Utarbeidelse og karakterisering av lipofile Doxorubicin Pro-stoff Miceller

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En protokoll for utarbeidelse og karakterisering av lipofile doxorubicin pro-drug lastet 1,2-distearoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [amino (polyetylenglykol) -2000] (DSPE-PEG) miceller er beskrevet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Li, F., Snow-Davis, C., Du, C., Bondarev, M. L., Saulsbury, M. D., Heyliger, S. O. Preparation and Characterization of Lipophilic Doxorubicin Pro-drug Micelles. J. Vis. Exp. (114), e54338, doi:10.3791/54338 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Kjemoterapi er vanligvis brukes til å behandle ulike former for kreft. De fleste, om ikke alle, cytostatika har toksiske bivirkninger som kan variere fra håndterbare mindre forhold, slik som kvalme og diaré, til mer livstruende tilstander. Fordi de fleste antikreftmidler er giftige, ikke-selektiv eksponering av disse stoffene med normalt vev uunngåelig fører til toksisitet. Det er derfor et stort behov for en terapeutisk tilnærming som selektivt kan levere medikamenter inn i kreftceller. En annen utfordring med administrasjon av legemidler mot kreft er deres dårlige løselighet i vann. Vanligvis er oppløsningsmidler nødvendig for å formulere disse dårlig oppløselige medikamenter. Imidlertid kan de fleste oppløsningsmidler, slik som dimetylsulfoksid (DMSO), Cremophor EL, og Polysorbat 80 (Tween 80) forårsake lever-og nyretoksisitet, hemolyse, akutte hypersensitivitetsreaksjoner og perifere nevropatier. 1 er derfor sikker og biokompatible formuleringer som trengs for klinisk bruk av dårligly løselige kreftmedisiner. Nanocarriers er lovende stoffet leveringssystemer for å ivareta de ovennevnte utfordringer. Disse nanocarriers inkluderer liposomer, 2 nanopartikler, 3 miceller, 4-7 polymer-legemiddelkonjugater, 8 og uorganiske materialer. 9 flere nanomedisin produkter (f.eks Doxil, Abraxane, og Genexol) har blitt godkjent av regulatoriske myndigheter for å behandle kreftpasienter. 10

Polymer miceller er lovende nano-skala stoffet levering bærere, som har blitt brukt for levering av kreftmedisiner. 4-7,11,12 Typiske polymere miceller er forberedt fra amfifile polymerer gjennom en selvmonteringsprosessen. De kjerne-skall strukturerte polymere micellene omfatter et hydrofilt skall og en hydrofob kjerne. Den hydrofile skallet kan sterisk stabil miceller og forlenge deres sirkulasjon i blodet. Den hydrofobe kjerne effektivt kan kapsle hydrofobe dtepper. På grunn av den lille størrelsen av miceller (typisk mindre enn 200 nm) og lang-sirkulasjon egenskaper, polymere miceller antas å oppnå målretting mot tumor gjennom økt permeabilitet og retensjon (EPR) virkninger (passiv tumor målretting).

Medikamentbelastning stabilitet er kritisk for tumor målretting evne til miceller. For å oppnå optimal svulst målretting, bør miceller ha minimal narkotika lekkasje før de når svulsten nettstedet, men likevel raskt frigjøre medikamentet etter å ha tastet kreftceller. I tillegg er preparatet stabilitet også en viktig forutsetning for produktutvikling, fordi formulering stabilitet bestemmer gjennomførbarheten av produktutvikling, samt holdbarheten av utviklede produkter. Nylig har mye arbeid blitt gjort for å forbedre lastingen av narkotika inn leverings bærere. Den lipofile pro-drug tilnærming er en strategi som har vært utforsket for å bedre legemiddelmengde i lipid nanopartikler og emulsjoner. 13,14 The conjugation av lipider med medikamenter kan forbedre sin lipofilisitet og forbedre lasting og oppbevaring i lipofile komponenter nanocarriers.

Her beskriver vi en protokoll for å forberede lipofile doxorubicin pro-narkotika lastet miceller. Først blir synteseprosedyre for doksorubicin lipofilt pro-legemiddel er beskrevet. Deretter blir en protokoll for generering av miceller med en film-dispersjon metode innføres. Denne fremgangsmåten har blitt brukt i vår tidligere studier. 5 DSPE-PEG ble valgt som bæremateriale for fremstilling av miceller, fordi det har blitt brukt for micelle legemiddelavlevering. 15,16 Til slutt beskriver vi flere vitro forsøk i som brukes til å karakterisere micelle formuleringer og for å evaluere anticancer aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Syntese av DOX-PA

  1. Veie 390 mg av doksorubicin og 243 mg palmitinsyre hydrazid, og overføre til en rundbunnet kolbe.
  2. Legg 150 ml vannfri methanol til kolben med en glassprøyte. Legg 39 mL trifluoreddiksyre (TFA) med en pipette. Ved hjelp av en magnetisk rører, omrør reaksjonsblandingen i 18 timer ved romtemperatur i mørket.
    MERK: Mengdene av reaksjons materialer kan skaleres opp eller ned for å oppnå ulike mengder av DOX-PA. Forholdet mellom reaktantene bør opprettholdes i de samme mengdeforhold. Reaksjoner ved hjelp av DOX mengder i området fra 78 mg til 1170 mg kan utføres i en vanlig kjemi laboratorium.
  3. Rensing av DOX-PA ved anvendelse av en silikagel-kolonne. 17
    1. Fjern løsningsmidlet i reaksjonsblandingen med en rotasjonsinndamper. Tilsett 3 g silikagel etter at volumet av blandingen er redusert til omtrent 20 ml. Fortsett rotasjonsinndampning for å gi tørre pulvere, og for å tillate than adsorpsjon av produkter på silikagel. Holde prøven under et vakuum i ytterligere 30 min etter at de tørre pulverne dannet.
    2. Pakke 50 g silikagel i en kolonne ved bruk av diklormetan som oppløsningsmiddel. Forsiktig tilsett silikagel prøve inneholdende adsorbert produkt til kolonnen.
    3. Eluer kolonnen med en blanding av diklormetan og metanol, mens man gradvis økte andelen av metanol, for derved å øke oppløsningsmiddel polaritet (tabell 1).
    4. Samle fraksjoner av elueringsmiddel i reagensglass (25 ml / rør) og overvåke fremdriften ved tynnsjiktskromatografi (TLC).
    5. Kombiner alle fraksjoner inneholdende ren DOX-PA og fjerne løsningsmidlet ved anvendelse av en rotasjonsfordamper inntil tørrhet pulver dannes. Ytterligere tørke produktet under vakuum O / N.
  4. Analyse av DOX-PA ved TLC.
    1. Skjær en 4 cm x 8 cm i TLC-plate. Spot prøveløsninger 0,5 cm fra bunnen av tallerkenen med TLC småblødninger kapillærer ved hjelp oppfyltMetanol som løsningsmiddel.
    2. Plasser TLC-plate inn i et utviklings kammer inneholdende en blanding av diklormetan og metanol (3/1, v / v). Dybden av oppløsningsmiddel bør være akkurat mindre enn 0,5 cm.
    3. Fjern platen fra fremkallingskammeret når løsningsmiddelfronten når toppen av platen. Markere plasseringen av løsemiddel front med en blyant og la maskinen tørke. Plasser TLC-plate inn i et kammer som inneholder flekker mettet jod-damp for å visualisere prøver.
  5. Analyse av DOX-PA med 1H-kjernemagnetisk resonansspektroskopi (1H-NMR). 18
    1. Oppløs 15 mg DOX-PA i 1 ml metylsulfoksid-d6 (DMSO) og overføre prøven til et NMR-rør.
    2. Sett NMR-rør inn i magnet av NMR-instrumentet. Mål protonspekteret, velge DMSO som oppløsningsmiddel. Fjern NMR-røret fra magneten. Analyser NMR resultat 18.

2. Utarbeidelse av DOX-PA Miceller av Film-spredning Method

  1. Oppløs DSPE-PEG (40 mg) og DOX-PA (4 mg) med 2 ml metanol i et 10 mL hetteglass.
  2. Fjern det organiske løsningsmiddel under vakuum ved anvendelse av en rotasjonsfordamper inntil en tynn film former i ampullen.
    MERK: Alternativt kan fordampe de organiske løsningsmidler under en inert gass (for eksempel argon eller nitrogengass) for å danne en film og holde ampullen i en vakuum-eksikator for ytterligere å fjerne gjenværende løsningsmiddel.
  3. Overføring 2 ml Dulbeccos fosfatbufret saltvann (pH 7,4, DPBS) til den hetteglass.
  4. Plasser flasken i et ultrasonisk bad i 3 minutter ved RT for å generere miceller.
    MERK: Ultralyd kraft varierer mellom ulike modeller av ultrasoniske bad. Velg en enhet som kan generere nok ultralyd makt for å spre den tynne polymer / medikament film. Utgangseffekten av ultrasonisk bad anvendt i denne protokollen er 110 W.
  5. Hold miceller ved 4 ° C i kort tid, og -20 ° C for lenge-term lagring.
    MERK: Alternativt kan miceller også være frysetørret og rekonstituert med vann før bruk. Vanligvis er ingen cryobeskyttelsesmiddelet eller lyoprotectant nødvendig for denne formulering.

3. Karakterisering av DOX-PA Miceller

  1. Fastsettelse av DOX-PA-konsentrasjon i miceller og narkotika innkapsling effektivitet
    1. Oppløs DOX-PA syntetisert på tidligere trinn i DMSO for å forberede DOX-PA-oppløsninger av fem forskjellige konsentrasjoner: 1 ug / ml, 5 ng / ml, 20 ug / ml, 50 ug / ml og 100 ug / ml. Mål absorpsjonen av DOX-PA-løsninger med en UV-VIS-spektrometer ved 490 nm. Generere en standardkurve basert på DOX-PA-medikamentkonsentrasjoner og deres tilsvarende absorpsjon ved 490 nm.
    2. Fortynne 25 mL av narkotika lastet micelle med 500 mL av DMSO. Mål absorpsjonen ved 490 nm med en UV-VIS-spektrometer. Beregn medikamentkonsentrasjoner med standardkurven generert i 3.1.1.
    3. Beregn innkapslingseffektivitet ved hjelp av følgende ligning:
      Drug Innekapslingseffektivitet (%) = (mengde av narkotika i miceller) / (mengde tilsatt medikament) x 100%
  2. Karakterisering av partikkelstørrelse med dynamisk lysspredning (DLS)
    1. Fortynn miceller med DPBS (pH 7,4) til en endelig DSPE-PEG-konsentrasjon på 1 mg / ml. Analyser en 2 ml prøve med en partikkelstørrelse analysator for å oppnå den Z-midlere størrelse og polydispersitetsindeksen (PDI).
  3. Evaluering av in vitro anticancer aktivitet
    MERK: Bruk passende steril teknikk og operere inne en biosikkerhet skap.
    1. Fjerne cellekulturmediet fra en cellekulturflaske (f.eks, T25) inneholdende DU-145 humane prostatakreftceller og skylle cellene med 2 ml DPBS (pH 7,4).
    2. Aspiratet DPBS, tilsett 1 ml trypsin-oppløsning (0,25%), og inkuberes i 2 minutter ved 37 ° C for å løsne cellene.
    3. Tilsett 10 ml av cellekulturmedium (RPMI 1640 + 10% føtalt bovint serum + 1% Antibiotikum-Anti-fungal), da de fleste av cellene er løsnet fra kolben. Overføre celler til en 15-ml sentrifugerør og sentrifuger cellene ved 1000 xg i 5 min.
    4. Re-suspen cellepelleten med 5 ml cellekulturmedium og fjerne en prøve for telling av antall celler med et hemocytometer. Fortynn cellene med cellekulturmedium til en tetthet på 50.000 celler / ml. Tilsett fortynnet-cellesuspensjoner i en 96-brønners cellekulturplate (100 ul / brønn). Inkuber cellene i en cellekulturinkubator (37 ° C, 5% CO2) i 18 timer for å tillate cellefesting.
    5. Fortynn DOX dimetylsulfoksid (DMSO) løsning og DOX-PA DMSO-oppløsning med cellekulturmedium for å oppnå endelige medikamentkonsentrasjoner på 0,1 uM, 0,5 uM, 2 uM, 5 uM og 10 uM, respektivt. Hold endelig DMSO-konsentrasjon i alle ovennevnte prøvene til 0,5%. Fortynn DOX-PA miceller med cellekulturmedium for å oppnå ferdige legemiddel concentrations på 0,1 uM, 0,5 uM, 2 uM, 5 uM og 10 uM, henholdsvis. Bruk tomme cellekulturmedium en kontroll.
    6. Fjerne den 96-brønners cellekulturplate fra inkubatoren og erstatte cellekulturmediet med 100 ul medium inneholdende forskjellige behandlingsmidler fremstilt i trinn 3.3.5 (n = 4 i hver gruppe). Inkuber cellene i cellekultur inkubator (37 ° C, 5% CO2) i ytterligere 72 timer.
    7. Aspirer medium og tilsett 100 ul av medium inneholdende 0,5 mg / ml av 3- (4,5-dimetyl-tiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT).
    8. Inkuber cellene i cellekulturinkubator i ytterligere 2 timer. Fjern mediet forsiktig og tilsett 100 ul DMSO for å oppløse formazankrystaller.
    9. Mål absorbansen med mikroplate-spektrofotometer ved en bølgelengde på 570 nm og en referansebølgelengde på 670 nm.
    10. Beregn cellelevedyktigheten ved anvendelse av følgende ligning:
      (A Test / A-kontroll) x 100%
      MERK: Sammenlign cellenes levedyktighet mellom forskjellige grupper ved anvendelse av en enveis variansanalyse (ANOVA) statistisk test. Beregn IC 50 basert på cellenes levedyktighet lignet med medikamentkonsentrasjonsdata.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser syntesen ordningen av DOX-PA. DOX-PA ble syntetisert ved konjugering av palmitinsyre med doksorubicin ved en pH-følsomt hydrazonbinding. Et svakt overskudd av palmitinsyre hydrazid ble anvendt for å lette fullføring av reaksjonen. Denne reaksjon fremgangsmåte har en meget høy virkningsgrad og bare en liten mengde av doxorubicin var tilbake etter en 18 timers reaksjon (figur 2). Utbyttet var ca 88%. Ved slutten av reaksjonen ble DOX-PA ble renset ved anvendelse av en silikagel-kolonne og tørket for å oppnå et rent rødt fast produkt. DOX-PA ble analysert med TLC, som viste en enkelt flekk for renset DOX-PA (figur 2). Figur 3 viser 1H-NMR-spektrum av DOX-PA. Karakteristiske NMR-topper fra både doxorubicin og palmitinsyre ble observert, noe som ytterligere bekrefter suksess av konjugeringsreaksjonen.

figur 4. Tomme DSPE-PEG-miceller uten medikament fremstå som en gjennomsiktig væske. DOX-PA DSPE-PEG-miceller vises som en rød væske; den røde fargen skyldes DOX-PA lagt i miceller. Representative resultater fra partikkelstørrelsesanalysen er vist i figur 5. Z-midlere partikkelstørrelse for tomme DSPE-PEG-miceller var 17,0 ± 0,5 nm (PDI = 0,034 ± 0,019). Lasting av DOX-PA øket micellen partikkelstørrelse litt; den Z-midlere partikkelstørrelse for DOX-PA DSPE-PEG-miceller var 25,7 ± 1,6 nm (PDI = 0,407 ± 0,035).

Den DOX-PA konsentrasjonen i micelle formuleringen ble fastsatt basert på absorpsjonen ved 490 nm. DSPE-PEG har ubetydelig absorbsjon ved denne bølgelengde, og dermed forstyrrer ikke i analysen av DOX-PA-konsentrasjon. Den DOX-PA-konsentrasjonen i formuleringen var micelle1,99 ± 0,11 mg / ml, og den medikament-last utbyttet var 99,3 ± 5,7%. Den høye innkapslingseffektivitet er på grunn av den lipofile egenskap av DOX-PA, som forbedrer dets retensjon i den hydrofobe kjerne av miceller. Formuleringen viste utmerket stabilitet. Det var ingen synlig utfelling når den lagres ved - 4 ° C i 3 uker. Ingen betydelig endring i medikament-konsentrasjon ble observert under lagring.

DU-145 menneskelige prostata kreft celler ble behandlet med ulike konsentrasjoner av fri doksorubicin, gratis DOX-PA og DOX-PA DSPE-PEG miceller. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved slutten av en 72 timers behandling ved hjelp av et MTT-assay (figur 6). En konsentrasjonsavhengig reduksjon i cellenes levedyktighet ble oppnådd ved å behandle DU145-celler med fri doksorubicin (IC50 = 0,10 uM), fritt DOX-PA (IC50 = 0,33 uM), eller DOX-PA-miceller (IC50 = 0,25 uM). Selv gratis doxorubicin er mer effektivt enn fritt DOX-PA eller DOX-PA-miceller ved lavere konsentrasjoner (0,1 uM og 0,5 uM), DOX-PA-gruppene viste større reduksjon i cellelevedyktighet enn fri doksorubicin ved høyere konsentrasjoner (2-10 uM). Også, det syntes å være noen signifikant forskjell mellom DOX-PA og DOX-PA miceller ved både høyere og lavere konsentrasjoner. Blank DSPE-PEG-miceller viste ingen toksisitet (data ikke vist), noe som indikerer god biokompatibilitet og sikkerhet av DSPE-PEG som en medikamentavgivelsesbærermateriale.

Figur 1
Figur 1. Syntese av lipofile pro-drug av doxorubicin (DOX-PA) Reagenser og betingelser:. Doxorubicin (DOX), palmitinsyre hydrazid (PA) og trifluoreddiksyre (TFA) oppløst i metanol ble omrørt i 18 timer ved romtemperatur i mørk. t = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Tynnsjiktskromatografi (TLC). TLC av (1) doksorubicin, (2) rå reaksjonsblanding, (3) palmitinsyre hydrazid, og (4) DOX-PA-konjugat. Prøvene ble utviklet med en blanding av diklormetan og metanol (3/1, v / v) og farget med jod. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. 1H-NMR av DOX-PA i deuterert DMSO. Tilstedeværelsen av karakteristiske topper fra både DOX og PA viser suksessen til konjugeringsreaksjonen.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54338/54338fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Utseende av miceller. (A) DSPE-PEG miceller og (B) DOX-PA DSPE-PEG miceller. Representative tall er presentert for å demonstrere utseendet tomme DSPE-PEG miceller og DOX-PA DSPE-PEG miceller. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Partikkel størrelse og størrelsesfordeling av miceller. (A) DSPE-PEG-miceller og (B) DOX -PA DSPE-PEG miceller. Micellen størrelse er bestemt ved dynamisk lysspredning. Representative tall er presentert for å demonstrere partikkelstørrelse og størrelsesfordeling. Data presentert er gjennomsnitt ± SD (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. Anticancer aktivitet av micelle-formuleringer. DU145-celler ble behandlet i 72 timer og cellenes levedyktighet ble målt ved anvendelse av MTT-analysen. Data presentert i figuren er gjennomsnitt ± SD (n = 4). * P <0,01, sammenlignet med DOX-behandlede grupper. Det er ingen statistisk forskjell mellom DOX-PA og DOX-PA-miceller behandlede grupper. IC50 ble beregnet basert på cellenes levedyktighet lignet med medikamentkonsentrasjonsdata.p_upload / 54338 / 54338fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1

Tabell 1. CH 2Cl 2 / CH3OH eluerende løsningsmidler som anvendes ved rensing av DOX-PA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette arbeidet, beskriver vi en ukomplisert, hurtig film-dispersjon fremgangsmåte for fremstilling av miceller. Denne metoden benytter selvbygging egenskaper av en amfifil polymer (f.eks DSPE-PEG) for å danne kjerne-skall strukturert miceller i et vandig miljø. Dette micelle fremstillingsmetode har flere fordeler. 1. Det innebærer en enkel formulering prosess, noe som unngår bruk av kompliserte størrelse-reduksjonstrinn (for eksempel ekstrudering eller homogenisering) som vanligvis brukes ved fremstilling av liposomer, nanopartikler, og nanoemulsions. 19 2. Den har en god reproduserbarhet. Utmerket batch-til-batch konsistens kan oppnås når formuleringen har blitt optimalisert og etablert. Protokollen er tolerant overfor variasjoner i fremstillingsprosessvariable, slik som ultralydbehandling styrke og tid. Selv om andre metoder (for eksempel dialyse tilnærming eller emulsjonen-løsningsmidlet fordampning metoden) er tilgjengelige for fremstilling av miceller, filmen dispersjonenMetoden er mer praktisk og effektiv. Derfor er det et stort potensiale for å bli tilpasset for bruk i storskala produksjon av miceller i den farmasøytiske industrien. Begrensningen med denne metoden er at den er avhengig av selvbygging egenskaper av bærermaterialer, og dermed er begrenset til materialer med slike egenskaper. Den upassende utvalg av polymere materialer kan føre til svikt i tilfredsstillende å generere micelle-formuleringer. I tillegg, avhengig av fremstillingsmetoden på ultrasonikering for å dispergere polymer / medikament film og for å lette dannelsen av miceller. De fleste kommersielt tilgjengelige ultrasoniske bad er egnet fordi bare en svak ultrasoniske strøm er nødvendig for å danne miceller. Imidlertid kan det være et problem hvis et ultralydbad med en meget svak strøm blir brukt.

Dårlig narkotika lasting og tidlig legemiddeldosering er store bekymringer for micelle levering av legemidler. I denne protokollen, har vi utviklet et lipofilt pro-drug strategi for å øke belastningening av doksorubicin inn DSPE-PEG miceller. Konjugering av doksorubicin med lipider betydelig forbedret kompatibilitet og interaksjon av medikamentet med lipid-kjerne av DSPE-PEG-miceller. Den pro-legemiddel, DOX-PA, ble syntetisert ved å konjugere doxorubicin med lipidet gjennom en sur pH-responsive hydrazon linker. Denne linkeren er stabile ved nøytral pH-verdi og kan spaltes ved sur pH. 20,21 blir således DOX stabilt lagt i DSPE-PEG-miceller som et pro-legemiddel ved nøytral pH og har en minimal medikament lekkasje under lagring og under sirkulasjon i blodet. Når DOX-PA-miceller gå inn tumorceller gjennom endocytose, vil DOX-PA pro-drug spaltes og omdannes til fritt DOX i respons til det sure endosomet miljø (pH 5-6). Siden DOX er mer hydrofile enn DOX-PA, vil denne konverteringen forstyrre samspillet mellom DOX og den hydrofobe kjerne av miceller, og dermed legge til rette for rask frigjøring av DOX fra miceller. Denne innovative design funksjonen vil unngå ufullstendig narkotika utgivelse, somer et stort problem i forbindelse med legemiddelkonjugater ved hjelp av ikke-spaltbare eller sakte-spalte linkere. 22 Denne fremgangsmåten kan også anvendes til levering av andre stoffer. Utvelgelsen av en passende linker er avgjørende for suksess for denne tilnærmingen. Linkerne bør være stabil i et fysiologisk miljø for å maksimere stabiliteten av formuleringen. Linkerne bør også effektivt spaltet i respons til utløser i tumoren mikromiljø (for eksempel pH, enzymer, etc.) for å frigjøre det opphavelige medikament.

I denne protokollen, ble DOX-PA effektivt lastet inn i miceller med høy innkapslingseffektivitet (~ 100%). Micellen formuleringen også vist overlegen stabilitet og holdt seg intakt i minst tre uker uten medikament utfelling eller reduksjon av medikamentkonsentrasjon. Dette er på grunn av den forbedrede interaksjonen mellom lipid-grupper i den pro-medikament og lipid kjerne av DSPE-PEG-miceller. Engineering compatibiheten av bærermolekyler med narkotika for å forbedre deres samhandling er en lovende strategi for å forbedre ytelsen til miceller og andre nanocarriers. Denne tilnærmingen kan forbedre narkotika lasting og minimere pre-moden narkotika utgivelse for disse nanocarriers. 23 Valg av en passende medikament / polymer paret er et avgjørende skritt i utformingen av micelle formulering. Strukturen av medikamentmolekyler kan bli endret (pro-drug metoden) eller utforming av bærermaterialer kan optimaliseres for å forbedre kompatibilitet og for å forbedre legemiddel / bærer-interaksjoner. 23 24 I tillegg kan beregnings modellering være et nyttig verktøy for å hjelpe i optimalisering av nanocarriers og gjør det mulig å lage et skredder designet nanocarrier for spesifikk et bestemt legemiddel.

Oppsummert beskriver vi her en metode for å syntetisere et lipofilt pro-drug av doxorubicin. Protokoller for utarbeidelse og karakterisering av narkotika lastet miceller er også descrIbed. Filmen-dispersjonen metode er en enkel og lovende metode for fremstilling av en rekke nanoskala selvmonteringsleveringssystemer. De karakteriseringsmetoder som er beskrevet her kan bli brukt som standard in vitro-analyser for å bestemme egenskapene til nanomedicines, således kan lette optimalisering av formuleringen og produkt utviklingsprosesser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DSPE-PEG2K Cordenpharm LP-R4-039 >95%
Doxorubicin LC Laboratories D-4000 >99%
Palmitic Acid Hydrazide TCI AMERICA   P000425G >98.0%
Methanol ACROS Organics 610981000 Anhydrous
Methylene chloride  FISHER  D151-4 99.90%
Methyl sulfoxide-d6 ACROS Organics AC320760075 NMR solvent
Trifluoroacetic Acid  ACROS Organics AC293811000 99.50%
Silica Gel FISHER  L-7446 230-400 mesh
Baker Flex TLC Plates FISHER  NC9990129
DPBS Sigma-Aldrich D8537
DU 145  Prostate Cancer Cells ATCC HTB-81
MTT ACROS Organics 158990050 98%
RPMI 1640 Medium MEDIATECH INC  10041CV
Antibiotic-Antimycotic  LIFE TECHNOLOGIES  15240062 100x stock solution
Fetal Bovine Serum LIFE TECHNOLOGIES  10437077
Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Varian, Inc 300 NMR 
Büchi R-3 Rotavapor Buchi 1103022V1  Rotary evaporator
Ultrasonic Bath BRANSON ULTRASONICS CORPORATION  CPX952318R
UV-VIS spectrometer Biomate 3 Thermo Spectronic
Zetasizer Nano ZS90  Malvern Instruments Particle Size Analyer
Microplate Spectrophotometer  Rio-Rad Benchmark Plus 
Cell Culture Incubator Napco CO2 6000
Biological Safety Cabinet Nuaire
SigmaPlot  Systat Software, Inc. Analytical Software
96-Well Cell Culture Plate Becton Dickinson 353072
Trypsin  0.25% Corning Cellgro 25-053-CI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hennenfent, K. L., Govindan, R. Novel formulations of taxanes: a review. Old wine in a new bottle? ESMO. 17, (5), 735-749 (2006).
  2. Paliwal, S. R., Paliwal, R., Agrawal, G. P., Vyas, S. P. Liposomal nanomedicine for breast cancer therapy. Nanomedicine. 6, (6), 1085-1100 (2011).
  3. Mahapatro, A., Singh, D. K. Biodegradable nanoparticles are excellent vehicle for site directed in vivo delivery of drugs and vaccines. J Nanobiotechnology. 9, (55), (2011).
  4. Danquah, M., Li, F., Duke, C. B., Miller 3rd,, D, D., Mahato, R. I. Micellar delivery of bicalutamide and embelin for treating prostate cancer. Pharm Res. 26, (9), 2081-2092 (2009).
  5. Li, F., Danquah, M., Mahato, R. I. Synthesis and characterization of amphiphilic lipopolymers for micellar drug delivery. Biomacromolecules. 11, (10), 2610-2620 (2010).
  6. Li, F., Danquah, M., Singh, S., Hao, W., Mahato, R. Paclitaxel- and lapatinib-loaded lipopolymer micelles overcome multidrug resistance in prostate cancer. Drug Deliv. and Transl. Res. 1, (6), 9 (2011).
  7. Li, F., Lu, Y., Li, W., Miller, D. D., Mahato, R. I. Synthesis, formulation and in vitro evaluation of a novel microtubule destabilizer, SMART-100. J Control Release. 143, (1), 151-158 (2010).
  8. Minko, T., Kopeckova, P., Pozharov, V., Kopecek, J. HPMA copolymer bound adriamycin overcomes MDR1 gene encoded resistance in a human ovarian carcinoma cell line. J Control Release. 54, (2), 223-233 (1998).
  9. Rosenholm, J. M., Mamaeva, V., Sahlgren, C., Linden, M. Nanoparticles in targeted cancer therapy: mesoporous silica nanoparticles entering preclinical development stage. Nanomedicine. 7, (1), 111-120 (2012).
  10. Kaur, I. P., et al. Issues and concerns in nanotech product development and its commercialization. J Control Release. 193, 51-62 (2014).
  11. Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers. Eur J Pharm Biopharm. 48, (2), 101-111 (1999).
  12. Wang, H., Li, F., Du, C., Mahato, R. I., Huang, Y. Doxorubicin and lapatinib combination nanomedicine for treating resistant breast cancer. Mol Pharm. 11, (8), 2600-2611 (2014).
  13. Ma, P., Rahima Benhabbour, S., Feng, L., Mumper, R. J. 2'-Behenoyl-paclitaxel conjugate containing lipid nanoparticles for the treatment of metastatic breast cancer. Cancer Lett. 334, (2), 253-262 (2013).
  14. Lundberg, B. B., Risovic, V., Ramaswamy, M., Wasan, K. M. A lipophilic paclitaxel derivative incorporated in a lipid emulsion for parenteral administration. J Control Release. 86, (1), 93-100 (2003).
  15. Perche, F., Patel, N. R., Torchilin, V. P. Accumulation and toxicity of antibody-targeted doxorubicin-loaded PEG-PE micelles in ovarian cancer cell spheroid model. J Control Release. 164, (1), 95-102 (2012).
  16. Gill, K. K., Kaddoumi, A., Nazzal, S. Mixed micelles of PEG(2000)-DSPE and vitamin-E TPGS for concurrent delivery of paclitaxel and parthenolide: enhanced chemosenstization and antitumor efficacy against non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines. Eur J Pharm Sci. 46, (1-2), 67-71 (2012).
  17. Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate Resolution. J. Org. Chem. 43, (14), 2923-2925 (1978).
  18. New Mexico State University. NMR Protocols and Specifications. Available from: http://web.nmsu.edu/~kburke/Instrumentation/NMSU_NMR_300.html (2015).
  19. Morton, L. A., Saludes, J. P., Yin, H. Constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of Nano-sized lipid vesicles. J Vis Exp. (64), (2012).
  20. Ulbrich, K., Etrych, T., Chytil, P., Jelinkova, M., Rihova, B. HPMA copolymers with pH-controlled release of doxorubicin: in vitro cytotoxicity and in vivo antitumor activity. J Controlled Release. 87, (1-3), 33-47 (2003).
  21. Patil, R., et al. Cellular Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(beta-L-Malic Acid). Int J Mol Sci. 13, (9), 11681-11693 (2012).
  22. Hu, X., Liu, S., Huang, Y., Chen, X., Jing, X. Biodegradable block copolymer-doxorubicin conjugates via different linkages: preparation, characterization, and in vitro evaluation. Biomacromolecules. 11, (8), 2094-2102 (2010).
  23. Huynh, L., Neale, C., Pomes, R., Allen, C. Computational approaches to the rational design of nanoemulsions, polymeric micelles, and dendrimers for drug delivery. Nanomedicine. 8, (1), 20-36 (2012).
  24. Shi, C., et al. A drug-specific nanocarrier design for efficient anticancer therapy. Nat Commun. 6, 7449 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics