EOB-DTPAとそのののGa(III)錯体に関する研究

Chemistry

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Summary

EOB-DTPAの単離およびその後の複合体形成の自然のGa(III)および68とGaが本明細書に提示されるだけでなく、標識効率上のすべての化合物との調査を徹底的に分析、in vitroでの安定性およびオクタノール /水のための手順放射性標識された複合体の分配係数。

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Greiser, J., Niksch, T., Weigand, W., Freesmeyer, M. Investigations on the Ga(III) Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue. J. Vis. Exp. (114), e54334, doi:10.3791/54334 (2016).

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Abstract

私たちは、EOB-DTPA(3,6,9-トリアザ - 3,6,9-トリス(カルボキシメチル)-4-(エトキシ)-undecanedioic酸)そののGd(III)から複雑とプロトコルのための単離のための方法を実証します斬新な非放射性、 すなわち、自然のGa(III)と同様に放射性の68 Ga錯体の製造。リガンド並びにジョージア(III)錯体は、核磁気共鳴(NMR)分光法、質量分析および元素分析によって特徴づけした。 の68 Gaは、68 Ge / 68 Gaジェネレータから、標準的な溶出法により得ました。 pHが3.8から4.0でEOB-DTPAの68 Gaの標識効率を評価するための実験を行いました。確立された分析技術ラジオTLC(薄層クロマトグラフィー)、ラジオHPLC(高速液体クロマトグラフィー)は、トレーサーの放射化学的純度を決定するために使用しました。 68 Gaトレーサー」親油性オクタノール /水distributioの最初の調査として、pH7.4の溶液中に存在する68のGa種のN個の係数は、抽出法によって決定した。行った生理的pHでの様々な媒体におけるトレーサのインビトロ安定性の測定値を、分解の異なる速度を明らかにする。

Introduction

Gadoxetic酸、リガンドEOB-DTPA 1ののGd(III)錯体の一般名は、肝胆道磁気共鳴画像(MRI)で頻繁に使用される造影剤である。2,3により、その肝細胞によって特異的な取り込みと高い割合に肝胆道排泄のそれは、局所性病変と肝腫瘍の局在化を可能にする。MRI技術( 例えば、造影剤の毒性、閉所恐怖症または金属インプラントの患者に限定された適用)の2-5しかし、一定の制限が代替診断ツールを求めます。

陽電子放射断層撮影(PET)分子イメージング法であり、前記放射性物質(トレーサー)少量の体内での分布をPETスキャナによって記録される際に、投与される。6 PETは高いが可能に動的な方法であります空間的および時間的な画像の解像度と同様にしなくても、結果の定量化、MRI造影剤の副作用に対処します。得られた代謝情報の有益な価値はさらに、最も一般的にPET / CTスキャナにおけるコンピュータ断層撮影(CT)とのハイブリッド画像化することによって達成さ、付加的な画像化方法から受け取った解剖学的データと組み合わせることによって増加させることができます。

PETに適したトレーサーの化学構造は、陽電子放射体として放射性同位元素を含まなければなりません。陽電子は、彼らはほとんどすぐに周辺組織の原子殻の電子と消滅するので、短い寿命を持っています。消滅によって運動の反対方向を有する2つの511keVのγ光子がPETスキャナによって記録され、放出される。7,8トレーサーを形成するために2デオキシの場合のように、PET核種は、分子に共有結合され得ます2- [18 F] fluoroglucose(FDG)、最も広く使用されるPETトレーサー7が、核種はまた、1つまたは複数のリガンドに配位結合を形成することができる( 例えば、[68 Gaの] -DOTATOC 9,10)、または溶存無機塩( 例えば、[18 F]フッ化ナトリウム11)として適用されます。それは、その生体内分布、代謝および排泄動作を決定するよう要するに、トレーサーの構造が重要です。

適切なPET核種は便利な陽電子エネルギーと可用性だけでなく、意図された調査のための十分な半減期のような良好な特性を組み合わせる必要があります。 68 Gaの核種は、過去20年間に、PETの分野で不可欠な力となっています。12,13これが原因サイクロトロン付近から独立して、オンサイトの標識を可能にする発電システムを介してその可用性、主にあります。発電機では、母親は68 Geが娘核種68 Gaは、適切なキレート剤に溶出し、続いてラベル付けされたカラムに吸収される核種。6,14 の68 Ga核種がtrivalとして存在するので、ただのGd(III)10,13のような耳鼻咽喉科カチオン、代わりにgadoxetic酸と同じ全体的に負電荷を有する複合体を生じるであろう68のGaとEOB-DTPAキレート。したがって、その68のGaトレーサーは、PETイメージングのための適性と同様の特性肝臓特異性を組み合わせることがあります。 gadoxetic酸は、次のコンテキストで購入し、二ナトリウム塩として投与されていますが、私たちはGdの[EOB-DTPA]と呼ぶことにしますのGa [EOB-DTPA]、または68 Gaの[などの非放射性のGa(III)錯体へ便宜的に、放射性標識成分の場合にはEOB-DTPA]。

PET用のトレーサーとしてのそれらの適用性を評価するために、放射性金属錯体は、最初にin vivoまたはex vivo実験で、インビトロで広範に検討される必要があります。それぞれの医学的問題のための適合性を判断するために、生体内分布挙動およびクリアランスプロフィール、安定性、器官特異性および細胞またはTISSUのような様々なトレーサー特性電子取り込みを検討する必要があります。それらの非侵襲的な文字に、in vitroでの決定は、多くの場合、in vivo実験に先立って行われています。一般的には、DTPAおよびその誘導体が原因で、in vivoで投与した場合に比較的速い分解その結果、運動不活性を欠いているこれらの複合体への68 Gaのためのキレート剤として限られた適合性であることが認められている。14-20これは主にアポトランスフェリン作用によって引き起こされます血漿中の68 Gaのための競争相手。それにもかかわらず、我々は診断情報は、それによって必ずしも長期トレーサー安定性を必要としない、数分以内に注射後3,4,21-23を提供することができる、請求肝胆道造影、その適用可能性に関するこの新しいトレーサーを調べました。この目的のために、我々はgadoxetic酸からEOB-DTPAを単離し、最初に二つの安定同位体、69 Gaと71の混合物として存在する天然のGa(III)、との複合体形成を行いました、68 Gaを、以下のキレート化のための非放射性標準を務めました。我々は方法を確立し、同時にEOB-DTPAの68 Galabeling効率を決定し、新しいの68 Gaトレーサーの親油性と異なる媒体でのその安定性を調査するための適性を評価した使用します。

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Protocol

EOB-DTPAとGaの調製[EOB-DTPA]

注意:使用前に使用される有機溶剤、酸、アルカリ類の関連するすべての物質安全データシート(MSDS)を参照してください。ヒュームフード内のすべてのステップを実行し、個人用保護具(安全眼鏡、手袋、白衣)を使用します。

  1. gadoxetic酸からEOB-DTPAの単離
    1. フラスコに0.25 M gadoxetic酸注射液の3ミリリットルを入れてください。攪拌溶液にシュウ酸500mgの(5.6ミリモル)を追加します。
    2. 1時間撹拌した後、減圧を使用してフリットを通して懸濁液を濾過します。それぞれ、3mlの水で残留物3回洗浄します。
    3. 水性ろ液を合わせ、pH電極を有する溶液を装備。 pHが約-0.1となるまでろ液に12​​ M塩酸を追加します。
    4. 無色の残渣を得、真空中で溶媒を除去します。不活性ガス下で保管してください。
    5. 徹底的に残留物を洗う(少なくとも3シュウ酸の過剰を除去するために酢酸エチルで倍)。 真空中で残留物を乾燥させます。
    6. 室温で水2mlに残渣を再溶解し、次いで氷浴中で溶液を冷却します。氷浴を除去することなく、形成されるまで、0.5M水酸化ナトリウム水溶液を滴下して加える無色観察される固体膠質。
    7. デカンテーションにより水を除去します。冷たい水の1ミリリットルで固体をさらに2回洗浄します。最初の生成物画分を得、真空下で固体を乾燥させます。
    8. カラムクロマトグラフィー(シリカ、メタノール/水4/1) を経由してデカント水を合わせた画分から第二生成物画分を分離してください。24溶媒を真空中で除去します。
    9. 得られた固体は純粋な白ではない場合、生成物を沈殿させるためにエタノール10ml、続いて10 mlのジエチルエーテルを追加し、水1ml中に再溶解。減圧し、 真空下で乾燥を使用して、フリットを通して濾過
    10. コンバイン固体EOB-DTPAの分画およびNMR分光、25質量分析26、元素27分析を行うの両方。
  2. Gaの合成[EOB-DTPA]
    注意:ストア乾燥した不活性雰囲気下で固体のGa(III)塩化物は、空気との接触時にあるため、水分やグリースの分解は、黄褐色または黒色の不純物の腐食性のフューム及び形成をもたらす、行われます。
    1. 100mlの水でのGa(III)塩化物の1.94グラム(11.0ミリモル)を溶​​解させることによって0.11 Mストック溶液を準備します。水4mlの25%アンモニア溶液1mlを希釈します。
    2. 水10mlでフラスコにEOB-DTPAの80ミリグラム(0.15ミリモル)を溶​​解します。必要であれば、完全な溶解を達成するために溶媒を加熱します。
    3. Ga(III)塩化ストック溶液1.4ミリリットル(0.15ミリモル)を追加します。攪拌機およびpH電極を備えたフラスコを装備。溶液のpHが約4.1になるまで希釈したアンモニア水溶液を滴下して加えます。 ROで撹拌30分間OM温度。
    4. 溶媒を真空中で除去します。中央と並列側ネックとstillheadを備えたフラスコ中の残渣を、置きます。真空ポンプの出口と冷却指で中央首と側ネックを装備
    5. 減圧下(125℃、0.6ミリバール)下で残留物を加熱します。定期的に冷却指とまだ頭から(ガラス表面の白いコーティングとして見える)昇華塩化アンモニウムを除去するだけでなく、わずかに濡れた布でフラスコの上部から。新しい昇華物の目に見える形成がなくなるまで処理を続行します。
    6. 塩化アンモニウムの最後の痕跡を除去するためには、それぞれ、熱メタノール0.5mlを、残留物を3回洗浄します。 真空中で無色の残留物を乾燥させます。 NMR分光、25質量分析26、元素27の分析を行います。

2.一般的な標識化手順

注意:すべてのex放射性物質との直接的または間接的な接触を含むperimentsは、訓練を受けた担当者によって行われなければなりません。適切な遮蔽装置を使用してください。別々に任意の放射性廃棄物を収集し、保存し、有効な規制に従って廃棄してください。

  1. 発電機の溶出
    注:ドデシル-3,4,5-トリヒドロキシシリカの酸化物として結合母核種40 mCiの68 Ge / 68 Gaジェネレータを使用しました。この手順の場合のように溶出し、精製は蠕動ポンプディスペンサ装置を使用して結合自動プロセスとして、手動で行ってもよいです。
    1. 5.5 M、1.0 Mおよび0.05 M塩酸の溶液を調製します。 1mlあたり5.5 M塩酸の25μLを含む5.0 M塩化ナトリウムの溶液を調製します。 4.1グラムの酢酸ナトリウムを1mlのHCl(30%)、2.5 mlの氷酢酸を合成し、50mlの水で混合物を希釈してpH 4.6の緩衝液を調製します。
    2. PREC1.0Mの塩酸、水、続いて5mlを1mlでゆっくり流すことによってPS-H +カートリッジondition。
    3. 4ミリリットル0.05 M HClで発電機のシリカカラムを溶出。12ロードPS-H +カートリッジへの68 Ga溶出液。
    4. 5mlの水でカートリッジをフラッシュし、続いて空気5mlで乾かし。 1ミリリットル5.0 M酸性塩化ナトリウム溶液でカートリッジからの68 Gaを溶出させる。28
  2. 68 GaとEOB-DTPAの標識
    1. 1mlの水にEOB-DTPA 1mgの(1.9マイクロモル)を溶​​解します。この溶液から100μL(0.19マイクロモル)に乗り、19μM(10 / mlの)EOB-DTPAのストック溶液を調製するために水の9.9ミリリットルでそれらを希釈します。
    2. 68 Gaを含む溶液50μl(22-29 MBqのに等しい)を外し、バイアルに入れました。 EOB-DTPAの19 mMストック溶液50μl(0.5μgの)と300μlのOを追加します。F pHを4.0に上げるためにバッファ。簡単に振ると5分間、室温で溶液をインキュベートします。 1-5μlのアリコートを取り出して、HPLC又はTLC分析に置きます。
    3. 逆相(RP)C18カラム上の無線HPLC分析を行い29次の移動相を使用します。A -水/トリフルオロ酢酸(99.9%/ 0.1%)、B -トリフルオロ/アセトニトリル酸(99.9%/ 0.1%)、勾配:06分で80%のA→0%A(0.5ml /分)、610分0%A(0.5ml /分)。
    4. 曲線下面積などの無線HPLC信号のピーク強度を決定します。次のようにトレーサーの放射化学的純度(RCP)などの標識率を計算します。
      RCP = A のGa-EOB-DTPA / ガリウム(Ga + A のGa-EOB-DTPA)は、100%を∙します
      Ga-EOB-DTPA:68のGa [EOB-DTPA]の曲線下面積
      ジョージア :無料の68 Gaの曲線下面積

3.標識効率

  1. 説明するように標識手順を実行しますセクション2.中のd(溶出液の鮮度に応じて40から140マイクロリットル) の68 Ga溶出液の活動を開始する一貫性の範囲、 例えば、22から29 MBqの。
  2. (68 Gaの溶出液の量に応じて、40から190μl)を3.8から4.0にpHを調整するための緩衝液の必要量を加えます。リガンドストック溶液(19 mM溶液の10から70マイクロリットル)の必要量を追加します。
  3. 1.75ミリリットルに各標識化プローブの全体の音量を調整するために水の必要量を追加します。徹底的に混合し、サンプルを室温で5分間放置しました。標識収率を決定するために、項2に記載のようにHPLC分析を行います。
  4. 0.1μgのと0.1μgの刻みで0.7μgの間のリガンドの量で標識する手順を実行します。各リガンド濃度について三連で実験を行います。平均収量と標準偏差を計算します。

4. インビトロ安定性

  1. 一般のprocedureと準備
    1. 10mMのリン酸濃度のPBSストック溶液を調製し、脱イオン水200mlにリン酸緩衝食塩水(PBS)の錠剤を溶解させます。
    2. 部3のサンプルを撤回で説明したように、セクション2に記載されるように、68 Gaの溶出液の量に応じて、EOB-DTPA原液の0.5μlの22から29 MBqでの68 Gaのラベル付けを行うバッファの量を調整安定性の測定を実行するためのトレーサーの6-12 MBqのを含む標識溶液。
    3. 溶離液として0.1 M水性クエン酸ナトリウムを使用して、80ミリメートルシリカゲル被覆アルミニウムプレート上でラジオTLC分析を行い、TLC放射能スキャナーでプレートを分析する。30は、曲線下面積としてTLC信号の強度を決定します。次のようにトレーサのRCPを計算します。
      RCP = A のGa-EOB-DTPA / ガリウム(Ga-無料 + のGa-EOB-DTPA + A のGa-コロイド )∙100%
      Ga-EOB-DTPA:68のGaの曲線下面積[EOB-DTPA]
      Gaを無料 :無料の68 Gaの曲線下面積
      コロイドの68 Gaの曲線下面積:Gaをコロイド
    4. すべての時点についてRCP トン / RCP 0を計算ます。出発点t = 0分からの時間差このように標準化されたRCPをプロットします。
      RCP トン =時点tでの68 Ga [EOB-DTPA]のRCP。
      = 0分tでの68 Ga [EOB-DTPA]のRCP 0 = RCP。
  2. リン酸緩衝生理食塩水(A)中での安定性
    1. 標識溶液の65μlにpHを7.4に上昇させるためにPBS原液15​​0μlの水酸化ナトリウム溶液(0.1 M)の60μlを添加します。完全に混合。
    2. ( '出発点')TLC分析を実行するために1-5μlのアリコートを削除します。すぐに表現でTLC分析を実行するために37℃のインキュベーター中の溶液を保存し、アリコートを除去3時間かけ時点をティブ。
  3. PBS中のアポ -transferrinの過剰に対する安定性(B)
    1. 標識溶液の120μlに7.4のpHを上昇させるためにPBS原液50μlの水酸化ナトリウム溶液(0.1 M)の430μLを加えます。 アポ -transferrin(25 mg / mlで)の溶液40μLを加えます。完全に混合。
    2. ( '出発点')TLC分析を実行するために1-5μlのアリコートを削除します。すぐに37℃のインキュベーターでソリューションを保存し、3時間かけて代表の時点でTLC分析を実行するためにアリコートを削除します。
  4. ヒト血清中での安定性(C)
    1. ヒト血清の500μlに7.4にpHを上げるために、標識溶液25μl及び水酸化ナトリウム溶液(0.1 M)の45μlを添加します。完全に混合。
    2. ( '出発点')TLC分析を実行するために1-5μlのアリコートを削除します。すぐにincuでソリューションを保存します37℃でバートル、アリコートを除去し、3時間かけて代表時点でTLC分析を実行します。

分配係数の5決意のlogD

  1. 標識溶液50μlに、セクション2で説明したように標識化手順を実行し7.4のpHを上昇させるためにPBS原液20μlの水酸化ナトリウム溶液(0.1 M)の170μLを加えます。
  2. その溶液から200μLを撤回し、プラスチック製のV-バイアルにそれを置きます。 オクタノール 200μlのを追加します。 2分間バイアルおよび渦を閉じます。その後、5分間1600×gでサンプルを遠心します。
  3. n個のオクタノール相と水相からそれぞれ40μLの三連を外し、別のV-バイアルに入れます。層を混在しないように注意してください。
  4. 30秒間ガンマウェルカウンターで各試料の活性を測定します。各サンプルについて、すぐに二回の測定を繰り返し、その平均活動Ᾱ トンを計算トン、W1、Ᾱのトン、W2とᾹ トン、W3(水性試料中の活動)とᾹのトン、O1、Ᾱトン、O2、Ᾱトン、O3( オクタノールでの活動は)それぞれと一緒に一覧表示しますその決意の時点t。
  5. トン0として最後のサンプルの測定の時点を定義します。 = TT 0Δtだけを計算することにより分でΔtだけを判別し、一覧表示します。次の式を使用して、Ᾱtの減衰補正を実行します。
    Ᾱ0 =Ᾱ トン ・2(ΔT/ 68分)。
  6. Ᾱ0、O1、Ᾱ0、O2Ᾱ0、O3の平均としてᾹ0、W1、Ᾱ0、W2Ᾱ0、W3と同様にᾹ0、Oの平均値としてW、Ᾱ0を計算ます。次の式を使用してのlogDを計算します。
    logD =ログ[(Ᾱ )/(Ᾱ0、W・33μgの)]。
  7. 三重での実験全体を実行し、その標準偏差と共に平均のlogDを算出します。

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Representative Results

リガンドEOB-DTPA、および非放射性のGa(III)錯体は、1 H及び13 C {1 H} NMR分光法、質量分析および元素分析によって分析しました。 図1-6、表1に記載されていると示した結果は、物質の純度を確認します。

68 Ge / 68 Gaジェネレータの溶出は400〜600 MBqでの68 Gaの溶液を得ました。所望のトレーサー68のGa [EOB-DTPA]の形成に記載の標識化手順の結果は、2.8分( 図7)の保持時間を示す無線HPLCピークとして示されます。 220 nmの(2.7分、 図8)のUV-VIS検出器中のGa [EOB-DTPA]標準の保持時間との比較が成功の標識を確認します。まとまりのない68 Gaは2.1分でラジオピークとして検出される( 7)。 EO-BDTPAの68 Gaの標識効率を、HPLC を介してリガンド濃度の関数としての標識収率( 図9)を決定することによって調べました。収率は、三連で測定し、標準偏差を算出しました。

pHおよび溶液中に存在する陰イオンの濃度に依存して、まとまりのないまたは非標識の68 Gaは、様々な種において、例えば 、没食子酸または不溶性の水酸化物として存在することができる。31一般的な用語「遊離の68 Ga「32は 、すべての非標識化のために使用されます一般的に「コロイドの68 Ga」と呼ばれる水酸化除いて、溶液中の種。説明解析条件の下では、無料の68 GaがTLCプレート上の溶媒先端(式中、R f = 1.0)に移動します。 TLCプレート上で、それが活動として表示されている間、コロイドの68 Gaは、HPLC を介して検出することができません原点(R F = 0)での。 TLC放射能スキャナで分析TLCプレートの代表的なクロマトグラムは、 図10に示されているトレーサーに依存して、異なる保持挙動を示すかどうかの標識溶液のサンプル(pHは3.8から4.0まで 、R f = 0.3)または生理学的試料pHは(式中、R f = 0.5)を分析しました。

希釈したPBS中で新鮮に生理的pHのサンプルに追加された68のGa [EOB-DTPA]標識トレーサーの安定性、希釈含むPBS(リン酸濃度5.5 mMの、A)、 アポトランスフェリンの過剰(1.6 mg / mlとを調査するために、それぞれ0.8のリン酸塩濃度ミリモル、B)およびヒト血清(C)、を有します。時間が経つにつれて、サンプル中のトレーサーの放射化学的純度(RCP t)は 、TLC により決定ました。無傷のトレーサーのパーセンテージは、RCP tの比として計算しました始点における各時点及びRCP 0( 表2)。これは、RCP 0(93から96まで%を)異なるのトレーサーを含むラベリング・ソリューションに必要でした。無傷のトレーサーのこのよう標準化された割合は、 図11中の時間の関数として示されています。

希釈したPBS溶液中のトレーサのlogDを水性サンプルの決意のために調製しました。サンプルは、 オクタノールと混合し、遠心分離し、その後アリコートを両方の相中の放射能濃度を決定するために除去しました。活性値とのlogDのその後の計算は、 表3に示されている。平均のlogD値は3.54±0.08です。

図1
EOB-DTPAの 図1. 1 H-NMRスペクトルを示します。 < / strong>のスペクトルは400.1 MHzでD 2 Oで記録した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2. 13 C EOB-DTPAの {1 H} -NMRスペクトルを。スペクトルは100.6 MHzでD 2 Oで記録した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
EOB-DTPAの図3. MS(エレクトロスプレーイオン化(ESI)、メタノール、ネガティブモード)。54334fig3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
Ga 図4. 1 H-NMRスペクトル[EOB-DTPA]。スペクトルは400.1 MHzでD 2 Oで記録した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5. 13 C {1 H}のGa [EOB-DTPA]の-NMRスペクトル。スペクトルは100.6 MHzでD 2 Oで記録した。 彼女をクリックしてください eは、この図の拡大版を表示します。

図6
Ga [EOB-DTPA](ESI、メタノール、ネガティブモード)の図6. MS、分子ピークの同位体パターンの詳細な描写と一緒にこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図7
Gaは[EOB-DTPAは]の部分に含む非協調的な68 Gaは、放射能検出器によって記録された。コーディネートされていない68 Gaは2.1分の保持時間を示す68のサンプルの図7.代表的HPLCクロマトグラム 、トレーサーは2.8分に検出されています。ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図8
標準物質のGa [EOB-DTPA]の 図8. 代表的HPLCクロマトグラム、220 nmでのUV-VISチャンネルで検出されるように。冷たい標準の保持時間は2.7分である。 これの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。図。

図9
EOB-DTPAの 68 のGa標識効率 図9. 描写が 。HPLC 決定されるようなラベリング収率はEOB-DTPA(22-29 MBqで始まる活動の濃度の関数としてプロットされ、pHは3.8から4.0、5分、RT)。標準偏差をエラーバーで示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図10
別の68 Gaの種を明かす図10.代表的TLCクロマトグラム。希釈したPBS中の68 Ga [EOB-DTPA](リン酸濃度5.5 mMの、pH値= 7.4)のサンプルは、インキュベーションの110分後に分析しました。 70ミリメートルTLCプレート上のコロイドの68 Ga(R F = 0)、68 Gaの[EOB-DTPA](式中、R f = 0.5)と無料の68 Ga(式中、R f = 1.0)の典型的な分布TLC放射能スキャナによって検出されるようです提示しました。カウントが減衰補正している。 大きく表示するには、こちらをクリックしてください。この図のバージョン。

図11
別のメディアで 68 Ga [EOB-DTPA] 11。 安定性の決定 減衰を補正し、TLC を経て決定されるように、無傷のトレーサーの標準化された割合は、時間の関数として描かれている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 。

表1
ピークのNMR分光、MSとEOB-DTPAとGa [EOB-DTPA]に対して行わ元素分析。相対的なMSピーク強度を%で与えられている、割り当ての表1の結果は、角括弧で示されています。エレメンタルCHN値はcalcuましたC 23 H 33 N 3 O 11・H 2 O(EOB-DTPA)および(NH 4)0.75 H 1.25 [C 23 H 28 GaN系3 O 11]・2H 2 O( のGa [EOB-DTPA])のためにされた関連。

表2
別のメディアで 68 Ga [EOB-DTPA] の表2の安定性の決意 メディアA、BおよびCの68 Ga [EOB-DTPA]のRCPは、与えられた時点で、TLC によって測定しました。サンプルの組成は、トレーサー/無料の68 Ga /コロイドの68 Gaの%で割合として与えられています。無傷のトレーサーのパーセンテージは、RCPのT / RCP 0の比として規格化されています。 RCP 0を t = 0分でのトレーサーの各RCPです。


サンプルのlogDを減衰 表3 決意は 値が0、α3つのアリコート(X = 1、2、3)各相から除去(::水、O nはオクタノールW)のX訂正しました。すべての活動は、CPMに記載されています。プロトコルのセクション5で説明したようにlogDを算出します。実験は2回繰り返しました。

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Discussion

EOB-DTPAは、多段階合成33を介してアクセス可能ですが、全く同じようにgadoxetic酸を含む利用可能な造影剤から単離することができます。この目的のために、中央のGd(III)イオンは、シュウ酸の過剰析出させることができます。 Gd(III)、シュウ酸とシュウ酸を除去した後、リガンドは、pH 1.5で冷水中での沈殿によって単離することができます。しかし、濾液の歩留まりカラムクロマトグラフィーを増強するために代わりに、またはフォローアップ手順として行うことができます。この方法は、70%( 図1〜図3、 表1)の全収率で分析的に純粋なリガンドを与えるのいずれか。

我々は、副生成物の塩化アンモニウムを昇華を介して非常に親水性残基から除去することができるのでのGa [EOB-DTPA]アンモニア溶液を用いてpHを調整を単離するためには、水酸化ナトリウムの使用に比べて有利で ​​あることを見出しました。上記条件の下では、このプロセスは遅く起こりますLY。塩化物の無視できない量が5日後に依然として検出可能であったので、残りの塩をメタノールで洗い流しました。ジョージアの部分的喪失でこの作業手順結果[EOB-DTPA]が、製品は46%( 図4-6、 表1)の全体的な収率で分析純度で得られました。 EOB-DTPAとのGa(III)複合体の両方の単離のために、逆相クロマトグラフィーの使用は、高度に極性溶媒を使用する場合、シリカゲルの分解の可能性があるので、特に、精製の代替方法として考慮されるべきです。

EOB-DTPAのラベリング処理が原因の68 Ga 1.75 mlの試料中の68 Gaのナノモル量で存在する(2 MBqのために、競合する金属イオンの存在を回避するために、高純度の溶剤、化学物質及び金属を含まない装置の使用を必要と)0.14 nMでの核種の濃度に等しいです。 68 GaにEOB-DTPAの標識は、5分以内にpHは3.8から4.0で発生します室温でUTES。反応条件のpH、温度および反応時間を維持するだけでなく、68 Gaを一定の活動を開始したり、正当な範囲内にいる間の68 Ga-標識効率に関する研究は、標識収量の決意が必要です。リガンド及び68 Gaの両方の濃度が非常に低いとのわずかなずれに標識収率は、したがって敏感であるため、各データポイント( すなわち、リガンド濃度)については、実験は、合理的な信頼レベルを提供するために少なくとも3回実施すべきです反応条件。例えば、68 Gaの溶出液の年齢として、増加量のアリコートを、それによってバッファの増加する容積を必要とする、一定の開始活性を提供するために引き出される必要があります。また、負したがって、それ自体が68 Gaのための競争相手として作用する可能性崩壊生成物68のZnの濃度を増加labelinに影響を与えることで、溶出液の結果の経年変化22-29 MBqでの68 Gaのグラム効率。13,34,35実際に定量的な標識は、自由68の内容のGa≤2%と約5と、EOB-DTPAの量≥0.7μgの( 図9)と、前述の条件下で達成されます試料中のコロイドの68 Gaの存在%。

HPLCは、無料の68 Gaと68 Gaの[EOB-DTPA]の優れたベースライン分離を提供したが、コロイドの68 Gaを検出するためには適していません。したがって、我々は、トランスフェリンまたはタンパク質結合の68 Gaの定量化が必要とされた請求、安定性の測定中にRCPを決定するためにTLCを選びました。我々は、この目的のために許容可能なベースライン分離( 図10)が見つかりました。しかしながら、サイズ排除クロマトグラフィーまたはろ過方法15,36の使用は、HPLC分析に続いて、コロイド画分が、代替案として考えられるかもしれません削除します。 68 Gaの複合体は、より強力なRETを示しますTLCプレート上ention生理的pH(式中、R f = 0.5)でのサンプルとは対照的に、試料は標識溶液から直接引き出されている場合(式中、R f = 0.3)。私たちは、この観察は、複合体の異なるプロトン化状態によって説明されるかもしれない示唆しています。

68 Gaトレーサーのin vitroでの安定性の決定は、通常と同様に、血液中の68 Gaのための主要な競争相手は、またはである、 アポトランスフェリン37を含む溶液にPBS 15,17または生理的pH 37を模倣する代替バッファシステムで実行されている中でヒト血清15,17。我々の実験では、PBSに0.1 M水酸化ナトリウム溶液の添加は、7.4にサンプルのpHを調整する必要がありました。リン酸塩濃度は、分解速度に影響を与えることを、我々は、リン酸濃度(0.8ミリモルおよび5.5 mmは(A))が得られた非reproduが変化する溶液中で安定性実験のため、主張できませんでしcible結果。しかし、我々は、 アポ -transferrin(正常な血漿量38の範囲内である1.6 mg / mlで)と(ヒト血液は、通常、0.8〜1.5ミリモル39,40のリンレベルを示す0.8mMのリン酸を含む、溶液Bことがわかっ)、ヒト血清(C)にその観測可能に匹敵する速度で分解を引き起こします。無料の68 Gaの含有量は、溶液中で溶液A11%、B液中の17%および27%C( 表2を増加した一方でソリューションACでは、コロイドの68 Gaの含有量分後185は、約24%増加していました)。 BCにコロイドまたはタンパク質結合の68 Gaとは対照的に、68 Gaはトレーサー分解によって形成されたという事実が原因トランスフェリン飽和または比較的遅いトランスフェリン結合率のためである可能性がある無料の68 Gaとして主に存在しています。 の68 Ga [EOB-DTPA]の( 図11)は同様のDTPA由来のキレート剤をフィーチャーしたトレーサーに匹敵するものである。15,16,18通常、肝臓の早期動脈と静脈潅流相の情報があります投与した後の最初の3分の4,21以内にMRIスキャンを実行することによって得たGd [EOB-DTPA]、肝細胞の存在は、20分3,4,23までの数時間、注射後21,22に遅れた位相で検出されています。ヒト血清中の20分後の68 Ga [EOB-DTPA]の93%はそのまま残ります。予想通り、その時間による信号対雑音比が原因で68トランスフェリン受容体を発現血漿および組織中に存在しているのGa-トランスフェリン、ならびに自由の68 Ga没食子酸の量の増加に悪化しているでしょう。41,42

オクタノール/水分配係数は、対数N-トレーサーの組織分布を予測しますP又は分配係数は、2つのフェーズにおける放射能濃度の比として決定することができるのlogD。定義により、logDをパラメータには、トレーサーの異なるプロトン化状態の可能性だけでなく、水相中のその分解に起因する実験に適していますこれは、媒体中に存在する複数の種を区別しません。抽出によるのlogDを決定するために、水性媒体は、通常、血液の条件を模倣するためにPBSでバッファされています。私たちは希釈されたPBSを使用し、前述の理由から17,43-45、リン酸0.8 mMの濃度と生理的pHを示します。 n個のオクタノールおよび遠心分離による抽出に続いて、同位相の複数のアリコートの除去を低減することがピペッティングすることによって引き起こされる不正確さを可能にします。原因オクタノール非常に低い放射能濃度に1は、水相との交差汚染を避けるために、別のバイアルに定量的な移動を確保するために注意する必要があります。按分この手順で決定ution係数は再現性があった、と彼らは親油性の概算を可能にしながら、のGdのlogP [EOB-DTPA]と直接比較することはできません。親油性の主ではない結果としてのGd [EOB-DTPA]の特異性にではなく、生きている被験者または細胞におけるその肝胆取り込み追加実験は、より広範な生体内分布に関する情報だけでなく、68のGaの生体内での安定性を提供する必要がある[EOB -DTPA]。要するに、灌流および早期肝胆相のための造影剤としての用途は想像です。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
primovist Bayer - 0.25 M
gallium(III) chloride Sigma-Aldrich Co. 450898
water (deionized) - - tap water deionizing equipment by Auma-Tec GmbH
hydrochloric acid 12 M VWR 20252.29
sodium hydroxide Polskie Odczynniki Chemiczne S.A. 810925429
oxalic acid Sigma-Aldrich Co. 75688
ethyl acetate Brenntag GmbH 10010447
silica gel Merck KGaA 1.10832.9025 Geduran Si 60 0.063-0.2 mm
TLC silica gel 60 F254 Merck KGaA 1.16834.0001
methanol VWR 20903.55
ethanol Brenntag GmbH 10018366
eiethylether VWR 23807.468 stored over KOH plates
ammonia solution (25%) VWR 1133.1
pH electrode VWR 662-1657
stirring and heating unit Heidolph 505-20000-00
pump Ilmvac GmbH 322002
frit - custom design
NMR spectrometer Bruker Coorporation - Ultra Shield 400
mass spectrometer Thermo Fisher Scientific Inc. -
elemental analyser Hekatech GmbH Analysentechnik - EuroVector EA 3000 CHNS
deuterated water D2O euriso-top D214 99.90% D
Material/Equipment required for labeling procedures
68Ge/68Ga generator ITG Isotope Technologies Garching GmbH A150
pump and dispenser system Scintomics GmbH - Variosystem
hydrochloric acid 30% (suprapur) Merck KGaA 1.00318.1000
water (ultrapur) Merck KGaA 1.01262.1000
sodium chloride (suprapur) Merck KGaA 1.06406.0500
sodium acetate (suprapur) Merck KGaA 1.06264.0050
glacial acetic acid (suprapur) Merck KGaA 1.00066.0250
sodium citrate dihydrate VEB Laborchemie Apolda 10782 >98.5%
PS-H+ Cartridge (S) Macherey-Nagel 731867 Chromafix
apo-Transferrin Sigma-Aldrich Co. T2036
PBS buffer (tablets) Sigma-Aldrich Co. 79382
human serum Sigma-Aldrich Co. H4522 from human male AB plasma
flasks, columns, etc. custom design
pH electrode Knick Elektronische Messgeräte GmbH & Co. KG 765-Set
binary pump (HPLC) Hewlett-Packard G1312A (HP 1100)
UV Vis detector (HPLC) Hewlett-Packard G1315A (HP 1100)
radioactive detector (HPLC) EGRC Berthold
HPLC C-18-PFP column Advanced Chromatography Technologies Ltd. ACE-1110-1503/A100528
HPLC glass vials GTG Glastechnik Graefenroda GmbH 8004-HP-H/i3µ
pipette Eppendorf -
plastic vials Sarstedt AG & Co. 6542.007
plastic vials Greiner Bio-One International GmbH 717201
activimeter MED Nuklear-Medizintechnik Dresden GmbH - Isomed 2010
tweezers custom design
incubator Heraeus Instruments GmbH 51008815
vortex mixer Fisons - Whirlimixer
centrifuge Heraeus Instruments GmbH 75003360
gamma well counter MED Nuklear-Medizintechnik Dresden GmbH - Isomed 2100
water for chromatography Merck KGaA 1.15333.2500
acetonitrile for chromatography Merck KGaA 1.00030.2500
trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 91707
TLC radioactivity scanner raytest Isotopenmessgeräte GmbH B00003875 equipped with beta plastic detector

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