse applicazioni. Colonne in questa figura sono replicati, mentre le righe cambiano la concentrazione di cellule per trovare la gamma idea per la cattura cellulare. Linea grigia rappresenta il controllo, e le barre di errore rappresentano l'errore standard della media. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. catturare e rilasciare esperimenti. Una miscela singola cella è stato esposto alla superficie funzionalizzata (A), catturando le cellule MCF7GFP utilizzando anticorpi HLA-ABC. Quando lavato con HBSS (B), le cellule rimaste catturate, ma quando esposti ad una soluzione di 20 mM biotina (C), le cellule erano released. Una miscela cellulare delle cellule MCF7GFP e RAW 264.7 macrofagi sono stati esposti ad una superficie funzionalizzata e sono stati catturati utilizzando anticorpi mCD11b (D). cellule MCF7GFP non specifici sono etichettati in verde. Intensità di fluorescenza delle cellule MCF7GFP diminuita quando esposto ad un lavaggio neutro (E), il che implica che la superficie non li bersaglio, e che essi collegato non specifico. Quando esposto ad un lavaggio biotina (F), i macrofagi RAW mirati sono stati liberati dalla superficie. Barre di scala sono 250 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Controllo delle cellule positive e negative per isolamento cellula doppia. Il controllo positivo RAW macrofagi vengono esposte ona microscopio a fluorescenza, mostrando alcuna attività fluorescente nonché il relativo dimensionamento delle cellule. Macrofagi Brightfield RAW mostrano dimensionamento cella (A), mentre sotto GFP eccitazione, non c'è nessuna fluorescenza (B), che è mostrato nell'immagine unita (C). Le cellule di controllo MCF7GFP negativi vengono esposte su un microscopio a fluorescenza che mostra l'attività fluorescente grande, così come le dimensioni relative delle cellule MCF7GFP. Le cellule vengono esposte in campo chiaro (D), che mostra il dimensionamento, e mentre sotto GFP eccitazione (E) mostrano grande di fluorescenza, che può essere chiaramente mostrato nell'immagine fusa (F). Barre di scala sono 250 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
FIGURA 5. Confronto di utilizzo centrifuga nelle tecniche di purificazione standard. La fase di centrifugazione pre-analisi è conservata in preparazione del campione. Isolamento tallone magnetico così come FACS coinvolge diverse fasi di centrifugazione aggiuntivi, che introduce lo stress sulle cellule e possono alterare i livelli di espressione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

File di codice supplementare. Calcoli. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Miglioramenti nelle tecniche di isolamento delle cellule promuove studi scientifici nelle relazioni struttura-funzione in neuroscienze 18, staminali programmazione delle cellule in biologia rigenerativa, e la segnalazione angiogenico in biologia vascolare 19. Infatti, colture primarie 20 (ad esempio, HUVEC) in biologia vascolare avviene principalmente attraverso l'uso di tecniche di isolamento cellulare. Isolamento delle cellule è stata recentemente utilizzata anche per il flusso quantitativa (QFlow) analisi di citometria di recettori di membrana plasmatica 3,14,15,19,21. Tuttavia, le metodologie di isolamento delle cellule esistenti influenzano i livelli dei recettori di superficie cellulare e sono costosi sia del personale e dei reagenti. Abbiamo avanzato un nuovo metodo di funzionalizzazione della superficie 17, che consente la creazione di un sistema di cattura dolce riproducibile di un singolo tipo di cellula da una miscela di tipi cellulari per soddisfare queste carenze. Questa tecnica può essere integrato in un sistema iterativo, consentendo la possibilità di capturing diversi tipi di cellule in fasi utilizzando anticorpi specifici. Per chiarire ulteriormente la procedura, una serie di domande e risposte sulla risoluzione dei problemi sono offerti di seguito:

Funzionalizzazione Ottimizzazione: I processi di funzionalizzazione è stato ottimizzato per una migliore uniformità e tirare verso il basso delle cellule MCF7gfp. Questo protocollo può alternativamente essere ottimizzato e personalizzato per qualsiasi tipo di cellula e la configurazione di anticorpi. Ciò può essere ottenuto attraverso alterando le concentrazioni dei componenti di base nella superficie cattura, o cambiando il tipo o concentrazioni degli anticorpi. La maggior parte dei tipi di anticorpi possono essere biotinilati utilizzando il protocollo di cui sopra. Una volta biotinilato, che possono poi essere titolati (Figura 1) per trovare concentrazione ideale per abbattere. La concentrazione cellulare può essere titolata (Figura 2) per trovare la concentrazione ideale di celle da catturare. Con questo, la fattibilità di catturare un certo tipo di cellula con tapposuperficie tura può essere accertata. Ad esempio, se un tipo di cellula di interesse è sulla scala di 100 cellule per milione cellule, catturando concentrazioni di cellule in tale intervallo utilizzando la superficie funzionalizzata sarebbe ideale. Se durante la titolazione, la superficie non può catturare cellule di quella piccola concentrazione, allora ottimizzazione della superficie o anticorpo è necessario per essere in grado di filtrare cellule in tale intervallo di concentrazione.

Quali tipi di cellule sono utilizzati in questo protocollo? Come qualcuno potrebbe modificare questo protocollo da utilizzare un tipo di cellula diversa?

Attualmente, questo protocollo utilizza cellule MCF7-GFP, e RAW 264.7 macrofagi sono spesso inclusi per dimostrare la capacità di tirare fuori un tipo di cellule in una miscela a due cellule. Queste cellule sono state selezionate come erano due dei tipi di cellule più pertinenti al modello di topo xenotrapianto (tumore umano all'interno dell'ambiente murino). Per calibrare il processo per una varietà di altre cellule, anticorpi specificity è di primaria importanza. Ci sono diverse risorse online disponibili per la selezione di anticorpi 22.

Quali sono alcuni dei vantaggi di questo metodo?

Approccio delicato: la mancanza di forza che rende questo approccio gentile. Infatti, la nostra forza di taglio è calcolato al massimo, 24 x 10 -6 pN 17, che non dovrebbe causare significative interruzioni di biomarcatori, dal momento che le sollecitazioni idrodinamiche di 2.09 Pa (656 PN assumendo zona 314 pm 2 superficie cellulare) indurre necrosi mentre i valori di stress sotto 0,59 Pa (185 pN assumendo 314 pm 2 di superficie delle cellule) non 23. Questo approccio dolce è pertanto vantaggioso su alcune opzioni disponibili in commercio, quali centrifugazione basato avvicina 24, che esercitano fino a 0,78 Pa 25 del picco sforzo di taglio a causa della brusca accelerazione a valori intorno a 600 G, che può modificare i modelli di espressione proteica e morfologie 25 , 26 23. Così un processo in grado di ridurre la quantità di usi centrifuga ridurrebbe la quantità di sollecitazioni che le cellule potrebbero verificarsi attraverso la purificazione e infine garantire dati più fisiologici. Il nostro protocollo corrente utilizza centrifughe per purificare e ricostituire la concentrazione cellulare prima di catturare, tuttavia, questo processo di preparazione è standard in molte tecniche di purificazione, come magnetico isolamento tallone 27,28, citometria a flusso 29, e FACS 30 (Figura 5). Il nostro approccio riduce tutti i processi di centrifugazione a valle che le altre tecniche utilizzano, oltre alla fase di preparazione.

Approccio biotina-avidina: L'applicazione di biomateriali comunemente usati (DSB-Sav e biotina-SAV) rende anche questo approccio vantaggioso 31,32. proteine ​​della famiglia avidina legano estremamente selettivamente le proteine ​​della famiglia biotina e sono utilizzati per una gamma di scientific e applicazioni mediche, tra cui: l'attaccamento anticorpo-fluoroforo 33, attacco tallone Qdot-polistirene quantitativa 34, e la creazione di idrogel che rispondono agli stimoli nell'ambiente per rilasciare farmaci incapsulati 32. Inoltre, la relativa facilità di acquisizione anticorpi biotinilati rende questo approccio ampiamente accessibile e personalizzabile.

Approccio Desthiobiotin senza perline: La superficie di cattura è in grado di implementare l'uso del desthiobiotin senza l'uso di reagenti duri e forze per rilasciare le cellule. DSB è stato utilizzato per l'adesione delle cellule reversibile e rilascio da altri sistemi in combinazione con DSB-anticorpi e biglie magnetiche 35. Tuttavia, gli effetti duri della tecnica di separazione, nonché la grande perdita cellulari associati con la preparazione dei campioni 27,28 risultati recettore differenziale ed espressione chemochine 28,36. Questo approccio mira a mitigaree superare queste limitazioni, eliminando l'uso di entrambe magnete e perline per creare una metodologia di lavaggio e rilascio molto più dolce.

Quali sono i passaggi critici in questo protocollo? Che cosa può causare la variabilità? Come è possibile che la variabilità essere controllato?

Questo processo prevede quattro fasi critiche che possono causare la diminuzione dell'efficienza della superficie cattura. Il primo passo fondamentale è la prevenzione di acqua alla superficie APTES durante le fasi di funzionalizzazione APTES, che comporterebbe la distruzione della superficie auto-assemblati. Ciò è risolto utilizzando etanolo come solvente e cottura dei APTES in forno per ridurre idrolisi da soluzioni acquose successive. Il secondo passo critico è stadi di reazione in cui EDC EDC catalizza la reazione del DSB con le APTES: consentono reticolazione dei due strati. Se l'EDC è esclusa o non sufficientemente aggiunto, la DSB non sarà in grado di collegare il piano, whic h comprometterà il meccanismo di rilascio. Il terzo passo critico è durante la funzionalizzazione SAv, come il mantenimento del livello SAv è critica. Non uniformità dei risultati strato streptavidina nella riduzione di efficienza di cattura. La quarta fase critica è nella biotinilazione dell'anticorpo, come il legame dell'anticorpo alla superficie cattura è facilitato mediante l'interazione biotina-streptavidina della superficie cattura e anticorpi. Se l'anticorpo non è biotinilato, poi lo strato di streptavidina non sarà in grado di catturare e tirare verso il basso, rendendo la superficie di cattura inutile. Variabilità e incoerenza nella cattura di superficie può essere attribuito alla concentrazione non regolarità così come stocasticità dell'attaccamento strato. Questa variazione può essere controllato utilizzando concentrazioni precise di componenti strato calibrate alla superficie e gli obiettivi previsti di cattura. In questo disegno, le concentrazioni sono calibrati specificamente alla cattura di cellule MCF7-GFP.

e_content "> Quali sono alcuni svantaggi di questo metodo?

Attualmente, la funzionalizzazione APTES viene fatto utilizzando una fase liquida di immersione della superficie per 55 minuti, seguita da una fase di cottura fino a 2 ore. Anche se questo permette uno strato completo di APTES silano per legarsi alla superficie, un processo più uniforme sarebbe la fase vapore silanizzazione 37. Questo riduce il tempo di contatto APTES, risparmiando così il tempo ricercatore, così come l'aumento uniformità. Inoltre, il miglioramento di pull-down è stata osservata 17 quando si utilizza notte di incubazione di SAv, e attualmente, la funzionalizzazione superficiale richiede due, incubazioni overnight, rendendo il processo generale prendere tre giorni. Così, ottimizzando la chimica avrebbe offerto notevoli risparmi di tempo per il ricercatore.

Quali sono alcune avvertenze o precauzioni che possono essere utili?

Quando funzionalizzazione di superfici, è imperative che ci si prenda cura al rischio di danni respiratori. Entrambi APTES e mercaptoetanolo possono essere estremamente pericolose per i polmoni e organi associati, quindi è necessario fare il processo di funzionalizzazione in una cappa chimica per ridurre l'interazione con i vapori chimici. Mercaptoetanolo è un tiolo che è particolarmente pungente odore. Quando si utilizza mercaptoetanolo, per consentire i rifiuti contaminati di sedersi in cappuccio per un giorno o due prima dello smaltimento.

Quali sono i futuri obiettivi e le applicazioni di questa superficie?

I nostri obiettivi futuri prevedono la personalizzazione di questa superficie per lavorare con una varietà di tipi di cellule rilevanti per le malattie correlate angiogenici. In particolare, abbiamo intenzione di concentrarsi su cellule endoteliali ombelicale vena al fine di Segue a utilizzare campioni di sangue e separare le cellule di interesse da lì. Inoltre, abbiamo in programma di integrare le modalità di separazione, come aptameri nel design della surfac funzionalizzatoe di aumentare ulteriormente le nostre cattura e rilascio percentuali.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) Acros Organics 919-30-2 Used to make 2% APTES solution
Plasma Cleaner Pico Diener Model 1 Cleans surfaces and allows for bonding of PDMS to glass
d-Desthiobiotin (DSB) Sigma D20655 Used as the releasing mechanism in the cellular capture surface. 
dimethyl sulfoxide (DMSO) British Drug Houses (BDH) BDH1115-1LP Dissolves the DSB into solution
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) Thermo-Scientific 5g: 22980
25g: 22981
Activates carboxylic acids and allows binding of proteins to glass surface.
uncoated 8-well culture slide BD Falcon Case of 24: 354118
Case of 96: 354108
Used in cellular experiments involving Zeiss fluorescence microscope such as initial capture and release quantification experiments
Glass bottom 24-well plates MatTek P24G-0-13-F Used in cellular experiments involving the plate reader such as antibody and cellular titration experiments
Mercaptoethanol Science Lab 60-24-2 Used to quench reaction between EDC and DSB
4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate
(MES Hydrate 99%)
Fisher Scientific AC172590250 Used to make 0.1 M MES Buffer for use in EDC reaction
Precision Oven Thermo Scientific 11-475-153 Used in curing of PDMS and APTES layer.
Titramax 1000 Shaker Heidolph 13-889-420 Used to ensure even distribution of APTES on surfaces.
1x Streptavidin 5 mg [e7105-5mg] Proteo Chem 9013-20-1 Biotin-binding protein. May cause irritation.
5 cm Glass Dish Fisher Scientific 08748A Used in HUVEC studies as well as future profiling studies.
14 cm Petri Dish with Cover Sigma-Aldrich Z717231 Used to hold samples being functionalized and transport them.
MCF7-GFP cells Cell Biolabs AKR211 Stored in liquid nitrogen
RAW264.7 mouse macrophages ATCC TIB-71 Gifted to us from Smith lab at the University of Illinois. Stored in liquid nitrogen.
TrypLE Life Technologies 12605036 Stored in 100 ml at room temperature
Dulbecco’s modified Eagle medium Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC 50003PC Supplier: Corning
Nonessential amino acids Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC 25-025-CI Already added into DMEM by facility. Supplier: Corning.
Cell scraper Fisher Scientific 12-565-58 Small 23 cm 50 pack
Cell Dissociation Solution Corning MT-25-056CI Used to lift cells non-enzymatically for the use in cell experiments
Hemacytometer Hausser 02-671-54 Used to count cells for quantification of cell solutions and capture and release effectivity.
Biotin Amresco 58-85-5 Used to release cells from surface.
HBSS Created from Recipe N/A Used to keep cells alive in suspension as well as wash surfaces of non-specific binding. Adapted from Cold Spring Harbor Protocols: In 500 ml, use 4 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.0402 g Na2PO4•7H2O, 0.03 g KH2PO4 and 0.5 g glucose. Add DI water to get to 500 ml, filter, and then refrigerate.
HLA-ABC Antibody BioLegend 311402 Antibody used to capture MCF7gfp cells
hIgG Antibody BioLegend HP6017 Antibody used to capture MCF7gfp cells
MCF7 GFP cells Cell Biolabs AKR-211 Luminal Breast Cancer line that has been transfected with green fluorescent protein.
Assorted Conicals Thermo-Scientific 15mL: 12-565-268 50/15 ml plastic conicals for storing solutions and aliquots.
Mini-Tube Rotators (End over End Mixer) Fisher Scientific 05-450-127 Used to incubate antibody and mix other cellular solutions in order to mix
Axiovert 200M (Fluorescence Microscope) Zeiss N/A Zeiss Axiovert 200 M inverted florescence microscope.
Zeba Desalting columns Thermo-Scientific PI-87770 Used to purify newly biotinylated antibodies after the use of the Biotinylation Kit. Instructions provided at: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf
EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation Kit Thermo- Scientific Used to biotinylate antibodies to allow them to integrate with the capture surface
Plate Reader BioTek Synergy HTX Multimode Reader Used to quantitatively measure fluorescent intensity in the titration experiments.

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