השוואה של שלוש שיטות שונות לקביעת שגשוג תאים בשורות תאי סרטן השד

1Medical Genetics, Hunter Medical Research Institute, 2Priority Research Centre for Cancer, School of Biomedical Sciences and Pharmacy, Faculty of Health and Medicine, University of Newcastle, 3Pathology North, John Hunter Hospital
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. J. Vis. Exp. (115), e54350, doi:10.3791/54350 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

הגן מדכא גידולים, p53, הוא הרגולטור חיוני של מספר תהליכים תאיים, כולל עיכוב מחזור התא, אפופטוזיס והזדקנות 1. הוא אחראי על שמירה על יציבות גנומית, ולכן הוא חיוני בשמירה על האיזון של מוות של תאים וצמיחת תא. מוטציות ב- p53 נפוצים סרטן והם הגורם העיקרי של איון p53 המוביל התפשטות תאים סרטניים בלתי מבוקרת 2. מעניין, מוטציות ב- p53 רק מהווים כ -25% ממקרי סרטן השד 3, דבר המצביע על כך מנגנונים אחרים אחראים אובדן תפקוד p53. Isoforms p53 גילה לאחרונה הוכח להיות ביטוי יתר במספר סוגים של סרטן אנושי, והוא יכול לווסת p53 פונקצית 4,5. הראינו בעבר כי איזופורם p53, Δ40p53, הוא איזופורם הביע הגבוהה ביותר בסרטן השד, והוא upregulated משמעותי בתאי סרטן השד, בהשוואה Tiss נורמלי סמוכיםue 6. בעקבות זאת, אנחנו transduced הקו הסלולרי סרטן השד האנושי ביציבות MCF-7 כדי overexpress Δ40p53 באמצעות לגו-iG2-פורו + וקטור (+ GFP) 7. תאים אלו שמשו לחקור אם ביטוי Δ40p53 גבוה מגביר את קצב התפשטות תאים בתאי סרטן השד.

ישנן שיטות ישירות ועקיפות רבות של מדידת תא התפשטות של תאים בתרבית במבחנה 8,9. אלה יכולים להתבצע גם כמו מדידה רציפה לאורך זמן, או מבחני סיום כמו 10. בשיטות מקובלות עדיין שימושיות, כגון ספירת תאים באמצעות hemocytometer. assay זוהי עלות נמוכה מדידה ישירה של המספר הסלולרי, אבל זה להסתמך על ספירה תאית גדולה אימון מיומן כדי למזער סטיות שגיאת תקן גדול מן הספירות. הצורך לבצע מדידות תואמות פורמטי תפוקה גבוהה הוביל את הפיתוח של מבחני multiwell צלחת. מבחני הארה מבוססת אלה צפחותמחדש מספרים סלולריים המבוססים על אות זורחת כי היא יחסית את הפעילות המטבולית של התא 11,12. ולאחרונה, את ההקדמה של פלטפורמות הדמיה תכולה גבוהה אפשרה כלים חדשים אשר לנטר התפשטות תאים תוך מתן איסוף נתונים פנוטיפי כמותיים ואיכותיים, וכולל מגוון רחב של מערכות 13. כל השיטות האלה לספק אפיקים למדוד צמיחת תאים, בין אם על ידי מבחני מדידה או נקודות קצה רציפים, וכל אחד להחזיק מגוון של יתרונות וחסרונות לגבי רגישות, תפוקה של מספרי מדגם, ומידע תא, כל מה שיכול להישקל בהתאם בהתאם על שאלת המחקר.

פרוטוקול זה מתאר שלוש שיטות שונות למדידת התפשטות תאים במבחנה, עם כל שיטת ניצול טווחים שונים של רגישות, שחזור ותבניות צלחת רבה היטב. פרוטוקול זה נועד להשוות את השימוש של צ'ה ספירת hemocytometermber, assay כדאיות התא מבוססי הארה, וכן imager התא, במדידה של התפשטות תאים על פני מהלך הזמן 96 שעות ביממה. לשם כך, את הצמיחה של תאים transduced וקטור (MCF-7-לגו) הושווה תאים transduced כדי overexpress Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), באמצעות שלוש צפיפויות תאים שונים. התפשטות תאים נמדדה כל 24 שעות עד 96 שעות. לכל שיטה נמצאה יש יתרונות וחסרונות משלו, בהתאם מטרת הניסוי, כל עוד הוא שיטה ערך למתן מידע על קצב הפרוליפרציה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תאי הכנות לקראת מבחני הפצת נשק

הערה: הכן שתי שורות תאים באותו אופן וזרעי במתכונת זהה עבור כל שיטה כדי להיות מנותח.

  1. לגדול MCF-7-לגו MCF-7-Δ40p53 7 התאים מפגש 75-80% ב T 75 ס"מ 2 צלוחיות תרבות רקמות באמצעות פנול אדום חינם בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS) L- גלוטמין, 200 מ"מ, 2 מיקרוגרם / מ"ל ו אינסולין 1 מיקרוגרם / מ"ל puromycin ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. לטפל בתאים בכיתה ארון biosafety סטרילי השנייה.
    הערה: משך הזמן שנדרש כדי לגדל את תאי המפגש משתנה בהתאם דילול הזריעה. לקראת ציפוי התאים עבור מבחני שגשוג, זרע התאים ב דילול 1: 3 DMEM בתוספת ולתחזק בתנאים צמיחה נורמלית במשך 3 ימים עד 75-80% confluency.
  2. כדי להסיר את התאים מהבקבוק, לשפוך את התקשורת לתוךמיכל פסולת. מיד לשטוף את שכבת התאים עם 2 מ"ל של טריפסין 2x מחומם מראש. לשאוב טריפסין. הוסף 2 מיליליטר נוסף של טריפסין מחומם מראש ל שכבת התאים והמקום באינקובטור במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
    1. ברגע שהתאים לנתק, לשטוף את התאים עם 10 מ"ל חימם השלימו טרי DMEM. מעבירים את ההשעיה לתא צינור צנטריפוגות 15 מ"ל סטרילי ב 491 XG במשך 5 דקות ב RT. בזהירות לשאוב ולהיפטר supernatant.
  3. Resuspend התא גלול ב 5 מיליליטר של DMEM בתוספת הטריה. בצע ספירת תאים כדי לקבוע את הצפיפות הנכונה זרע התאים 96-גם צלחות.
    1. לדלל 100 μl של ההשעיה תא 900 μl בופר פוספט של 1x Dulbecco (DPBS). מניח חיישן 60 מיקרומטר חדש על דלפק התא האוטומטי. החזק את הבוכנה ואת להטביע את חיישן השעית התא המדולל. לאט לשחרר את הבוכנה על דלפק התא. הסר את החיישן מן cou התאnter כאשר הושלם.
      הערה: ספירת תאי יוצג על הדלפק של תאים תאים / מ"ל.
  4. תאי זרע בווליום סופי של 100 μl (ב DMEM) בצלחת 96-היטב confluency ~ 20% כדי לאפשר מקום צמיחת תאים ומדידה של התפשטות על פני 3-5 ימים (ראה טבלה 1). זרעים כל שורות תאים בשלושה עותקים.
    הערה: לצורך ניסוי זה, שלוש צפיפויות תאים שונות הוערכו כדי לקבוע את צפיפות התא האופטימלית. המספרים התא נדרש מסוכמים בטבלה 1. תאי זרע בצפיפות נמוכה אם המדידה של צמיחה לטווח ארוך יותר נדרש.
    1. עבור hemocytometer מבחני מבוססי הארה, להכין צלחת אחת לכל נקודת זמן (כלומר 4 צלחות לכל assay). עבור assay תרמי התא, להכין רק צלחת אחת למשך הניסוי.
  5. לשמור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 למשך 24 שעות.

2. תא קביעת סופרים אותנוing hemocytometer

  1. טרום חם הוא בינוני טריפסין עד 37 מעלות צלזיוס חממת תרבית תאים, תנור או באמבט מים. לשאוב מדיה מתאי לתוך מיכל פסולת, לשטוף פעם אחת עם 30 μl של טריפסין 2x, לשאוב טריפסין.
  2. שטפו תאים שוב עם 30 μl של טריפסין 2x, דגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לטפוח בעדינות קץ הצלחת כדי לסלק תאים מן הצלחת. הוסף 50 μl של DMEM בתוספת ומערבבים התאים על ידי pipetting עד שהתאים ליצור ההשעיה תא בודד.
  3. כן hemocytometer על ידי ניקוי פני שטח מכסה זכוכית עם 70% אתנול.
  4. מניח את המכסה להחליק זכוכית מעל התאי לספור להדביק עד 'הטבעות השבירות של ניוטון' ניתן לראות בין קצות כיסוי החלקים ואת hemocytometer.
    הערה: אלו מעידים כי החלקת הכיסוי דבקה כהלכה hemocytometer.
  5. בעדינות פיפטה 20 μl של השעית תא בחסות החלקה, מילוי תא הספירה לפי תנועה נימי.מניחים hemocytometer בהגדלה 10x של מיקרוסקופ ולדמיין לתאי הספירה של פריסת רשת.
  6. ספירת תאים ב 4 הריבועים החיצוניים של פריסת הרשת. כדי לשפר את דיוק, ספירות חוזרות של ריבועים חיצוניים נוספים במידת הצורך, או עד לספור יש הגיעו לגיל 70 - 100 תאים 14,15.
    1. חישוב ריכוז התאים לכל מ"ל כדלקמן: ספירת תאי ממוצע גורם לדילול x מרובע (אם משתמשים בו) x 10 4
  7. חזור על שלבי 2.1-2.8 כל 24 שעות למשך 96 שעות שלאחר זריעה.

3. קביעת התפשטות תאים באמצעות Assay הארה מבוססת

הערה: זוהי מדידת סיום. לאחר המגיב מתווסף התאים, הצלחת ניתן לכמת רק פעם אחת.

  1. מגיב הארת הפשרה באמבט מי C ° 22 למשך 30 דקות.
  2. לערבב בעדינות מגיב על ידי היפוך הבקבוק להשיג תערובת הומוגנית.
  3. לאזן צלחת אחת של תאים שנזרעו (משלב1.5) בשעה RT למשך 30 דקות.
  4. הוספת 100 μl של מגיב הארה היטב כל אחד. מערבבי תוכן על שייקר מסלולית במשך 2 דקות. אפשר צלחת כדי לדגור במשך 10 דקות ב RT.
  5. הגדרת ניסוי הארה באמצעות תוכנת קורא צלחת מצב מרובה.
    1. הפעל קורא צלחת מצב מרובה ולפתוח את התוכנה. ב 'מנהל המשימות', בחר 'ניסויים' ו 'ליצור new'.Select' קובץ 'מסרגל הכלים בצד, ותחת' פרוטוקול 'כרטיסייה, בחר' נוהל ".
    2. בחירה 'גרנייה 96 תחתית שטוחה' סוג הצלחת, וסמן את התיבה 'שימוש מכסה'. בחר פעולה "לקרוא" תחת תיבת "שיטה לקרוא '. 'הארה' בחר שיטת הזיהוי. לחץ על 'אישור'.
    3. בתיבת הדו הצעד לקרוא, בחר את הבארות לסריקה תחת הלשונית "הצלחת המלאה", ובחר בארות לפעול בארות ריקות כמו.
    4. הגדר את המסנן מוגדר מסנן ריק (למשל, תקע, Em: חור, ראי: ללא). קבע את הרווח כדי135, עם זמן אינטגרציה של 0.5 שניות לעמוד היטב לגובה לקרוא של 6.5 מ"מ. לחץ על 'אישור' כדי לשמור את ההגדרות על לקרוא הארה.
  6. ביצוע קריאת פלורסנט
    1. הוצא בעל צלחת על ידי בחירת הכרטיסייה 'מכשיר בקרה' ולחץ על 'צלחת out'.Place צלחת 96-היטב על בעל צלחת, הבטחת המכסה על. סגור את מחזיק צלחת על ידי לחיצה על "הצלחת" הכרטיסייה תחת "מכשיר הבקרה '. לחץ על "לקרוא עכשיו 'מסרגל הכלים לבצע קריאה זורחת.
    2. לייצא יחידת זורח יחסית (RLU) מדידות עבור כל טוב לגיליון אלקטרוני לניתוח נוסף.
  7. חזור על שלבי 3.1-3.6 להקליט התפשטות כל 24 שעות עד 96 שעות לאחר זריעת תאים.

4. קביעת ספירת תאים באמצעות Imager נייד

  1. הגדרת ניסוי הדמיה תא באמצעות תוכנת תרמי התא מצב מרובה
    1. הפעל תרמי תא רב-מצבים ה הפתוחהתוכנת דואר.
    2. ב 'מנהל המשימות', בחר בכרטיסייה 'הניסויים' ו 'ליצור new'.On את' 'בסרגל הכלים, לחץ על' קובץ 'כרטיסייה ופתוח' פרוטוקול נוהל "פעולת טמפרטורת הסט 'tab.Select'. גדר חממה 'על' ולהגדיר טמפרטורה ל 37 מעלות צלזיוס, לבדוק 'מחממים' לפני שתמשיך עם תיבה 'לשלב הבא. לחץ על 'אישור' כדי לשמור את ההגדרות.
    3. בחר פעולה "לקרוא". הקישו על שיטת הזיהוי 'תמונה', בחר 'קצה / התנועתיות" לקרוא סוג וסוג אופטיקה' מסננים '. לחץ על 'OK'.Click ב'כרטיסיית מלאת צלחת' ובחר בארות על הצלחת להיות צלמו. לחץ על 'אישור' כדי לשמור את ההגדרות.
    4. בחר את המטרה פי 2.5 מן הנפתחת אפשרויות 'מטרות'. תחת לשונית 'הערוצים', בחר בשני ערוצים: GFP 469, 525 ו מואר שדה. בדוק חשיפה 'אוטומטית' עבור שני הערוצים ובחר את-החשיפה אוטומטית גם.
    5. כדי לקבוע AUTo הגדרות פוקוס, בחרו 'פוקוס אוטומטי' ולחצו על 'אפשרויות'. עבור אפשרויות פוקוס אוטומטי, בחר בשיטת 'לסרוק ולאחר מכן פוקוס אוטומטי'. לחץ על 'אישור' כדי לשמור את ההגדרות.
    6. הגדר את אופקי ואנכי לקזז ממרכז היטב (מיקרומטר) כדי 0.Select לסרוק מספר רב של תמונות לכל היטב מונטאז 3 x 2, עם מרווח אופקי (מיקרומטר) = 2881 ואת המרווח האנכי (מיקרומטר) = 2,127. לחץ על 'אישור' כדי לשמור את הגדרות הליך.
      הערה: ראה טבלה 2 עבור פרמטרים לקריאה.
  2. ביצוע ניסוי המשך לקרוא פלייט נבחר
    1. לחץ על כרטיסיית 'בקרת מכשיר' ובחר את הצלחת 'צלחת החוצה' function.Place 96-היטב בעל צלחת, הבטחת המכסה על. בכרטיסייה 'בקרת מכשיר', בחר 'הצלחת' פונקציה. בחר "לקרוא עכשיו 'חוצץ צלחת. חזור לקרוא כל 24 שעות עד 96 שעות שלאחר זריעה.
  3. ניתוח של ספירת כדוריות שימושCell Imager תוכנה.
    1. כדי לנתח תמונה, לחץ על הכרטיסייה 'הנתונים' על הצלחת ההדמיה, בחר 'תמונה [GFP 469, 525 + מואר שדה]'. לחץ לחיצה כפולה על צלם גם.
    2. לחץ על תמונה טעונה. בחירה 'לנתח' ובחר תמונה אחת של מונטאז להיות מנותחת. לחץ על 'OK'.Check את' GFP 'הערוץ היחיד, ופרמטרים להגדיר כפי שמתואר בטבלה 3. לחץ על' START 'ליישם פרמטרים לתאי הדמיה.
    3. שים את המסכה ספירת תאים ממוקם מעל התאים צילמו, אשר משמש כדי לקבוע את ספירת התאים לכל תמונה. לחץ על "החל שינויים" ולשמור הגדרות אלה עבור כל צלחת צילמו לאורך הניסוי.
    4. לאחר חזרה לעבר הצלחת הדמיה, לחץ על התפריט 'נתונים' הנפתח ובחר "ספירת תאי '. זה יפיק את ספירת תאים הכוללת לכל טוב.
    5. לייצא את כל הנתונים לגיליון אלקטרוני על ידי לחיצה על הכרטיסייה 'יצוא' עבור o ניתוח נוסףf ספירת תאים לכל טוב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי ללמוד שיטות שונות למדידת ההתפשטות של תאים בתרבית, התפשטות התאים של MCF-7-Δ40p53 transduced תאים הושווה MCF-7-לגו הלא transduced שורת תאי סרטן השד. השלוש השיטות שהושוו - את assay ההארה הקונבנציונלית hemocytometer שיטה, תא כדאיות, והדמית תא אנליזה מתוארת בתרשים סכמטי (איור 1). יש לכל שיטה יתרונות וחסרונות למדוד ספירת תאים במדויק לאורך זמן, ואת השיטה היעילה ביותר תלוי בדרישות הסיום של הניסוי והמידע שניתן לרכוש עבור אוכלוסיית תאים.

הצמיחה של MCF-7-לגו MCF-7- תאים Δ40p53 נמדדו לאחר 24 שעות במשך 4 ימים. כפי שניתן לראות בתרשים 1, שתי שורות התאים היו זורעות בשלוש צפיפויות תאים שונות (1.5 x 10 3 3; 5 x 10 3 תאים / טוב) ותא ספירה בוצעו 24, 48, 72 ו -96 שעות לאחר זריעה. לכל שיטה הפגינה התפשטות תא מוגברת, באמצעות hemocytometer, assay מבוסס הארה, וכן תרמי תא (2a הדמוי, B ו- C, בהתאמה) מעל 96 שעות. העלייה הגבוהה ביותר התפשטות תאים נתפסה על צפיפות התאים הגבוה ביותר (5 x 10 3 תאים), וכן הראו תוצאות לשחזור ביותר בכל נקודת זמן, דבר המצביע על זה להיות צפיפות התאים האופטימלי עבור מדידת התפשטות בתאים אלה. לא נמצא הבדל משמעותי התפשטות תאים בין שורות תאים.

מדידת התפשטות תאים בין השיטות השונות הושוותה על ידי ניתוח רגרסיה ליניארית 6 (איור 3; טבלה 4). חוקרים מצא קורלציה משמעותית בין כל אחת מהשיטות השונות שנבדקו, כאשר משווים גell התפשטות הכלל של צפיפות התא בשתי שורות התאים (איור 3 א 'וב'). המתאם החזק נצפה בין ההשוואה של assay מבוסס ההארה, ואת תרמי התא (R 2 = 0.8899, p ≤0.0001; R 2 = 0.9805, p ≤0.0001, איור 3 א 'וב', בהתאמה).

ייצוג חזותי של התפשטות תאים באמצעות תרמי התא מוצג (איור 4). כמו שיטה זו משתמשת מדידות מתמשכות של צלחת אחת, התאים ניתן צלמו כל 24 שעות עד שהתאים להגיע קרוב ל 100% מפגש. כפי שניתן לראות בתרשים 2, שיעורי הצמיחה של תאי MCF-7-לגו MCF-7-Δ40p53 היו דומים בכל נקודות הזמן. שיטה זו מספקת מידע שימושי הסלולר, כולל היכולת לפקח צמיחת תאים חזותי על פני מספר ימים, ולהשוות גודל תא מורפו התאמשעמם בין שורות תאים שונות.

איור 1
איור 1: תרשים סכמטי של שלוש שיטות שונות מדידת התפשטות תאים תאים היו זורעים שלוש צפיפויות תאים שונים לתוך 96-גם הצלחות מרובות וטופחו על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 עד 96 שעות.. כל 24 שעות, התפשטות תאים נמדדה על ידי אחד באמצעות hemocytometer, הדמית assay או מבוסס תאי הארה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2:. מדידות התפשטות תאים לאחר 96 שעות ספירת תאים נמדדו כל 24 שעות למשך 96 שעות ב MCF-7-רגלO ו MCF-7-Δ40p53 תאים זורעים שלוש צפיפויות תאים שונים. ספירת תאים נמדדו באמצעות (א) hemocytometer בתאים / מיליליטר, (ב) באמצעות assay מבוסס הארה ביחידות זורחות יחסית (RLU), או (ג) ספירת תאים רציפה באמצעות תרמי של תאי תאים / תמונה. תנאים עבור תרמי התא מוצגים בלוח 2. כל הניסויים מייצגים את הממוצע של שלושה ניסויים בלתי תלויים, ± הס"ד אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3:. השוואה של שלוש שיטות שונות מדידת התפשטות תאים בשורות תאי סרטן שד ניתוח רגרסיה ליניארית בוצע להשוות את היחסים הגומלים בין מ 'השונה ethods בחן למדידת תא התפשטות ב (א) MCF-7-לגו תאים (ב) תאי MCF-7-Δ40p53. מקדם המתאם של פירסון חושב ואת המשמעות נקבעה (p <0.05) בין השיטות השונות למדידת התפשטות תאים. כל התוצאות מייצגות את ממוצע ± הס"ד של שלושה ניסויים בלתי תלויים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4:. תמונות של תאי סרטן השד GFP חיובי MCF-7-לגו MCF-7-Δ40p53 נציג תמונות של התאים מפני 5 x 10 3 תאים שנזרעו שנתפסו באמצעות תרמי תא כל 24 שעות. סרגל הסולם מייצג 1,000 מיקרומטר. פרמטרים הדמיה תא מסוכמים בטבלה 2. יעד href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54350/54350fig4large.jpg" = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

צפיפות התאים (תאי / טוב)
סוג תא 1.5 x 10 3 3.0 x 10 3 5 x 10 3
MCF-7-לגו 76 μl ב 8.4 מ"ל התקשורת 152 μl ב 8.3 מ"ל התקשורת 254 μl ב 8.2 מ"ל התקשורת
MCF-7-Δ40p53 93 μl ב 8.4 מ"ל התקשורת 185 μl ב 8.3 מ"ל התקשורת 308 μl ב 8.2 מ"ל התקשורת

טבלה 1: כרכים זריעת תאים עבור 96 צלחות היטב.

"FO: keep-עם-next.within-page =" תמיד "> קראו פרמטרים סוג פלייט 96 גם מצב תמונה מַטָרָה פי 2.5 צֶבַע GFP (469, 525), באופן מואר חשיפה אוטו מוֹקֵד אוטומטי (סריקה ואז פוקוס אוטומטי)

טבלה 2: פרמטרים קראו הדמית תא באמצעות Imager Cell.

טבלה 3: פרמטרי הדמיה לניתוח תא ספירה.

פרמטרי הדמיה
סף 5000
גודל האובייקט המינימלי (מיקרומטר) 30
גודל מקסימאלי של אובייקט (מיקרומטר) 300
MCF-7-לגו
מרובע R p-value
Hemocytometer לעומת assay מבוסס הארה .6301 .0021
תא תרמי לעומת hemocytometer .7524 0.0003
Assay מבוסס הארה לעומת תרמי תא .8899 <0.0001
MCF-7-Δ40p53
מרובע R p-value
Hemocytometer לעומת luassay מבוסס minescence .8983 <0.0001
תא תרמי לעומת hemocytometer .9303 <0.0001
Assay מבוסס הארה לעומת תרמי תא .9805 <0.0001

לוח 4: ניתוח רגרסיה לינארית של שלוש שיטות הפצת הנשק השונות שנבדקו.

שִׁיטָה יתרונות חסרונות הערות טכניות פלט סופי
hemocytometer עלות נמוכה טעות אנושה גבוהה פיפטה מספר פעמים להכין השעית תא בודדת תאים / מ"ל
דורש ציוד מינימלי דורש השעית תא יחיד בצע ספירה מרובה כדי להשיג דיוק
ספירת תאים ישירה מספר גבוה של תאי דרושי הערכה מדויקת של ספירת תאים
Endpoint
Assay הארה מבוססת השתמש עם פורמטי multiwell צלחת ריאגנטים יקרים להגן מפני אור יחידות פלורסנט יחסית (RLU) / טוב
קל לבצע דורש קורא צלחת זורח כלול בארות שליטה לקבוע הארת רקע
assay המהיר טמפרטורה רגישה
מספק מידע כדאי תא משתנה בהתאם לפעילות המטבולית של תאי
מדידה עקיפה
Endpoint
תרמי נייד מדידה רציפה תרמי יקר ודא תרמי תא מוגדר 37 ° C תאים / תמונה
בקרת טמפרטורה מיומנות אינטנסיבית הימנע טלטול או הפרעה מיותרת של תאים
מספק מידע הסלולר משתנה תלוי מפגש של תאים
חסכוני (אם יש לך את תרמי) ספירה יחסית
מדידה ישירה
הדמיה אוטומטית של פורמט multiwell צלחת

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בפרוטוקול זה בשלוש שיטות שונות של מדידת התפשטות תאים בתאים בתרבית נבדקו. לכל שיטה הייתה מסוגלת מדידות לשחזור המדויקות של התפשטות תאים מעל 96 שעות, והתוצאות היו דומות בין כל אחת מהשיטות שנבדקו (איור 2 ו -3). הן assay ושיטת הדמית תא מבוסס ההארה הפיקו את התוצאות החזקות ביותר, מראים מגדילה ליניארי התפשטות תאים לאחר 96 שעות (איור 2b, ג). בנוסף, הדמיה תא לאורך זמן מתואר הבדל משמעותי בשיעורי הצמיחה בין transduced שורות תאים שאינם transduced (איור 4).

ישנם יתרונות רבים וחסרונות לכל שיטה בחן בפרוטוקול זה, ראו טבלה 5 עבור סיכום. שיטת ספירת תאים הקונבנציונלית באמצעות hemocytometer היא שיטה בעלות נמוכה הדורשת ריאגנטים נוסף קטן מאוד או effort להכין ולהפעיל. יתר על כן, שיטה זו quantitates ספירה מוחלטת לתא בתאים / מ"ל 14. עם זאת, ישנם חסרונות רציניים, אשר כוללים את הזמן רב הטבע של ספירת התאים, שיעורי שגיאה גבוהים שתוצאתו סטיות תקן גדולות בין הספירה, והעובדה כי בטווח גבוה של מספרים סלולריים נחוץ ספירת תאי מדויקת. ניתן לראות זאת באיור 2a, שבו ספירת תאים באמצעות hemocytometer הראה תוצאות משתנות על צפיפות התא נמוכה, וסטיות תקן גדולה בנקודות זמן מה לאחר מכן. חסרונות אלה הופכים שיטה זו שימושית עבור ספירת תאים בגדלי מדגם קטנים, ולוקה בחסר למדידות קצב העברת נתונים גבוהים גדולות שבו גדלה ודחיסויות זריעה בצלחת קטנות נדרשות. מגבלות אלה שניתנות להתגבר אם צפיפות התאים הוגדלה, כגון כי המספר המזערי של תאי נספר החל סף של יותר מ -100 תאים. ככל מדולל השעית התא, או להקטין את התא דensity, הסיכוי הגדול יותר של ספירה פחות מ -100 תאים ולכן הגדלת ההשתנות בין משכפל 15. עם זאת, שיטה זו אינה מתאימה צלחת 96 היטב, עקב שטח פן התא הנמוך, ולכן, המספר המספיק של תאים שיכולים לשמש בניתוח. זה מדגיש את חוסר יכולות העברת נתונים גבוהות של השיטה הזאת ואת נחיתות ברורה עבור משתמשים זקוקים יכולת זו.

את assay מבוססי הארה קובע כדאיות התא על ידי מדידת כמות ATP, המהווה מדד של נוכחות של תאים פעילים מבחינה מטבולית 16. assay זה מיועד להקרנה תפוקה גבוהה של דגימות מרובות במתכונת צלחת 96 היטב כדי לקבוע התפשטות תאים. זו שיטה פשוטה quantitates תא התפשטות כיחידה הארה יחסית (RLU) באמצעות קורא צלחת, אשר עומד ביחס להווה ATP בתאים פעילים מבחינה מטבולית. עם זאת, החיסרון העיקרי של שיטה זו הוא tהוא לעלות של המגיב, ואת התלות של המדידה על הפעילות המטבולית של התאים. תנאי תרבית תאים שונים, כגון מועדים לפי שעון טמפרטורה או תא מחזור, יכולים להשפיע על כמות ATP בקלות המיוצר על ידי התאים, אשר עומד ביחס ישר האות הזורח שנוצר על ידי assay 17. לכן, חשוב לקבוע באופן אמפירי כי תנאי הניסוי לא להפריע את הפעילות המטבולית של התאים ואפשרות לעכב את האות הזורח היחסי שנוצר על ידי התאים.

השיטה השלישית בחנה לקביעת התפשטות תאים הייתה תרמי תא חי ותוכנה לבצע ספירת תאים יחסית. משקפי התא יש יכולות תפוקה גבוהה כפי שהוא יכול להיות אוטומטי ללכוד תמונות מרובות עבור כל טוב, בזמן האמת יחד עם בקרת טמפרטורה, תוך שימוש באותה תאים על פני המשך של assay. כפי שניתן לראות בתרשים 4, התפשטות תאים יכול להיות מonitored באותה הצלחת מעל כמובן זמן, אשר יכול לספק מידע נוסף על אוכלוסיית התאים יחד עם ניתוח ספירת תאים. זהו יתרון מאוד כפי שהוא מבטל השתנות צולבת צלחת ותא שגיאת זריעה, וזה דבר שבשגרה 96 פורמטים הצלחת היטב. התוכנה המלווה את תרמי התא מאפשרת לכמת את ספירת תאים באמצעות הפרמטרים מפורטים בטבלה 2 ו -3. לכן הוא יעיל בסביבת תפוקה גבוהה והוא יכול להיות מרובב בקלות מבחני אחרים למדוד תפקודים תאיים כגון אפופטוזיס או רעיל. החיסרון העיקרי של המערכת הוא תוכנה, אשר מוגבלת ביכולתה לפצל חפצים נוגע ללב. למרות שזה יכול למלא את התפקיד הזה בתאי מפגש נמוכים, הוא מגבלה עיקרית של assay ולכן דורש אופטימיזציה ספציפית תאים מסוג. כמו כן, בעוד ניסויים בודדים באמצעות תרמי הם עלות נמוכה מאוד בסולם צלחת אחר צלחת, שיטה זו לא עלly להיות חסכוני אם המכשיר מוגדר כבר במעבדה. לכן, זה מספק שיטה חדשה למדידת תא התפשטות של תאים בתרבית, ויש לו את היתרון העיקרי של אין צורך ריאגנטים נוספים, והוא מסוגל 96 ספירה גם צלחת אוטומטית, מה שהופך שיטה זו מתאימה לניתוח תפוקה גבוהה. זהו שיפור משמעותי על שיטת ספירת תאים הקונבנציונלית hemocytometer, ומהווה אפשרות יעילה יותר עלות assay מבוסס ההארה.

השלב הקריטי בעת שימוש תרמי התא הוא במהלך הניתוח של תמונות שנתפסו וספירת כדוריות עוקבת לכל תמונה. תמונות אלה יכולים להיות מעובד באמצעות מספר פלטפורמות הדמית תא. לכן חשיבות עליונה כדי לקבוע את התוכנה המתאימה ביותר לסוג התא תחת חקירה. זה יהיה שימושי כדי לאמת את ספירת תאים מהתמונות נרכשו על ידי תרמי התא באמצעות תוכנת הדמיה שונה. פרוטוקול זה יכול להיות מוחל עלתאים בתרבית y, אולם פרמטרי הניתוח יצטרכו להיות מוגדרים עבור כל קו תא. זה יכול להיות זמן רב בהתחלה, אבל ברגע הפרמטרים הוגדרו, השיטה יכולה להיות אוטומטית צלחות כולו תמונה בכל פעם.

חשוב לציין כי מבחנים אלה הם למעשה אמצעי עקיף של התפשטות, כפי שהוא למדוד מספר סלולארי (hemocytometer, תרמי תא), או פעילות מטבולית (assay מבוסס הארה), על פני תקופה של זמן. ניתן שיטות אלה מתוקנים בקלות למדוד גורמים חשובים אחרים שיכול משפיעים על שגשוג. לדוגמא, שיטת ההרחקה הכחולה trypan ניתן לשלב בקלות לתוך לשיטת hemocytometer או תא תרמי להוציא תאים מתים ומכאן לקבוע תא כדאיות 13. את assay מבוסס ההארה יכול להיות מרובב עם assay cytotoxicity כדי לספק מידע נוסף על בריאות תא, ואת הפעילות המטבולית שנמדדה במהלך assay זה גם מדידה של התא viability 12. לכן, את הגמישות של מבחנים אלה כדי להיות מרובב עם מבחנים אחרים כדי לספק מידע סלולארי נוסף היא יתרון חזק של כל אחת משיטות אלו.

פרוטוקול זה משמש קו תאים אנושיים של סרטן השד MCF-7 אשר כבר transduced ביציבות עם הגן לגו-iG2-פורו + וקטור המכיל את ה- GFP. זה מאפשר שימוש במסנן אופטיקה GFP לתדמית התאים, ללא צורך להוסיף כל סוכני צבע לתוך המדיום לתרבות. שיטה זו יכולה בקלות להיות שונה תאי GFP שלילי תמונה או אפילו שורות תאים ראשוניות, בין אם על ידי הדמית התאים באמצעות סוג אופטיקה בשדה הבהיר, או על ידי סימון התאים עם סמן התפשטות. השיטות לעומת בפרוטוקול זה הן חזקות מספיק כדי לשמש במגוון רחב של שורות תאים שונות, אולם הגדרות הפרוטוקול האופטימלי עבור כל קו תאים בודד צריכות להיקבע ראשונה. הדמיה של תאים באמצעות ערוץ השדה הבהיר מייצגת את האפשרות הטובה ביותר עבור ce העיקריLLS או כאלה שמכילים הרבה גדל לאט, בשל האופי ארוך הטווח של שיטה זו. מבחני נקודות קצה, כגון assay מבוסס ההארה, אינם מתאימים היטב לניתוח צמיחת תאים לטווח ארוך.

פרוטוקול זה תאר שלוש שיטות שונות למדידת התפשטות תאים במבחנה. לכל שיטה ניתן לבצע באופן שגרתי במעבדה למדוד צמיחת תאים, ורוב המעבדות תירשנה את הכישורים הדרושים כדי לבצע באחת השיטות הבאות. עם זאת, ישנם גם מגוון של מבחני אחרים הזמינים למדידת תאים מתחלקים. אלו יכולים לכלול שיטות המודדות סינתזה של DNA, פעילות מטבולית, אנטיגנים הקשורים מהפצה או ATP ריכוז 9. לדוגמא, מספר המבחנים פותח כדי למדוד את קצב סינתזת ה- DNA של תאים על ידי תיוג תאים עם חומר רדיואקטיבי כגון thymidine 3H. החיסרון של שיטה זו הוא השימוש הברור של חומרים רדיואקטיביים, וכן לרשותם. אַחֵרשיטות אשר משמשים באופן שגרתי למדידת התפשטות תאים לכלול את השימוש של תיוג BrdU של DNA שהוקמה זה עתה, אשר ניתן למדוד באמצעות זרימת cytometry 18. Cytometry זרימה ניתן להשתמש כדי לנתח הן את מספר הנייד וכן מידע מחזור התא. זה עשוי להיות תוצאת יתרון לניסויים מסוימים, אולם החסרונות של שיטה זו כוללים את הזמן נוסף וצעדים, ריאגנטים יקרים ומיומנויות מאומן משתמש מוגברות על מנת להפעיל את זרימת cytometer ולנתח את הנתונים המתקבלים 18. לכן, יש מבחנים שונים זמינים למדענים להעריך את הצמיחה של תאים, ואת השיטה שנבחרה תלויה במידה רבה בסוג התא בשימוש, משתמש ורמת המיומנות שלהם, ואת סוג הנתונים הנדרשים על נקודת הסיום של הניסוי.

לסיכום, שלוש שיטות שונות למדוד התפשטות תאים הושוו באמצעות תאי סרטן השד. יש לכל שיטה יתרונות רבים disadvantages, ולכן הוא תלוי משתמש מבוסס על הדרישות שלהם עבור כל ניסוי, מבחינת קביעת assay המתאים ביותר לבצע ספירת תאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red ThermoFisher Scientific 21063-045 Supplemented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 µg/ml insulin and 1 µg/ml puromycin
L-glutamine solution (100x) ThermoFisher Scientific 25030-081
Insulin solution human Sigma-Aldrich I9278-5ML
Fetal bovine serum (FBS) Bovogen Biologicals SFBS-F-500ml
Puromycin dihydrochloride Sigma-Aldrich P9620-10ML
0.5% trypsin-EDTA solution (10x) ThermoFisher Scientific 15400-054 Dilute to 2x in DPBS
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x) ThermoFisher Scientific 30028-02
Tissue culture flask, 75 cm2 growth area Greiner Bio-One 658175
Scepter 2.0 Cell Counter Merck Millipore Automated cell counter
96 well multiwell plate, flat bottom Nunc 167008
Improved Neubauer Hemocytometer BOECO Germany BOE 01
Olympus IX51 inverted microscope Olympus IX51
CellTiter-Glo 2.0 Assay Promega G9242 Luminescence-based assay
Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader BioTek Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging
Gen5 Data Analysis Software BioTek GEN5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lane, D. P. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 358, (6381), 15-16 (1992).
  2. Olivier, M., Hollstein, M., Hainaut, P. TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (1), a001008 (2010).
  3. Olivier, M., et al. The clinical value of somatic TP53 gene mutations in 1,794 patients with breast cancer. Clin Cancer Res. 12, (4), 1157-1167 (2006).
  4. Bourdon, J. C., et al. p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity. Genes Dev. 19, (18), 2122-2137 (2005).
  5. Avery-Kiejda, K. A., et al. Small molecular weight variants of p53 are expressed in human melanoma cells and are induced by the DNA-damaging agent cisplatin. Clin Cancer Res. 14, (6), 1659-1668 (2008).
  6. Avery-Kiejda, K. A., Morten, B., Wong-Brown, M. W., Mathe, A., Scott, R. J. The relative mRNA expression of p53 isoforms in breast cancer is associated with clinical features and outcome. Carcinogenesis. 35, (3), 586-596 (2014).
  7. Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral "gene ontology" (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16, (4), 698-706 (2008).
  8. Riss, T. L., Moravec, R. A. Cell Biology. Celis, J. E. Third Edition, Academic Press. 25-31 (2006).
  9. Ng, K. W., Leong, D. T., Hutmacher, D. W. The challenge to measure cell proliferation in two and three dimensions. Tissue Eng. 11, (1-2), 182-191 (2005).
  10. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev Technol. 2, (1), 51-62 (2004).
  11. Butzler, M., Worzella, T., Hungriano, M., Osorio, F., Hanegraaff, I., Cowan, C. Automated cytotoxicity profiling using the CyBi-FeliX instrument, cell health assays and thaw-and-use cells. http://au.promega.com/resources/pubhub/automated-profiling-using-the-cybi-felix-instrument-cell-health-assays-and-thaw-and-use-cells (2014).
  12. CellTiter-Glo 2.0 Assay Technical Manual #403. http://www.promega.com/~/media/files/resources/protocols/technical%20manuals/101/celltiterglo%202%200%20assay%20protocol.pdf (2015).
  13. Banks, P., Brescia, P. J. Application Guide: Automated Digital Microscopy. http://www.biotek.com/resources/articles/automated-digital-microscopy.html (2015).
  14. Bastidas, O. Cell Counting with Neubauer Chamber: Basic Hemocytometer Usage. http://www.celeromics.com/en/resources/Technical%20Notes/cell-article-chamber.php (2016).
  15. Bastidas, O. Technical Note: Cell Count for Low Concentration Samples . http://www.celeromics.com/en/resources/docs/Articles/Low-concentration-cell-counting.pdf (2012).
  16. Riss, T. L., Moravec, R., Niles, A. L., et al. Cell Viability Assays. Assay Guidance Manual[Internet]. Sittampalam, G. S., Coussens, N. P., Nelson, H., et al. (2013 May 1 [Updated 2015 Jun 29]) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065/ (2013).
  17. Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research. J Cell Mol Med. 14, (4), 1003-1013 (2010).
  18. Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. (2013 May 1 [Updated 2015 Jun 29]) https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSVerse_CellCycleAnalysis_AppNote.pdf 1-12 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics