Préparation et caractérisation des lipophile doxorubicine micelles Pro-drogue

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Un protocole pour la préparation et la caractérisation de la doxorubicine lipophile pro-médicament chargé 1,2-distéaroyl sn - glycéro-3-phosphoethanolamine- N - [amino (polyéthylène glycol) -2000] (DSPE-PEG) micelles est décrite.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Li, F., Snow-Davis, C., Du, C., Bondarev, M. L., Saulsbury, M. D., Heyliger, S. O. Preparation and Characterization of Lipophilic Doxorubicin Pro-drug Micelles. J. Vis. Exp. (114), e54338, doi:10.3791/54338 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

La chimiothérapie est couramment utilisé pour traiter diverses formes de cancers. La plupart, sinon la totalité, des médicaments de chimiothérapie ont des effets secondaires toxiques qui peuvent varier selon les conditions mineures administrable, tels que la nausée et de diarrhée, à des conditions plus menaçant la vie. Parce que la plupart des médicaments anticancéreux sont toxiques, l'exposition non sélective de ces médicaments à des tissus normaux provoque inévitablement la toxicité. Par conséquent, il y a un grand besoin d'une approche thérapeutique qui peut sélectivement délivrer des médicaments dans les cellules cancéreuses. Un autre défi à l'administration de médicaments anticancéreux est leur solubilité dans l'eau pauvre. Habituellement, des agents de solubilisation sont nécessaires pour formuler ces médicaments peu solubles. Cependant, la plupart des agents solubilisants, tels que le diméthylsulfoxyde (DMSO), le Cremophor EL, et le polysorbate 80 (Tween 80) peut provoquer une toxicité hépatique et rénale, une hémolyse, des réactions d'hypersensibilité aiguë et des neuropathies périphériques. 1 Par conséquent, les formulations sûres et biocompatibles sont nécessaires pour l'utilisation clinique des pauvresmédicaments anticancéreux ly solubles. Nanocarriers sont prometteurs systèmes de délivrance de médicaments pour relever les défis ci-dessus. Ces nanocarriers comprennent des liposomes, 2 nanoparticules, 3 micelles, 4-7 conjugués polymère-médicament, 8 et des matériaux inorganiques. 9 Plusieurs produits de la nanomédecine (par exemple, Doxil, Abraxane, et Genexol) ont été approuvés par les organismes de réglementation pour traiter les patients atteints de cancer. dix

Les micelles polymériques sont prometteurs transporteurs de délivrance de médicaments à l' échelle nanométrique, qui ont été utilisés avec succès pour l'administration de médicaments anticancéreux. 4-7,11,12 micelles polymères typiques sont préparés à partir de polymères amphiphiles à travers un processus d' auto-assemblage. Les micelles polymères structurés à noyau-enveloppe comprennent une enveloppe hydrophile et un noyau hydrophobe. La coquille hydrophile peut stériquement stabiliser micelles et prolonger leur circulation dans le flux sanguin. Le noyau hydrophobe peut effectivement encapsuler d hydrophobetapis. En raison de la petite taille de micelles (typiquement inférieure à 200 nm) et des propriétés de longue circulation, les micelles polymères sont censés atteindre le ciblage tumoral grâce à une meilleure perméabilité et de rétention (EPR) effets (tumeur passive ciblage).

la stabilité de chargement de la drogue est critique pour la capacité de ciblage tumoral de micelles. Pour parvenir à un ciblage optimal des tumeurs, les micelles doivent avoir une fuite minimale de médicament avant d'atteindre le site de la tumeur, mais libérer rapidement le médicament après être entré dans les cellules cancéreuses. En outre, la stabilité de la formulation est également une condition essentielle pour le développement de produits, parce que la stabilité de la formulation détermine la faisabilité du développement des produits, ainsi que la durée de vie des produits développés. Récemment, beaucoup d'efforts ont été faits pour améliorer le chargement de la drogue dans les transporteurs de livraison. L'approche pro-médicament lipophile est une stratégie qui a été explorée pour améliorer la charge de médicament dans des nanoparticules lipidiques et émulsions. 13,14 Le conjugation de lipides avec des médicaments peut améliorer de manière significative leur lipophilie et améliorer le chargement et la rétention dans les composants lipophiles de nanocarriers.

Ici, nous décrivons un protocole pour la préparation de la doxorubicine lipophile pro-drogue micelles chargées. Tout d'abord, la procédure de synthèse pour la doxorubicine pro-médicament lipophile est décrit. Puis, un protocole pour générer des micelles avec un procédé de film de dispersion est introduite. Cette méthode a été utilisée avec succès dans les études précédentes. 5 DSPE-PEG a été choisi en tant que matériau de support pour préparer des micelles parce qu'il a été utilisé avec succès pour la livraison micelle de médicaments. 15,16 Enfin, nous décrivons plusieurs essais in vitro utilisées pour caractériser micellaire Les formulations et d'évaluer l'activité anti-cancéreuse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Synthèse de la DOX-PA

  1. Peser 390 mg de doxorubicine et 243 mg d'hydrazide d'acide palmitique, et les transférer dans un ballon à fond rond.
  2. Ajouter 150 ml de methanol anhydre dans le flacon avec une seringue en verre. Ajouter 39 ul d'acide trifluoroacétique (TFA) avec une pipette. L'utilisation d'un agitateur magnétique, agiter le mélange de réaction pendant 18 heures à la température ambiante dans l'obscurité.
    REMARQUE: Les quantités de matériaux de réaction peuvent être mis à l' échelle vers le haut ou vers le bas pour obtenir des quantités différentes de DOX-PA. Le rapport des réactifs doit être maintenue dans les mêmes proportions. Les réactions en utilisant des quantités DOX dans l'intervalle de 78 mg à 1 170 mg peut être effectuée dans un laboratoire de chimie régulière.
  3. La purification de la DOX-PA en utilisant une colonne de gel de silice. 17
    1. Retirer le solvant du mélange réactionnel avec un évaporateur rotatif. Ajouter 3 g de gel de silice après que le volume du mélange est réduit à environ 20 ml. Poursuivre l'évaporation rotative pour donner des poudres sèches et permettre til l'adsorption des produits sur le gel de silice. Maintenir l'échantillon sous vide pendant 30 minutes supplémentaires après que les poudres sèches sont formées.
    2. Empaqueter 50 g de gel de silice dans une colonne en utilisant du dichlorométhane comme solvant. Ajouter avec précaution l'échantillon de gel de silice contenant le produit adsorbé à la colonne.
    3. Éluer la colonne avec un mélange de dichlorométhane et de methanol, tout en augmentant progressivement le pourcentage de methanol, ce qui augmente la polarité du solvant (tableau 1).
    4. Collecter des fractions d'éluant dans des tubes à essai (25 ml / tube) et suivre les progrès par chromatographie sur couche mince (CCM).
    5. Combinez toutes les fractions contenant pur DOX-PA et éliminer le solvant en utilisant un évaporateur rotatif jusqu'à la poudre sèche est formée. En outre sécher le produit sous vide O / N.
  4. Analyse des DOX-PA par CCM.
    1. Coupez un 4 cm section de la plaque TLC x 8 cm. solutions d'échantillons ponctuels de 0,5 cm à partir du bas de la plaque de TLC en utilisant des capillaires de détachage sont réunisHanol comme solvant.
    2. Placer la plaque de CCM dans une chambre de développement contenant un mélange de dichlorométhane et de méthanol (3/1, v / v). La profondeur du solvant doit être un peu moins de 0,5 cm.
    3. Retirer la plaque de la chambre de développement lorsque le front de solvant atteint le sommet de la plaque. Marquer l'emplacement du front du solvant avec un crayon et laisser sécher la plaque. Placer la plaque de CCM dans une chambre de coloration contenant de la vapeur d'iode saturée dans le but de visualiser les échantillons.
  5. Analyse de la DOX-PA avec 1 H-résonance magnétique nucléaire de spectroscopie (RMN-1H). 18
    1. Dissoudre 15 mg de DOX-PA dans 1 ml de sulfoxyde de méthyle-d6 (DMSO) et transférer l'échantillon dans un tube RMN.
    2. Insérer le tube RMN dans l'aimant de l'instrument RMN. Mesurer le spectre de proton, avec du DMSO comme solvant. Retirer le tube RMN de l'aimant. Analyser le résultat RMN 18.

2. Préparation de DOX-PA micelles par la méthode du film de dispersion

  1. Dissoudre DSPE-PEG (40 mg) et de la DOX-PA (4 mg) avec 2 ml de methanol dans un flacon de 10 ml en verre.
  2. Retirer le solvant organique sous vide en utilisant un évaporateur rotatif jusqu'à un mince film se forme dans le flacon.
    REMARQUE: Vous pouvez également évaporer les solvants organiques sous gaz inerte (par exemple, l' argon ou de l' azote gazeux) pour former un film et de garder le flacon dans un dessiccateur sous vide pour éliminer davantage de solvant résiduel.
  3. Transfert 2 ml de sérum physiologique tamponnée au phosphate de Dulbecco (pH 7,4, DPBS) dans le flacon de verre.
  4. Placer le flacon dans un bain à ultrasons pendant 3 minutes à température ambiante pour générer des micelles.
    NOTE: Puissance ultrasonique varie selon les différents modèles de bains à ultrasons. Sélectionnez une unité qui peut générer assez de puissance à ultrasons pour disperser le film polymère / médicament mince. La puissance de sortie du bain à ultrasons utilisé dans ce protocole est de 110 W.
  5. Gardez micelles à 4 ° C pour le stockage à court terme et -20 ° C pour longtempsstockage -terme.
    NOTE: Alternativement, les micelles peuvent aussi être lyophilisé et reconstitué avec de l'eau avant utilisation. Normalement, il ne cryoprotecteur ou lyoprotecteur est nécessaire pour cette formulation.

3. Caractérisation de DOX-PA micelles

  1. Détermination de la concentration de DOX-PA dans les micelles et l' efficacité de la drogue encapsulation
    1. Dissoudre DOX-PA synthétisé dans les étapes précédentes dans du DMSO pour préparer des solutions de DOX-PA de cinq concentrations différentes: 1 ug / ml, 5 pg / ml, 20 pg / ml, 50 pg / ml et 100 pg / ml. Mesurer l'absorption de la solution de DOX-PA avec un spectromètre UV-VIS à 490 nm. Générer une courbe standard basé sur les concentrations de médicament DOX-PA et leur absorption correspondant à 490 nm.
    2. Diluer 25 ul d'une micelle de médicament chargé avec 500 ul de DMSO. Mesurer l'absorption à 490 nm avec un spectromètre UV-VIS. Calculer les concentrations de médicament avec la courbe standard générée en 3.1.1.
    3. Calculer l'efficacité d'encapsulation en utilisant l'équation suivante:
      L'encapsulation des médicaments Rendement (%) = (quantité de drogue dans les micelles) / (quantité de médicament ajoutée) x 100%
  2. Caractérisation de la taille des particules par diffusion de lumière dynamique (DLS) ,
    1. Diluer micelles avec du DPBS (pH 7,4) à une concentration finale de DSPE-PEG de 1 mg / ml. Analyser un échantillon de 2 ml avec un analyseur de taille de particules pour obtenir la taille et indice de polydispersité de la moyenne Z (PDI).
  3. L' évaluation in vitro de l' activité anti - cancéreuse
    REMARQUE: Utiliser une technique stérile appropriée et fonctionner à l'intérieur d'une enceinte de sécurité biologique.
    1. Éliminer le milieu de culture cellulaire à partir d' un flacon de culture cellulaire (par exemple, T25) contenant des cellules DU-145 du cancer de la prostate humain et rincer les cellules avec 2 ml de DPBS (pH 7,4).
    2. Aspirer DPBS, ajouter 1 ml de solution de trypsine (0,25%), et incuber pendant 2 minutes à 37 ° C pour détacher les cellules.
    3. Ajouter 10 ml de milieu de culture cellulaire (RPMI 1640 + 10% de sérum bovin fœtal + 1% d'antibiotique-antimycotique), lorsque la plupart des cellules sont détachées du flacon. Transfert des cellules dans un tube centrifuge de 15 ml et centrifuger les cellules à 1000 g pendant 5 min.
    4. Remettre en suspension le culot de cellules avec 5 ml de milieu de culture cellulaire et de prélever un échantillon pour le comptage du nombre de cellules avec un hémocytomètre. Diluer les cellules avec un milieu de culture de cellules à une densité de 50.000 cellules / ml. Ajouter la suspension de cellules diluée dans une plaque de culture cellulaire à 96 puits (100 pl / puits). Incuber les cellules dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5% CO2) pendant 18 heures pour permettre la fixation des cellules.
    5. Diluer DOX diméthylsulfoxyde (DMSO), la solution et la solution de DOX-PA DMSO avec un milieu de culture cellulaire pour obtenir une concentration finale de médicament de 0,1 pM, 0,5 pM, 2 pM, 5 pM et 10 pM, respectivement. Maintenir la concentration finale de DMSO dans tous les échantillons ci-dessus à 0,5%. Diluer micellaire DOX-PA avec un milieu de culture cellulaire pour obtenir finale du médicament concentrations de 0,1 pM, 0,5 pM, 2 pM, 5 pM et 10 pM, respectivement. Utiliser le milieu de culture cellulaire en blanc un contrôle.
    6. Retirer la plaque de culture cellulaire à 96 puits de l'incubateur et remplacer le milieu de culture cellulaire avec 100 ul de milieu contenant différents agents de traitement préparées dans l'étape 3.3.5 (n = 4 pour chaque groupe). Incuber les cellules dans l'incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5% CO 2) pendant un temps supplémentaire de 72 heures.
    7. Aspirer le milieu et ajouter 100 ul de milieu contenant 0,5 mg / ml d'acide 3- (4,5-diméthyl-thiazol-2-yl) -2,5-diphényl tétrazolium (MTT).
    8. Incuber les cellules dans l'incubateur de culture cellulaire pendant encore 2 heures. Retirez délicatement le moyen et ajouter 100 pi de DMSO pour dissoudre les cristaux de formazan.
    9. Mesurer l'absorbance au spectrophotomètre pour microplaques à une longueur d'onde de 570 nm et une longueur d'onde de 670 nm de référence.
    10. Calculer la viabilité cellulaire en utilisant l'équation suivante:
      (A Test / Un contrôle) × 100%
      REMARQUE: Comparer la viabilité cellulaire entre les différents groupes en utilisant une analyse de variance (Anova) test statistique. Calculer la CI50 sur la base de la viabilité cellulaire par rapport à des données de concentration de médicament.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La figure 1 montre le schéma de synthèse de la DOX-PA. DOX-PA a été synthétisé par la conjugaison de l'acide palmitique avec de la doxorubicine à travers une liaison hydrazone sensible au pH. Un léger excès de l'hydrazide de l'acide palmitique a été utilisé pour faciliter l'achèvement de la réaction. Cette méthode de réaction a une efficacité très élevée et seulement une petite quantité de doxorubicine restant après une réaction de 18 h (Figure 2). Le rendement était d'environ 88%. A la fin de la réaction, DOX-PA a été purifié en utilisant une colonne de gel de silice et on le sèche pour obtenir un produit solide rouge pur. DOX-PA a été analysé avec TLC, qui a montré une seule tache pour purifiée DOX-PA (Figure 2). La figure 3 montre le spectre de DOX-PA 1 H-RMN. RMN pics caractéristiques à la fois de la doxorubicine et l'acide palmitique ont été observées, ce qui a en outre confirmé le succès de la réaction de conjugaison.

figure 4. Blank micelles DSPE-PEG sans médicament apparaissent sous la forme d' un liquide transparent. micelles DOX-PA DSPE-PEG apparaissent comme un liquide rouge; la couleur rouge est due à la DOX-PA chargé dans les micelles. Des résultats représentatifs de l' analyse de taille de particule sont présentés sur la figure 5. La taille moyenne de particule moyenne Z pour le blanc de micelles de DSPE-PEG était de 17,0 ± 0,5 nm (PDI = 0,034 ± 0,019). Le chargement de la DOX-PA a légèrement augmenté la taille des particules des micelles; la taille moyenne de particule moyenne Z pour micelles DOX-PA DSPE-PEG était de 25,7 ± 1,6 nm (PDI = 0,407 ± 0,035).

La concentration de DOX-PA dans la formulation micellaire a été déterminée en se basant sur l'absorption à 490 nm. DSPE-PEG a une absorption négligeable à cette longueur d'onde, donc ne pas interférer dans l'analyse de la concentration de DOX-PA. La concentration de DOX-PA dans la formulation micellaire était1,99 ± 0,11 mg / ml et l'efficacité de chargement de médicament était de 99,3 ± 5,7%. L'efficacité d'encapsulation élevée est due à la caractéristique lipophile de DOX-PA, ce qui renforce son maintien dans le noyau hydrophobe de micelles. La formulation a présenté une excellente stabilité. Il n'y avait pas de précipitation visible lorsqu'il est stocké à - 4 ° C pendant 3 semaines. Aucun changement significatif de la concentration du médicament n'a été observée au cours du stockage.

les cellules cancéreuses de la prostate humaine DU-145 ont été traitées avec différentes concentrations de doxorubicine gratuit, DOX-PA, et micelles DOX-PA DSPE-PEG. La viabilité cellulaire a été déterminée à la fin d'un traitement de 72 h en utilisant un dosage MTT (figure 6). Une diminution de la concentration-dépendante de la viabilité cellulaire a été obtenue en traitant les cellules DU145 avec la doxorubicine libre (CI50 = 0,10 pM), exempte de DOX-PA (CI50 = 0,33 pM) ou des micelles DOX-PA (CI50 = 0,25 pM). Bien que la doxorubicine libre est plus efficace que la DOX libre-PA ou de micelles DOX-PA à des concentrations plus faibles (0,1 uM et 0,5 uM), les groupes DOX-PA a montré une plus grande réduction de la viabilité cellulaire que la doxorubicine libre à des concentrations plus élevées (2-10 pm). En outre, il semble y avoir aucune différence significative entre DOX-PA et micelles DOX-PA aux deux concentrations supérieures et inférieures. Blanc de micelles de DSPE-PEG ont montré aucune toxicité (données non présentées), ce qui indique une bonne biocompatibilité et la sécurité de DSPE-PEG en tant que matériau de support de distribution de médicament.

Figure 1
Figure 1. Synthèse de pro-médicament lipophile de la doxorubicine (DOX-PA) Réactifs et conditions:. Doxorubicine (DOX), hydrazide de l' acide palmitique (PA) et de l' acide trifluoroacétique (TFA) dissous dans le méthanol ont été agités pendant 18 heures à température ambiante dans le foncé. t = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Chromatographie sur couche mince (CCM). Chromatographie sur couche mince (1) de doxorubicine, (2) le mélange réactionnel brut, (3) l' hydrazide de l' acide palmitique, et (4) un conjugué de DOX-PA. Les échantillons ont été développés avec un mélange de dichlorométhane et de méthanol (3/1, v / v) et colorées avec de l' iode. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3 1 H-RMN de la DOX-PA dans le DMSO deutérié. La présence de pics caractéristiques à la fois de la DOX et PA démontre le succès de la réaction de conjugaison.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54338/54338fig3large.jpg "Target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. L' apparition de micelles. (A) des micelles DSPE-PEG et (b) des micelles DOX-PA DSPE-PEG. Chiffres représentatifs sont présentés pour démontrer l'apparition de vides micelles DSPE-PEG et micelles DOX-PA DSPE-PEG. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
La Figure 5. La taille des particules et la distribution de la taille des micelles. (A) des micelles DSPE-PEG et (B) DOX -PA micelles DSPE-PEG. La taille des micelles est déterminée par diffusion de lumière dynamique. les chiffres représentatifs sont présentés pour démontrer la taille des particules et la distribution granulométrique. Les données présentées sont SD ± moyenne (n = 3). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
La figure 6. activité anti - cancéreuse de formulations micellaires. Cellules DU145 ont été traitées pendant 72 h et la viabilité des cellules a été mesurée en utilisant le test MTT. Les données présentées dans la figure sont SD ± moyenne (n = 4). *, P <0,01, par rapport aux groupes traités DOX. Il n'y a pas de différence statistique entre DOX-PA et micelles DOX-PA groupes traités. CI50 a été calculée en se basant sur ​​la viabilité cellulaire par rapport à des données de concentration de médicament.p_upload / 54338 / 54338fig6large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1

Tableau 1. CH 2 Cl 2 / CH 3 OH solvants d' élution utilisés dans la purification de la DOX-PA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dans ce travail, nous décrivons une méthode film dispersion simple, rapide pour la préparation de micelles. Cette méthode utilise les propriétés d' auto-assemblage d'un polymère amphiphile (par exemple, DSPE-PEG) pour former des micelles structuré noyau-enveloppe dans un environnement aqueux. Cette méthode de préparation micellaire présente plusieurs avantages. 1. Il comprend un processus de formulation simple, ce qui évite l'utilisation de mesures de réduction de taille complexes (telles que l' extrusion ou l' homogénéisation) couramment utilisés dans la préparation des liposomes, des nanoparticules et des nanoémulsions. 19 2. Il a une bonne reproductibilité. Excellente cohérence de lot à lot peut être réalisée une fois que la formulation a été optimisé et mis en place. Le protocole est tolérant aux variations des variables du procédé de préparation, telles que la résistance et le temps de sonication. Bien que d'autres méthodes (telles que l'approche de la dialyse ou l'approche d'évaporation émulsion-solvant) sont disponibles pour la préparation des micelles, la dispersion du filmméthode est plus pratique et efficace. Par conséquent, il a un grand potentiel pour être adapté pour une utilisation dans la fabrication à grande échelle de micelles dans l'industrie pharmaceutique. La limitation de cette méthode est qu'elle dépend des propriétés d'auto-assemblage des matériaux de support et est donc limité à des matériaux ayant ces propriétés. La sélection inappropriée des matériaux polymères peut conduire à l'échec dans la création de formulations de micelles satisfaisantes. En outre, le procédé de préparation repose sur le traitement aux ultrasons pour disperser / film de polymère et de médicament pour faciliter la formation de micelles. La plupart du commerce bains à ultrasons disponibles sont appropriés parce que seule une puissance ultrasonore faible est nécessaire pour former des micelles. Toutefois, il pourrait être un problème si un bain à ultrasons avec une puissance très faible est utilisé.

Mauvais chargement de drogues et de médicaments à libération prématurée sont des préoccupations majeures pour la livraison micelles de drogue. Dans ce protocole, nous avons développé une stratégie lipophile pro-drogue pour améliorer la chargetion de la doxorubicine dans des micelles DSPE-PEG. La conjugaison de doxorubicine avec des lipides significativement amélioré la compatibilité et une interaction du médicament avec le noyau lipidique des micelles de PEG-DSPE. La pro-drogue, DOX-PA, a été synthétisé en conjugant doxorubicine avec des lipides par un acide hydrazone lieur sensible au pH. Cette liaison est stable à pH neutre et clivable à un pH acide. 20,21 Ainsi, la DOX est chargé de façon stable dans des micelles de PEG-DSPE comme un pro-médicament à un pH neutre et a une fuite minimale de médicament pendant le stockage et pendant la circulation dans le sang. Une fois que les micelles DOX-PA pénètrent dans les cellules tumorales par endocytose, DOX-PA pro-drogue sera clivée et converti en libre DOX en réponse à l'environnement de l'endosome acide (pH 5-6). Depuis DOX est plus hydrophile que DOX-PA, cette conversion va perturber les interactions entre DOX et le noyau hydrophobe des micelles, et de faciliter ainsi la libération rapide de DOX de micelles. Cette caractéristique de conception innovante permettra d'éviter la libération de médicament incomplète, quiest un problème majeur associé avec des conjugués de médicaments à l' aide de linkers non clivables ou lent-clivant. 22 Cette approche peut également être appliquée à la prestation d'autres médicaments. La sélection d'un linker est un élément critique pour le succès de cette approche. Les lieurs doivent être stables dans un milieu physiologique afin d'optimiser la stabilité de la formulation. Les lieurs doivent également être efficacement clivés en réponse à des déclencheurs dans le microenvironnement tumoral (par exemple, le pH, les enzymes, etc.) pour libérer le médicament parent.

Dans ce protocole, DOX-PA a été efficacement chargé en micelles avec efficacité d'encapsulation élevé (~ 100%). La formulation micellaire a également démontré une stabilité supérieure et est restée intacte pendant au moins trois semaines sans précipitation ou réduction de la concentration de médicament pharmaceutique. Ceci est dû à l'interaction accrue entre des fractions lipidiques dans le promédicament et le noyau lipidique des micelles de PEG-DSPE. Ingénierie de la compatibilité des molécules porteuses avec des médicaments pour améliorer leur interaction est une stratégie prometteuse pour améliorer la performance des micelles et autres nanocarriers. Cette approche peut améliorer la charge de médicament et minimiser la libération de médicament pré-mature pour ces nanocarriers. 23 La sélection d'une paire médicament / polymère appropriée est une étape critique dans la conception de la formulation de micelles. La structure des molécules de médicament peut être modifié (approche pro-médicament) ou la conception de matériaux de support peut être optimisé afin d'améliorer la compatibilité et de renforcer les interactions médicament / support. 23 24 En outre, la modélisation informatique peut être un outil utile pour aider dans l'optimisation de nanocarriers et permettent de préparer un nanocarrier sur mesure conçu pour un médicament spécifique spécifique.

En résumé, nous décrivons ici une méthode pour synthétiser un pro-médicament lipophile de la doxorubicine. Protocoles pour la préparation et la caractérisation des micelles chargées de médicament sont également described. La méthode film dispersion est une méthode simple et prometteuse pour la préparation d'une variété de systèmes de distribution d'auto-assemblage à l'échelle nanométrique. Les méthodes de caractérisation décrites ici peuvent être utilisés en tant que norme dans des essais in vitro pour déterminer les propriétés de la nanomédecine, ce qui peut faciliter l'optimisation des processus de formulation et de développement de produits.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DSPE-PEG2K Cordenpharm LP-R4-039 >95%
Doxorubicin LC Laboratories D-4000 >99%
Palmitic Acid Hydrazide TCI AMERICA   P000425G >98.0%
Methanol ACROS Organics 610981000 Anhydrous
Methylene chloride  FISHER  D151-4 99.90%
Methyl sulfoxide-d6 ACROS Organics AC320760075 NMR solvent
Trifluoroacetic Acid  ACROS Organics AC293811000 99.50%
Silica Gel FISHER  L-7446 230-400 mesh
Baker Flex TLC Plates FISHER  NC9990129
DPBS Sigma-Aldrich D8537
DU 145  Prostate Cancer Cells ATCC HTB-81
MTT ACROS Organics 158990050 98%
RPMI 1640 Medium MEDIATECH INC  10041CV
Antibiotic-Antimycotic  LIFE TECHNOLOGIES  15240062 100x stock solution
Fetal Bovine Serum LIFE TECHNOLOGIES  10437077
Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Varian, Inc 300 NMR 
Büchi R-3 Rotavapor Buchi 1103022V1  Rotary evaporator
Ultrasonic Bath BRANSON ULTRASONICS CORPORATION  CPX952318R
UV-VIS spectrometer Biomate 3 Thermo Spectronic
Zetasizer Nano ZS90  Malvern Instruments Particle Size Analyer
Microplate Spectrophotometer  Rio-Rad Benchmark Plus 
Cell Culture Incubator Napco CO2 6000
Biological Safety Cabinet Nuaire
SigmaPlot  Systat Software, Inc. Analytical Software
96-Well Cell Culture Plate Becton Dickinson 353072
Trypsin  0.25% Corning Cellgro 25-053-CI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hennenfent, K. L., Govindan, R. Novel formulations of taxanes: a review. Old wine in a new bottle? ESMO. 17, (5), 735-749 (2006).
  2. Paliwal, S. R., Paliwal, R., Agrawal, G. P., Vyas, S. P. Liposomal nanomedicine for breast cancer therapy. Nanomedicine. 6, (6), 1085-1100 (2011).
  3. Mahapatro, A., Singh, D. K. Biodegradable nanoparticles are excellent vehicle for site directed in vivo delivery of drugs and vaccines. J Nanobiotechnology. 9, (55), (2011).
  4. Danquah, M., Li, F., Duke, C. B., Miller 3rd,, D, D., Mahato, R. I. Micellar delivery of bicalutamide and embelin for treating prostate cancer. Pharm Res. 26, (9), 2081-2092 (2009).
  5. Li, F., Danquah, M., Mahato, R. I. Synthesis and characterization of amphiphilic lipopolymers for micellar drug delivery. Biomacromolecules. 11, (10), 2610-2620 (2010).
  6. Li, F., Danquah, M., Singh, S., Hao, W., Mahato, R. Paclitaxel- and lapatinib-loaded lipopolymer micelles overcome multidrug resistance in prostate cancer. Drug Deliv. and Transl. Res. 1, (6), 9 (2011).
  7. Li, F., Lu, Y., Li, W., Miller, D. D., Mahato, R. I. Synthesis, formulation and in vitro evaluation of a novel microtubule destabilizer, SMART-100. J Control Release. 143, (1), 151-158 (2010).
  8. Minko, T., Kopeckova, P., Pozharov, V., Kopecek, J. HPMA copolymer bound adriamycin overcomes MDR1 gene encoded resistance in a human ovarian carcinoma cell line. J Control Release. 54, (2), 223-233 (1998).
  9. Rosenholm, J. M., Mamaeva, V., Sahlgren, C., Linden, M. Nanoparticles in targeted cancer therapy: mesoporous silica nanoparticles entering preclinical development stage. Nanomedicine. 7, (1), 111-120 (2012).
  10. Kaur, I. P., et al. Issues and concerns in nanotech product development and its commercialization. J Control Release. 193, 51-62 (2014).
  11. Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers. Eur J Pharm Biopharm. 48, (2), 101-111 (1999).
  12. Wang, H., Li, F., Du, C., Mahato, R. I., Huang, Y. Doxorubicin and lapatinib combination nanomedicine for treating resistant breast cancer. Mol Pharm. 11, (8), 2600-2611 (2014).
  13. Ma, P., Rahima Benhabbour, S., Feng, L., Mumper, R. J. 2'-Behenoyl-paclitaxel conjugate containing lipid nanoparticles for the treatment of metastatic breast cancer. Cancer Lett. 334, (2), 253-262 (2013).
  14. Lundberg, B. B., Risovic, V., Ramaswamy, M., Wasan, K. M. A lipophilic paclitaxel derivative incorporated in a lipid emulsion for parenteral administration. J Control Release. 86, (1), 93-100 (2003).
  15. Perche, F., Patel, N. R., Torchilin, V. P. Accumulation and toxicity of antibody-targeted doxorubicin-loaded PEG-PE micelles in ovarian cancer cell spheroid model. J Control Release. 164, (1), 95-102 (2012).
  16. Gill, K. K., Kaddoumi, A., Nazzal, S. Mixed micelles of PEG(2000)-DSPE and vitamin-E TPGS for concurrent delivery of paclitaxel and parthenolide: enhanced chemosenstization and antitumor efficacy against non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines. Eur J Pharm Sci. 46, (1-2), 67-71 (2012).
  17. Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate Resolution. J. Org. Chem. 43, (14), 2923-2925 (1978).
  18. New Mexico State University. NMR Protocols and Specifications. Available from: http://web.nmsu.edu/~kburke/Instrumentation/NMSU_NMR_300.html (2015).
  19. Morton, L. A., Saludes, J. P., Yin, H. Constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of Nano-sized lipid vesicles. J Vis Exp. (64), (2012).
  20. Ulbrich, K., Etrych, T., Chytil, P., Jelinkova, M., Rihova, B. HPMA copolymers with pH-controlled release of doxorubicin: in vitro cytotoxicity and in vivo antitumor activity. J Controlled Release. 87, (1-3), 33-47 (2003).
  21. Patil, R., et al. Cellular Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(beta-L-Malic Acid). Int J Mol Sci. 13, (9), 11681-11693 (2012).
  22. Hu, X., Liu, S., Huang, Y., Chen, X., Jing, X. Biodegradable block copolymer-doxorubicin conjugates via different linkages: preparation, characterization, and in vitro evaluation. Biomacromolecules. 11, (8), 2094-2102 (2010).
  23. Huynh, L., Neale, C., Pomes, R., Allen, C. Computational approaches to the rational design of nanoemulsions, polymeric micelles, and dendrimers for drug delivery. Nanomedicine. 8, (1), 20-36 (2012).
  24. Shi, C., et al. A drug-specific nanocarrier design for efficient anticancer therapy. Nat Commun. 6, 7449 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics