स्तन कैंसर कोशिका लाइनों में सेल प्रसार निर्धारण के लिए तीन अलग अलग तरीकों की तुलना

Biology

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Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. J. Vis. Exp. (115), e54350, doi:10.3791/54350 (2016).

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Abstract

Introduction

ट्यूमर शमन जीन, P53, सेल चक्र गिरफ्तारी, apoptosis और वार्धक्य 1 सहित सेलुलर प्रक्रियाओं के एक नंबर का एक आवश्यक नियामक है। यह जीनोमिक स्थिरता को बनाए रखने के लिए जिम्मेदार है, और इसलिए कोशिका मृत्यु और सेल के विकास के संतुलन को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। P53 उत्परिवर्तनों में कैंसर में आम हैं और अनियंत्रित कैंसर सेल प्रसार 2 के लिए अग्रणी P53 निष्क्रियता का प्रमुख कारण हैं। दिलचस्प है, p53 में म्यूटेशन केवल स्तन कैंसर 3 के लगभग 25% के लिए खाते, सुझाव है कि अन्य तंत्र P53 समारोह के नुकसान के लिए जिम्मेदार हैं। हाल ही में पता चला P53 isoforms मानव कैंसर की संख्या में overexpressed होना दिखाया गया है, और p53 समारोह 4,5 मिलाना कर सकते हैं। हम पहले से पता चला है कि P53 isoform, Δ40p53, सबसे उच्च व्यक्त स्तन कैंसर में isoform है, और काफी, स्तन कैंसर की कोशिकाओं में upregulated है जब सामान्य आसन्न Tiss की तुलनाUE 6। इस के बाद, हम स्थिरतापूर्वक लेगो-IG2-Puro + वेक्टर (GFP +) 7 का उपयोग कर Δ40p53 overexpress करने के लिए मानव स्तन कैंसर कोशिका लाइन MCF 7 transduced। इन कोशिकाओं को उच्च Δ40p53 अभिव्यक्ति स्तन कैंसर की कोशिकाओं में सेल प्रसार दर बढ़ जाती है, तो जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया।

वहाँ इन विट्रो 8,9 में संवर्धित कोशिकाओं के सेल प्रसार को मापने के कई प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष तरीके हैं। ये या तो समय के साथ निरंतर माप, या के रूप में समापन बिंदु assays 10 के रूप में किया जा सकता है। पारंपरिक तरीकों जैसे एक hemocytometer का उपयोग सेल गिनती के रूप में उपयोगी अभी भी कर रहे हैं। इस परख एक कम लागत और सेल नंबर का सीधा उपाय है, लेकिन यह मायने रखता से त्रुटि और बड़े मानक विचलन को कम से कम करने के लिए बड़े सेल मायने रखता है और अत्यधिक कुशल प्रशिक्षण पर भरोसा करता है। उच्च throughput स्वरूपों के साथ संगत माप प्रदर्शन करने की जरूरत multiwell प्लेट assays के विकास के लिए प्रेरित किया है। ये luminescence आधारित assays measuएक luminescent संकेत है कि सेल 11,12 की चयापचय क्रिया के लिए आनुपातिक है के आधार पर सेल नंबर रहे हैं। अभी हाल ही में उच्च सामग्री इमेजिंग प्लेटफार्मों की शुरूआत नए उपकरण है जो सेल प्रसार की निगरानी, ​​जबकि मात्रात्मक और गुणात्मक प्ररूपी डाटा संग्रह प्रदान करने के लिए अनुमति दी, और प्रणालियों 13 साल की एक किस्म भी शामिल किया गया है। इन तरीकों के सभी सेल के विकास को मापने के लिए अवसर प्रदान, या तो निरंतर माप या समापन बिंदु assays के द्वारा, और प्रत्येक संवेदनशीलता के साथ संबंध है, नमूना संख्या के throughput, और सेल में जानकारी के साथ फायदे और नुकसान की एक सीमा है, जो सभी के आधार पर तदनुसार तौला जा सकता अधिकारी अनुसंधान के सवाल पर।

इस प्रोटोकॉल इन विट्रो में सेल प्रसार को मापने, प्रत्येक विधि संवेदनशीलता, reproducibility और बहु अच्छी तरह से थाली प्रारूपों के विभिन्न श्रेणियों के उपयोग के साथ के लिए तीन अलग-अलग तरीकों का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल एक hemocytometer गिनती चा के उपयोग की तुलना करने के उद्देश्य सेmber, एक luminescence आधारित सेल व्यवहार्यता परख, और सेल इमेजर, एक 96 घंटे के समय के पाठ्यक्रम पर सेल प्रसार की माप में। ऐसा करने के लिए, वेक्टर transduced कोशिकाओं (एमसीएफ-7-लेगो) के विकास Δ40p53 (एमसीएफ-7-Δ40p53) overexpress को transduced कोशिकाओं की तुलना में था, तीन अलग-अलग सेल घनत्व का उपयोग कर। सेल प्रसार अप करने के लिए 96 घंटे के लिए हर 24 घंटा मापा गया था। प्रत्येक विधि के अपने फायदे और नुकसान है पाया गया था, और प्रयोग के उद्देश्य पर निर्भर करता है, प्रत्येक अभी भी प्रसार की दर पर जानकारी प्रदान करने के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है।

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Protocol

1. प्रसार Assays के लिए तैयारी प्रकोष्ठों

नोट: एक ही प्रारूप में एक ही तरीके से और बीज में दो सेल लाइनों तैयार करने के लिए प्रत्येक विधि का विश्लेषण किया जाए।

  1. एमसीएफ-7-लेगो और एमसीएफ-7-Δ40p53 का उपयोग कर टी में 75-80% संगम 7 कोशिकाओं को विकसित 75 सेमी 2 टिशू कल्चर बोतल फिनोल लाल मुक्त Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक (एफबीएस) 200 मिमी एल glutamine, 2 माइक्रोग्राम / एमएल इंसुलिन और 5% सीओ 2 के साथ 1 ग्राम के 37 डिग्री सेल्सियस पर / एमएल puromycin। एक बाँझ जैव सुरक्षा कैबिनेट वर्ग द्वितीय में कोशिकाओं को संभाल लेना।
    नोट: समय की राशि के लिए यह संगम के लिए कोशिकाओं को विकसित करने के लिए लेता है बोने कमजोर पड़ने पर निर्भर करता है। प्रसार assays के लिए कोशिकाओं चढ़ाना के लिए तैयार करने में, एक 1 पर कोशिकाओं बीज: पूरक DMEM में 3 कमजोर पड़ने और जब तक 75-80% confluency 3 दिनों के लिए सामान्य विकास की स्थिति में बनाए रखने के।
  2. कुप्पी से कोशिकाओं को निकालने के लिए, मीडिया में टपकनाबर्बादी कंटेनर। इसके तत्काल बाद पूर्व गर्म 2x trypsin के 2 मिलीलीटर के साथ सेल परत धो लें। महाप्राण trypsin। सेल परत और जगह पर पूर्व गर्म trypsin के एक और 2 मिलीलीटर 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए एक मशीन में जोड़ें।
    1. एक बार जब कोशिकाओं को अलग, 10 मिलीलीटर ताजा पूरक गरम DMEM के साथ कोशिकाओं को धो लें। सेल निलंबन आरटी पर 5 मिनट के लिए 491 XG पर एक बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज के लिए स्थानांतरण। ध्यान aspirate और सतह पर तैरनेवाला के निपटान के।
  3. ताजा पूरक DMEM के 5 मिलीलीटर में सेल गोली Resuspend। 96 अच्छी तरह प्लेटें में कोशिकाओं को बीज के लिए सही घनत्व निर्धारित करने के लिए एक सेल गिनती प्रदर्शन।
    1. 900 μl 1x Dulbecco फास्फेट खारा बफर (DPBS) में सेल निलंबन के 100 μl पतला। स्वचालित सेल काउंटर पर एक नया 60 माइक्रोन सेंसर रखें। सवार को दबाए रखें और पतला सेल निलंबन में सेंसर डूब। धीरे-धीरे सेल काउंटर पर सवार जारी। सेल cou से सेंसर हटायेnter जब पूरा किया।
      नोट: सेल गिनती कोशिकाओं / एमएल में सेल काउंटर पर प्रदर्शित किया जाएगा।
  4. ~ 20% confluency एक 96 अच्छी तरह से थाली में 100 μl (DMEM में) के अंतिम मात्रा में बीज कोशिकाओं 3-5 दिन (1 टेबल देखें) पर सेल के विकास और प्रसार की माप के लिए कमरे की अनुमति है। तीन प्रतियों में सभी सेल लाइनों के बीज।
    नोट: इस प्रयोग के लिए, तीन अलग-अलग सेल घनत्व इष्टतम सेल घनत्व का निर्धारण करने के लिए मूल्यांकन किया गया। आवश्यक सेल नंबर एक कम घनत्व पर तालिका 1 में संक्षेप हैं। बीज कोशिकाओं अगर अधिक लंबी अवधि के विकास की माप की आवश्यकता है।
    1. Hemocytometer और luminescence आधारित assays के लिए, समय बिंदु प्रति एक प्लेट (यानी परख प्रति 4 प्लेट) तैयार करते हैं। सेल इमेजर परख के लिए, प्रयोग की अवधि के लिए केवल एक ही प्लेट तैयार करते हैं।
  5. 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस से 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को बनाए रखें।

2. निर्धारण सेल हमें गिनतीएक hemocytometer आईएनजी

  1. पूर्व गर्म दोनों एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में मध्यम और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए trypsin, ओवन या पानी से स्नान। बर्बादी कंटेनर में कोशिकाओं से महाप्राण मीडिया, 2x trypsin के 30 μl के साथ एक बार धोने, और trypsin aspirate।
  2. 2x trypsin के 30 μl के साथ फिर से कोशिकाओं को धो लें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं। धीरे थाली से कोशिकाओं को बेदखल करने के लिए थाली के किनारे नल। पूरक DMEM के 50 μl जोड़ें और pipetting द्वारा कोशिकाओं मिश्रण जब तक कोशिकाओं को एक एकल कक्ष निलंबन के रूप में।
  3. 70% इथेनॉल के साथ सतह और गिलास को कवर सफाई से hemocytometer तैयार करें।
  4. गिनती कक्षों पर कांच कवर पर्ची की जगह और प्रत्यय जब तक 'न्यूटन के अपवर्तन के छल्ले' कवर पर्ची किनारों और hemocytometer के बीच देखा जा सकता है।
    नोट: ये संकेत मिलता है कि कवर पर्ची सही ढंग से hemocytometer का पालन किया है।
  5. धीरे कवर पर्ची के तहत सेल निलंबन के 20 μl पिपेट, केशिका गति से मतगणना कक्ष भरने।एक खुर्दबीन के 10x बढ़ाई के तहत hemocytometer रखें और ग्रिड लेआउट में मतगणना कक्षों कल्पना।
  6. ग्रिड लेआउट के 4 बाहरी वर्गों में कोशिकाओं की गणना। सटीकता में सुधार करने के लिए, यदि आवश्यक हो तो अतिरिक्त बाहरी चौकों की दोहराने मायने रखता है, या गिनती जब तक 70 तक पहुँच गया है - 100 कोशिकाओं 14,15।
    1. (इस्तेमाल किया हो) प्रति वर्ग एक्स कमजोर पड़ने कारक औसत सेल गिनती 10 x 4: मिलीलीटर प्रति सेल एकाग्रता की गणना के रूप में निम्नानुसार
  7. दोहराएँ 2.1-2.8 हर 96 घंटे के लिए 24 घंटे बाद बोने कदम।

3. सेल प्रसार एक Luminescence आधारित परख का उपयोग कर निर्धारण

नोट: यह एक समापन बिंदु माप है। एक बार जब अभिकर्मक कोशिकाओं को जोड़ा जाता है, थाली केवल एक बार मात्रा निर्धारित किया जा सकता है।

  1. 30 मिनट के लिए एक 22 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पिघलना luminescence अभिकर्मक।
  2. धीरे एक समरूप मिश्रण प्राप्त करने के लिए बोतल inverting द्वारा अभिकर्मक मिश्रण।
  3. (कदम से वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की एक प्लेट संतुलित करना1.5) 30 मिनट के लिए आरटी पर।
  4. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए luminescence अभिकर्मक के 100 μl जोड़ें। 2 मिनट के लिए एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर सामग्री मिश्रण। प्लेट आरटी पर 10 मिनट के लिए सेते दें।
  5. बहु मोड प्लेट रीडर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक luminescence प्रयोग की स्थापना।
    1. बहु मोड प्लेट पाठक को चालू करें और सॉफ्टवेयर खुला। 'कार्य प्रबंधक' में, 'प्रयोग' का चयन करें और फ़ाइल 'new'.Select बनाने' 'की ओर से उपकरण पट्टी, और तहत' प्रोटोकॉल प्रक्रिया '' टैब, 'चुनें।
    2. चुनें 'Grenier 96 फ्लैट नीचे' थाली प्रकार, और 'उपयोग ढक्कन' बॉक्स की जाँच करें। 'पढ़ने विधि' बॉक्स के तहत 'पढ़ने' कार्रवाई का चयन करें। 'Luminescence' का पता लगाने विधि का चयन करें। ओके पर क्लिक करें'।
    3. पढ़ने के लिए कदम बॉक्स में, कुओं 'पूरी थाली' टैब के अंतर्गत स्कैन करने के लिए चयन करें, और के रूप में खाली कुओं में कार्य करने के कुओं का चयन करें।
    4. (: छेद, दर्पण: कोई नहीं जैसे, प्लग, एम) फिल्टर खाली फिल्टर करने के लिए सेट सेट करें। को लाभ निर्धारित135, अच्छी तरह से प्रति 0.5 सेकंड के एकीकरण समय और 6.5 मिमी की ऊंचाई के साथ पढ़ा। luminescence पढ़ने के लिए सेटिंग्स को बचाने के लिए क्लिक करें 'ठीक है'।
  6. प्रदर्शन एक luminescent पढ़ें
    1. 'साधन नियंत्रण' टैब का चयन करके प्लेट धारक निकालें और 'थाली धारक पर 96 अच्छी तरह से थाली out'.Place थाली, ढक्कन सुनिश्चित करने पर है पर क्लिक करें। के तहत 'साधन नियंत्रण' टैब 'में थाली' पर क्लिक करके प्लेट धारक को बंद करें। उपकरण पट्टी से 'अब पढ़ने' पर क्लिक करें luminescent पढ़ें प्रदर्शन करने के लिए।
    2. अच्छी तरह से आगे के विश्लेषण के लिए एक स्प्रेडशीट के लिए प्रत्येक के लिए रिश्तेदार luminescent इकाई (RLU) माप निर्यात करें।
  7. दोहराएँ 3.1-3.6 कदम कोशिकाओं बोने के बाद प्रसार 96 घंटा के लिए हर 24 घंटा रिकॉर्ड करने के लिए।

4. एक सेल इमेजर का उपयोग कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण

  1. बहु मोड सेल इमेजर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक सेल इमेजिंग प्रयोग की स्थापना
    1. बहु मोड सेल इमेजर और खुले वें चालू करेंई सॉफ्टवेयर।
    2. 'कार्य प्रबंधक' में, 'प्रयोग' टैब का चयन करें और फ़ाइल 'उपकरण पट्टी पर क्लिक करें' 'new'.On बनाने' प्रोटोकॉल 'टैब और खुला' प्रक्रिया 'tab.Select' सेट तापमान 'कार्रवाई की। 'पर' पर सेट इनक्यूबेटर और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए निर्धारित तापमान और जाँच अगले कदम 'बॉक्स के साथ जारी रखने से पहले' पहले से गरम '। 'ठीक है' सेटिंग्स को बचाने के लिए क्लिक करें।
    3. 'पढ़ने' कार्रवाई का चयन करें। 'छवि' का पता लगाने विधि पर क्लिक करें, चुनें 'समापन बिंदु / गतिज' पढ़ने के प्रकार और 'फिल्टर' प्रकाशिकी प्रकार। प्लेट पर पूरी थाली 'टैब' पर OK'.Click 'पर क्लिक करें और चुनें कुओं imaged किया जाना है। सेटिंग्स को सहेजने के लिए ओके पर क्लिक करें।
    4. नीचे के उद्देश्यों 'विकल्प बूंद से 2.5X उद्देश्य का चयन करें। GFP 469, 525 और उज्ज्वल क्षेत्र: 'चैनल' टैब के अंतर्गत, दो चैनलों का चयन करें। दोनों चैनलों के लिए 'ऑटो' जोखिम चेक करें और अच्छी तरह से ऑटो जोखिम का चयन करें।
    5. aut निर्धारित करने के लिएओ फोकस सेटिंग्स, चुनें 'ऑटो फोकस' और 'विकल्प' पर क्लिक करें। ऑटो फोकस विकल्पों के लिए, 'स्कैन और फिर ऑटो फोकस' विधि का चयन करें। 'ठीक है' सेटिंग्स को बचाने के लिए क्लिक करें।
    6. सेट क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर अच्छी तरह से (माइक्रोन) के केंद्र से ऑफसेट क्षैतिज रिक्ति (माइक्रोन) = 2,881 और ऊर्ध्वाधर रिक्ति (माइक्रोन) = 2127 के साथ एक 3 एक्स 2 असेंबल में अच्छी तरह से प्रति एकाधिक छवियों को स्कैन करने के लिए, 0.Select करने के लिए। प्रक्रिया सेटिंग्स को बचाने के लिए 'ठीक' पर क्लिक करें।
      नोट: पढ़ें मापदंडों के लिए 2 टेबल देखें।
  2. चुने प्लेट पर पढ़ें प्रयोग प्रदर्शन
    1. 'साधन नियंत्रण' टैब पर क्लिक करें और 'बाहर थाली' function.Place प्लेट धारक में 96 अच्छी तरह से थाली का चयन करें, ढक्कन सुनिश्चित करने पर है। 'साधन नियंत्रण' टैब के तहत, 'समारोह में थाली' का चयन करें। चयन प्लेट टैब से 'अब पढ़ने'। 96 घंटे बाद बोने के लिए हर 24 घंटा पढ़ा दोहराएँ।
  3. कोशिका गिनती के विश्लेषण का उपयोगसेल इमेजर सॉफ्टवेयर।
    1. एक छवि का विश्लेषण करने के लिए, imaged प्लेट पर 'डाटा' टैब पर क्लिक करें, का चयन 'चित्र [GFP 469, 525 + उज्ज्वल क्षेत्र]'। एक अच्छी तरह से imaged पर डबल क्लिक करें।
    2. एक भरी हुई छवि पर क्लिक करें। 'विश्लेषण' और चयन असेंबल की एक एकल छवि विश्लेषण किया जा चयन करें। GFP 'OK'.Check' imaged कोशिकाओं के लिए मानकों को लागू करने के लिए शुरू '' केवल चैनल, और जैसा कि तालिका 3 में उल्लिखित मानकों सेट पर क्लिक करें। 'पर क्लिक करें।
    3. सेल गिनती मुखौटा imaged कोशिकाओं पर रखा गया है, जो छवि प्रति कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है का निरीक्षण करें। प्रत्येक थाली के प्रयोग के दौरान imaged के लिए 'परिवर्तन लागू करें' और इन सेटिंग्स को बनाए रखने के लिए क्लिक करें।
    4. एक बार imaged थाली में वापस, डाउन मेनू 'डेटा' ड्रॉप पर क्लिक करें और 'कोशिकाओं की संख्या का चयन करें। यह अच्छी तरह से प्रति कुल कोशिकाओं की संख्या उत्पन्न होगा।
    5. आगे के विश्लेषण के लिए ओ 'निर्यात' टैब पर क्लिक करके एक स्प्रेडशीट के लिए सभी डेटा निर्यातअच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं की गिनती च।

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Representative Results

संवर्धित कोशिकाओं के प्रसार, एमसीएफ-7-Δ40p53 की सेल प्रसार transduced कोशिकाओं को मापने के विभिन्न तरीकों का अध्ययन करने के लिए गैर transduced एमसीएफ-7-लेगो स्तन कैंसर कोशिका लाइन की तुलना में था। तीन तरीकों कि तुलना में थे - पारंपरिक विधि hemocytometer, सेल व्यवहार्यता luminescence परख, और सेल इमेजिंग विश्लेषण योजनाबद्ध आरेख में रेखांकित कर रहे हैं (चित्रा 1)। प्रत्येक विधि के फायदे और नुकसान के लिए सही समय के साथ सेल गिनती को मापने के लिए है, और सबसे प्रभावी तरीका प्रयोग के समापन बिंदु आवश्यकताओं और जानकारी है कि एक सेल की आबादी के लिए अधिग्रहीत की जा सकती है, पर निर्भर करता है।

एमसीएफ-7-लेगो और एमसीएफ-7- Δ40p53 कोशिकाओं के विकास को 4 दिनों के लिए 24 घंटे के बाद मापा गया। जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, दो सेल लाइनों तीन अलग-अलग सेल घनत्व (1.5 x 10 3 में वरीयता प्राप्त थे 3; 5 एक्स 10 3 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) और सेल गिनती बोने के बाद 24, 48, 72 और 96 मानव संसाधन प्रदर्शन किया गया था। प्रत्येक विधि बढ़ सेल प्रसार का प्रदर्शन किया, 96 घंटा से अधिक एक hemocytometer, एक luminescence आधारित परख, और एक सेल इमेजर (आंकड़े 2A, बी और सी, क्रमशः) का उपयोग कर। सेल प्रसार में सबसे ज्यादा वृद्धि उच्चतम सेल घनत्व (5 एक्स 10 3 कोशिकाओं) में देखा गया था, और यह भी हर समय बिंदु पर सबसे प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों से पता चला है, सुझाव यह है कि इन कोशिकाओं में प्रसार को मापने के लिए इष्टतम सेल घनत्व होने के लिए। वहाँ सेल लाइनों के बीच सेल प्रसार में कोई महत्वपूर्ण अंतर था।

अलग अलग तरीकों के बीच सेल प्रसार का माप एक रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण 6 (; तालिका 4 चित्रा 3) से तुलना की गई थी। अलग अलग तरीकों में से प्रत्येक के बीच एक महत्वपूर्ण संबंध का परीक्षण किया था, जब की तुलना गदोनों सेल लाइनों में सेल घनत्व के सभी पर पक्ष प्रसार (चित्रा 3 ए और बी)। सबसे मजबूत सहसंबंध के luminescence आधारित परख की तुलना, और सेल इमेजर के बीच मनाया गया (2 आर = 0.8899, पी ≤0.0001, आर 2 = 0.9805, पी ≤0.0001, चित्रा 3 ए और बी, क्रमशः)।

सेल इमेजर का उपयोग करते हुए सेल प्रसार का एक दृश्य प्रतिनिधित्व (चित्रा 4) दिखाया गया है। इस विधि एक ही थाली के लगातार माप का उपयोग करता है के रूप में, कोशिकाओं को हर 24 घंटा imaged किया जा सकता जब तक कोशिकाओं 100% संगम के करीब पहुंच जाती हैं। चित्रा 2 में दिखाया गया है, एमसीएफ-7-लेगो और एमसीएफ-7-Δ40p53 कोशिकाओं की वृद्धि दर हर समय अंक के पार तुलनीय थे। इस विधि नेत्रहीन कई दिनों से भर में सेल के विकास पर नजर रखने, और सेल आकार और सेल Morpho तुलना करने में सक्षम किया जा रहा सहित उपयोगी सेलुलर जानकारी प्रदान करता हैअलग सेल लाइनों के बीच सना हुआ।

आकृति 1
चित्रा 1: तीन अलग मापने सेल प्रसार के तरीके के एक योजनाबद्ध आरेख प्रकोष्ठों अप करने के लिए 96 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ कई 96 अच्छी तरह प्लेटों में तीन अलग-अलग सेल घनत्व पर वरीयता प्राप्त और 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated रहे थे।। हर 24 घंटा, सेल प्रसार या तो द्वारा मापा गया था एक hemocytometer, एक luminescence आधारित परख या सेल इमेजिंग का उपयोग। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। सेल प्रसार माप 96 घंटा सेल की गिनती के बाद एमसीएफ-7-पैर में 96 घंटे के लिए हर 24 घंटा मापा गयाहे और एमसीएफ-7-Δ40p53 कोशिकाओं तीन अलग-अलग सेल घनत्व पर वरीयता प्राप्त। सेल मायने रखता कोशिकाओं / एमएल में एक (क) hemocytometer का उपयोग, (ख) रिश्तेदार luminescent इकाइयों में एक luminescence आधारित परख (RLU), या (ग) एक सतत कोशिका गिनती कोशिकाओं / छवि में एक सेल इमेजर का उपयोग कर का उपयोग करके मापा गया था। सेल इमेजर के लिए स्थितियां तालिका 2 में दिखाया गया है सभी प्रयोगों तीन स्वतंत्र प्रयोगों का मतलब प्रतिनिधित्व करते हैं, ± एसडी यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। मापने स्तन कैंसर कोशिका लाइनों में सेल प्रसार तीन अलग अलग तरीकों की तुलना एक रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण विभिन्न मीटर के बीच correlative संबंधों की तुलना करने के लिए किया गया था (क) एमसीएफ-7-लेगो कोशिकाओं और (ख) एमसीएफ-7-Δ40p53 कोशिकाओं में सेल प्रसार को मापने के लिए जांच की ethods। एक पियर्सन के सहसंबंध गुणांक गणना की गई और महत्व सेल प्रसार को मापने के विभिन्न तरीकों के बीच (पी <0.05) निर्धारित किया गया था। सभी परिणाम ± तीन स्वतंत्र प्रयोगों के एसडी मतलब प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। GFP पॉजिटिव एमसीएफ-7-लेगो और एमसीएफ-7-Δ40p53 स्तन कैंसर की कोशिकाओं की छवियाँ कोशिकाओं की छवियों प्रतिनिधि 5 एक्स 10 3 वरीयता प्राप्त कोशिकाओं से एक सेल इमेजर हर 24 घंटा का उपयोग कर कब्जा कर लिया। पैमाने पर पट्टी 1,000 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। सेल इमेजिंग के लिए पैरामीटर तालिका 2 में संक्षेप हैं। href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54350/54350fig4large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सेल घनत्व (कोशिकाओं / अच्छी तरह से)
सेल प्रकार 1.5 x 10 3 3.0 x 10 3 5 एक्स 10 3
एमसीएफ-7-लेगो 8.4 मिलीलीटर मीडिया में 76 μl 8.3 मिलीलीटर मीडिया में 152 μl 8.2 मिलीलीटर मीडिया में 254 μl
एमसीएफ-7-Δ40p53 8.4 मिलीलीटर मीडिया में 93 μl 8.3 मिलीलीटर मीडिया में 185 μl 8.2 मिलीलीटर मीडिया में 308 μl

तालिका 1: 96 प्लेटों के लिए सेल बोने संस्करणों।

"Fo: रखने के-साथ-next.within-पेज =" हमेशा "> मानकों को पढ़ें प्लेट प्रकार 96 मोड छवि लक्ष्य 2.5X रंग GFP (469, 525), उज्ज्वल क्षेत्र अनावरण ऑटो फोकस ऑटो (स्कैन तो ऑटो फोकस)

तालिका 2: सेल इमेजिंग सेल इमेजर का उपयोग के लिए पैरामीटर पढ़ें।

तालिका 3: सेल गिनती विश्लेषण के लिए इमेजिंग पैरामीटर।

इमेजिंग पैरामीटर
डेवढ़ी 5000
न्यूनतम वस्तु आकार (माइक्रोन) 30
अधिकतम वस्तु आकार (माइक्रोन) 300
एमसीएफ-7-लेगो
आर स्कवेयर पी मूल्य
Hemocytometer बनाम luminescence आधारित परख 0.6301 0.0021
सेल इमेजर बनाम hemocytometer 0.7524 0.0003
बनाम सेल इमेजर luminescence आधारित परख 0.8899 <0.0001
एमसीएफ-7-Δ40p53
आर स्कवेयर पी मूल्य
Hemocytometer बनाम लूminescence आधारित परख 0.8983 <0.0001
सेल इमेजर बनाम hemocytometer 0.9303 <0.0001
बनाम सेल इमेजर luminescence आधारित परख 0.9805 <0.0001

तालिका 4: परीक्षण तीन अलग अलग प्रसार के तरीके के रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण।

तरीका फायदे नुकसान तकनीकी नोटों अंतिम उत्पादन
hemocytometer कम लागत उच्च मानव त्रुटि कई बार पिपेट एकल कक्ष निलंबन तैयार करने के लिए कोशिकाओं / एमएल
न्यूनतम उपकरणों की आवश्यकता है एकल कोशिका निलंबन की आवश्यकता सटीकता प्राप्त करने के लिए कई मायने प्रदर्शन करना
प्रत्यक्ष कोशिकाओं की संख्या कोशिकाओं की उच्च संख्या में कोशिकाओं की संख्या का सही आकलन के लिए आवश्यक
समापन बिंदु
Luminescence आधारित परख multiwell प्लेट स्वरूपों के साथ प्रयोग करें महंगा अभिकर्मकों लाइट से बचाएँ सापेक्ष Luminescent इकाइयों (RLU) / अच्छी तरह से
प्रदर्शन करने के लिए आसान luminescent प्लेट पाठक की आवश्यकता है पृष्ठभूमि luminescence निर्धारित करने के लिए नियंत्रण कुओं को शामिल करें
तेजी से परख तापमान के प्रति संवेदनशील
सेल व्यवहार्यता जानकारी प्रदान करता है चर कोशिकाओं की चयापचय क्रिया पर निर्भर करता है
अप्रत्यक्ष माप
समापन बिंदु
सेल इमेजर निरंतर माप महंगा इमेजर सुनिश्चित करें सेल इमेजर 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट है प्रकोष्ठों / छवि
तापमान नियंत्रण कौशल गहन अनावश्यक झटकों या कोशिकाओं के विघटन से बचें
सेलुलर जानकारी प्रदान करता है कोशिकाओं के संगम के आधार पर चर
लागत प्रभावी (आप इमेजर है) सापेक्ष गिनती
प्रत्यक्ष माप
multiwell प्लेट प्रारूप का स्वचालित इमेजिंग

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में संवर्धित कोशिकाओं में सेल प्रसार को मापने के तीन अलग अलग तरीकों की जांच की गई। प्रत्येक विधि 96 घंटा से अधिक सेल प्रसार की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सटीक मापन करने में सक्षम था, और परिणाम तरीकों का परीक्षण से प्रत्येक के बीच बराबर थे (चित्रा 2 और 3)। दोनों luminescence आधारित परख और सेल इमेजिंग विधि का उत्पादन सबसे मजबूत परिणाम के बाद 96 घंटा सेल प्रसार में रैखिक बढ़ जाती दिखा (चित्रा 2 बी, सी)। इसके अतिरिक्त, समय के साथ सेल इमेजिंग transduced और गैर transduced सेल लाइनों (चित्रा 4) के बीच विकास दर में कोई महत्वपूर्ण अंतर दर्शाया।

प्रत्येक विधि इस प्रोटोकॉल में जांच के लिए कई फायदे और नुकसान कर रहे हैं, एक सारांश के लिए 5 टेबल देखें। पारंपरिक सेल गिनती एक hemocytometer का उपयोग विधि एक कम लागत तरीका है कि बहुत कम अतिरिक्त अभिकर्मकों या effo की आवश्यकता हैRT तैयार करने और चलाने के लिए। इसके अलावा, इस विधि / एमएल 14 कोशिकाओं में एक निरपेक्ष कोशिका गिनती quantitates। हालांकि, वहाँ गंभीर नुकसान है, जो समय लेने वाली सेल गिनती, उच्च त्रुटि दर है कि मायने रखता है के बीच बड़े मानक विचलन में परिणाम की प्रकृति, और इस तथ्य के सेल नंबर की एक उच्च श्रेणी सटीक कोशिकाओं की गिनती के लिए आवश्यक हैं कि शामिल कर रहे हैं। यह चित्रा 2A, जहां hemocytometer का उपयोग सेल गिनती कम सेल घनत्व में चर परिणाम है, और बड़े मानक विचलन से पता चला बाद में समय बिंदुओं पर में देखा जा सकता है। ये नुकसान इस विधि बड़ा उच्च throughput माप जहां छोटी प्लेट आकार और घनत्व बोने के लिए आवश्यक हैं के लिए छोटा सा नमूना आकार के सेल गिनती के लिए उपयोगी है, और अपर्याप्त हैं। इन सीमाओं को क्रमशः समाप्त किया जा सकता है अगर सेल घनत्व, वृद्धि की गई थी कि इस तरह के गिना कोशिकाओं की न्यूनतम संख्या 100 से अधिक कोशिकाओं की एक सीमा में शुरू हुआ। अधिक सेल निलंबन पतला, या कम सेल घensity, कम से कम 100 कोशिकाओं की गिनती और इसलिए परिवर्तनशीलता बढ़ती जा रही प्रतिकृति के बीच 15 का अधिक से अधिक मौका। हालांकि, इस पद्धति कम कोशिका की सतह क्षेत्र की वजह से, एक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए अनुपयुक्त है, और इसलिए, कि विश्लेषण में इस्तेमाल किया जा सकता कोशिकाओं की संख्या अपर्याप्त है। यह इस विधि और जो इस क्षमता की आवश्यकता होती है जो उपयोगकर्ताओं के लिए एक स्पष्ट नुकसान के उच्च throughput क्षमताओं की कमी पर प्रकाश डाला गया।

Luminescence आधारित परख एटीपी की राशि है, जो पाचन सक्रिय कोशिकाओं 16 की उपस्थिति का एक उपाय है मापने के द्वारा सेल व्यवहार्यता का निर्धारण करता है। इस परख सेल प्रसार निर्धारित करने के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में कई नमूने के उच्च throughput प्रदर्शन के लिए बनाया गया है। इस सरल विधि एक रिश्तेदार luminescence इकाई (RLU) एक प्लेट रीडर का उपयोग, जो पाचन सक्रिय कोशिकाओं में एटीपी पेश करने के लिए आनुपातिक है के रूप में सेल प्रसार quantitates। हालांकि, इस पद्धति का बड़ा नुकसान टी हैवह अभिकर्मक की लागत, और कोशिकाओं के चयापचय गतिविधि पर माप की निर्भरता। जैसे तापमान या सेल चक्र समय बिंदुओं के रूप में विभिन्न सेल संस्कृति शर्तों, आसानी से कोशिकाओं है, जो सीधे परख 17 द्वारा उत्पन्न luminescent संकेत करने के लिए आनुपातिक है के द्वारा उत्पादित एटीपी की राशि को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए, यह अनुभव से निर्धारित करने के लिए है कि प्रयोग की शर्तों कोशिकाओं के चयापचय गतिविधि के साथ हस्तक्षेप नहीं करते और संभावित कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न रिश्तेदार luminescent संकेत बाधित महत्वपूर्ण है।

तीसरा तरीका सेल प्रसार का निर्धारण करने के लिए जांच की एक रिश्तेदार कोशिका गिनती प्रदर्शन करने के लिए एक जीवित कोशिका इमेजर और सॉफ्टवेयर था। सेल इमेजर उच्च throughput क्षमताओं के रूप में यह तापमान नियंत्रण के साथ-साथ अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए कई छवियों पर कब्जा करने के लिए, वास्तविक समय में, परख की अवधि से अधिक एक ही कोशिकाओं का उपयोग कर स्वचालित किया जा सकता है। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 4, सेल प्रसार मीटर हो सकता हैएक समय के पाठ्यक्रम पर एक ही थाली है, जो सेल गिनती विश्लेषण के साथ सेल की आबादी के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान कर सकते हैं में onitored। यह बहुत ही लाभप्रद के रूप में इसे पार प्लेट परिवर्तनशीलता और सेल बोने त्रुटि है, जो 96 अच्छी तरह से थाली स्वरूपों में आम है समाप्त है। सॉफ्टवेयर सेल इमेजर साथ मापदंडों तालिका 2 और 3 में उल्लिखित का उपयोग कर कोशिकाओं की गिनती के quantitation के लिए अनुमति देता है। इसलिए यह एक उच्च throughput सेटिंग में उपयोगी है और आसानी से ऐसे apoptosis या cytotoxicity के रूप में सेलुलर कार्यों को मापने के लिए अन्य assays के लिए मल्टिप्लेक्स जा सकता है। प्रणाली का एक बड़ा नुकसान सॉफ्टवेयर है, जो दिल को छू लेने वस्तुओं को विभाजित करने की क्षमता में सीमित है। यह कम संगम कोशिकाओं में इस समारोह में प्रदर्शन कर सकते हैं, यह परख का एक प्रमुख सीमा है और इसलिए सेल प्रकार विशिष्ट अनुकूलन की आवश्यकता है। इसके अलावा, जबकि व्यक्ति एक इमेजर का उपयोग कर प्रयोगों एक थाली-से-प्लेट पैमाने पर बहुत कम खर्च कर रहे हैं, इस विधि पर होगाLy लागत प्रभावी हो यदि साधन पहले से ही एक प्रयोगशाला में स्थापित किया जाएगा। इसलिए, इस उच्च throughput विश्लेषण के लिए इस विधि उपयुक्त बनाने संवर्धित कोशिकाओं के सेल प्रसार को मापने के लिए एक उपन्यास तरीका प्रदान करता है, और कोई अतिरिक्त अभिकर्मकों की आवश्यकता के प्रमुख लाभ है, और 96 अच्छी तरह से थाली स्वचालित गिनती करने में सक्षम है। इस पारंपरिक hemocytometer सेल गिनती पद्धति पर एक महत्वपूर्ण सुधार है, और luminescence आधारित परख करने के लिए एक और अधिक लागत प्रभावी विकल्प है।

महत्वपूर्ण कदम है जब सेल इमेजर का उपयोग कर कब्जा कर लिया छवियों और छवि प्रति बाद में कोशिकाओं की संख्या के विश्लेषण के दौरान होता है। इन छवियों को सेल इमेजिंग प्लेटफार्मों के एक नंबर का उपयोग कर कार्रवाई की जा सकती। यह जांच के तहत सेल प्रकार के लिए सबसे उपयुक्त सॉफ्टवेयर का निर्धारण करने के लिए इसलिए सर्वोपरि है। यह अलग इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग सेल इमेजर द्वारा अधिग्रहीत छवियों से कोशिकाओं की गिनती मान्य करने के लिए उपयोगी होगा। इस प्रोटोकॉल एक करने के लिए लागू किया जा सकता हैY संवर्धित कोशिकाओं, तथापि विश्लेषण मानकों को प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए परिभाषित करना होगा। इस बार पहली बार में लगता हो सकता है, लेकिन एक बार मानकों को निर्धारित किया गया है, विधि एक समय में छवि पूरे प्लेटों के लिए स्वचालित किया जा सकता है।

यह ध्यान दें कि इन assays प्रसार के एक अप्रत्यक्ष उपाय वास्तव में कर रहे हैं, क्योंकि वे सेल नंबर (hemocytometer, सेल इमेजर), या चयापचय क्रिया (luminescence आधारित परख) को मापने के समय की अवधि से अधिक महत्वपूर्ण है। इन विधियों को आसानी से अन्य महत्वपूर्ण कारक है कि प्रसार प्रभावित कर सकते हैं मापने के लिए संशोधन किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, trypan नीले अपवर्जन विधि आसानी से मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए और इसलिए सेल व्यवहार्यता 13 निर्धारण या तो hemocytometer या सेल इमेजर विधि में शामिल किया जा सकता है। luminescence आधारित परख एक cytotoxicity परख के साथ मल्टिप्लेक्स जा सकता है सेल स्वास्थ्य के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करने के लिए, और चयापचय क्रिया इस परख के दौरान मापा भी सेल viabi की एक माप हैlity 12। इसलिए, इन assays के लचीलेपन अन्य assays के साथ मल्टिप्लेक्स जा करने के लिए अतिरिक्त सेलुलर जानकारी प्रदान करना है इन तरीकों में से प्रत्येक का एक मजबूत लाभ।

इस प्रोटोकॉल मानव स्तन कैंसर कोशिका लाइन MCF 7 है जो स्थिरतापूर्वक लेगो-IG2-Puro + वेक्टर GFP जीन से युक्त के साथ ट्रांसड्यूस दिया इस्तेमाल किया। यह छवि के लिए GFP प्रकाशिकी फिल्टर कोशिकाओं के उपयोग की अनुमति देता संस्कृति माध्यम में किसी भी डाई एजेंटों को जोड़ने की आवश्यकता के बिना। इस विधि को आसानी से, या तो उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाशिकी प्रकार का उपयोग कोशिकाओं इमेजिंग द्वारा छवि GFP नकारात्मक कोशिकाओं या यहां तक ​​कि प्राथमिक सेल लाइनों को संशोधित किया जा सकता है, या एक प्रसार मार्कर के साथ कोशिकाओं लेबल करके। तरीकों इस प्रोटोकॉल में की तुलना में काफी अलग सेल लाइनों की एक विस्तृत विविधता में इस्तेमाल किया जा करने के लिए मजबूत, तथापि प्रत्येक व्यक्ति के सेल लाइन के लिए इष्टतम प्रोटोकॉल सेटिंग्स पहले निर्धारित किया जाना चाहिए रहे हैं। उज्ज्वल क्षेत्र चैनल का उपयोग कोशिकाओं की इमेजिंग प्राथमिक सीई के लिए सबसे अच्छा विकल्प का प्रतिनिधित्वlls या उन है कि धीमी गति से बढ़ रहे हैं, इस विधि के लंबे समय तक प्रकृति के कारण। ऐसे luminescence आधारित परख के रूप में अंत बिंदु assays, लंबी अवधि के सेल के विकास के विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं हैं।

इस प्रोटोकॉल इन विट्रो में सेल प्रसार को मापने के लिए तीन अलग-अलग तरीकों का वर्णन किया गया है। प्रत्येक विधि को नियमित प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया जा सकता है सेल के विकास को मापने के लिए, और सबसे प्रयोगशालाओं इन तरीकों में से एक प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक कौशल के अधिकारी करेंगे। हालांकि, वहाँ भी अन्य कोशिकाओं को विभाजित को मापने के लिए उपलब्ध assays की एक सीमा है। इन विधियों कि डीएनए संश्लेषण, चयापचय गतिविधि को मापने, प्रसार या एटीपी एकाग्रता 9 के जुड़े एंटीजन शामिल कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, assays के एक नंबर ऐसे 3H-thymidine के रूप में एक रेडियोधर्मी पदार्थ के साथ कोशिकाओं लेबल करके कोशिकाओं के डीएनए संश्लेषण की दर को मापने के लिए विकसित किया गया है। इस पद्धति का एक दोष यह रेडियोधर्मी पदार्थ, और उनके निपटान के स्पष्ट इस्तेमाल होता है। अन्यतरीकों जो नियमित तौर पर सेल प्रसार को मापने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं नवगठित डीएनए के BrdU लेबलिंग, जो 18 प्रवाह cytometry का उपयोग मापा जा सकता है का उपयोग शामिल है। प्रवाह cytometry दोनों सेल नंबर के साथ ही सेल चक्र जानकारी का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह विशेष रूप से प्रयोगों के लिए एक लाभप्रद परिणाम हो सकता है, हालांकि इस विधि का नुकसान आदेश प्रवाह कोशिकामापी काम करते हैं और जिसके परिणामस्वरूप डेटा का विश्लेषण करने के 18 में अतिरिक्त समय और कदम, महंगा अभिकर्मकों और बढ़ उपयोगकर्ता के प्रशिक्षित कौशल शामिल हैं। इसलिए, वहाँ कई अलग अलग कोशिकाओं के विकास का मूल्यांकन करने के लिए वैज्ञानिकों को उपलब्ध assays हैं, और चुने हुए विधि काफी हद तक सेल इस्तेमाल किया प्रकार, उपयोगकर्ता और उनके कौशल के स्तर, और प्रयोग के समापन बिंदु पर आवश्यक डेटा के प्रकार पर निर्भर है।

अंत में, सेल प्रसार को मापने के तीन अलग अलग तरीकों स्तन कैंसर की कोशिकाओं का उपयोग कर की तुलना में थे। प्रत्येक विधि के कई फायदे और disadvantag हैes, और इसलिए उपयोगकर्ता पर निर्भर है और एक प्रयोग के लिए उनकी आवश्यकताओं के आधार पर, सबसे उपयुक्त परख का निर्धारण सेल गिनती प्रदर्शन करने के मामले में है।

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Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red ThermoFisher Scientific 21063-045 Supplemented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 µg/ml insulin and 1 µg/ml puromycin
L-glutamine solution (100x) ThermoFisher Scientific 25030-081
Insulin solution human Sigma-Aldrich I9278-5ML
Fetal bovine serum (FBS) Bovogen Biologicals SFBS-F-500ml
Puromycin dihydrochloride Sigma-Aldrich P9620-10ML
0.5% trypsin-EDTA solution (10x) ThermoFisher Scientific 15400-054 Dilute to 2x in DPBS
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x) ThermoFisher Scientific 30028-02
Tissue culture flask, 75 cm2 growth area Greiner Bio-One 658175
Scepter 2.0 Cell Counter Merck Millipore Automated cell counter
96 well multiwell plate, flat bottom Nunc 167008
Improved Neubauer Hemocytometer BOECO Germany BOE 01
Olympus IX51 inverted microscope Olympus IX51
CellTiter-Glo 2.0 Assay Promega G9242 Luminescence-based assay
Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader BioTek Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging
Gen5 Data Analysis Software BioTek GEN5

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References

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