As investigações sobre o Complexo Ga (III) de EOB-DTPA e sua

Chemistry

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Summary

Um procedimento para o isolamento de EOB-DTPA e complexação subsequente com Ga naturais (III) e 68 Ga é aqui apresentado, bem como uma análise aprofundada de todos os compostos e investigações sobre a eficiência rotulagem, a estabilidade in vitro e o octanol / água coeficiente de distribuição do complexo marcado radioactivamente.

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Greiser, J., Niksch, T., Weigand, W., Freesmeyer, M. Investigations on the Ga(III) Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue. J. Vis. Exp. (114), e54334, doi:10.3791/54334 (2016).

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Abstract

Nós demonstramos um método para o isolamento de EOB-DTPA (3,6,9-triaza-f 3,6,9-tris (carboximetil) -4- (etoxibenzil) ácido -undecanedioic) a partir da sua Gd (III) e os protocolos para a preparação do seu novo não-radioactivos, isto é, singular Ga (III), bem como radioactivos 68Ga complexo. O ligando, bem como o Ga (III) foram caracterizados por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), espectrometria de massa e análise elementar. 68Ga foi obtido por um método de eluição a partir de um padrão / 68Ga gerador 68 Ge. Experimentos para avaliar a eficiência de 68 Ga-rotulagem de EOB-DTPA em pH 3,8-4,0 foram realizadas. técnicas de análise de rádio estabelecida TLC (cromatografia de camada fina) e HPLC de rádio (cromatografia líquida de alta eficiência) foram usadas para determinar a pureza radioquímica do traçador. Como uma primeira investigação de lipofilicidade dos 68 Ga traçadores o n- octanol / água DISTRIBUTION coeficiente de Ga 68 espécies presentes em uma solução de pH 7,4 foi determinada por um método de extracção. medições in vitro de estabilidade do marcador em vários meios a pH fisiológico foram realizadas, revelando diferentes taxas de decomposição.

Introduction

Ácido gadoxético, um nome comum para o complexo de Gd (III) do ligando EOB-DTPA 1, é um agente de contraste utilizado em imagiologia hepatobiliar frequência de ressonância magnética (MRI). 2,3 Devido à sua absorção específica do fígado por hepatócitos e elevada percentagem de excreção hepatobiliar que permite a localização das lesões focais e tumores hepáticos. 2-5 no entanto, certas limitações da técnica de ressonância magnética (por exemplo, a toxicidade dos agentes de contraste, aplicabilidade limitada em pacientes com implantes claustrophobia ou de metal) para chamar uma ferramenta de diagnóstico alternativa .

A tomografia de emissão de positrões (PET) é um método de imagiologia molecular, em que uma pequena quantidade de uma substância radioactiva (traçador) é administrado, em que a sua distribuição no corpo é registado por um aparelho de PET. 6 O PET é um método dinâmico que permite alta a resolução espacial e temporal das imagens, bem como a quantificação dos resultados, sem ter delidar com os efeitos colaterais dos agentes de contraste de MRI. O valor informativo das informações metabólica obtida pode ser ainda aumentada pela combinação com dados anatômicos recebidos dos métodos de imagem adicionais, como mais comumente atingida por imagem híbrido com tomografia computadorizada (TC) em scanners de PET / CT.

A estrutura química de um marcador adequado para o PET deve incluir um isótopo radioactivo serve como emissor de positrões. Pósitrons têm um curto período de vida, uma vez que aniquilar quase imediatamente com os elétrons das conchas átomo de tecido circundante. Por aniquilação dois fotões gama 511 keV com direcção oposta de movimento são emitidos, que são registados pelo aparelho de PET 7,8. Para formar um traçador, nuclidos animal de estimação pode ser ligado covalentemente a uma molécula, como é o caso em 2-desoxi- 2- [18F] fluoroglucose (FDG), o marcador PET mais amplamente utilizado. 7 no entanto, um nuclídeo também podem formar ligações coordenativas a um ou vários ligantes (por exemplo,, [68 Ga] -DOTATOC 9,10) ou ser aplicado na forma de sais inorgânicos dissolvidos (por exemplo, [18F] fluoreto de sódio 11). No seu conjunto, a estrutura do marcador é crucial, uma vez que determina o seu comportamento biodistribuição, metabolismo e excreção.

Um nuclido PET adequado deve combinar as características favoráveis ​​de energia de positrões como conveniente e disponibilidade, bem como uma meia-vida adequadas para a investigação pretendida. O 68Ga nuclídeo tornou-se uma força essencial no domínio do PET ao longo das últimas duas décadas. 12,13 Isto é principalmente devido à sua disponibilidade através de um sistema de gerador, que permite rotulagem no local, independentemente, a partir da vizinhança de um ciclotrão. Em um gerador, o nuclido mãe 68 Ge é absorvido numa coluna de onde o nuclídeo filha 68Ga é eluída e, subsequentemente, rotulados com um agente quelante adequado. 6,14 Uma vez que o 68Ga nuclídeo existe como um TrivalPendientesent catião tal como Gd (III) 10,13, quelantes EOB-DTPA com 68Ga vez iria produzir um complexo com a mesma carga global negativa como ácido gadoxético. Assim, que 68 Ga traçador pode combinar uma especificidade hepática característica semelhante com a aptidão para a imagem PET. Embora o ácido gadoxético é comprado e administrado como sal de sódio, no seguinte contexto vamos nos referir a ele como Gd [EOB-DTPA] e para o complexo não-radioativo Ga (III) como Ga [EOB-DTPA], ou 68 Ga [ EOB-DTPA] no caso de o componente marcado radioactivamente por uma questão de conveniência.

Para avaliar a sua aplicabilidade como marcadores para PET, complexos de metais radioactivos têm de ser examinadas extensivamente in vitro, in vivo ou ex experiências in vivo em primeiro lugar. Para determinar a aptidão para o respectivo problema médico, várias características tracer como comportamento biodistribuição e perfil de apuramento, a estabilidade, a especificidade do órgão e célula ou tissue captação precisam ser investigadas. Devido ao seu caráter não-invasivo, in vitro determinações são muitas vezes realizados antes de experimentos in vivo. É geralmente reconhecido que o DTPA e os seus derivados são de aptidão limitada como quelantes para 68Ga, devido a estes complexos de falta inércia cinética, resultando em decomposição comparativamente rápido, quando administrado in vivo. 14-20 Isto é causado principalmente pela apo- transferrina actua como um concorrente por 68 Ga no plasma. No entanto, nós investigamos este novo marcador relativa à sua eventual aplicação em imagiologia hepatobiliar, em que as informações de diagnóstico podem ser fornecidas dentro de minutos após a injecção 3,4,21-23, assim, que não implica necessariamente a estabilidade traçador de longo prazo. Para este efeito foram isoladas EOB-DTPA a partir de ácido gadoxético e inicialmente realizado a complexação com Ga naturais (III), que existe como uma mistura de dois isótopos estáveis, 69 Ga e 71 68 Ga. Usamos métodos estabelecidos e, simultaneamente, avaliada sua adequação para determinar a eficiência 68 Galabeling de EOB-DTPA e investigar a lipofilicidade do novo 68 Ga traçador e sua estabilidade em diferentes mídias.

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Protocol

1. Preparação de EOB-DTPA e Ga [EOB-DTPA]

Cuidado: Por favor, consulte todas as folhas de dados de segurança pertinentes (MSDS) dos utilizados solventes orgânicos, ácidos e alcalinos antes do uso. Execute todas as etapas em um exaustor e usar equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, luvas, jaleco).

  1. Isolamento de EOB-DTPA a partir de ácido gadoxético
    1. Coloque 3 ml de solução injectável gadoxético 0,25 M de ácido para um balão. Adicionar 500 mg (5,6 mmol) de ácido oxálico à solução agitada.
    2. Depois de se agitar durante 1 hora, filtrar a suspensão através de uma frita utilizando pressão reduzida. Lavar o resíduo três vezes com 3 ml de água, respectivamente.
    3. Combinar os filtrados aquosos e equipar a solução com um eléctrodo de pH. Adiciona-se ácido clorídrico 12 M para o filtrado até que o pH é de cerca de -0,1.
    4. Remover o solvente in vácuo para se obter um resíduo incolor. Armazenar sob gás inerte.
    5. Lavar o resíduo cuidadosamente (pelo menos trêsvezes) com acetato de etilo para remover o excesso de ácido oxálico. Secar o resíduo em vácuo.
    6. Redissolve-se o resíduo em 2 ml de água à temperatura ambiente e depois arrefece-se a solução num banho de gelo. Sem remover o banho de gelo, adicionar 0,5 M de hidróxido de sódio aquoso a solução gota a gota, até que a formação de um sólido incolor é observado pegajosa.
    7. Remover a água por decantação. Lavar os sólidos mais duas vezes com 1 ml de água fria. Seca-se o sólido in vácuo para se obter a primeira fracção do produto.
    8. Isolar uma segunda fracção de produto a partir das fracções combinadas de água decantada por meio de cromatografia em coluna (sílica, metanol / água 01/04). 24 Remover o solvente em vácuo.
    9. Se o sólido assim obtido não é puro branco, dissolvê-la em 1 ml de água, adicionar 10 ml de etanol e subsequentemente 10 ml de éter dietílico para precipitar o produto. Filtra-se através de um filtro poroso utilizando pressão reduzida e seca in vácuo.
    10. Combinarambas as frações sólidas de EOB-DTPA e realizar espectroscopia de RMN, 25 de espectrometria de massa 26 e elementares 27 análises.
  2. Síntese de Ga [EOB-DTPA]
    CUIDADO: Loja cloreto de sólido Ga (III) sob uma atmosfera inerte seca, uma vez que ao entrar em contato com o ar, humidade ou a decomposição da graxa ocorre, resultando em vapores corrosivos e formação de impurezas amarelos, castanhos ou pretos.
    1. Prepara-se uma solução de estoque de 0,11 M por dissolução de 1,94 g (11,0 mmol) de Ga (III) cloreto em 100 ml de água. Dilui-se 1 ml de solução de amoníaco aquoso a 25% com 4 ml de água.
    2. Dissolve-se 80 mg (0,15 mmol) de EOB-DTPA num balão de 10 ml de água. Se necessário, aquecer o solvente para se conseguir a dissolução completa.
    3. Adicionar 1,4 ml (0,15 mmol) da solução de cloreto de Ga (III). Equipar o frasco com um agitador e pH-eletrodo. Adicionar gota a gota uma solução de amoníaco diluído aquoso até que o pH da solução é de aproximadamente 4,1. Agita-se à rotemperatura om durante 30 minutos.
    4. Remover o solvente em vácuo. Colocar o resíduo num balão, equipado com um stillhead com uma tubuladura lateral central e paralela. Equipar a central do pescoço com um dedo de arrefecimento e do pescoço lado com uma saída da bomba de vácuo
    5. Aquece-se o resíduo sob pressão reduzida (125 ° C, 0,6 mbar). Periodicamente remover o cloreto de amónio sublimado (visível como revestimento branco da superfície de vidro) a partir do dedo de refrigeração e ainda cabeça, bem como a partir das partes superiores do frasco com um pano ligeiramente molhado. Continuar o processo até que não há formação visível de novo sublimado.
    6. Para remover os vestígios finais de cloreto de amónio lavar o resíduo três vezes com 0,5 ml de metanol quente, respectivamente. Seca-se o resíduo incolor em vácuo. Execute NMR espectroscópica, 25 de massa por espectrometria de 26 e elementares 27 análises.

2. Procedimento Geral Labeling

ATENÇÃO: Todos os exexperi- incluindo contato direto ou indireto com substâncias radioactivas devem ser realizadas apenas por pessoal treinado. Por favor, use equipamento de proteção adequado. Recolher quaisquer resíduos radioactivos separadamente e armazenar e descartar de acordo com os regulamentos válidos.

  1. A eluição do gerador
    Nota: A 40 mCi 68 Ge / 68Ga gerador com o nuclido mãe ligado como óxido sobre sílica dodecil-3,4,5-trihydroxybenzoate foi usada. A eluição e a purificação pode ser realizada manualmente ou, como foi o caso no presente processo, tal como um processo automatizado combinada utilizando uma bomba peristáltica e unidade de distribuição.
    1. Preparar soluções de 5,5 M, 1,0 M e ácido clorídrico 0,05 M. Prepara-se uma solução de cloreto de sódio 5,0 M contendo 25 uL de ácido clorídrico 5,5 M por ml. Prepara-se uma solução tampão de pH 4,6 através da combinação de 4,1 g de acetato de sódio, 1 mL de HCl (30%) e 2,5 ml de ácido acético glacial e diluindo a mistura com água até 50 ml.
    2. precondition o PS-H + cartucho enxaguando-o devagar com 1 ml de ácido clorídrico 1,0 M e, subsequentemente, 5 ml de água.
    3. Elui-se a coluna de sílica do gerador com 4 ml de 0,05 M de HCl. 12 Carregar o 68Ga eluato para o PS-H + cartucho.
    4. Passar o cartucho com 5 ml de água e subsequentemente secá-lo com 5 ml de ar. Eluir a 68 Ga a partir do cartucho com 1 ml de 5,0 M de solução de cloreto de sódio acidificada. 28
  2. Etiquetagem de EOB-DTPA com 68Ga
    1. Dissolve-se 1 mg (1,9 umol) de EOB-DTPA em 1 ml de água. A partir desta solução ter 100 uL (0,19 nmol) e diluí-los com 9,9 ml de água para preparar um 19 uM (10 ug / ml) da solução de EOB-DTPA.
    2. Remover 50 pi (equivalentes a 22-29 MBq) da solução contendo 68 Ga e colocado num frasco. Adicionam-se 50 ul (0,5 ug) de uma solução de estoque 19 mM de EOB-DTPA e 300 ul óf tampão para elevar o pH a 4,0. Agitar rapidamente e incubar a solução à temperatura ambiente durante 5 min. Retirar uma alíquota de 1-5 ul e colocar a HPLC ou análise TLC.
    3. Realizar a análise por HPLC de rádio em um de fase inversa (RP) C18 29 Uso da seguinte fase móvel:. A - água ácido trifluoroacético / (99,9% / 0,1%), B - acetonitrilo / ácido trif luoroacético (99,9% / 0,1%), gradiente : 06 min 80% de A → 0% de A (0,5 ml / min), 610 min 0% de A (0,5 ml / min).
    4. Determinar as intensidades dos picos dos sinais de rádio HPLC, como área sob a curva. Calcular o rendimento da marcação de pureza radioquímica (RCP) do traçador como se segue:
      RCP = A Ga-EOB-DTPA / (A Ga + A Ga-EOB-DTPA) ∙ 100%
      A Ga-EOB-DTPA: área sob a curva de 68 Ga [EOB-DTPA]
      A Ga: área sob a curva de livre 68 Ga

Eficiência 3. Rotulagem

  1. Realizar procedimentos de rotulagem como descreverd na seção 2. Use uma gama consistente de iniciar a atividade de 68 Ga fluido, por exemplo, 22-29 MBq (40-140 ul, dependendo da frescura do eluato).
  2. Adicionar a quantidade necessária de solução tampão para ajustar o pH a 3,8-4,0 (40-190 ul, dependendo do volume de fluido 68 Ga). Adicionar a quantidade necessária de solução de reserva de ligando (10-70 ul de uma solução a 19 mM).
  3. Adicionar as quantidades necessárias de água para ajustar o volume global de cada sonda rotulagem para 1,75 ml. Misturar completamente e deixar a amostra repousar durante 5 min à temperatura ambiente. Realizar análise HPLC como descrito na seção 2 para determinar o rendimento de marcação.
  4. Realizar procedimentos de rotulagem com quantidades de ligante entre 0,1 mg e 0,7 mg em intervalos de 0,1 g. Realizar experiências em triplicado para cada concentração de ligando. Calcule o rendimento de média e desvio padrão.

4. Vitro estabilidade na

  1. p geralROCEDIMENTO e preparações
    1. Dissolve-se um comprimido de tampão fosfato salino (PBS) em 200 ml de água desionizada para se preparar uma solução stock de PBS com uma concentração de fosfato de 10 mM.
    2. Realizar etiquetagem de 22-29 MBq 68Ga com 0,5 ml de solução de estoque EOB-DTPA, como descrito na secção 2. Dependendo do volume do eluato 68Ga, ajustar a quantidade de tampão, como descrito na secção 3. Retirar amostras de solução de rotulagem contendo 6-12 MBq de traçador para realizar medições de estabilidade.
    3. Realizar a análise TLC rádio sobre gel de sílica placas de alumínio revestidas de 80 mm utilizando citrato de sódio 0,1 M aquoso como eluente e analisar as placas com um leitor de radioactividade TLC. 30 Determinar as intensidades dos sinais de TLC como a área sob a curva. Calcula-se a RCP do traçador como se segue:
      RCP = A Ga-EOB-DTPA / (A Ga-livre + A Ga-EOB-DTPA + A Ga-coloidal) ∙ 100%
      A Ga-EOB-DTPA: área sob a curva de 68 Ga [EOB-DTPA]
      A Ga-livre: área sob a curva de livre 68 Ga
      A Ga-coloidal: área sob a curva de coloidal 68 Ga
    4. Calcule RCP t / RCP 0 para cada ponto de tempo. Traçar a RCP assim padronizado vs. diferença de tempo desde o ponto de partida t = 0 min.
      RCP t = RCP de 68 Ga [EOB-DTPA] no ponto de tempo t.
      RCP 0 = RCP de 68 Ga [EOB-DTPA] em t = 0 min.
  2. Estabilidade em tampão fosfato salino (A)
    1. A 65 ul de solução de etiquetagem adicionar 150 ul de solução de reserva de PBS e 60 ul de solução de hidróxido de sódio (0,1 M) para elevar o pH para 7,4. Homogeneizar.
    2. Retirar uma alíquota de 1-5 ul para realizar a análise TLC ( 'ponto de partida'). armazenar imediatamente a solução numa incubadora a 37 ° C e remover aliquotas para realizar a análise de cromatografia em camada fina representamAtivE pontos de tempo ao longo de 3 h.
  3. Estabilidade no sentido excesso de apo -transferrin em PBS (B)
    1. A 120 ul de solução de etiquetagem adicionar 50 ul de solução de reserva de PBS e 430 ul de uma solução de hidróxido de sódio (0,1 M) para elevar o pH para 7,4. Adicionar 40 ul de uma solução de Apo -transferrin (25 mg / ml). Homogeneizar.
    2. Retirar uma alíquota de 1-5 ul para realizar a análise TLC ( 'ponto de partida'). armazenar imediatamente a solução numa incubadora a 37 ° C e remover aliquotas para realizar a análise de TLC em pontos temporais representativos ao longo de 3 h.
  4. Estabilidade no soro humano (C)
    1. A 500 ul de soro humano adicionar 25 ul de solução de etiquetagem e 45 ul de solução de hidróxido de sódio (0,1 M) para elevar o pH para 7,4. Homogeneizar.
    2. Retirar uma alíquota de 1-5 ul para realizar a análise TLC ( 'ponto de partida'). armazenar imediatamente a solução em uma incuBator a 37 ° C e remover aliquotas para realizar a análise de TLC em pontos temporais representativos ao longo de 3 h.

5. Determinação do coeficiente de distribuição LoGD

  1. Executar procedimentos de marcação, tal como descrito na secção 2. 50 ul de solução de etiquetagem adicionar 20 ul de solução de reserva de PBS e 170 ul de uma solução de hidróxido de sódio (0,1 M) para elevar o pH para 7,4.
  2. Retirar 200 ul a partir dessa solução e colocá-la em um plástico V-frasco. Adicionar 200 ul de n-octanol. Fechar o frasco e agitar com vortex durante 2 min. Em seguida centrifugar a amostra a 1600 xg durante 5 min.
  3. Remover triplicatas de 40 ul da fase n -octanol e a fase aquosa cada um e colocá-los em V-frascos separados. Tenha cuidado para não misturar as camadas.
  4. Medir a actividade de cada uma das amostras num contador gama bem durante 30 segundos. Para cada amostra imediatamente repetir a medição e duas vezes da mesma calcular a actividade Ᾱ t significativo t, W1, Ᾱ t, W2 e Ᾱ t, W3 (atividades em amostras aquosas) e Ᾱ t, O1,t, O2,t, O3 (atividades em n- octanol), juntamente com o respectivo ponto de tempo t de sua determinação.
  5. Definir o ponto de tempo da medição da última amostra, tal como t 0. Determinar e listar Dt em min calculando Dt = tt 0. Realizar correcção de decaimento Ᾱ t, usando a seguinte fórmula:
    0 = Ᾱ T · 2 (Dt / 68 min).
  6. Calcular Ᾱ 0, W como a média de Ᾱ 0, W1,0, W2 e Ᾱ 0, W3, bem como Ᾱ 0, O como a média de Ᾱ 0, O1,0, O2 e Ᾱ 0, O3. Calcular logD usando a seguinte fórmula:
    logD = log [(Ᾱ 0, W · 33 ug)].
  7. Executar toda a experiência em triplicado e calcular a média de logD, juntamente com o seu desvio padrão.

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Representative Results

O ligando EOB-DTPA e o Ga não radioactivo (III) foram analisados ​​por meio de 1 H e 13 C {1 H} espectroscopia de RMN, espectrometria de massa e análise elementar. Os resultados listados na Tabela 1 e ilustrados nas Figuras 1-6 verificar a pureza das substâncias.

A eluição da Ga gerador de 68 Ge / 68 produziu soluções de 400-600 MBq 68 Ga. As procedimento de marcação descritos resulta na formação do desejado traçador 68Ga [EOB-DTPA], indicado como pico de HPLC de rádio que apresenta um tempo de retenção de 2,8 min (Figura 7). A comparação com o tempo de retenção do padrão Ga [EOB-DTPA] no detector de UV-VIS a 220 nm (2,7 min, Figura 8) confirma rotulagem bem sucedida. Descoordenada 68 Ga é detectado como pico de rádio em 2,1 min (Figura7). A eficiência de 68Ga-rotulagem de óxido de etileno-BDTPA foi investigada através da determinação do rendimento da marcação, como uma função da concentração de ligando por meio de HPLC (Figura 9). Os rendimentos foram determinados em triplicado e os desvios padrão foram calculados.

Dependendo do pH e da concentração de aniões presentes na solução, não coordenados ou não marcadas 68Ga podem existir em várias espécies, por exemplo, galatos ou hidróxido insolúvel. 31 O termo geral "livre 68Ga" 32 é utilizada para todas marcadas não- espécies em solução, excepto o hidróxido, que é geralmente referida como "coloidal 68Ga". Sob as condições de análise descritas, Ga livre 68 move-se com a frente do solvente (Rf = 1,0) numa placa de TLC. Coloidal 68Ga não pode ser detectada, por HPLC, enquanto que numa placa de TLC que aparece como actividadena origem (Rf = 0). Um cromatograma representativo de uma placa de TLC analisadas com um scanner de radioactividade TLC é mostrado na Figura 10. O traçador apresenta um comportamento de retenção diferente, dependendo se uma amostra de solução de etiquetagem (pH 3,8-4,0, Rf = 0,3) ou uma amostra de fisiológica pH (Rf = 0,5) foi analisado.

Para investigar a estabilidade do marcador, marcado recém 68Ga [EOB-DTPA] foi adicionado a amostras de pH fisiológico, contendo diluída de PBS (fosfato de concentração de 5,5 mM, A), o excesso de apo de transferrina (1,6 mg / ml em PBS diluída com uma concentração de fosfato de 0,8 mM, B) e soro humano (C), respectivamente. Ao longo do tempo, a pureza radioquímica (RCP t) de marcador nas amostras foi determinada por TLC. A percentagem de traçador intacto foi calculada como a razão entre a RCP tos respectivos pontos de tempo e RCP 0 no ponto de partida (Tabela 2). Isso foi necessário devido às soluções de etiquetagem contendo traçador de diferentes RCP 0 (93-96%). A percentagem assim padronizado de traçador intacta é descrito como uma função do tempo na Figura 11.

Para a determinação de amostras aquosas de logD marcador numa solução diluída de PBS foram preparados. As amostras foram misturadas com n-octanol, e, subsequentemente, centrifugadas aliquotas foram removidas para determinar a concentração de actividade em ambas as fases. Os valores de actividade e subsequente cálculo de logD dos mesmos são descritos na Tabela 3. O valor médio logD é 3,54 ± 0,08.

figura 1
Figura 1. Espectro de 1H-RMN de EOB-DTPA. < / strong> O espectro foi gravado em D 2 O em 400,1 MHz. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. 13 C {1 H} RMN espectro de EOB-DTPA. O espectro foi gravado em D 2 O em 100,6 MHz. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. MS de EOB-DTPA (ionização por electrospray (ESI), metanol, modo negativo).54334fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. espectro de 1 H-RMN de Ga [EOB-DTPA]. O espectro foi gravado em D 2 O em 400,1 MHz. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. 13 C {1 H} RMN espectro de Ga [EOB-DTPA]. O espectro foi gravado em D 2 O em 100,6 MHz. Por favor, clique dela e para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6. MS de Ga [EOB-DTPA] (ESI, metanol, modo negativo), juntamente com uma descrição detalhada do padrão isótopo do pico molecular. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7
Figura 7. representativas cromatograma HPLC de uma amostra de 68 Ga [EOB-DTPA] contendo em partes descoordenada 68Ga, tal como registado pelo detector de radioactividade. Descoordenada 68Ga exibe um tempo de retenção de 2,1 min, enquanto que o marcador é detectado em 2,8 min .target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8
Figura 8. Representante HPLC cromatograma da substância padrão Ga [EOB-DTPA], como detectado no canal UV-vis a 220 nm. O tempo de retenção do padrão de frio é de 2,7 min. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9
Figura 9. Descrição de 68 Ga eficiência de rotulagem de EOB-DTPA. O rendimento de marcação, tal como determinado por meio de HPLC é representada graficamente como uma função da concentração de EOB-DTPA (22-29 MBq actividade de partida, pH 3,8-40,0, 5 min, RT). O desvio padrão é representado por barras de erro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10
Figura 10. representativas cromatograma TLC revelando diferentes espécies de 68 Ga. Uma amostra de 68 Ga [EOB-DTPA] diluída em PBS (concentração de fosfato 5,5 mM, pH = 7,4) foi analisada após 110 minutos de incubação. Distribuição Exemplos de coloidal 68Ga (Rf = 0), 68 Ga [EOB-DTPA] (Rf = 0,5) e livre 68Ga (Rf = 1,0) numa placa de TLC 70 milímetros, como detectado por um scanner radioactividade TLC é apresentada. Conta são decadência corrigidos. Por favor clique aqui para ver uma maiorversão desta figura.

Figura 11
Figura 11. Determinações de estabilidade de 68 Ga [EOB-DTPA] em diferentes meios de comunicação. A decadência corrigidas, porcentagem padronizada de tracer intacto como determinado através de TLC, é descrita como uma função do tempo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura .

tabela 1
Tabela 1. Resultados de RMN espectroscópica, MS e análises elementares realizados para EOB-DTPA e Ga [EOB-DTPA]. Relativos intensidades de pico MS é dado em%, a atribuição a picos são mencionadas entre parêntesis rectos. valores CHN Elemental foram calculada para C 23 H 33 N 3 O 11 · H2O (EOB-DTPA) e (NH 4) 0,75 H 1,25 [C 23 H 28 GaN 3 S 11] · 2H 2 O (Ga [EOB-DTPA]).

mesa 2
Tabela 2. Estabilidade da determinação 68Ga [EOB-DTPA] em diferentes meios. A RCP de 68 Ga [EOB-DTPA] em meios A, B e C foi determinada por meio de TLC em determinados pontos de tempo. A composição das amostras é dada em percentagens em% de marcador livre / 68Ga / coloidais 68Ga. A porcentagem de traçador intacta é padronizado como proporção do RCP t / RCP 0. 0 PCR é a respectiva RCP do traçador no instante t = 0 min.


. Tabela 3. Determinação de logD Decay corrigido ct valores 0, X de três alíquotas (x = 1, 2, 3) removida de cada fase (W: aquosa, O: N -octanol) de uma amostra. Todas as atividades são dadas em cpm. LoGD é calculado conforme descrito no ponto 5 do protocolo. A experiência foi repetida duas vezes.

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Discussion

EOB-DTPA é acessível através de uma síntese de múltiplos passos 33, mas pode muito bem ser isolado a partir de agentes de contraste que contêm ácido disponíveis gadoxético. Para este propósito, o ião central, Gd (III) pode ser precipitado com um excesso de ácido oxálico. Depois de remover o oxalato Gd (III) e ácido oxálico o ligando pode ser isolado por precipitação em água fria a um pH de 1,5. No entanto, a fim de aumentar os rendimentos de cromatografia em coluna do filtrado pode ser realizada em vez disso, ou como um processo de seguimento. Qualquer um dos métodos produz o ligando analiticamente puro com rendimentos totais de 70% (Figuras 1-3, Tabela 1).

Descobrimos que a fim de isolar Ga [EOB-DTPA] ajustando o pH com uma solução de amoníaco é comparado vantajoso para a utilização de hidróxido de sódio, uma vez que o cloreto de amónio por-produto pode ser removido a partir do resíduo por meio de sublimação muito hidrófilo. Sob as condições acima mencionadas esse processo ocorre lentaly. Uma vez que quantidades não negligenciáveis ​​de cloreto de ainda eram detectáveis ​​após cinco dias, o sal restante foi lavado com metanol. Embora este processo de processamento resulta em perda parcial de Ga [EOB-DTPA], o produto foi obtido com pureza analítica com um rendimento global de 46% (Figuras 4-6, Tabela 1). Para o isolamento de ambos EOB-DTPA e os seus Ga (III), a utilização de cromatografia de fase inversa deve ser considerado como um método alternativo de purificação, especialmente uma vez que a decomposição de gel de sílica, é provável que quando a utilização de solventes altamente polares.

O processo de marcação de EOB-DTPA necessário o uso de solventes, produtos químicos e equipamentos isento de metal de elevada pureza para evitar a presença de iões metálicos competem, devido à 68Ga estar presente em quantidades nanomolares (2 MBq de 68 Ga em uma amostra de 1,75 ml igual a uma concentração de 0,14 nM nuclídeo). Etiquetagem de EOB-DTPA a 68 Ga ocorre a um pH de 3,8-4,0 dentro de cinco minutosnutos à temperatura ambiente. As investigações sobre a eficácia Ga-68 rotulagem exigem a determinação do rendimento da marcação, mantendo a condições de reacção de pH, temperatura e tempo de reacção, assim como a partir da actividade 68Ga constante ou em uma gama justificável. Para cada ponto de dados (isto é, a concentração de ligando) a experiência deve ser realizado pelo menos três vezes para fornecer um grau de confiança razoável, uma vez que as concentrações de ambos os ligandos e 68Ga são muito baixo e o rendimento da marcação, portanto, sensíveis ao mesmo ligeiros desvios da condições de reacção. Por exemplo, como as idades 68 de eluato Ga, alíquotas de aumento de volume têm de ser retirado para proporcionar uma actividade de partida constante, requerendo, assim, volumes crescentes de tampão. Além disso, o envelhecimento dos resultados de eluato em concentrações crescentes do produto de desintegração de Zn 68, que por sua vez pode actuar como um competidor para 68 Ga, assim, afectar negativamente as Labeling eficiência. 13,34,35 rotulagem Praticamente quantitativa de 22-29 MBq 68 Ga é alcançado nas condições acima mencionadas, com quantidades de EOB-DTPA ≥ 0,7 g (Figura 9), com conteúdo livre 68 Ga ≤ 2% e cerca de 5 % de 68Ga coloidal presente em amostras.

Enquanto HPLC proporcionou a separação de linha de base superior de livre 68Ga e 68Ga [EOB-DTPA], que não é adequado para detectar coloidal 68Ga. Assim, optamos por TLC para determinar a RCP durante as medições de estabilidade, em que a quantificação de transferrina ou ligado às proteínas 68 Ga foi exigido. Encontrámos separação de linha de base aceitável para esse fim (Figura 10); No entanto, a utilização de exclusão de tamanho de cromatografia ou métodos de filtração para remover as fracções 15,36 coloidais, seguido por análise de HPLC, pode ser considerado como alternativas. O complexo Ga 68 exibe um forte retenção em placas de TLC (Rf = 0,3), se a amostra for retirada directamente a partir de solução de rotulagem, em oposição às amostras a pH fisiológico (Rf = 0,5). Sugerimos esta observação pode ser explicada por diferentes estados de protonação do complexo.

Em determinações de estabilidade in vitro de 68 Ga marcadores são normalmente realizados em PBS 15,17 ou sistemas tampão alternativos mimetizando o pH fisiológico 37, bem como em soluções contendo apo- transferrina 37, que é o principal concorrente para 68Ga no sangue, ou em 15,17 soro humano. Nas nossas experiências foi necessária a adição de solução de hidróxido de sódio 0,1 M a PBS para ajustar o pH das amostras a 7,4. Não conseguimos afirmar que a concentração de fosfato influencia a taxa de degradação, já que experiências de estabilidade em soluções de várias concentrações de fosfato (0,8 mM e 5,5 mM (A)), produziu o não-reproduresultados cible. No entanto, verificou-se que uma solução B, contendo apo -transferrin (1,6 mg / ml, o que está dentro do alcance do teor de plasma normal 38) e 0,8 mM de fosfato (sangue humano geralmente apresenta um nível de fosfato de 0,8-1,5 mM de 39,40 ), faz com que a decomposição a uma taxa comparável à observada no soro humano (C). Em soluções CA, após 185 minutos o teor de coloidal 68Ga tinha aumentado em cerca de 24%, enquanto que o teor de livre 68Ga tinha aumentado em 11% na solução A, 17% em solução B e 27% na solução C (Tabela 2 ). O facto de 68Ga formada por decomposição do marcador é predominantemente presente como 68Ga livre em oposição à coloidal ou ligado à proteína Ga 68 em B e C pode ser devido a saturação de transferrina ou de ligação à transferrina taxas comparativamente lentas. (Figura 11) de 68Ga [EOB-DTPA] é comparável ao que caracterizam marcadores quelantes de DTPA derivados semelhantes. 15,16,18 Normalmente, a informação sobre o início arterial e venosa fase de perfusão do fígado são obtido pela execução de imagens de ressonância magnética, dentro dos primeiros 3 minutos após a administração 4,21 Gd [EOB-DTPA], enquanto que a presença de hepatócitos é detectada na fase tardia 3,4,23 20 minutos até várias horas após a injecção 21,22. Depois de 20 minutos em soro humano 93% de 68Ga [EOB-DTPA] permanecem intactos. Como era de esperar, a relação sinal-ruído que por vez teria deteriorado devido a quantidades crescentes de 68Ga-transferrina, que está presente em receptores de transferrina no plasma e tecido que expressa, bem como livre 68Ga galato 41,42.

Para prever uma distribuição de tecidos traçadores n- partição octanol / água log coeficientesP ou distribuição coeficientes LoGD pode ser determinada como relação de concentrações de actividade nas duas fases. Por definição, o parâmetro logD não faz distinção entre múltiplos espécies presentes num meio, o que o torna adequado para nossas experiências, devido à possibilidade de diferentes estados de protonação do marcador bem como a sua decomposição na fase aquosa. Para determinar logD por extracção do meio aquoso é geralmente tamponado com PBS para mimetizar condições de sangue. 17,43-45 Por razões acima mencionadas usamos PBS diluídas, que apresenta uma concentração de fosfato de 0,8 mM e um pH fisiológico. Após a extracção com n -octanol e centrifugação, a remoção de várias aliquotas a partir da mesma fase permite a imprecisões causadas por pipetagem a ser reduzida. Devido às concentrações muito baixas de actividade em n- octanol deve-se ter cuidado para evitar a contaminação cruzada com a fase aquosa e para garantir a transferência quantitativa num frasco separado. distribcoeficientes ution, determinados pelo procedimento foram reprodutíveis, e enquanto eles permitem uma estimativa aproximada de lipofilicidade, uma comparação direta a um logP de D'us [EOB-DTPA] não é possível. Devido à especificidade de Gd [EOB-DTPA] resultante não primariamente a partir de lipofilicidade, mas sim a sua absorção hepatobiliar experiências adicionais em sujeitos ou células vivas seria necessário para proporcionar informações mais detalhadas sobre a biodistribuição, bem como a estabilidade in vivo de 68 Ga [EOB -DTPA]. Ao todo, uma aplicação como agente de imagem para a perfusão e fase hepatobiliar precoce é imaginável.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
primovist Bayer - 0.25 M
gallium(III) chloride Sigma-Aldrich Co. 450898
water (deionized) - - tap water deionizing equipment by Auma-Tec GmbH
hydrochloric acid 12 M VWR 20252.29
sodium hydroxide Polskie Odczynniki Chemiczne S.A. 810925429
oxalic acid Sigma-Aldrich Co. 75688
ethyl acetate Brenntag GmbH 10010447
silica gel Merck KGaA 1.10832.9025 Geduran Si 60 0.063-0.2 mm
TLC silica gel 60 F254 Merck KGaA 1.16834.0001
methanol VWR 20903.55
ethanol Brenntag GmbH 10018366
eiethylether VWR 23807.468 stored over KOH plates
ammonia solution (25%) VWR 1133.1
pH electrode VWR 662-1657
stirring and heating unit Heidolph 505-20000-00
pump Ilmvac GmbH 322002
frit - custom design
NMR spectrometer Bruker Coorporation - Ultra Shield 400
mass spectrometer Thermo Fisher Scientific Inc. -
elemental analyser Hekatech GmbH Analysentechnik - EuroVector EA 3000 CHNS
deuterated water D2O euriso-top D214 99.90% D
Material/Equipment required for labeling procedures
68Ge/68Ga generator ITG Isotope Technologies Garching GmbH A150
pump and dispenser system Scintomics GmbH - Variosystem
hydrochloric acid 30% (suprapur) Merck KGaA 1.00318.1000
water (ultrapur) Merck KGaA 1.01262.1000
sodium chloride (suprapur) Merck KGaA 1.06406.0500
sodium acetate (suprapur) Merck KGaA 1.06264.0050
glacial acetic acid (suprapur) Merck KGaA 1.00066.0250
sodium citrate dihydrate VEB Laborchemie Apolda 10782 >98.5%
PS-H+ Cartridge (S) Macherey-Nagel 731867 Chromafix
apo-Transferrin Sigma-Aldrich Co. T2036
PBS buffer (tablets) Sigma-Aldrich Co. 79382
human serum Sigma-Aldrich Co. H4522 from human male AB plasma
flasks, columns, etc. custom design
pH electrode Knick Elektronische Messgeräte GmbH & Co. KG 765-Set
binary pump (HPLC) Hewlett-Packard G1312A (HP 1100)
UV Vis detector (HPLC) Hewlett-Packard G1315A (HP 1100)
radioactive detector (HPLC) EGRC Berthold
HPLC C-18-PFP column Advanced Chromatography Technologies Ltd. ACE-1110-1503/A100528
HPLC glass vials GTG Glastechnik Graefenroda GmbH 8004-HP-H/i3µ
pipette Eppendorf -
plastic vials Sarstedt AG & Co. 6542.007
plastic vials Greiner Bio-One International GmbH 717201
activimeter MED Nuklear-Medizintechnik Dresden GmbH - Isomed 2010
tweezers custom design
incubator Heraeus Instruments GmbH 51008815
vortex mixer Fisons - Whirlimixer
centrifuge Heraeus Instruments GmbH 75003360
gamma well counter MED Nuklear-Medizintechnik Dresden GmbH - Isomed 2100
water for chromatography Merck KGaA 1.15333.2500
acetonitrile for chromatography Merck KGaA 1.00030.2500
trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 91707
TLC radioactivity scanner raytest Isotopenmessgeräte GmbH B00003875 equipped with beta plastic detector

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