إعداد وتوصيف محبة للدهون دوكسوروبيسين المذيلات الموالية للعقار

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

بروتوكول لإعداد وتوصيف دوكسوروبيسين محبة للدهون المؤيدة للمخدرات تحميل 1،2-distearoyl- التعطيل -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [الأمينية (البولي ايثيلين جلايكول) -2000] يوصف (DSPE-PEG) المذيلات.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Li, F., Snow-Davis, C., Du, C., Bondarev, M. L., Saulsbury, M. D., Heyliger, S. O. Preparation and Characterization of Lipophilic Doxorubicin Pro-drug Micelles. J. Vis. Exp. (114), e54338, doi:10.3791/54338 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

ويستخدم العلاج الكيميائي عادة لعلاج أشكال مختلفة من أمراض السرطان. معظم، إن لم يكن كلها، أدوية العلاج الكيميائي لها آثار جانبية سامة والتي قد تختلف من الشروط البسيطة يمكن التحكم فيها، مثل الغثيان والإسهال، لظروف تهدد حياة أكثر. لأن معظم الأدوية المضادة للسرطان سامة، والتعرض غير انتقائي من هذه الأدوية إلى الأنسجة الطبيعية يسبب حتما سمية. لذلك، هناك حاجة ماسة لنهج العلاجي الذي يمكن أن يحقق انتقائي المخدرات إلى الخلايا السرطانية. وهناك تحد آخر مع إدارة الأدوية المضادة للسرطان ضعيف الذوبان في الماء الخاصة بهم. عادة، لا بد من وكلاء الانحلال لصياغة هذه الأدوية قليلة الانحلال. ومع ذلك، فإن معظم وكلاء الانحلال، مثل سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس])، Cremophor EL، وبوليسوربات 80 (توين 80) قد يسبب الكبد والتسمم الكلوي، انحلال الدم، تفاعلات فرط الحساسية الحادة واعتلال الأعصاب المحيطية. 1 لذلك، هناك حاجة إلى تركيبات آمنة وحيويا ل استخدام السريري للفقراءالأدوية المضادة للسرطان القابلة للذوبان لاي. Nanocarriers واعدة أنظمة توصيل الدواء للتصدي للتحديات المذكورة أعلاه. وتشمل هذه nanocarriers الجسيمات الشحمية، 2 النانوية، 3 المذيلات، 4-7 تقارن البوليمر المخدرات و 8 و المواد غير العضوية. 9 العديد من المنتجات النانوي (على سبيل المثال، Doxil، Abraxane، وGenexol) وقد تمت الموافقة من قبل الهيئات التنظيمية لعلاج مرضى السرطان. 10

المذيلات البوليمرية واعدة ناقلات تسليم المخدرات مقياس النانو، والتي تم استخدامها بنجاح لإيصال الأدوية المضادة للسرطان. وتعد 4-7،11،12 المذيلات البوليمرية النموذجية من البوليمرات محبة للجهتين من خلال عملية التجميع الذاتي. وتشمل الأساسية قذيفة المذيلات البوليمرية المركبة قذيفة ماء والأساسية مسعور. قذيفة ماء يمكن تحقيق الاستقرار sterically المذيلات وإطالة تداولها في مجرى الدم. جوهر مسعور يمكن أن تلخص على نحو فعال د مسعورالسجاد. ونظرا لصغر حجم المذيلات (عادة ما تكون أقل من 200 نانومتر) وخصائص التداول منذ فترة طويلة، ويعتقد أن المذيلات البوليمرية لتحقيق الورم تستهدف من خلال تعزيز نفاذية والاستبقاء (EPR) آثار (استهداف الورم السلبي).

استقرار تحميل الدواء هو أمر حاسم لورم تستهدف قدرة المذيلات. لتحقيق استهداف الورم الأمثل، يجب أن يكون المذيلات الحد الأدنى من تسرب المخدرات قبل الوصول إلى موقع الورم، ولكن بسرعة الافراج عن المخدرات بعد دخول الخلايا السرطانية. وبالإضافة إلى ذلك، الاستقرار صياغة هو أيضا شرط أساسي لتطوير المنتجات، وذلك لأن الاستقرار صياغة يحدد جدوى تطوير المنتجات، فضلا عن العمر الافتراضي للمنتجات المتقدمة. مؤخرا، تم إحراز الكثير من الجهد لتحسين التحميل من المخدرات داخل أجسام ناقلة التسليم. النهج المؤيدة للمخدرات محبة للدهون هي استراتيجية التي تم استكشافها لتحسين تحميل المخدرات في النانوية الدهون والمستحلبات. 13،14 في حرف عطفugation من الدهون مع العقاقير يمكن أن تحسن إلى حد كبير بالانجذاب وتعزيز التحميل والاحتفاظ في مكونات المحب للدهون nanocarriers.

هنا، نحن تصف بروتوكول لإعداد دوكسوروبيسين محبة للدهون المؤيدة للمخدرات المذيلات تحميل. أولا، يتم وصف الإجراء التوليف لدوكسوروبيسين محبة للدهون المؤيدة للمخدرات. ثم، يتم إدخال بروتوكول لتوليد المذيلات مع طريقة فيلم والتشتت. وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح في دراساتنا السابقة. وقد تم اختيار 5 DSPE-PEG كمادة حاملة لإعداد المذيلات لأنه كان قد تم استخدامها بنجاح لتسليم مذيلة المخدرات. 15،16 أخيرا، وصفنا عدة فحوصات في المختبر يستخدم لوصف مذيلة تركيبات ولتقييم النشاط المضادة للسرطان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. توليف DOX والسلطة الفلسطينية

  1. تزن 390 ملغ من دوكسوروبيسين و 243 ملغ من هيدرازيد حمض البالمتيك، ونقل إلى قارورة أسفل مستديرة.
  2. إضافة 150 مل من الميثانول اللامائية لقارورة مع حقنة زجاجية. إضافة 39 ميكرولتر من حمض trifluoroacetic (TFA) مع ماصة. باستخدام محرك مغناطيسي، وتحريك خليط التفاعل لمدة 18 ساعة على RT في الظلام.
    ملاحظة: كميات من المواد رد فعل يمكن زيادتها أو لأسفل للحصول على كميات مختلفة من DOX والسلطة الفلسطينية. ينبغي الحفاظ على نسبة من المواد المتفاعلة في نفس النسب. ردود الفعل باستخدام كميات DOX في نطاق من 78 ملغ إلى 1170 ملغ يمكن أن يؤديها في مختبر الكيمياء منتظم.
  3. تنقية DOX والسلطة الفلسطينية باستخدام عمود هلام السيليكا 17
    1. إزالة المذيب في خليط التفاعل مع المبخر الدوار. إضافة 3 غرام من هلام السيليكا بعد يتم تقليل حجم الخليط إلى حوالي 20 مل. يستمر التبخر الدوارة لانتاج المساحيق الجافة والسماح رانه الامتزاز من المنتجات على هلام السيليكا. الحفاظ على العينة تحت فراغ لمدة 30 دقيقة إضافية بعد أن يتم تشكيل المساحيق الجافة.
    2. حزمة 50 غ من هلام السيليكا في عمود باستخدام ثنائي كلورو ميثان كمادة مذيبة. بعناية إضافة العينة تحتوي على هلام السيليكا المنتج كثف إلى العمود.
    3. أزل عمود مع خليط من ثنائي كلورو ميثان والميثانول، مع زيادة تدريجية في نسبة الميثانول، وبالتالي زيادة الاستقطاب المذيبات (الجدول 1).
    4. جمع كسور شاطف في أنابيب الاختبار (25 مل / أنبوب) ورصد التقدم المحرز من قبل اللوني طبقة رقيقة (TLC).
    5. الجمع بين جميع الكسور التي تحتوي نقية DOX والسلطة الفلسطينية وإزالة المذيب باستخدام المبخر الدوار حتى يتم تشكيل مسحوق جاف. وعلاوة على ذلك تجفيف المنتجات تحت فراغ O / N.
  4. تحليل DOX والسلطة الفلسطينية من قبل TLC.
    1. قطع جزء سم 4 سم × 8 لوحة TLC. بقعة عينة حلول 0.5 سم من الجزء السفلي من لوحة مع TLC الشعيرات الدموية اكتشاف باستخدام التقىhanol مثل المذيبات.
    2. وضع لوحة TLC في غرفة تطوير تحتوي على خليط من ثنائي كلورو ميثان والميثانول (01/03، ت / ت). يجب أن يكون عمق مذيب أقل فقط من 0.5 سم.
    3. إزالة لوحة من غرفة تطوير عندما تصل الجبهة المذيبات الجزء العلوي من لوحة. بمناسبة موقع الجبهة المذيبات مع قلم رصاص والسماح لوحة لتجف. وضع لوحة TLC في غرفة تلطيخ تحتوي المشبعة بخار اليود من أجل رؤية العينات.
  5. تحليل DOX والسلطة الفلسطينية مع الرنين المغناطيسي الطيفي 1 H-النووي (1 H-NMR). 18
    1. حل 15 ملغ من DOX والسلطة الفلسطينية في 1 مل من الميثيل سلفوكسيد-D6 ([دمس]) ونقل العينة إلى أنبوب الرنين المغناطيسي.
    2. إدراج أنبوب الرنين المغناطيسي في المغناطيس الصك NMR. قياس الطيف البروتون، واختيار DMSO كمادة مذيبة. إزالة أنبوب NMR من المغناطيس. تحليل نتيجة NMR 18.

2. إعداد DOX والسلطة الفلسطينية المذيلات بواسطة الأسلوب السينمائي والتشتت

  1. حل DSPE-PEG (40 ملغ) وDOX-PA (4 ملغ) مع 2 مل من الميثانول في قارورة زجاجية 10 مل.
  2. إزالة المذيبات العضوية تحت فراغ باستخدام المبخر الدوار حتى أشكال رقيقة في القارورة.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، تتبخر المذيبات العضوية تحت غاز خامل (مثل الأرجون أو غاز النيتروجين) لتشكيل الفيلم والحفاظ على قنينة في مجفف فراغ لمواصلة إزالة المذيبات المتبقية.
  3. نقل 2 مل من الفوسفات مخزنة المالحة Dulbecco و(7.4 درجة الحموضة، DPBS) إلى قارورة زجاجية.
  4. ضع القارورة في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 3 دقائق على RT لتوليد المذيلات.
    ملاحظة: تختلف السلطة بالموجات فوق الصوتية بين نماذج مختلفة من الحمامات فوق الصوتية. اختر وحدة التي يمكن أن تولد ما يكفي من القوة بالموجات فوق الصوتية لتفريق رقيقة فيلم البوليمر / المخدرات. انتاج الطاقة من حمام بالموجات فوق الصوتية المستخدمة في هذا البروتوكول هو 110 W.
  5. الحفاظ المذيلات في 4 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى القصير و -20 درجة مئوية لمدة طويلةتخزين الاجل.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن أيضا أن تكون المذيلات تجميد المجفف وتشكيلها مع الماء قبل الاستخدام. عادة، لا حاجة لcryoprotectant أو lyoprotectant لهذه الصيغة.

3. توصيف DOX والسلطة الفلسطينية المذيلات

  1. تحديد تركيز DOX والسلطة الفلسطينية في المذيلات والكفاءة التغليف المخدرات
    1. حل DOX والسلطة الفلسطينية توليفها في الخطوات السابقة في DMSO لإعداد حلول DOX والسلطة الفلسطينية من خمسة تركيزات مختلفة: 1 ميكروغرام / مل، 5 ميكروغرام / مل و 20 ميكروغرام / مل و 50 ميكروغرام / مل، و 100 ميكروغرام / مل. قياس امتصاص حلول DOX والسلطة الفلسطينية مع مطياف الأشعة فوق البنفسجية-VIS في 490 نانومتر. توليد منحنى القياسية على أساس تركيز الدواء DOX والسلطة الفلسطينية والمقابلة استيعابهم في 490 نانومتر.
    2. تمييع 25 ميكرولتر من مذيلة محملة المخدرات مع 500 ميكرولتر من DMSO. قياس امتصاص عند 490 نانومتر مع مطياف الأشعة فوق البنفسجية-VIS. حساب تركيز الدواء مع المنحنى القياسي ولدت في 3.1.1.
    3. حساب الكفاءة التغليف باستخدام المعادلة التالية:
      تغليف المخدرات الكفاءة (٪) = (كمية من المخدرات في المذيلات) / (كمية من المخدرات المضافة) × 100٪
  2. توصيف حجم الجسيمات مع تشتت الضوء الحيوي (DLS)
    1. تمييع المذيلات مع DPBS (درجة الحموضة 7.4) إلى تركيز DSPE-PEG النهائي من 1 ملغ / مل. تحليل عينة 2 مل مع محلل حجم الجسيمات للحصول على الحجم والتشتت المتعدد مؤشر Z متوسط ​​(PDI).
  3. تقييم في المختبر النشاط المضادة للسرطان
    ملاحظة: استخدام تقنية معقمة المناسبة والعمل داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
    1. إزالة مستنبت الخلايا من قارورة ثقافة خلية (على سبيل المثال، T25) التي تحتوي على اليورانيوم المنضب-145 خلايا سرطان البروستاتا البشرية وشطف الخلايا مع 2 مل من DPBS (7.4 درجة الحموضة).
    2. نضح DPBS، إضافة 1 مل من محلول التربسين (0.25٪)، واحتضان لمدة 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية لفصل الخلايا.
    3. إضافة 10 ملتر من مستنبت الخلية (RPMI 1640 + 10٪ مصل بقري جنيني + 1٪ للمضادات الحيوية مضاد فطري)، عندما يتم فصل معظم الخلايا من القارورة. نقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 1000 x ج لمدة 5 دقائق.
    4. إعادة تعليق بيليه خلية مع 5 مل من مستنبت الخلية وإزالة عينة لحساب أعداد الخلايا مع عدادة الكريات. تمييع الخلايا مع مستنبت الخلية إلى كثافة من 50000 خلية / مل. إضافة الخلية تعليق المخفف إلى 96 جيدا لوحة زراعة الخلايا (100 ميكرولتر / جيد). احتضان الخلايا في حاضنة الثقافة الخلية (37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2) لمدة 18 ساعة للسماح مرفق الخلية.
    5. تمييع DOX ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) حل والحل DOX والسلطة الفلسطينية DMSO مع خلية ثقافة المتوسط ​​للحصول على تركيز الدواء النهائية من 0.1 ميكرومتر، 0.5 ميكرومتر، 2 ميكرومتر، 5 ميكرومتر، و 10 ميكرومتر، على التوالي. إبقاء تركيز DMSO النهائية في جميع العينات المذكورة أعلاه إلى 0.5٪. تمييع مذيلة DOX والسلطة الفلسطينية مع خلية ثقافة المتوسط ​​للحصول شارك المخدرات النهائيncentrations من 0.1 ميكرومتر، 0.5 ميكرومتر، 2 ميكرومتر، 5 ميكرومتر، و 10 ميكرومتر، على التوالي. استخدام فارغة زراعة الخلايا المتوسطة عنصر تحكم.
    6. إزالة 96-جيدا لوحة الثقافة خلية من الحاضنة واستبدال مستنبت الخلية مع 100 ميكرولتر من المتوسط ​​تحتوي على عناصر العلاج المختلفة التي أعدت في الخطوة 3.3.5 (ن = 4 لكل مجموعة). احتضان الخلايا في حاضنة الثقافة الخلية (37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2) للحصول على 72 ساعة إضافية.
    7. نضح المتوسطة وإضافة 100 ميكرولتر من المتوسط ​​تحتوي على 0.5 ملغ / مل من 3- (4،5-ثنائي ميثيل-thiazol-2-YL) -2،5-ثنائي بروميد نتروبلو (الإنتقالي العسكري).
    8. احتضان الخلايا في حاضنة الثقافة خلية لمدة 2 ساعة إضافية. إزالة بعناية متوسطة وإضافة 100 ميكرولتر من DMSO لإذابة البلورات formazan.
    9. قياس الامتصاصية مع معمل صفيحة عند طول موجي 570 نانومتر، والطول الموجي إشارة من 670 نانومتر.
    10. حساب بقاء الخلية باستخدام المعادلة التالية:
      (A اختبار / عنصر تحكم) × 100٪
      ملاحظة: مقارنة بقاء الخلية بين المجموعات المختلفة باستخدام تحليل التباين الأحادي (ANOVA) اختبار إحصائي. حساب IC 50 على أساس بقاء الخلية مقابل البيانات تركيز الدواء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 1 مخطط تركيب DOX والسلطة الفلسطينية. تم تصنيعه DOX والسلطة الفلسطينية عن طريق الاقتران من حمض البالمتيك مع دوكسوروبيسين من خلال السندات هيدرازون الحساسة درجة الحموضة. تم استخدام فائض طفيف من هيدرازيد حمض البالمتيك لتسهيل إتمام التفاعل. هذه طريقة رد الفعل لديه كفاءة عالية جدا وبقي فقط كمية صغيرة من دوكسوروبيسين بعد رد فعل 18 ساعة (الشكل 2). وكان العائد نحو 88٪. في نهاية التفاعل، وتنقيته DOX والسلطة الفلسطينية باستخدام عمود هلام السيليكا والمجففة للحصول على منتج الصلبة الأحمر الخالص. تم تحليل DOX والسلطة الفلسطينية مع TLC، والذي أظهر بقعة واحدة لتنقية DOX والسلطة الفلسطينية (الشكل 2). ويبين الشكل 3 الطيف 1 H-NMR من DOX والسلطة الفلسطينية. وقد لوحظت قمم الرنين المغناطيسي النووي مميزة من كلا دوكسوروبيسين والحامض النخيلي، الذي أكد كذلك نجاح رد فعل الاقتران.

رقيقة الصفحات = "1"> ويظهر مظهر المذيلات أعد هذا البروتوكول في الشكل (4). فارغة المذيلات DSPE-PEG دون المخدرات تظهر كسائل شفاف. تظهر المذيلات DOX والسلطة الفلسطينية DSPE-PEG كسائل الحمراء؛ ويرجع ذلك إلى DOX والسلطة الفلسطينية التي تم تحميلها في المذيلات اللون الأحمر. وأظهرت النتائج ممثل تحليل حجم الجسيمات في الشكل (5). وكان متوسط ​​حجم الجسيمات Z متوسط ​​للفارغة المذيلات DSPE-PEG 17.0 ± 0.5 نانومتر (PDI = 0.034 ± 0.019). التحميل من DOX والسلطة الفلسطينية زادت مذيلة حجم الجسيمات قليلا؛ كان متوسط ​​حجم الجسيمات Z متوسط ​​لالمذيلات DOX والسلطة الفلسطينية DSPE-PEG 25.7 ± 1.6 نانومتر (PDI = 0.407 ± 0.035).

تم تحديد تركيز DOX والسلطة الفلسطينية في صياغة مذيلة بناء على امتصاص عند 490 نانومتر. DSPE-PEG ديه امتصاص يذكر في هذا الطول الموجي، وبالتالي لا تتدخل في تحليل تركيز DOX والسلطة الفلسطينية. وكان تركيز DOX والسلطة الفلسطينية في صياغة مذيلةكان 1.99 ± 0.11 ملغ / مل وكفاءة التحميل المخدرات 99.3 ± 5.7٪. كفاءة عالية التغليف ويرجع ذلك إلى ميزة المحب للدهون DOX والسلطة الفلسطينية، مما يعزز الاحتفاظ به في قلب مسعور من المذيلات. وأظهرت صياغة الاستقرار ممتازة. لم يكن هناك هطول الأمطار وضوحا عند تخزينها في - 4 درجة مئوية لمدة 3 أسابيع. وقد لوحظ عدم حدوث تغير كبير في تركيز الدواء أثناء التخزين.

وعولج DU-145 خلايا سرطان البروستاتا البشرية مع تركيزات مختلفة من دوكسوروبيسين الحرة، خالية DOX والسلطة الفلسطينية، والمذيلات DOX والسلطة الفلسطينية DSPE-PEG. تم تحديد بقاء الخلية في نهاية العلاج 72 ساعة باستخدام الفحص الإنتقالي العسكري (الشكل 6). وقد تحقق تخفيض تعتمد على التركيز في بقاء الخلية عن طريق علاج الخلايا DU145 مع دوكسوروبيسين مجانا (IC 50 = 0.10 ميكرومتر)، حرة DOX والسلطة الفلسطينية (IC 50 = 0.33 ميكرومتر)، أو المذيلات DOX والسلطة الفلسطينية (IC 50 = 0.25 ميكرومتر). على الرغم من دوكسوروبيسين الحرة أكثر فعالية من حرة DOX والسلطة الفلسطينية أو المذيلات DOX-PA في تركيزات منخفضة (0.1 ميكرومتر و 0.5 ميكرومتر)، أظهرت مجموعة DOX والسلطة الفلسطينية أكبر انخفاض في بقاء الخلية من دوكسوروبيسين مجانا في تركيزات أعلى (2-10 ميكرون). أيضا، يبدو أن هناك أي فرق كبير بين DOX والسلطة الفلسطينية والمذيلات DOX والسلطة الفلسطينية في كل من تركيزات أعلى وأدنى هناك. وأظهرت فارغة المذيلات DSPE-PEG أي سمية (لا تظهر البيانات)، مما يدل على توافق مع الحياة الجيدة وسلامة DSPE-PEG كمادة الناقل تسليم المخدرات.

شكل 1
وقد أثار دوكسوروبيسين (DOX)، النخيلي هيدرازيد حمض (PA) وحمض trifluoroacetic (TFA) المذاب في الميثانول لمدة 18 ساعة على RT في: الشكل 1. توليف محبة للدهون الموالية للأدوية دوكسوروبيسين (DOX-PA) الكواشف والشروط. ظلام. ر = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. طبقة رقيقة اللوني (TLC). TLC من (1) دوكسوروبيسين، (2) رد فعل الخام الخليط، (3) هيدرازيد حمض البالمتيك، و (4) DOX والسلطة الفلسطينية المترافقة. وقد وضعت عينات بمزيج من ثنائي كلورو ميثان والميثانول (01/03، ت / ت) وملطخة اليود. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3. 1 H-NMR من DOX والسلطة الفلسطينية في DMSO بالديوتيريوم. إن وجود قمم مميزة من كلا DOX والسلطة الفلسطينية يدل على نجاح رد فعل الاقتران.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54338/54338fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الرقم 4. المظهر من المذيلات. (A) المذيلات DSPE-PEG و (ب) المذيلات DOX والسلطة الفلسطينية DSPE-PEG. يتم عرض الأرقام التمثيلية للتدليل على ظهور فارغة المذيلات DSPE-PEG والمذيلات DOX والسلطة الفلسطينية DSPE-PEG. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. حجم الجسيمات وتوزيع حجم المذيلات. (A) المذيلات DSPE-PEG و (ب) DOX المذيلات -PA DSPE-PEG. يتم تحديد حجم مذيلة التي تشتت الضوء الديناميكي. يتم عرض الأرقام تمثيلية لإثبات حجم الجسيمات وحجم التوزيع. البيانات المقدمة هي SD ± متوسط ​​(ن = 3). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6. النشاط المضاد للسرطان من الصيغ مذيلة. وعولج خلايا DU145 لمدة 72 ساعة وخلية الجدوى تم قياسها باستخدام الفحص الإنتقالي العسكري. البيانات الواردة في الشكل هي متوسطات SD ± (ن = 4). *، P <0.01، مقارنة DOX المجموعات المعالجة. ليس هناك فرق إحصائي بين DOX والسلطة الفلسطينية والمذيلات DOX-PA المجموعات المعالجة. تم احتساب IC 50 على أساس بقاء الخلية مقابل البيانات تركيز الدواء.p_upload / 54338 / 54338fig6large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1

الجدول 1. CH 2 الكلورين 2 / CH 3 OH يبلغ حجمه المذيبات المستخدمة في تنقية DOX والسلطة الفلسطينية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا العمل، نحن تصف وسريع طريقة فيلم تشتت غير معقدة لإعداد المذيلات. هذه الطريقة تستخدم خصائص التجميع الذاتي من البوليمر محبة للجهتين (على سبيل المثال، DSPE-PEG) لتشكيل نواة قذيفة المذيلات منظم في بيئة مائية. هذه طريقة إعداد مذيلة ديها العديد من المزايا. 1. كان ينطوي على عملية صياغة بسيطة، والذي يتجنب استخدام خطوات للحد من حجم تعقيدا (مثل قذف أو التجانس) التي يشيع استخدامها في إعداد الجسيمات الشحمية، النانوية، وnanoemulsions. 19 2. أنه يحتوي على استنساخ جيدة. لا يمكن أن يتحقق ممتاز الاتساق دفعة إلى دفعة مرة واحدة وقد تم تحسين صياغة وراسخة. بروتوكول متسامح للتغيرات في المتغيرات عملية إعداد، مثل قوة صوتنة والوقت. رغم أن هناك طرقا أخرى (مثل نهج غسيل الكلى أو النهج تبخر مستحلب المذيبات) متاحة للالمذيلات إعداد وتشتت فيلمالأسلوب هو أكثر ملاءمة وكفاءة. ولذلك، فإنه لديه امكانات كبيرة يمكن تكييفها للاستخدام في تصنيع واسعة النطاق من المذيلات في صناعة المستحضرات الصيدلانية. الحد من هذه الطريقة هو أنه يعتمد على خصائص التجميع الذاتي من المواد الناقل، وبالتالي يقتصر على المواد مع هذه الممتلكات. اختيار غير لائقة من مواد البوليمر قد يؤدي إلى فشل في توليد الصيغ مذيلة مرضية. وبالإضافة إلى ذلك، تعتمد طريقة التحضير على ultrasonication لتفريق البوليمر / فيلم المخدرات وتسهيل تشكيل المذيلات. الأكثر تجاريا الحمامات بالموجات فوق الصوتية المتاحة هي مناسبة لأن هناك حاجة فقط السلطة بالموجات فوق الصوتية ضعيفة لتشكيل المذيلات. ومع ذلك، فإنه قد يكون هناك مشكلة إذا تم استخدام حمام بالموجات فوق الصوتية مع قوة ضعيفة جدا.

الفقراء تحميل المخدرات والإفراج عن المخدرات من السابق لأوانه من الشواغل الرئيسية للتسليم مذيلة المخدرات. في هذا البروتوكول، وضعنا استراتيجية محبة للدهون المؤيدة للمخدرات لتعزيز الحملجي من دوكسوروبيسين في المذيلات DSPE-PEG. تصريف دوكسوروبيسين مع الدهون تحسنت بشكل ملحوظ التوافق والتفاعل بين الدواء مع جوهر الدهون من المذيلات DSPE-PEG. الموالية للأدوية، DOX والسلطة الفلسطينية، تم تصنيعه من قبل التصريف دوكسوروبيسين مع الدهون من خلال درجة الحموضة استجابة هيدرازون رابط الحمضية. هذا رابط مستقرة في درجة الحموضة محايدة وشطورة في درجة الحموضة الحمضية. 20،21 وهكذا، يتم تحميل DOX مستقر في المذيلات DSPE-PEG ومؤيدة للأدوية في الرقم الهيدروجيني محايدة ولديها تسرب المخدرات الحد الأدنى أثناء التخزين وخلال التداول في الدم. مرة واحدة تدخل المذيلات DOX والسلطة الفلسطينية الخلايا السرطانية من خلال الإلتقام، سيتم المشقوق DOX والسلطة الفلسطينية الموالية للمخدرات وتحويلها إلى الحر DOX في استجابة للبيئة الاندوسوم الحمضية (درجة الحموضة 5-6). منذ DOX أكثر ماء من DOX والسلطة الفلسطينية، وهذا التحويل تعطيل التفاعل بين DOX وجوهر مسعور من المذيلات، وبالتالي تسهيل سرعة الافراج عن DOX من المذيلات. وهذه الميزة التصميم المبتكر تجنب إطلاق المخدرات غير مكتمل، التيهي مشكلة كبرى المرتبطة تقارن المخدرات باستخدام غير شطورة أو بطيئة الشق-linkers. ويمكن أيضا أن تطبق 22 هذا النهج لإيصال أدوية أخرى. اختيار من رابط المناسب هو أمر حاسم لنجاح هذا النهج. يجب أن يكون linkers مستقرة في البيئة الفسيولوجية من أجل تحقيق أقصى قدر من الاستقرار للوضع. وينبغي أيضا أن linkers أن المشقوق بكفاءة ردا على مشغلات في المكروية الورم (على سبيل المثال، ودرجة الحموضة، والإنزيمات، الخ) للافراج عن المخدرات الأم.

في هذا البروتوكول، وكانت محملة DOX والسلطة الفلسطينية بكفاءة في المذيلات مع كفاءة عالية التغليف (~ 100٪). أظهر صياغة مذيلة أيضا الاستقرار متفوقة وبقيت على حالها لمدة ثلاثة أسابيع على الأقل دون هطول المخدرات أو انخفاض في تركيز الدواء. ويرجع ذلك إلى التفاعل المعزز بين الأنصاف الدهون في الموالية للمخدرات وجوهر الدهون من المذيلات DSPE-PEG هذا. هندسة compatibiعنه lity من جزيئات الناقل مع الأدوية لتعزيز تفاعلها هي استراتيجية واعدة لتحسين أداء المذيلات وnanocarriers أخرى. هذا النهج يمكن أن يعزز تحميل المخدرات وتقليل تحرر الدواء قبل الأوان لهذه nanocarriers 23 اختيار الزوج المخدرات / البوليمر المناسب هو خطوة حاسمة في تصميم صياغة مذيلة. هيكل جزيئات الدواء يمكن تعديل (نهج المؤيدة للمخدرات) أو يمكن أن يكون الأمثل للتصميم والمواد الناقل من أجل تحسين التوافق وتعزيز التفاعلات المخدرات / الناقل. 23 24 وبالإضافة إلى ذلك، يمكن النمذجة الحاسوبية أن تكون أداة مفيدة لمساعدة في الاستفادة المثلى من nanocarriers وتجعل من الممكن لإعداد nanocarrier مصممة خصيصا لمحددة دواء معين.

باختصار، نحن هنا وصف طريقة لتجميع محبة للدهون الموالية للأدوية دوكسوروبيسين. بروتوكولات لإعداد وتوصيف المذيلات المخدرات التي تم تحميلها أيضا أن described. طريقة فيلم والتشتت هو طريقة بسيطة واعدة لإعداد مجموعة متنوعة من أنظمة تسليم التجميع الذاتي النانوية. أساليب توصيف الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم كمعيار في فحوصات المختبر لتحديد خصائص طب النانو، وبالتالي يمكن أن تسهل الأمثل للعمليات صياغة وتطوير المنتجات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DSPE-PEG2K Cordenpharm LP-R4-039 >95%
Doxorubicin LC Laboratories D-4000 >99%
Palmitic Acid Hydrazide TCI AMERICA   P000425G >98.0%
Methanol ACROS Organics 610981000 Anhydrous
Methylene chloride  FISHER  D151-4 99.90%
Methyl sulfoxide-d6 ACROS Organics AC320760075 NMR solvent
Trifluoroacetic Acid  ACROS Organics AC293811000 99.50%
Silica Gel FISHER  L-7446 230-400 mesh
Baker Flex TLC Plates FISHER  NC9990129
DPBS Sigma-Aldrich D8537
DU 145  Prostate Cancer Cells ATCC HTB-81
MTT ACROS Organics 158990050 98%
RPMI 1640 Medium MEDIATECH INC  10041CV
Antibiotic-Antimycotic  LIFE TECHNOLOGIES  15240062 100x stock solution
Fetal Bovine Serum LIFE TECHNOLOGIES  10437077
Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Varian, Inc 300 NMR 
Büchi R-3 Rotavapor Buchi 1103022V1  Rotary evaporator
Ultrasonic Bath BRANSON ULTRASONICS CORPORATION  CPX952318R
UV-VIS spectrometer Biomate 3 Thermo Spectronic
Zetasizer Nano ZS90  Malvern Instruments Particle Size Analyer
Microplate Spectrophotometer  Rio-Rad Benchmark Plus 
Cell Culture Incubator Napco CO2 6000
Biological Safety Cabinet Nuaire
SigmaPlot  Systat Software, Inc. Analytical Software
96-Well Cell Culture Plate Becton Dickinson 353072
Trypsin  0.25% Corning Cellgro 25-053-CI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hennenfent, K. L., Govindan, R. Novel formulations of taxanes: a review. Old wine in a new bottle? ESMO. 17, (5), 735-749 (2006).
  2. Paliwal, S. R., Paliwal, R., Agrawal, G. P., Vyas, S. P. Liposomal nanomedicine for breast cancer therapy. Nanomedicine. 6, (6), 1085-1100 (2011).
  3. Mahapatro, A., Singh, D. K. Biodegradable nanoparticles are excellent vehicle for site directed in vivo delivery of drugs and vaccines. J Nanobiotechnology. 9, (55), (2011).
  4. Danquah, M., Li, F., Duke, C. B., Miller 3rd,, D, D., Mahato, R. I. Micellar delivery of bicalutamide and embelin for treating prostate cancer. Pharm Res. 26, (9), 2081-2092 (2009).
  5. Li, F., Danquah, M., Mahato, R. I. Synthesis and characterization of amphiphilic lipopolymers for micellar drug delivery. Biomacromolecules. 11, (10), 2610-2620 (2010).
  6. Li, F., Danquah, M., Singh, S., Hao, W., Mahato, R. Paclitaxel- and lapatinib-loaded lipopolymer micelles overcome multidrug resistance in prostate cancer. Drug Deliv. and Transl. Res. 1, (6), 9 (2011).
  7. Li, F., Lu, Y., Li, W., Miller, D. D., Mahato, R. I. Synthesis, formulation and in vitro evaluation of a novel microtubule destabilizer, SMART-100. J Control Release. 143, (1), 151-158 (2010).
  8. Minko, T., Kopeckova, P., Pozharov, V., Kopecek, J. HPMA copolymer bound adriamycin overcomes MDR1 gene encoded resistance in a human ovarian carcinoma cell line. J Control Release. 54, (2), 223-233 (1998).
  9. Rosenholm, J. M., Mamaeva, V., Sahlgren, C., Linden, M. Nanoparticles in targeted cancer therapy: mesoporous silica nanoparticles entering preclinical development stage. Nanomedicine. 7, (1), 111-120 (2012).
  10. Kaur, I. P., et al. Issues and concerns in nanotech product development and its commercialization. J Control Release. 193, 51-62 (2014).
  11. Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers. Eur J Pharm Biopharm. 48, (2), 101-111 (1999).
  12. Wang, H., Li, F., Du, C., Mahato, R. I., Huang, Y. Doxorubicin and lapatinib combination nanomedicine for treating resistant breast cancer. Mol Pharm. 11, (8), 2600-2611 (2014).
  13. Ma, P., Rahima Benhabbour, S., Feng, L., Mumper, R. J. 2'-Behenoyl-paclitaxel conjugate containing lipid nanoparticles for the treatment of metastatic breast cancer. Cancer Lett. 334, (2), 253-262 (2013).
  14. Lundberg, B. B., Risovic, V., Ramaswamy, M., Wasan, K. M. A lipophilic paclitaxel derivative incorporated in a lipid emulsion for parenteral administration. J Control Release. 86, (1), 93-100 (2003).
  15. Perche, F., Patel, N. R., Torchilin, V. P. Accumulation and toxicity of antibody-targeted doxorubicin-loaded PEG-PE micelles in ovarian cancer cell spheroid model. J Control Release. 164, (1), 95-102 (2012).
  16. Gill, K. K., Kaddoumi, A., Nazzal, S. Mixed micelles of PEG(2000)-DSPE and vitamin-E TPGS for concurrent delivery of paclitaxel and parthenolide: enhanced chemosenstization and antitumor efficacy against non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines. Eur J Pharm Sci. 46, (1-2), 67-71 (2012).
  17. Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate Resolution. J. Org. Chem. 43, (14), 2923-2925 (1978).
  18. New Mexico State University. NMR Protocols and Specifications. Available from: http://web.nmsu.edu/~kburke/Instrumentation/NMSU_NMR_300.html (2015).
  19. Morton, L. A., Saludes, J. P., Yin, H. Constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of Nano-sized lipid vesicles. J Vis Exp. (64), (2012).
  20. Ulbrich, K., Etrych, T., Chytil, P., Jelinkova, M., Rihova, B. HPMA copolymers with pH-controlled release of doxorubicin: in vitro cytotoxicity and in vivo antitumor activity. J Controlled Release. 87, (1-3), 33-47 (2003).
  21. Patil, R., et al. Cellular Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(beta-L-Malic Acid). Int J Mol Sci. 13, (9), 11681-11693 (2012).
  22. Hu, X., Liu, S., Huang, Y., Chen, X., Jing, X. Biodegradable block copolymer-doxorubicin conjugates via different linkages: preparation, characterization, and in vitro evaluation. Biomacromolecules. 11, (8), 2094-2102 (2010).
  23. Huynh, L., Neale, C., Pomes, R., Allen, C. Computational approaches to the rational design of nanoemulsions, polymeric micelles, and dendrimers for drug delivery. Nanomedicine. 8, (1), 20-36 (2012).
  24. Shi, C., et al. A drug-specific nanocarrier design for efficient anticancer therapy. Nat Commun. 6, 7449 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics