Olfaktorischen Behaviors Assayed von Computer-Tracking
1The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Center for Sensory Biology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2MRC Clinical Sciences Center, Imperial College London

Published 8/20/2016
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Neuroscience

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Summary

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Lin, C. C., Riabinina, O., Potter, C. J. Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer. J. Vis. Exp. (114), e54346, doi:10.3791/54346 (2016).

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Abstract

Eine zentrale Herausforderung in der Neurobiologie ist zu verstehen , wie neuronale Schaltkreise funktionieren Verhaltensweisen geeignetes Tier zu führen. Drosophila melanogaster ein ausgezeichnetes Modellsystem für solche Untersuchungen aufgrund seiner komplexen Verhaltensweisen, leistungsstarke genetische Techniken ist, und kompakt Nervensystem. Verhaltenstests Laboratory haben lange mit Drosophila verwendet Eigenschaften der natürlichen Umgebung zu simulieren und untersuchen die neuronalen Mechanismen , die entsprechenden Verhaltensweisen zugrunde liegen (zB Phototaxis, Chemotaxis, sensorische Lernen und Gedächtnis) 1-3. Mit der jüngsten Verfügbarkeit von großen Sammlungen von transgenen Drosophila Linien , die spezifische neuronale Untergruppen bezeichnen, haben Verhaltenstests auf eine herausragende Rolle genommen Neuronen mit Verhaltensweisen zu verknüpfen 11.04. Vielseitig und reproduzierbare Paradigmen zusammen mit den zugrunde liegenden Berechnungsroutinen für die Datenanalyse, sind unverzichtbar für schnelle Tests von Kandidaten Fliegenlinien mit verschiedenen genotypes. Besonders nützlich sind Konfigurationen, die getestet in der Anzahl der Tiere, flexibel sind, die Dauer der Experimente und der Art der dargebotenen Stimuli. Der Test der Wahl sollte auch reproduzierbare Daten generieren, die leicht zu erwerben und zu analysieren ist. Hier stellen wir eine detaillierte Beschreibung eines Systems und eines Protokolls zur Bestimmung von Verhaltensreaktionen von Drosophila - Fliegen in einem großen Vierfeld - Arena. Das Setup wird hier Antworten von Fliegen auf einen einzelnen Geruchsreizes zu untersuchen; jedoch kann die gleiche Einstellung mehrerer olfaktorischen, optischen oder optogenetische Stimuli oder eine Kombination von diesen zu testen, modifiziert werden. Die Olfaktometer Einrichtung zeichnet die Aktivität von Fliegenpopulationen auf Gerüche reagieren, und Rechen analytischen Methoden werden angewendet, um Fliegenverhalten zu quantifizieren. Die gesammelten Daten werden analysiert, um ein schnelles Auslesen eines experimentellen Lauf zu erhalten, die für eine effiziente Datenerfassung und die Optimierung der experimentellen Bedingungen wesentlich ist.

Introduction

Die Fähigkeit zur äußeren Umgebung anzupassen und zu reagieren, ist von entscheidender Bedeutung für das Überleben aller Tiere. Ein Tier braucht, Gefahren zu vermeiden, Nahrung suchen und finden mates, und aus früheren Erfahrungen zu lernen. Sensorische Systeme funktionieren eine Vielzahl von Reizen, wie visuelle, chemische und mechanosensorischen, und senden diese Signale an das zentrale Nervensystem zu empfangen, zu interpretieren und decodiert. Das Gehirn leitet dann entsprechende motorische Verhaltensweisen auf der Grundlage der wahrgenommenen Umgebung, wie zum Beispiel Futter für Lebensmittel oder von einem Raubtier zu entkommen. Zu verstehen, wie sensorische Systeme, die die Außenwelt erkennen, und wie das Gehirn und Entscheidungen lenkt decodiert, ist eine große Herausforderung in der Neurobiologie.

Drosophila melanogaster ist ein leistungsfähiges Modellsystem für die, wie neuronale Schaltkreise Führungsverhalten zu untersuchen. Neben halten einfach und kostengünstig ist, zeigen Drosophila viele verschiedene und komplexe Verhaltensweisen schablonenhaft , und doch tun dies mit einem compact Nervensystem von etwa 100.000 Neuronen. Powerful genetische Techniken existieren , um die Drosophila - Genoms für die Manipulation und Tausende von transgenen Linien erzeugt wurden , die selektiv und reproduzierbar die gleichen Untergruppen von Neuronen 10-13 kennzeichnen. Diese transgenen Linien kann verwendet werden, um selektiv die Aktivität der markierten Neuronen manipulieren (aktivieren oder inhibieren), und diese Manipulationen können eingesetzt werden, wie neuronale Funktionen Führungsverhalten zu untersuchen.

Mehrere Verhaltenstests wurden Verhaltensweisen für die Untersuchung verschiedener Drosophila entwickelt. Drosophila, wie viele Tiere, nutzen ihren Geruchssinn für viele Verhaltens Entscheidungen zu führen, wie Nahrung zu finden, finden Kollegen und Gefahren zu vermeiden. Der Geruchssinn ist daher eine gute sensorische System für die Untersuchung, wie äußere Reize werden erkannt und interpretiert von einem Tier das Nervensystem zu entsprechenden Entscheidungen führen. Als solches sind eine Anzahl von Assays für investiga entwickeltting Larven- und Erwachsenen olfaktorische Verhalten. Traditionell wurden durch eine zwei Wahl T-Labyrinth Paradigma getestet, olfaktorische Verhalten in Drosophila, die zur Bestimmung von angeborenen verwendet werden können und gelernt Geruchsverhalten 3. In diesem Test werden etwa 50 Fliegen eine Wahl zwischen zwei Rohren gegeben: ein Rohr enthält den fraglichen Geruch und die andere enthält eine Steuerriechstoff (in der Regel der Geruch Lösungsmittel). Die Fliegen sind eine bestimmte Zeit gegeben, um eine Wahl zu treffen, und dann die Anzahl der Fliegen, die in den verschiedenen Kammern sind gezählt. Obwohl die T-Labyrinth ein einfacher Test für viele Experimente ist, gibt es einige Einschränkungen. Beispielsweise werden olfaktorische Verhalten an nur einem Zeitpunkt gemessen wird, und verschiedene Möglichkeiten vor diesem Zeitpunkt gemacht werden verworfen. In ähnlicher Weise werden die einzelnen Verhalten der Fliegen in der Bevölkerung vernachlässigt. Darüber hinaus erfordert die T-maze manuelles Zählen von Fliegen, die zu Fehlern führen könnte. Schließlich, da es nur zwei gemessenen Auswahl dieserreduziert die statistische Aussagekraft oft zu erkennen subtile Verhaltensänderungen erforderlich. Eine Alternative zu einer Zwei-choice T-Labyrinth ist ein Vier-Quadranten (Vier-Felder) Olfaktometer 14-18. In diesem Test erforschen Tiere eine Arena, in der jeder der vier Ecken der Arena mit einer potentiellen Quelle von odorierten Luft gefüllt ist. Die Arena hat eine gespitzten Sternform, die Bildung von vier experimentell definierten Geruchs Quadranten zu maximieren. Wenn Geruch in einer der Ecken zugeführt wird, dann wird sie enthalten, nur in diesem einen Quadranten. Das Verhalten der Tiere können verfolgt werden, da sie den Geruch Quadranten betreten und verlassen, und leicht im Vergleich zu ihrem Verhalten in den drei Steuer Quadranten. Der Vier-Quadranten-Olfaktometer Assay somit Aufzeichnungen räumliche und zeitliche Verhaltensreaktion auf die Geruchsreize über einen großen experimentellen Arena.

Der Vier-Quadranten - Olfaktometer wurde zuerst von Pettersson et al. 15 und Vet et al. 17 , um die ol zu untersuchenFabrik Verhaltensreaktionen einzelner parasitären Hautflügler. Faucher et al. 18 und Semmelhack und Wang 16 angepasst ist, die Einrichtung , die geruchlichen Reaktionen der einzelnen Drosophila zu überwachen. Der Vier-Quadranten-Olfaktometer ist ebenso empfindlich auf anziehende und abstoßende Reaktionen, so dass für eine breite Palette von Test Geruchs- und Bedingungen. Sonderanfertigungen geschrieben fly - Tracking - Software, entwickelt von Alex Katsov 19 und aktuell gehalten von Julian Brown (detailliert in Materialien), eingeführt zusätzliche Vorteile auf neuere Implementierungen des Vier-Quadranten - Olfaktometer 14,20-23. Es ist nun möglich, 100 fliegt mit hoher räumlicher (27,5 Pixel / cm) und zeitliche (30 Bilder pro Sekunde) Auflösung gleichzeitig zu testen, die unsere verschiedenen Parameter wie Position, Geschwindigkeit und Beschleunigung von Fliegen zu jedem Zeitpunkt erlaubt das Extrahieren. Dies ermöglicht Untersuchungen über die Dynamik der Verhaltensreaktionen auf Gerüche "Fliegen 20 fly Spuren aufgezeichnet nicht schneiden. An welchem ​​Punkt werden neue Spuren zugewiesen, nachdem die Fliegen auseinander. Durch die Integration von anderen Video-Capturing - Software ( die in Werkstoff - Tabelle), kann die gleiche Konfiguration flexible Tracking - Perioden und könnte verwendet werden , Fliegen für bis zu 24 Stunden zu verfolgen , indem Sie Bilder mit einer niedrigeren Bildrate nehmen. Diese Option wurde verwendet , um Eiablageverhalten von Fliegen und vergleichen ihre Körperpositionen mit Eiablage Präferenzen 14 studieren. Das Vier-Feld Olfaktometer kann auch Antworten verwendet werden , um zu studieren , um zu multimodal (zB olfaktorischen und visuellen) Stimuli oder optogenetische 9 oder thermogene 21 Stimulation mit Präsentationen von Sinnesreizen zu kombinieren. Darüber hinaus ermöglicht die hohe zeitliche Auflösung der Extraktion von Trajektorien for jedes einzelne Haar in der Ensemble-Datensatz. Daher ermöglicht das Verfahren Untersuchung in olfaktorischen geführte Bevölkerung Verhaltensweisen und auch individuelle soziale Interaktionen. Die Daten, die durch diesen Test erzeugt sind robust und hoch reproduzierbar, was die Verwendung des Vierfeld-Olfaktometer für Verhaltens Bildschirmen.

Wir beschreiben hier die Setup-Baugruppe für ein Vier-Quadranten-Olfaktometer. Wir zeigen weiterhin, seine Verwendung bei der Untersuchung von olfaktorischen Reiz in Reaktion auf Apfelessig und Abstoßung in Reaktion auf hochkonzentrierte Ethylpropionat. Schließlich beschreiben wir und Beispielcode für die Analyse der aufgezeichneten Flugverfolgungsdaten bereitzustellen.

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Protocol

1. Setup-Assembly

  1. Herstellung der sternförmigen Arena (19,5 cm 19,5 cm 0,7 cm) aus Polytetrafluorethylen (PTFE) gemäß der bereitgestellten Zeichnung (Ergänzende Materialien, SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf). Die Arena kann durch Ausübung einer gewerblichen oder einer benutzerdefinierten Einrichtung hergestellt werden.
  2. Erwerben zwei Glasplatten (20,25 cm mal 20,25 cm mit einer Dicke von 2 mm), und ein Loch bohren (~ 0,7 cm im Durchmesser) genau in der Mitte von einer der Glasplatten ein diamantbeschichteten Bohrer.
  3. Herstellung eines lichtdichten Verhalten Feld für die Verhaltens Arena. Auch die Herstellung einer lichtdichten Kameragehäuse für die Infrarot-CCD-Videokamera nach den zur Verfügung gestellten Zeichnungen (Supplementary Materials, SupplementalSketch_LightTightBox.pdf). Die Boxen können durch eine kommerzielle oder eine benutzerdefinierte Einrichtung hergestellt werden.
  4. Montieren Sie das Klimagerät an der hinteren Wand und den LED-Arrays an den Seitenwänden des Verhaltens Box. Legen Sie die Temperaturfühlerim Verhalten Feld durch ein Seitenloch für Echtzeit - Temperatur - Feedback und Anpassung (siehe Abbildungen 1 und 2 für Details).
  5. Befestigen Sie den IR-Filter und Zirkularpolarisator auf die Kamera, und montieren Sie die Baugruppe in das Kameragehäuse. Das Verhalten Feld und Kamerafeld werden durch ein Glasfenster für eine bessere Temperatursteuerung des Verhaltens Kasten (siehe 1 und 2 für Details) getrennt.
  6. Schließen Sie den Infrarot-CCD-Kamera mit einem Kameraadapter. Schließen Sie die Kamera-Adapter an einen USB-Konverter. Schließen Sie den USB-Konverter an einen USB-Anschluss am Computer für die Datenerfassung.
  7. Installieren Sie den Treiber für den Video-Konverter auf dem Computer nach den Anweisungen des Herstellers. Optional installieren Sie eine breitere Palette von Kameraeinstellungen und Aufnahmeparameter Bildverarbeitungssoftware vom Hersteller des USB-Videowandler zur Verfügung gestellt zuzugreifen.
  8. Schließen Sie das Klimagerät (durch "-Ausgabe"Auf der Rückseite der Temperatursteuerung) und der Temperatursonde (durch" Thermoelement "auf der Rückseite der Temperaturregler) auf die Temperatur-Controller. Die Sonde in das Verhalten Feld.
    Hinweis: Das Temperatursteuersystem in unserem Layout Aufrechterhaltung der Box Temperatur zwischen 18 ° C und 30 ° C fähig ist. Höhere oder niedrigere Umgebungstemperaturen für thermogene (dTrpA1, TRPM8 oder shibire ts) Experimente nützlich sein könnten neuronale Aktivität oder hemmen die synaptische Übertragung zu manipulieren. Bei den meisten Experimenten wird die Temperatur bei 25 ° C gehalten.
  9. Montieren Sie den Geruch Abgabesystem in den folgenden Schritten (siehe Abbildung 1B für detaillierte Schaltpläne und Anschlussarmaturen):
    1. Verwenden, um die Luftdruckregler des Lufteingang von dem zentralen Luftsystem zu steuern. Schließen Sie einen Kohlenstoff Luftfilter (gefüllt mit Holzkohle) mit dem Druckregler, um die Luft aus dem zentralen ein reinigenir-System.
    2. Montieren Sie den Stromregelsystem, das aus mehreren Kanälen geregelt durch hochauflösende Messröhren.
    3. Verbinden Sie den Ausgang aus dem Kohlenstoff - Luftfilter des Durchfluss - Messrohre über einen Verteiler , wie in 1B und 2F gezeigt. Richten Sie die Ausgabe der Messröhren durch elektronisch gesteuerte 3-Wege - Magnetventile zu regulieren , wenn saubere Luft , um die Durchflussmessgeräte verlassen in den Raum ausgestoßen wird oder in diese eingegeben maßgeschneiderte Geruch Kammern 24.
    4. Installieren Sie das Magnetventilsteuerung entsprechend der Anleitung des Herstellers.
  10. Installieren Sie die elektronische Luftmengenmesser, indem sie es mit einem Datenerfassungsgerät (DAQ) und eine Stromversorgung anschließen gemäß der Anleitung des Herstellers. Installieren Sie die DAQ-Interface-Software zu gleichen Flussraten in jedem Quadranten der Arena überprüfen Sie vor jedem Experiment.

2. olfaktorischer Stimuli Vorbereitung

  1. Bereiten Sie 5 Geruchant Kammern 24 , die aus einem Kunststoffaußenbehälter bestehen, Glasinnenbehälter, eine maßgeschneiderte PTFE Deckeleinsatz, original Behälterdeckel mit Mittelteil entfernt und zwei Einwegventile.
    Hinweis: Ein O-Ring um den Deckel aus PTFE verwendet werden könnten Luftleck aus dem Geruchskammer während Geruchs Perfusion zu verhindern. Siehe Abbildung 1 für schematische und 2 für Fotos der Kammern.
  2. Verwenden Sie vier Riechstoff Kammern für Lösungsmittelkontrollen und eine Kammer für einen Test Riechstoff. Füllen Sie die Glasbehälter mit 1000 ul Lösungsmittel bzw. Riechstoff Verdünnung (Test Riechstoffe + geeigneten Lösungsmitteln, gründlich mischen, bevor Experimente), legen Sie den Glasbehälter im Inneren der entsprechenden Kunststoffkammer (verschütten Sie nicht die Flüssigkeit in die Kunststoffkammer) und ziehen Sie den Deckel . Achten Sie darauf, immer eine saubere Kammer für den Test Riech- und Lösungsmittelkontrollen verwenden.
    Hinweis: olfaktorischen Reiz kann durch 1/16 Verdünnung von Apfelessig (5% Säure) in w ausgelöst werdenater. Im Gegensatz dazu kann olfaktorischen Abstoßungsverhalten unter Verwendung einer 10% igen Verdünnung von Ethylpropionat in Mineralöl sucht werden. Steuer Stimuli in diesen Fällen sind geruchsKammern mit reinem Mineralöl.

3. Fly Vorbereitung

  1. Hinten fliegt auf Standard cornmeal Medium. Legen Sie 30 männliche und 30 weibliche Eltern Fliegen in einer Standardflasche, und lassen Sie sie legen Eier für 5 Tage bei 25 ° C oder Raumtemperatur.
  2. Für jedes Experiment collect neu geschlüpften (<1 Tag alt) 25 männlich und 25 weiblich fliegt unter kurzen CO 2 Narkose.
  3. Halten Sie fliegt in einem Fläschchen mit Standard-fly Medium für 2-4 Tage.
  4. 40-42 Stunden vor dem Experiment, übertragen die Fliegen ohne CO 2 Narkose   in ein Fläschchen mit ~ 10 ml 1% iges Agarosegel. Dies wird die Fliegen halten, ohne Nahrung angefeuchtet, die ihre Bewegungsaktivität zu erhöhen hilft.
    Hinweis: Mehr als 90% der Fliegen den Hunger überleben sollte. Einige Genotypen sind weniger heilendein und kann nicht durch eine 40 Stunden Hunger machen. In diesen Fällen kürzere Zeiträume, wie beispielsweise 24-28 h sind akzeptabel, aber sollten die gleiche für alle Versuchsbedingungen und repeats gehalten werden.

4. Verhaltensreaktionen auf Attraktive und Repellent Riechstoffe

  1. Schalten Sie den Temperaturregler und stellen Sie es auf 25 ° C.
  2. Verbinden Sie die Riechstoffkammern (Kontroll- und Test Riechstoffe) durch den Schlauch mit dem Auslass des Riechstoffkammer einlegen und auf die Push-to-Connect-Fitting auf das Verhalten Feld.
  3. Überprüfen Sie die Strömungsgeschwindigkeit in jedem Quadranten durch den Luftmengenmesser verwendet, um sicherzustellen, dass die Steuer- und Riechstoffluftströme auf 100 ml / min gleich sind.
  4. Reinigen Sie die PTFE-fly-Arena und die Glasplatten mit 70% Ethanol 2-3 mal und lassen Sie sie vollständig trocknen (~ 3-4 min).
  5. Befestigen Sie die Glasplatten in die Arena mit Klammern.
  6. Transfer fliegt ohne CO 2 Narkose in die Arena durch das Loch in einer der Glasplatten. Achterner kann die Übertragung, legen Sie eine kreisförmige Gitter auf dem Loch entfernt entweichen zu verhindern.
    Hinweis: CO 2 Anästhesie gezeigt wurde 25 Drosophila Verhalten zu beeinflussen , und nicht innerhalb von 24 h einer Verhaltensexperiment verwendet werden soll.
  7. Legen Sie die Arena mit Fliegen in die lichtdichte Kammer, schließen Sie die vier Steuerluftströme durch den Schlauch an den Push-to-Connect-Fitting auf das Verhalten Feld der Arena Ecken angebracht verbinden, schließen Sie die Tür der Kammer und warten 10- 15 Minuten, damit sich die Fliegen an die neue Umgebung gewöhnen. Wenn möglich, schalten Sie das Licht in den Raum ab, wo die Experimente durchgeführt werden, möglichst wenig Licht Leck zu vermeiden, die Vorspannung der experimentellen Ergebnis kann.
  8. Führen Sie einen 5-10 min Kontrollexperiment, bei dem Fliegen zu 4 Steuerluftströmen ausgesetzt sind.
  9. Analysieren Sie die Daten sofort (siehe Datenanalyse Abschnitt weiter unten), um sicherzustellen, dass die Fliegen gleichmäßig in der Arena verteilt sind, und die Art der Index in der Nähe0. Dieser Schritt ist wichtig, da es , dass es in der Arena sind keine unkontrollierten Quellen der Präferenz oder Vermeidung überprüft (zB Licht von außen, ungleichmäßige Temperaturverteilung, unebene Arena, Geruchsbelästigungen undicht, etc.). Wenn die Fliegen ungleicher verteilt sind oder ihre Bewegungsaktivität niedrig ist, verwerfen die Fliegen, reinigen Sie die Arena wieder (Schritt 4.4) und eine neue Charge von Fliegen verwenden, um das Experiment zu wiederholen.
  10. Schließen Sie den Test Riechstoff Kammer mit dem Setup durch Einschalten der 3-Wege-Ventile oder Umstecken der Verbinderrohre.
  11. Führen Sie Testversuch für 5-10 Minuten und die Daten analysieren , wie in Abschnitt 5 weiter unten (siehe auch Referenz 14 und Abbildung 3). Aufnahmen länger als 20 Minuten können in Dateien kommen, die rechnerisch Prozess schwierig sein kann. Wenn mehr experimentelle Aufnahmen gewünscht werden, schnell zu stoppen und das Tracking-Programm neu starten. Dies führt zu einer ~ 10 sec Lücke zwischen experimentellen Aufnahmen.
  12. discard Fliegen.
  13. Saubere Arena und Glasplatten mit 70% Ethanol (Schritt 4.4) und Anschlussrohre innerhalb der lichtdichten Gehäuse ersetzen. Zur Beschleunigung der Experimente kann eine neue, saubere Arena verwendet werden, und die schmutzige Arena gereinigt, während Versuchsdurchläufe durchführen.
  14. Führen Sie ein anderes Experiment mit einer neuen Charge von Fliegen, falls erforderlich. Wenn mehrere Experimente am selben Tag ausgeführt werden, extreme Vorsicht walten, um sicherzustellen, dass keine Geruchsstoff in dem System von einer vorherigen Testlauf gelassen wird. Dies ist normalerweise kein Problem mit geringen Konzentrationen von Geruchsstoffen oder mit CO 2, aber zur Herstellung hochkonzentrierter Stimuli bis zu einem 24 - Stunden - Abstand zwischen Versuchsdurchläufe erforderlich sein. Darüber hinaus können alle Rohre, nachdem die Strömungsrohre ersetzt werden, wenn Riechstoff Kontamination während Kontrollversuchen vermutet wird. Lassen Sie immer die trockene Luft auf zwischen den Versuchen, um kontinuierlich das System spülen

5. Datenanalyse

Hinweis: Die vorgeschlagene fly-Tracking-Akquisition software (die in Materialien), verfolgt Fliegen in Echtzeit während der Erfassung und speichert den Zeitstempel und Koordinaten aller erkannten Fliegen im Format * .dat. Wir haben eine maßgeschneiderte Matlab Routine entwickelt, um die Daten in ein Matlab-Format zu konvertieren, und die Daten zu analysieren. Code-Beispiele sind in ergänzenden Materialien zur Verfügung gestellt, aber Einzelheiten der Umsetzung werden auf der Software zur Datenerfassung ab.

  1. Legen Sie die Rohdaten. Erstellen Sie eine räumliche Maske , die die Konturen der Arena und die Maske auf die Rohdaten folgt alle Datenpunkte zu entfernen , die außerhalb der Arena fallen , wie sie repräsentieren Lärm (4A, Ergänzender - Code MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask. m).
  2. Entferne alle Datenpunkte , die mit einer Geschwindigkeit unter 0,163 cm / s für mehr bewegen als 3s, da diese Daten wahrscheinlich Rauschen sein oder erzeugt durch unbewegte Fliegen (4B, Ergänzender - Code TemporalFiltering.m).
  3. Visualisieren verbleibenden DatenPunkte , indem sie aus auf einmal oder als einzelne Trajektorien (Abbildung 3, Ergänzender Kodex SingleTrajectoryViewer.m) aufgetragen ist .
    Hinweis: Die Lage der Geruchsgrenzen in der Vier-Felder von einer Reihe von Faktoren, die abhängig ist, wie die Eigenschaften jeder Geruchsstoff und die Luftströmungsraten verwendet werden. Zum Beispiel wird sehr flüchtige Riechstoffe wahrscheinlich den Geruch Quadrant vollständiger als weniger flüchtige Riechstoffe füllen. So ist es wahrscheinlich, dass jeder Geruchsstoff leicht Grenzen unterschiedlicher Geruch aufweisen kann. Die Verwendung eines Photoionisationsdetektor Geruchsgrenzen zu messen, kann problematisch sein, da es ein Vakuum verwendet Luft von einer bestimmten Stelle zu probieren, und stört so die Odormittelkonzentration an dieser Stelle. Dennoch können schnell geschätzten Grenzen Geruch auf Basis von Verhaltensdaten fliegen. So kann beispielsweise eine Geruchsgrenze basierend auf kumulierten fly Tracks in Reaktion auf verschiedene Gerüche deutlich in den Figuren 3C und 3D zu beobachten.
  4. Calculate eine Attraktion Index zu bestimmen , ob Kontrollexperimenten keine Präferenz Reaktion erzeugen, und auch die Antwort auf Riechstoff zuzugreifen (oder optogenetische 9) Reiz. Um eine Art Index (AI) zu berechnen, verwenden Sie die letzten 5 min von einer Steuer- oder Testaufzeichnung. Um ein Maß der Anziehung zu erhalten, die zwischen +1 (absolute Attraktion) und -1 (absolute Abstoßung) fällt, wird die folgende Formel verwendet, um die AI zu berechnen:
    Gleichung 1
    wobei N Test die Anzahl von Datenpunkten in dem Test Quadranten ist, N Steuer die durchschnittliche Anzahl der Datenpunkte in den drei Steuer Quadranten. Diese Maßnahme ist intuitiv wie egal wäre von nahezu Null-Werte angegeben werden. Allerdings ist es nicht richtig, den Anteil der Gesamtzahl von Fliegen zeigen, die in der Riechstoff Quadranten befinden. Um diese Maßnahme zu erhalten, ein Anteil Index (PI) verwendet werden:
    Gleichung 2 wobei N - Test ist die Zahl der Datenpunkte in dem Test Quadranten und N total die Gesamtzahl der Datenpunkte in allen vier Quadranten. Diese Formel stellt eine Maßnahme , die zwischen 0 und 1, mit 0,25 entspricht , ohne Verhaltenspräferenz (3E und 4C Ergänzungs - Code AttractionIndex.m) fällt.
  5. Führen Sie 5-10 Wiederholungen jeder Versuchsbedingung, eine neue Gruppe von Fliegen für jede Wiederholung verwenden. Vergleichen Sie die Attraktion Indizes zwischen den Bedingungen oder gegen Kontrollen durch den Kolmogorov-Smirnov nicht-parametrischer Test (Abbildung 3F, kstest2 Funktion in Matlab).

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Representative Results

Die Vier-Quadranten-Olfaktometer-Assay erfasst und analysiert die Wanderaktivitäten von vielen Fliegen über einen großen Verhaltens Raum. Geruchsstoffe können in die Luftströme eingeführt werden, die man eingeben, zwei, drei oder alle vier Quadranten. In Abwesenheit von Gerüchen, werden die Fliegen frei zwischen allen vier Quadranten bewegen. Dieses Verhalten ist von entscheidender Bedeutung zu beobachten, denn sie zeigt, dass nicht-absichtlich Vorurteile wurden nicht in den Test eingeführt. Diese Verzerrungen können , umfassen Licht, Temperaturschwankungen, Unterschiede in der Luftströmung oder Geruchs Verunreinigungen. 3B zeigt die Verhaltensreaktionen in dem Vier-Quadranten - Olfaktometer von 25 männlichen und 25 weiblichen Fliegen Luft trocknen. Eine einzelne Fly-Spur aus den gesammelten Daten werden auch in 3B markiert ist , und zeigt , dass diese Fliege die gesamte Verhaltens Arena wurde zu erkunden. Die Attraktion Indexwert (AI) für alle analysierten Spuren über die 5-Minuten-Testperiode nahe 0, indicating einen Mangel an Anziehungskraft auf den Geruch Quadranten. In ähnlicher Weise ist der Prozentsatz Index (PI) des Experiments 0,24, was darauf hinweist, dass Fliegen in allen vier Quadranten in der 5 min Testperiode ziemlich gleichmäßig verteilt wurden.

Die vier Feldverhaltensreaktion auf eine attraktive Riechstoff ist in 3C gezeigt. Apfelessig wird in den Luftstrom eingeführt von   oben links Geruch Quadrant Luftstrom durch eine 6,25% Verdünnung von Apfelessig in die Testkammer Geruch platzieren. Die gesammelten Flugspuren in grau dargestellt zeigen, dass die meisten Fliegen in diesem Geruch Quadranten sammeln, und nicht mehr alle vier Quadranten erkunden. Eine einzelne farbige Fliege Spur zeigt, dass einmal eine Fliege den Apfelessig geruchs Quadrant Apfel betritt, ist es in der attraktiven Geruch Quadranten zu bleiben neigt. Die KI von 0,94 für das Experiment in der Nähe von 1, was starke Anziehungskraft auf diese Riechstoff. Der PI von 0,92 zeigt an, dass 92% der Fliegen rim Geruch Quadranten während der Analyseperiode emained.

Die vier Feldverhaltensreaktion auf eine abstoßende Geruchsstoff wird in 3D gezeigt. Eine 10% ige Verdünnung des Riechstoff Ethylpropionat in einer Geruchskammer gelegt wurde als die Geruchsquelle für den linken oberen Luftstrom verwendet wird. Die geballte fly Spuren für den analysierten Experiment zeigen Vermeidung der Geruchs Quadranten, andeutend geruchs geführt Abstoßung. Eine einzelne farbige Fliege Spur zeigt, dass eine Fliege, wenn sie den Geruch Quadrant eingegeben, schnell weg den Geruch Quadranten zu vermeiden gedreht. Die KI von -0,68 kleiner als 0 ist, die Abstoßung gibt, und in der Nähe auf -1, was auf eine starke Abstoßungsriechstoff Antwort. Der PI von 0,06 für das Experiment legt nahe, daß nur 6% (im Vergleich zu ca. 25% in den neutralen Geruch Experimenten) der Fliegendatenpunkte verfolgt wurden im Geruch Quadranten über den Verlauf des Experimentes gefunden.

3E Diagramme , die die Beziehung zwischen AI und PI - Scores, und wie sich diese Zahlen beziehen sich auf die anziehende oder abstoßende Verhalten.

Das Vier-Feld-Test führt zu robusten und reproduzierbaren olfaktorische Verhalten. Dies ermöglicht eine quantitative Vergleiche zwischen Kontroll- und Versuchsbedingungen wie in 3F gezeigt ist , und ermöglicht auch die Identifizierung von subtilen olfactory Antworten, die von der Neutralität abweichen.

Ferner, da die Daten mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung erhalten wird, ist es möglich , zahlreiche Faktoren der Verhaltensreaktionen, wie beispielsweise Flugbahnen einzelner Fliegen zu untersuchen (wie in 3 gezeigt), sowie verschiedene Aktivitäts Dynamik der Fliegen charakterisieren in ein Geruch Feld (zB Änderungen in Richtung und Geschwindigkeit 19,20).

Es kann oft schwierig sein, das Vier-Feld-Arena in genau der gleichen Stelle für jedes Experiment zu positionieren, vor allem, da eine häufige Reinigung der Arena benötigt wird. Die zur Verfügung gestellten Analysen Skripte für diese geringfügige Schwankungen kompensieren , indem zuerst die Daten passend wie in 4A gezeigt. In diesem Fall wird die Form der Vierfeld-Arena berechnet, und Datenpunkte, die außerhalb dieses Raumes liegen, werden entfernt. Diese verfolgten Objekte stellen oft debris oder Reflexionen, die fälschlicherweise verfolgt werden. Als sie in der Arena nicht liegen und somit Lärm darstellen, ist es wichtig, dass diese Datenpunkte entfernt werden fehlerhaft zu verhindern Datenanalysen. Ebenso ist es auch wichtig, getrackten Datenpunkte zu entfernen, die Rauschen oder unbewegten Fliegen in der Arena darstellen könnte. Um dies zu erreichen, wird eine Analyse Skript verwendet (und hier zur Verfügung gestellt) , die Datenpunkte entfernt , die im Wesentlichen nicht bewegen (wie in 4B gezeigt). Diese Datenpunkte sind in der Regel in der Minderheit, doch ihre Retention zu Fehlern bei der Analyse führen würde.

Art der Index und Vorlieben Indexwerte können nach einem festgelegten Zeitraum berechnet werden (zB am Ende eines 5 min Experiment wie in Abbildung 3). Es sollte jedoch angemerkt werden, dass, da Fliegen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung verfolgt werden, ähnliche Analysen während des gesamten Experiments durchgeführt werden konnte. Das istin 4C in dem die Art der Index und Percentage Index Scores berechnet in kontinuierlichen 10-sec bins über die Zeitperiode angezeigt. Eine solche Analyse ermöglicht eine bessere Würdigung der olfaktorischen Veränderungen, die während des gesamten Experiments, wie Gewöhnung an Riechstoff auftreten könnten.

Abbildung 1
Abb . 1: Schematische Darstellung des Vier-Quadranten - Olfaktometer (A) Das Verhalten Aufbau eines Geruchsabgabesystem zusammengesetzt ist, Temperaturregelsystem (nicht grafisch dargestellt), Bildaufnahmesystem (IR LED - Leuchten und IR - CCD - Kamera an einen Computer angeschlossen ist ), vier-Quadranten-Arena und lichtdichten Verhalten und Arena-Boxen. Die roten Kreise bezeichnen die entsprechenden Komponenten in Abbildung 2 (B) Ausführungsplanung des Geruchsabgabesystems gezeigt. Die grünen Zeichen stehen für die Verbindung / Umwandlung Größen von fDie Armaturen. Schläuche von 1/16 ID und 1/8 OD sind gelb, während diejenigen von 1/8 ID und 1/4 OD markiert sind, in rosa markiert. Abkürzungen: IR, Infrarot; CF, Kompressionsverschraubung; BF, Schlauchtülle, MNPT, Mann National Pipe Thread. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2:. Fotos von der Setup - olfaktorischen Assay (A) Weitfeld - Ansicht der Kamera - Box und Verhalten Box. (B) Blick in das Verhalten Feld. Der Temperaturfühler, Stecker Rohre und IR-LED-Arrays sind beschriftet. (C) Vier-Quadranten - Arena. (D) Weitfeld - Ansicht des Geruchsabgabesystems auf das Verhalten Box verbunden. Das Kameragehäuse wurde entfernt, um die CCD-Kamera zu offenbaren. (E (F) Beispiel der Geruchsröhren verbunden mit dem Verteiler. (G) Hochaufgelöste Strömungsrohre regulieren den Luftstrom. (H) Der Geruch Förderschlauch und Anschlüsse hinter den Durchflußrohr Regler. (I) Die Magnetventile regulieren , wenn saubere Luft durch einen Geruchskammer geleitet wird , oder in den Raum ausgestoßen. (J) Die Geruchskammern sind mit Einwegventilen verbunden ist , und enthält eine innere Glasbehälter für das Odoriermittel. (K) Das Verhalten Box enthält außerhalb Push-to-Connect - Armaturen, die mit dem Geruch Förderschlauch anschließen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Beispiel Daten , die ein Vier-Feld olfaktorischen Assay generiert unter Verwendung von (A) Schematische Darstellung des Vier-Feld - Arena.. (B) Neutrale Reaktionen beobachtet werden, wenn alle vier Quadranten nur trockene Luft Perfusion enthalten. (C) Art der Antworten auf eine 6,25% Verdünnung von Apfelessig aus dem linken oberen Quadranten perfundiert. (D) Repulsion Verhaltensweisen , die von 10% Ethylpropionat ausgelöst. In 2B bis 2D wird eine einzelne Bahn aus der erhaltenen Daten aufgetragen. Ein Farbverlauf wird verwendet, um den Zeitverlauf der Aufnahme zu bedeuten, mit blauen und roten Farben, die Anfang und Ende der Aufnahmen ist, respectively. (E) Vergleich der Art Index (AI) und der Prozentsatz Index (PI). (F) Durchschnitt KI von 3- 6 Experimente ohne Geruch (Control), Apfelessig (ACV) und 10% Ethylpropionat (EP). Fehlerbalken zeigen SEM. Statistische Differenz wurde von der Kolmogorov-Smirnov te ausgewertetst. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4:. Beispieldaten , die durch die Datenanalyse Schritte (A) räumliche Filterung der Daten, durchgeführt von MaskSpatialFiltering.m , um Datenpunkte zu entfernen , die außerhalb der Arena fallen. Rote Kreise zeigen Anfangspositionen der Kreise, die verwendet werden, um die Grenzen der Arena zu definieren. Schwarze Kreise sind die endgültigen Positionen erworben, durch den Kreis passend zu den Daten umreißt (grau schattierte Fläche im Inneren des Vier-Felder). Rote Punkte und schwarze Pfeile bezeichnen Datenpunkte, die aus dem Datensatz nach diesem Filterschritt entfernt werden. (B) eine zeitliche Filterung von Daten, die von TemporalFiltering.m durchgeführt. Dieser Filterschritt entfernt Datenpunkte, die sehr slo bewegenWLY oder gar nicht, da sie wahrscheinlich vom unbewegten Fliegen erzeugt werden oder durch Schmutz / Reflexionen von der Arena. Ein roter Punkt durch eine gestrichelte roten Kasten umgeben zeigt Positionen von ~ 6.000 Datenpunkte mit identischen Koordinaten, die von diesem Filterungsschritt entfernt wird. (C) Art der Index (AI) und Percentage Index (PI), berechnet in 10-Sekunden - Bins in den letzten 5 Minuten eines Experiments durch AttractionIndex.m. Temporal Profile dieser Indizes enthalten Informationen über die Dynamik von Verhaltensreaktionen und können für eine detaillierte Analyse von Verhaltensweisen verwendet werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Das Vier-Feld Olfaktometer beschrieben hier ist ein vielseitiges Verhaltenssystem zur Untersuchung der olfaktorischen Reaktionen von großen Populationen von Wildtyp und Mutante Drosophila - Fliegen. Jeder Versuch dauert ca. 1 Stunde (einschließlich Setup, Versuchsdurchläufe und Reinigung), und 4-6 Experimente können routinemäßig jeden Tag durchgeführt werden. Ein typischer Test 40-50 Fliegen für 5 Minuten unter Verwendung erzeugt etwa 450.000 Datenpunkte für die Analyse verfolgt. Die beschriebene Anordnung kann auch verwendet werden, mit geringen Modifikationen in Reaktion Bewegungen anderer Insekten oder Insektenlarven zu überwachen, um eine Zeitdauer olfaktorischen oder andere Sinnesreize über, im Bereich von Minuten bis Tagen. Der Vier-Quadranten-Assay ist empfindlich gegenüber den Auswirkungen von sowohl anziehenden und abstoßenden Reize. Die meisten Riechstoffe erzeugen Attraktion Indizes (AI) zwischen -0,9 und +0,9 (Gleichung 1). Ein AI im Bereich von 0,5 bis 1 bedeutet starke Anziehungsverhalten der Fliegen auf die Reize, während AI im Bereich von -0,5 bis -1ausgelöst durch starke Abschreckungsmittel. Im Allgemeinen eine neutrale Reaktion durch Kontrolle Gerüche (trockene Luft, befeuchtete Luft, Mineralöl) zwischen +0,1 und -0,1 fallen. Die KI ändert sich häufig im Verlauf des Tests Experiment, was die Zeit vergeht in die Riechstoff Federn laufen erfordern, initial Anziehung und Erhöhung der lokomotorischen Aktivität gegenüber einem neuen Stimulus und die schließliche Desensibilisierung in Antwort auf den Reiz. Pre-Test Kontrollläufe sind wichtig und müssen sorgfältig durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass Fliegen wurden gleichmäßig in der Arena in Abwesenheit des gewünschten Stimulus verteilt.

Häufigste Ursachen der räumlichen Vorspannung von Fliegen in der Arena sind: ungleiche Luftströme, möglicherweise aufgrund einer getrennten Schläuchen oder unzureichend geklemmt Glasplatten des sternförmigen Arena (in unserer Erfahrung, Fliegen können Unterschiede von Luftstrom zu erfassen, der so wenig wie 15 ml / min); ungleichmäßige Temperaturverteilung über die Arena, die durch das Festlegen der verbessert werden kann,Klimagerät zu erzeugen schwächer und diffuse Luftströmung und / oder längere Zeit vor Erwerb Periode (~ 20 min) Temperatur der Arena, um sicherzustellen, selbst; minimale Lichtverlust durch die Temperaturfühler Öffnung, die durch Abdichten der Öffnung mit schwarzem Klebeband reduziert werden kann; Restgeruch in der Arena oder in der Luftzufuhrsystem, in welchem ​​Fall die Einrichtung (Arena, Durchflußrohre, Armaturen des lichtdichten Gehäuse, etc.) müssen gründlich gereinigt werden und für mehrere Tage trocknen gelassen oder , falls möglich ersetzt.

Die Wartung der olfaktorischen Ausrüstung ist wichtig für eine zuverlässige und konsistente Ergebnisse. Push-to-Connect-Armaturen auf das Verhalten Kasten und Lufteinlässe und Innenwänden der Arena sollte mit Ethanol nach jedem Experiment gereinigt werden, wenn starke Gerüche verwendet werden und erlaubt vollständig zu trocknen. Die Glasplatten sollten dreimal mit einer 70% Ethanol gewaschen werden, die in der Regel ausreichend ist, Restgeruch und Schmutz von den Platten zu entfernen, aber ist nützlich Hexanbei der Entfernung von Fliegen abgelagerte organische Verbindung (beispielsweise bestehend aus Pheromonen langen Kohlenwasserstoffketten). Seife ist in der Regel nicht empfohlen, da es in der Regel aromatische Bestandteile enthält, die olfaktorische Verhalten beeinflussen würden. Das Verhalten Feld sollte auf die trockenen Lufteinlässe zwischen den Experimenten verbunden bleiben (zB über Nacht) Entfernung der Restgerüche aus dem System zu erleichtern.

Wenn der Bewegungsaktivität der Fliegen niedrig ist, kann sie zu wenige Datenpunkte zu erzeugen, die häufig zu einer verrauschten und variable Art Index. Längere Hunger und Aufnahmezeiten helfen kann, dieses Problem zu lösen. Im Gegensatz dazu, wenn die Fliegen krank sind, 24-28 h Hunger im allgemeinen ausreichend, so lange Lokomotion Aktivität wäre für die Verbesserung, wie sie überall in Experimenten konsistent ist. Es gibt eine feine Balance einen gesunden Zustand der Fliegen zwischen Erhaltung und Steigerung der Fortbewegung. 40 Stunden Hungern kann als Ausgangspunkt verwendet werden und später modifiziertbasierend auf den experimentellen Ergebnissen benötigt. Art der Indizes wird etwas von der Dauer des Hungers betroffen sein, so ist es wichtig, alle Versuchstiere für den gleichen Zeitraum, um zu verhungern verwirrende Wirkung von Hunger Zeit zu vermeiden. Längere Hungerzeiten in der Regel Abstoßungsreaktionen schwächer (näher an 0) zu machen, und attraktive Antworten stärker. Trockene Luft Steuerluftströme dazu neigen, um die Fliegen zu vertrocknen, und sollte nicht länger als 40 min verwendet werden.

Der Vier-Quadranten - Olfaktometer kann verwendet werden , um Antworten einzelner 16,18 oder mehrere Fliegen auf einen einzelnen Reiz zu studieren oder die Wahl bevorzugt zwischen Stimuli zu studieren. Zum Beispiel könnten verschiedene Gerüche in jedem der vier Quadranten verwendet werden. Dies könnte auch die Antworten auf geruchs Mischungen verwendet werden, um zu bestimmen, indem sie die Grenzen der geruchs Quadranten untersuchen. Es sollte auch beachtet werden, dass obwohl das Tracking-System einzelne Tracks ermöglicht aus den gesammelten Daten isoliert werden, ist esmöglich, dass einzelne Fliegen können anders verhalten, wenn sie als Teil einer Gruppe getestet, als wenn sie alleine getestet werden. Beispielsweise Gruppen von Fliegen aufweisen geruchs geführt Abstoßung aufgrund physikalischer Wechselwirkungen zwischen Linie 26 erhöht. Das Tracking-System und das Layout kann auch für die Verwendung in nicht-olfaktorischen Assays angepasst werden. Der Test Rahmen kann leicht ein LED - Array 9 für optogenetische Stimulation oder einer Wärmeplatte 27 für thermogenetics aufzunehmen. Das System kann auch Verhaltens Auswahl einer Zeitskala von vielen Stunden zu untersuchen angepasst, beispielsweise Eiablage Verhalten 14 zu studieren. In diesem Fall muss die Erfassungsbildrate angepasst werden, um die Erzeugung von großen Datendateien, und eine Feuchtigkeitsquelle und dem Substrat (1% Agarose-Gel) zu vermeiden, müssen als Eiablage Substrat vorgesehen werden.

Eine Einschränkung dieser Einrichtung ist, dass die Fliegen nachgeführt werden als IR-reflektierende Gegenstände in und unterhalb der Arena- wenn irgendein Element eines optogenetische oderthermogene Experiment reflektiert IR, die irrelevanten Datenpunkte benötigt, während die Nachbearbeitung entfernt werden. Derzeit ist es auch nicht möglich, Fliegen mit einer räumlichen Auflösung zu filmen, die verschiedene Fliegen kontinuierlich unterscheidbar sein können, aber dies kann durch die Verwendung fortgeschrittener Videokameras in Zukunft verbessert werden. Eine weitere Einschränkung des gegenwärtigen Systems ist, dass die Bewegung von Fliegen auf zwei Dimensionen beschränkt ist, zu Fuß Verhaltensweisen zu fördern und die olfaktorischen induzierten Flug Reaktionen verhindern.

Es sollte beachtet werden, dass zusätzliche automatisierte Assays wurden auch die Geruchsverhalten von einzelnen oder Gruppen von Fliegen zu untersuchen entwickelt. Das ähnlichste Design des Assays hier beschrieben ist ein Verfahren , entwickelt von Beshel und Zhong 28. In diesem Test werden die Antworten von ~ 30 Fliegen in einer kleinen kreisförmigen Arena (etwa ein Viertel der Fläche der Vier-Felder-Arena) überwacht, in denen Gerüche von 1 von 4 Geruch Häfen entlang der Arena wa geliefert werdenll, und in der Mitte der kreisförmigen Arena durch ein Loch entfernt. Neben einer kleineren Arena, umfassen andere Designunterschiede Verhaltensweisen unter Lichtbedingungen durchgeführt wird, und Riechstoffe hauptsächlich konzentriert nahe der Geruchs Ports (statt im gesamten Riechstoff Quadranten, wie durch die gewellten Wände des Vierfeld-Arena gerichtet). Nichtsdestoweniger ist die kreisförmige Bühne ein geeignetes Verfahren zum Screenen olfaktorischen Antworten von Fliegen und hier beschrieben zur Fliege Verfolgungs Design angepasst werden können.

Ein alternativer Ansatz ist, um gleichzeitig die Aktivität vieler Einzellinie in Reaktion auf Gerüche überwachen. Im Flywalk Test werden einzelne Fliegen in kleinen Röhrchen gegeben, und ihre Antworten verfolgt , wenn Riechstoffe durch die Röhre 29,30 perfundiert werden. Änderungen in der Vorwärts- oder Rückwärtsrichtung oder Änderungen der Geschwindigkeiten kann zu messen verwendet werden, wenn ein Riechstoff allgemein anziehend oder abstoßend ist. Dieser Test, wie das Vier-Felder-Test, verfolgt automatisch fly movements und kann so verwendet werden, um schnell olfaktorischen Reaktionen auf eine breite Palette von Gerüchen zu messen. Doch im Gegensatz zu dem Vier-Feld, komplexe Motordynamik, wie Bahndrehwinkel und mögliche soziale Interaktionen, verpasste vielleicht im Flywalk Test-Aufnahme.

Automatische Verfolgung einzelner Fuß Fliegen hat auch zu einem T-Labyrinth - Typ - Test 31,32 angepasst. In diesem Test werden die Fliegen in kleinen Kammern angeordnet, in denen Gerüche von beiden Enden der Kammer durchblutet werden und Ausgang über einen Port in der Mitte der Kammer. Die Positionen der Fliegen werden automatisch nachgeführt. Dies ahmt, eine Fliege Skala, einem T-Labyrinth Rahmen. In Kombination mit Optogenetik, dieser Test besonders gut wurde zur Untersuchung neuronaler Schaltkreise vermittelnde olfaktorischen Lernen und Gedächtnis geeignet, und kann auch verwendet werden, die geruchlichen Vorlieben der einzelnen Fliegen zu messen. Ähnlich wie Flywalk, ist es nicht komplexe Tätigkeit Dynamik überwachen können, die über größere räumliche Bereiche auftreten könnten, Wie jene , die bei der Lebensmittelsuch 14 oder Verhaltensweisen auftreten , die nur in fly Populationen vorkommen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air delivery system  (Quantity needed)
Tubing and connectors
Thermoplastic NPT(F) Manifolds Cole-Parmer, IL, USA R-31522-31 1
Hex reducing  nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) McMaster-Carr, IL, USA 5232T314 1
Tubing (ID:1/8) McMaster-Carr, IL, USA 5108K43 50 Ft
Tubing (ID:1/16) McMaster-Carr, IL, USA 52355K41 100 Ft
Barbed tube fittings McMaster-Carr, IL, USA 5117K71 1 pack
Push-to-connect tube fittings McMaster-Carr, IL, USA 5779K102 4
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) McMaster-Carr, IL, USA 5463K439 1 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) McMaster-Carr, IL, USA 5463K438 2 pack (10) 
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) McMaster-Carr, IL, USA 5463K4 2 pack (10) 
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) McMaster-Carr, IL, USA   5670K84 1
Hex head plug McMaster-Carr, IL, USA 48335K152 1
Air pressure regulator, air filter and flowmeters (Quantity needed)
Labatory gas drying unit W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA Model: L68-NP-303; stock #26840 1
Multitube frames for 150 mm flowtubes Cole-Parmer, IL, USA R03215-30 1
Multitube frames for 150 mm flowtubes Cole-Parmer, IL, USA R03215-76 1
150 mm flowtubes Cole-Parmer, IL, USA R-03217-15 9
Valve Cartridge Cole-Parmer, IL, USA R-03218-72 9
Precision Air regulator McMaster-Carr, IL, USA 6162K13 1
Soleniod valves Automate Scientific, Berkeley, CA 02-10i 4
Solenoid valve controller ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA 01-18 1
Electronic flow meter Honeywell AWM3100V 1
DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a  National Instruments NI USB-6009 1
Power supply Extech Instruments 382200 1
Odor chambers
Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml Nalgene 562118-0002 At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114)
Glass odor chamber, 0.25 oz Sunburst Bottle LB4B At least 5 are required per experiment 
"In" valve for odor chamber Smart Products, Inc., CA, USA 214224PB-0011S000-4074 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
"Out" valve for odor chamber Smart Products, Inc., CA, USA 224214PB-0011S000-4074 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
O ring RT Dygert International, MN, USA AS568-029 Buna-N O-R 1 pack (100)
Fly arena, camera and behavior boxes (Quantity needed)
Behavior and camera box material Interstate plastics, CA, USA ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) 1803 sq inch
Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12" x 12" McMaster-Carr, IL, USA 8545K27  1
Glass plates, 1/8" Thick, 9" x 9" McMaster-Carr, IL, USA 8476K191  2
Dual action thermoelectric controller WAtronix Inc, CA, USA DA12V-K-0 1
IR LED array Advanced Illumination, Rochester, VT, USA AL4554-88024, PS24-TL 2 LED arrays and one power supply
Air conditioner Unit Melcor Store  MAA280T-12 1
Imaging system (Quantity needed)
Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA PEC21211 KP 1
CCXC-12P05N Interconnect Cable B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA SOCCXC12P05N 1
DC-700 Camera Adapter B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA SODC700 1
B+W 40,5 093 IR filter B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA 65-072442 1
TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer Amazon 1
IR Videocamera Industrial Vision Source, FL, USA Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) 1
USB video converter The Imagingsource, NC, USA DFG/USB2-It 1
iFlySpy2 (fly tracking software) Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com iFlySpy2 1
IC Capture 2.2 software The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/)
Miscellaneous (Quantity needed)
Dremel rotary tool Dremel, Racine, WI, USA Dremel 8000-03  1
Diamond-coated drill bits for glass cutting Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY 90606328 1

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References

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