Comparación de tres diferentes métodos para determinar la proliferación celular en líneas celulares de cáncer de mama

1Medical Genetics, Hunter Medical Research Institute, 2Priority Research Centre for Cancer, School of Biomedical Sciences and Pharmacy, Faculty of Health and Medicine, University of Newcastle, 3Pathology North, John Hunter Hospital
Biology

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Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. J. Vis. Exp. (115), e54350, doi:10.3791/54350 (2016).

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Abstract

Introduction

El gen supresor de tumor, p53, es un regulador esencial de una serie de procesos celulares, incluyendo la detención del ciclo celular, la apoptosis y senescencia 1. Es responsable de mantener la estabilidad genómica, y por lo tanto es crucial para mantener el equilibrio de la muerte celular y el crecimiento celular. Las mutaciones en p53 son comunes en el cáncer y son la causa principal de la inactivación de p53 conduce a la proliferación de células de cáncer no controlado 2. Curiosamente, las mutaciones en p53 sólo representan aproximadamente el 25% de los cánceres de mama 3, lo que sugiere que otros mecanismos son responsables de la pérdida de la función p53. Las isoformas de p53 recientemente descubiertos se ha demostrado que se sobreexpresa en un número de cánceres humanos, y pueden modular la función de p53 de 4,5. Hemos demostrado anteriormente que la isoforma p53, Δ40p53, es la isoforma más altamente expresado en el cáncer de mama, y ​​se regula positivamente de manera significativa en las células de cáncer de mama, en comparación con TISS normal adyacenteue 6. A raíz de esto, estable transduced la línea celular de cáncer de mama humano MCF-7 para sobreexpresar Δ40p53 utilizando el Lego-ig2-puro + vectorial (GFP +) 7. Estas células se usaron para investigar si la expresión de alto Δ40p53 aumenta las tasas de proliferación celular en células de cáncer de mama.

Hay muchos métodos directos e indirectos de la medición de la proliferación celular de las células cultivadas in vitro 8,9. Estos se pueden realizar ya sea como mediciones continuas en el tiempo, o ensayos de punto final como 10. Los métodos convencionales son todavía útiles, tales como el recuento de células usando un hemocitómetro. Este ensayo es un bajo costo y medida directa del número de células, pero no se basan en el recuento de células grandes y la formación altamente especializada para minimizar el error y gran estándar desviaciones de los recuentos. La necesidad de realizar mediciones compatible con los formatos de alto rendimiento ha llevado al desarrollo de ensayos de múltiples pocillos de placa. Estos ensayos basados ​​en luminiscencia Measure el número de células sobre la base de una señal luminiscente que es proporcional a la actividad metabólica de la célula 11,12. Más recientemente, la introducción de las plataformas de imágenes de alta contenido ha permitido nuevas herramientas que controlan la proliferación celular mientras que proporciona la recogida de datos fenotípica cuantitativa y cualitativa, e incluye una variedad de sistemas 13. Todos estos métodos proporcionan vías para medir el crecimiento celular, ya sea por medio de ensayos de medición o de punto final continuas, y cada uno posee una serie de ventajas y desventajas con respecto a la sensibilidad, el rendimiento de los números de muestra, y la información de células, todo lo cual puede ser pesada en consecuencia dependiendo en la pregunta de investigación.

Este protocolo describe tres métodos diferentes para medir la proliferación celular in vitro, con cada método de utilización de diferentes gamas de sensibilidad, reproducibilidad y formatos de placas de múltiples pocillos. Este protocolo tiene como objetivo comparar el uso de una cha conteo de hemocitómetromber, un ensayo basado en luminiscencia viabilidad celular, y de imágenes de células, en la medición de la proliferación de células durante un tiempo de 96 horas. Para ello, el crecimiento de las células transducidas por vectores (MCF-7-LEGO) se comparó con células transducidas para sobreexpresar Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), utilizando tres diferentes densidades de células. La proliferación celular se midió cada 24 horas para un máximo de 96 hr. Se encontró que cada método para tener sus propias ventajas y desventajas, y en función del objetivo del experimento, cada uno todavía es un método valioso para proporcionar información sobre la tasa de proliferación.

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Protocol

1. Las células que se preparan para Ensayos de proliferación

Nota: Preparar las dos líneas celulares en la misma forma y semilla en el mismo formato para a analizar cada método.

  1. Crecer MCF-7-Lego y MCF-7-Δ40p53 7 células a 75-80% de confluencia en T 75 cm 2 frascos de cultivo de tejidos usando fenol libre de rojo de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) , 200 mM L-glutamina, 2 mg de insulina / ml y 1 mg / ml puromicina a 37 ° C con 5% de CO 2. Manejar las células en una cabina de bioseguridad de clase II estéril.
    Nota: La cantidad de tiempo que se necesita para crecer las células hasta confluencia varía en función de la dilución de la siembra. En preparación para el recubrimiento de las células para los ensayos de proliferación, las semillas de las células a una dilución 1: 3 en DMEM suplementado y mantener en condiciones normales de crecimiento durante 3 días hasta 75-80% de confluencia.
  2. Para retirar las células del matraz, verter el medio enun contenedor de residuos. Inmediatamente se lava la capa de células con 2 ml de tripsina 2x pre-calentado. Aspirar tripsina. Añadir otros 2 ml de tripsina previamente calentada a la capa de células y el lugar en una incubadora durante 5 min a 37 ° C con 5% de CO 2.
    1. Una vez que las células se separan, se lavan las células con 10 ml calentado fresco suplementado DMEM. Transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml estéril y se centrifuga a 491 xg durante 5 min a TA. aspirar con cuidado y desechar el sobrenadante.
  3. Resuspender el sedimento celular en 5 ml de DMEM fresco suplementado. Realizar un recuento de células para determinar la densidad correcta para sembrar las células en placas de 96 pocillos.
    1. Diluir 100 l de la suspensión de células en 900 l de 1x solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS). Coloque un nuevo sensor de 60 micras en el contador de células automatizado. Mantenga presionado el émbolo y sumergir el sensor en la suspensión celular diluida. liberar lentamente el émbolo en el contador de células. Retire el sensor del COU celularnter cuando esté terminado.
      Nota: El número de células se mostrará en el contador de células en células / ml.
  4. Se siembran las células en un volumen final de 100 l (en DMEM) en una placa de 96 pocillos a ~ 20% de confluencia para dejar espacio para el crecimiento celular y la medición de la proliferación durante 3-5 días (véase la Tabla 1). Sembrar todas las líneas celulares por triplicado.
    Nota: Para este experimento, se evaluaron tres densidades de células diferentes para determinar la densidad celular óptima. El número de células requeridas se resumen en la Tabla 1. Se siembran las células a una densidad más baja si se requiere la medición de más crecimiento a largo plazo.
    1. Para el hemocitómetro y ensayos basados ​​en luminiscencia, preparar una placa por punto de tiempo (es decir, 4 placas por ensayo). Para el ensayo de imágenes de células, preparar una sola placa para la duración del experimento.
  5. Mantener las células a 37 ° C con 5% de CO2 durante 24 hr.

2. La determinación de recuento de células con nosotrosing un hemocitómetro

  1. Pre-caliente tanto medio y tripsina a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular, horno o baño de agua. Aspirar los medios de células en un contenedor de residuos, se lavan una vez con 30 l de tripsina 2x, y aspirar la tripsina.
  2. Lavar las células de nuevo con 30 l de tripsina 2x, y se incuba durante 5 minutos a 37 ° C. Golpear suavemente borde de la placa para desalojar las células de la placa. Añadir 50 l de DMEM suplementado y las células de la mezcla mediante pipeteo hasta que las células forman una única suspensión celular.
  3. Preparar hemocitómetro por la superficie y cubierta de cristal de la limpieza con etanol al 70%.
  4. Coloque el cubre de vidrio sobre las cámaras de recuento y colocarán hasta 'anillos de Newton refracción' se pueden ver entre los bordes cubres y el hemocitómetro.
    Nota: Estos indican que el cubreobjetos se ha adherido correctamente al hemocitómetro.
  5. pipeta suavemente 20 l de suspensión de células debajo de la cubierta antideslizante, llenando la cámara de recuento por el movimiento capilar.Coloque hemocitómetro bajo un aumento de 10x de un microscopio y visualizar las cámaras de recuento en el diseño de cuadrícula.
  6. Recuento de células en las 4 plazas exteriores de la disposición de la rejilla. Para mejorar la eficiencia, la repetición de cargos de cuadrados externos adicionales si es necesario, o hasta que el recuento ha alcanzado 70 - 100 células 14,15.
    1. Calcular la concentración de células por ml de la siguiente manera: recuento celular medio por el factor de dilución x cuadrado (si se usa) x 10 4
  7. Repita los pasos 2.1-2.8 cada 24 horas durante 96 horas después de la siembra.

3. Determinación de la proliferación de células utilizando un ensayo basado en luminiscencia

Nota: Esta es una medición de punto final. Una vez se añade el reactivo a las células, la placa solamente se puede cuantificar de una vez.

  1. reactivo de luminiscencia deshielo en un baño de agua a 22 ° durante 30 minutos.
  2. Mezclar suavemente reactivo por inversión de la botella para obtener una mezcla homogénea.
  3. Equilibrar una placa de células sembradas (del paso1.5) a TA durante 30 min.
  4. Añadir 100 ml de reactivo de luminiscencia a cada pocillo. Mezcle los contenidos en un agitador orbital durante 2 min. Permitir que la platina incubar durante 10 min a TA.
  5. La creación de un experimento de la luminiscencia utilizando el multi-modo de software lector de placas.
    1. Encienda el lector de placas multi-modo y abrir el software. En el "administrador de tareas ', seleccione' experimentos 'y' crear new'.Select 'archivo' de barra de herramientas, y bajo" protocolo "pestaña, seleccione" procedimiento ".
    2. Seleccione 'Grenier fondo plano 96' del tipo de placas, y marca la casilla 'utilización tapa'. Seleccione la acción "leer" en la casilla «método de lectura '. Seleccionar método de detección de 'la luminiscencia'. Haga clic en Aceptar'.
    3. En el cuadro de paso leer, seleccionar los pozos que hay que analizar en la pestaña "plato lleno" y seleccione pozos para actuar como pozos en blanco.
    4. Establecer el conjunto de filtros para filtrar vacío (por ejemplo, el enchufe, Em: agujero, espejo: ninguno). Ajuste la ganancia de135, con un tiempo de integración de 0,5 segundos por pocillo y una altura de 6,5 mm leer. Haga clic en "Aceptar" para guardar la configuración para la lectura de luminiscencia.
  6. Realización de una luminiscentes Lee
    1. Expulsar soporte de la placa seleccionando la pestaña 'control de instrumentos' y hacer clic en "placa out'.Place placa de 96 pocillos en el soporte de la placa, asegurando la tapa está encendido. Cierre el soporte de la placa haciendo clic en "placa de pestaña en" control de instrumentos '. Haga clic en "leer ahora" de la barra de herramientas para realizar lectura luminiscente.
    2. Exportar las mediciones relativas unidad luminiscente (RLU) para cada pocillo a una hoja de cálculo para el análisis adicional.
  7. Repita los pasos 3.1-3.6 para registrar la proliferación cada 24 horas hasta 96 horas después de la siembra de células.

4. La determinación de recuento de células El uso de un generador de imágenes de la célula

  1. La creación de un experimento de imágenes de células usando el software de imágenes de células multimodo
    1. Encienda el reproductor de imágenes de células multi-modo y TH abiertosoftware de correo.
    2. En el "administrador de tareas", seleccione la pestaña 'experimentos' y 'crear new'.On la' 'barra de herramientas, haga clic en "archivo" ficha y abierta' protocolo de actuación 'tab.Select' temperatura de ajuste de acción '. Establecer incubadora en 'on' y ajuste la temperatura a 37 ° C y comprobar 'precalentamiento' antes de continuar con el cuadro siguiente paso '. Haga clic en "Aceptar" para guardar la configuración.
    3. Seleccione la acción "leer". Haga clic en el método de detección "imagen", seleccione "punto final / kinetic leer el tipo y el tipo de óptica 'filtros'. Haga clic en 'OK'.Click en la pestaña plato lleno' y seleccione pocillos de la placa para formar imágenes. Haga clic en "Aceptar" para guardar la configuración.
    4. Seleccione el objetivo 2,5 veces en el menú desplegable Opciones 'objetivos'. En la pestaña de 'canales', seleccionar dos canales: GFP 469, 525 y campo brillante. Compruebe la exposición 'auto' para ambos canales y seleccione así la exposición automática.
    5. Para determinar auto ajustes de enfoque, seleccione "Ajustar el enfoque 'y haga clic en" opciones ". Para las opciones de enfoque automático, seleccione el método de 'escanear y luego enfoque automático'. Haga clic en "Aceptar" para guardar la configuración.
    6. Ajuste el horizontal y el desplazamiento desde el centro del pozo (m) vertical para 0.Select para escanear varias imágenes por pocillo en un montaje 3 x 2, con una separación horizontal (m) = 2881 y el espaciamiento vertical (m) = 2,127. Haga clic en 'Aceptar' para guardar los parámetros del procedimiento.
      Nota: Véase la Tabla 2 para parámetros de lectura.
  2. Realización Lee Experimento en la placa seleccionada
    1. Haga clic en la pestaña 'control de instrumentos' y seleccionar el function.Place 'depositarse' placa de 96 pocillos en soporte de la placa, asegurando la tapa está encendido. En la pestaña 'control de instrumentos', seleccione el 'plato en "función. Seleccione 'leer ahora' de lengüeta de la placa. Repita leer cada 24 horas hasta 96 horas después de la siembra.
  3. El análisis de recuento de células Utilizando elSoftware Imager celular.
    1. Para analizar una imagen, haga clic en la pestaña '' de datos en la placa de captación de imagen, 'foto [GFP 469, 525 + campo brillante]' select. Haga doble clic en un reflejado también.
    2. Haga clic en una imagen cargada. Seleccione 'analizar' y seleccionar una sola imagen del montaje que va a analizarse. Haga clic en 'OK'.Check la' GFP 'canal sólo, y establecer parámetros como se indica en la Tabla 3. Haga clic en "START" para aplicar parámetros a las células fotografiadas.
    3. Observe la máscara de recuento de células se coloca sobre las células fotografiadas, que se utiliza para determinar el recuento de células por imagen. Haga clic en "aplicar los cambios 'y mantener estos valores para cada plancha expuesta durante todo el experimento.
    4. Una vez de vuelta en la plancha expuesta, haga clic en el menú "datos" del menú desplegable y seleccione 'recuento de células'. Esto generará el recuento total de células por pocillo.
    5. Exportar todos los datos a una hoja de cálculo haciendo clic en la pestaña de "exportar" para su posterior análisis of los recuentos de células por pocillo.

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Representative Results

Para estudiar diferentes métodos de medición de la proliferación de las células cultivadas, la proliferación celular de las células MCF-7-Δ40p53 células transducidas se comparó con la línea celular de cáncer de mama MCF-LEGO-7 no transducidas. Los tres métodos que se compararon - la formación de imágenes método hemocitómetro convencional, ensayo de luminiscencia viabilidad de las células, y las células análisis- se describen en el diagrama esquemático (Figura 1). Cada método tiene ventajas y desventajas para medir con precisión el recuento de células con el tiempo, y el método más eficaz depende de los requisitos de punto final del experimento y la información que puede ser adquirida por una población de células.

El crecimiento de las células MCF-7 Δ40p53 MCF-7-Lego y se midieron después de 24 hr durante 4 días. Como se muestra en la Figura 1, las dos líneas celulares fueron sembradas en tres densidades celulares diferentes (1,5 x 10 3 3; 5 x 10 3 células / pocillo) y de células de recuento se llevó a cabo 24, 48, 72 y 96 horas después de la siembra. Cada método demostró aumento de la proliferación celular, utilizando un hemocitómetro, un ensayo basado en luminiscencia, y un generador de imágenes de células (Figuras 2a, b y c, respectivamente) durante 96 hr. El mayor incremento en la proliferación celular se observó a la densidad celular más alta (5 x 10 3 células), y también mostró los resultados más reproducibles en cada punto de tiempo, lo que sugiere que se trata de la densidad celular óptima para la medición de la proliferación en estas células. No hubo diferencia significativa en la proliferación celular entre las líneas celulares.

La medición de la proliferación celular entre los diferentes métodos se comparó mediante un análisis de regresión lineal 6 (Figura 3, Tabla 4). Hubo una correlación significativa entre cada uno de los diferentes métodos de prueba, cuando se comparan cproliferación ell En todas las densidades de células en ambas líneas celulares (Figura 3a y b). Se observó que la correlación más fuerte entre la comparación del ensayo basado en luminiscencia, y el generador de imágenes de células (R 2 = 0,8899, p ≤0.0001; R 2 = 0,9805, p ≤0.0001, la figura 3a y b, respectivamente).

Una representación visual de la proliferación celular utilizando el generador de imágenes de células se muestra (Figura 4). Dado que este método utiliza mediciones continuas de una sola placa, las células se pueden obtener imágenes cada 24 h hasta que las células alcanzan cerca de 100% de confluencia. Como se muestra en la Figura 2, las tasas de crecimiento de las células MCF-7 Δ40p53 MCF-7-Lego y fueron comparables en todos los puntos de tiempo. Este método proporciona información útil celular, incluyendo la posibilidad de controlar visualmente el crecimiento celular en varios días, y compara el tamaño celular y morfo celularlogía entre diferentes líneas celulares.

Figura 1
Figura 1: Un Diagrama esquemático de los tres diferentes métodos de medición de proliferación celular Las células se sembraron a tres densidades de células diferentes en múltiples placas de 96 pocillos y se incubaron a 37 ° C con 5% de CO 2 durante un máximo de 96 hr.. Cada 24 horas, la proliferación celular se midió, ya sea usando un hemocitómetro, un ensayo o una célula de imágenes basado en la luminiscencia. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2:. Las mediciones de proliferación celular después de 96 horas el recuento de células se midió cada 24 horas durante 96 horas en las células MCF-7-LEGcélulas S y MCF-7-Δ40p53 sembraron a tres densidades de células diferentes. Los recuentos de células se midieron usando un (a) hemocitómetro en células / ml, (b) utilizando un ensayo basado en luminiscencia en unidades luminiscentes relativas (RLU), o (c) un recuento de células continua utilizando un generador de imágenes de células células / imagen en. Condiciones para el generador de imágenes de células se muestran en la Tabla 2. Todos los experimentos representan la media de tres experimentos independientes, ± SD Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3:. Comparación de tres métodos de medición diferentes proliferación celular en líneas celulares de cáncer de mama se realizó un análisis de regresión lineal para comparar las relaciones entre los diferentes correlativos m étodos examinado para medir la proliferación celular en (a) células MCF-7-Lego y (b) las células MCF-7-Δ40p53. coeficiente de correlación de Pearson se calculó y la significación se determinó (p <0,05) entre los diferentes métodos de medición de la proliferación celular. Todos los resultados representan la media ± SD de tres experimentos independientes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4:. Imágenes de GFP-positivo MCF-7-LEGO y MCF-7-Δ40p53 Breast Cancer Cells Imágenes representativas de células de 5 x 10 3 células sembradas capturado utilizando un generador de imágenes de células cada 24 horas. La barra de escala representa 1.000 micras. Los parámetros para imágenes de células se resumen en la Tabla 2. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54350/54350fig4large.jpg" target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La densidad de células (células / pocillo)
Tipo de célula 1,5 x 10 3 3,0 x 10 3 5 x 10 3
MCF-7-LEGO 76 l en 8,4 ml de medios 152 l en 8,3 ml de medios 254 l en 8,2 ml de medios
MCF-7-Δ40p53 93 l en 8,4 ml de medios 185 l en 8,3 ml de medios 308 l en 8,2 ml de medios

Tabla 1: la siembra de células para placas de 96 pocillos.

"Fo: keep-con-next.within-page =" always "> leer parámetros tipo de la placa 96 así Modo Imagen Objetivo 2.5X Color GFP (469, 525), Campo brillante Exposición Auto Atención Auto (Escanear a continuación, enfoque automático)

Tabla 2: lectura de parámetros para imágenes de células Utilizando el procesador de imágenes de la célula.

Tabla 3: Parámetros de imagen para el análisis Recuento celular.

parámetros de imagen
Límite 5000
tamaño del objeto mínimo (m) 30
Máximo tamaño del objeto (m) 300
MCF-7-LEGO
R Plaza p-valor
Hemocitómetro vs. ensayo basado en luminiscencia 0.6301 0.0021
De imágenes de células vs. hemocitómetro 0.7524 0.0003
Ensayo basado en luminiscencia vs. imager célula 0.8899 <0,0001
MCF-7-Δ40p53
R Plaza p-valor
Hemocitómetro vs luensayo basado en minescence 0.8983 <0,0001
De imágenes de células vs. hemocitómetro 0.9303 <0,0001
Ensayo basado en luminiscencia vs. imager célula 0.9805 <0,0001

Tabla 4: Análisis de regresión lineal de los tres métodos diferentes de proliferación probados.

Método ventajas desventajas notas técnicas salida final
hemocitómetro Bajo costo Alta errores humanos Pipetear varias veces para preparar la suspensión de una sola célula Células / ml
Requiere un mínimo de equipo Requiere suspensión de una sola célula Realizar múltiples cargos para lograr una precisión
recuento de células directo Alto número de células requerido para una evaluación precisa de recuento de células
Punto de llegada
Ensayo basado en luminiscencia El uso con formatos múltiples pocillos de placa reactivos caros Proteger de la luz Luminiscentes relativa Unidades (RLU) / pocillo
Fácil de realizar Requiere lector de placas luminiscentes Incluir los pocillos de control para determinar la luminiscencia de fondo
ensayo rápido Sensible a la temperatura
Proporciona información de la viabilidad celular Variable dependiendo de la actividad metabólica de las células
medición indirecta
Punto de llegada
de imágenes de células La medición continua generador de imágenes caros Asegúrese de imágenes de células se ajusta a 37 ° C Células / imagen
Control de temperatura habilidad intensiva Evitar la agitación innecesaria o la interrupción de las células
Proporciona información celular Variable en función de la confluencia de las células
Rentable (si tiene el generador de imágenes) recuento relativa
La medición directa
automatizado de imágenes de formato de múltiples pocillos de la placa

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Discussion

En este protocolo se examinaron tres métodos diferentes de medir la proliferación celular en células cultivadas. Cada método era capaz de mediciones reproducibles y precisos de la proliferación celular en 96 horas, y los resultados fueron comparables entre cada uno de los métodos de prueba (Figura 2 y 3). Tanto el ensayo basado en luminiscencia y el método de formación de imágenes de células producen los resultados más robustos, mostrando aumentos lineales en la proliferación celular después de 96 hr (Figura 2b, c). Además, imágenes de células con el tiempo representado ninguna diferencia significativa en las tasas de crecimiento entre las líneas de células transducidas no transducidas y (Figura 4).

Hay muchas ventajas y desventajas de cada método examinados en este protocolo, véase la Tabla 5 para un resumen. El método de recuento celular convencional utilizando un hemocitómetro es un método de bajo costo que requiere muy poco reactivos o EFFO adicionalesrt para preparar y ejecutar. Además, este método cuantifica un recuento absoluto de células en células / ml 14. Sin embargo, hay serias desventajas, que incluyen el tiempo naturaleza del recuento de células, altas tasas de error que da lugar a grandes desviaciones estándar entre los conteos, y el hecho de que una alta gama de números de células son necesarios para el recuento de células precisos. Esto se puede ver en la figura 2a, donde el recuento de células usando el hemocitómetro mostró resultados variables en las bajas densidades celulares, y las grandes desviaciones estándar en los puntos de tiempo posteriores. Estos inconvenientes hacen que este método útil para el recuento de células de pequeños tamaños de muestra, e inadecuada para las mediciones de alto rendimiento más grandes donde se requieren pequeños tamaños de placas y densidades de siembra. Estas limitaciones podrían ser aliviados si se aumentó la densidad celular, de manera que el número mínimo de células contadas comenzó en un umbral de más de 100 células. Cuanto más diluido la suspensión celular, o bajar la célula density, la mayor posibilidad de contar menos de 100 células y por lo tanto el aumento de la variabilidad entre repeticiones 15. Sin embargo, este método no es adecuado para una placa de 96 pocillos, debido a la zona de la superficie celular baja, y por lo tanto, el número insuficiente de células que se puede utilizar en el análisis. Esto pone de relieve la falta de capacidades de alto rendimiento de este método y una clara desventaja para los usuarios que requieren esta capacidad.

El ensayo basado en luminiscencia determina la viabilidad celular mediante la medición de la cantidad de ATP, que es una medida de la presencia de células metabólicamente activas 16. Este ensayo está diseñado para cribado de alto rendimiento de múltiples muestras en un formato de placa de 96 pocillos para determinar la proliferación celular. Este sencillo método cuantifica la proliferación celular como una unidad de luminiscencia relativa (RLU) utilizando un lector de placas, que es proporcional a la ATP presente en las células metabólicamente activas. Sin embargo, la principal desventaja de este método es tl costo del reactivo, y la dependencia de la medición de la actividad metabólica de las células. Varias condiciones de cultivo celular, tales como puntos de temperatura o de tiempo del ciclo celular, pueden afectar fácilmente la cantidad de ATP producido por las células, que es directamente proporcional a la señal luminiscente generada por el ensayo de 17. Por lo tanto, es importante determinar empíricamente que las condiciones del experimento no interfieren con la actividad metabólica de las células y, potencialmente, impiden la señal luminiscente relativa generada por las células.

El tercer método examinado para determinar la proliferación celular era un generador de imágenes de células vivas y software para llevar a cabo un recuento de células relativo. El generador de imágenes de células tiene capacidades de alto rendimiento, ya que se puede automatizar para capturar varias imágenes para cada pocillo, en tiempo real, junto con el control de la temperatura, utilizando las mismas células durante la duración del ensayo. Como se muestra en la Figura 4, la proliferación celular puede ser monitored en la misma placa sobre un curso de tiempo, que puede proporcionar información adicional sobre la población de células junto con el análisis de recuento celular. Esto es muy ventajoso ya que elimina la variabilidad transversal placa y error la siembra de células, que es común en 96 formatos de placa de pocillos. El software que acompaña a la impresora de imágenes de células permite la cuantificación de los recuentos de células utilizando los parámetros descritos en la Tabla 2 y 3. Es por lo tanto útil en un entorno de alto rendimiento y puede ser fácilmente multiplexa a otros ensayos para medir las funciones celulares como la apoptosis o citotoxicidad. Una desventaja importante del sistema es el software, que está limitada en su capacidad de dividir tocar objetos. Mientras que puede realizar esta función en las células de confluencia más bajos, es una de las principales limitaciones del ensayo y por lo tanto requiere de tipo celular optimización específica. También, mientras que los experimentos individuales utilizando un generador de imágenes son muy bajo costo en una escala placa por placa, este método haría enLy ser rentable si el instrumento ya está configurado en un laboratorio. Por lo tanto, esto proporciona un nuevo método para la medición de la proliferación celular de las células cultivadas, y tiene la gran ventaja de que no requiere reactivos adicionales, y es capaz de recuento automatizado placa de 96 pocillos, haciendo de este método apropiado para el análisis de alto rendimiento. Esta es una mejora significativa en el método de recuento de células hemocitómetro convencional, y es un costo de la opción más eficaz para el ensayo basado en luminiscencia.

El paso crítico cuando se utiliza el generador de imágenes de células es durante el análisis de las imágenes capturadas y posterior recuento de células por imagen. Estas imágenes se pueden procesar utilizando un número de plataformas de formación de imágenes de células. Por tanto, es de suma importancia para determinar el software más apropiado para el tipo de células bajo investigación. Sería útil para validar los recuentos de células a partir de las imágenes adquiridas por el generador de imágenes de células utilizando diferentes software de imágenes. Este protocolo se podría aplicar a unacélulas cultivadas de y, sin embargo los parámetros de análisis tendrían que ser definida para cada línea celular. Esto puede llevar mucho tiempo al principio, pero una vez que se han establecido los parámetros, el método puede ser automatizado de placas enteras imagen a la vez.

Es importante señalar que estos ensayos son de hecho una medida indirecta de la proliferación, ya que miden el número de células (hemocitómetro, generador de imágenes de células), o la actividad metabólica (ensayo basado en luminiscencia), durante un período de tiempo. Estos métodos pueden ser modificados fácilmente para medir otros factores importantes que pueden influir en la proliferación. Por ejemplo, el método de exclusión con azul de tripano fácilmente puede ser incorporado en el método de hemocitómetro o imager célula para excluir las células muertas y por lo tanto determinar la viabilidad celular 13. El ensayo basado en luminiscencia se puede multiplexar con un ensayo de citotoxicidad para proporcionar información adicional acerca de la salud celular, y la actividad metabólica medida durante este ensayo es también una medida de viabi céluladad 12. Por lo tanto, la flexibilidad de estos ensayos para ser multiplexada con otros ensayos para proporcionar información celular adicional es una fuerte ventaja de cada uno de estos métodos.

Este protocolo utiliza la línea celular de cáncer de mama humano MCF-7 que han sido establemente transducidas con el Lego-ig2-puro + vector que contiene el gen GFP. Esto permite el uso del filtro de la óptica GFP a la imagen de las células, sin la necesidad de añadir ningún agente colorante en el medio de cultivo. Este método se puede modificar fácilmente para células GFP-negativo de imagen o incluso líneas celulares primarias, ya sea por la formación de imágenes de las células utilizando el tipo brillante óptica de campo, o por marcación de las células con un marcador de proliferación. Los métodos de comparación en este protocolo son suficientes para ser utilizado en una amplia variedad de diferentes líneas celulares robusta, sin embargo la configuración del protocolo óptimas para cada línea de células individuales deben determinarse primero. Obtención de imágenes de células utilizando el canal de campo claro representa la mejor opción para ce primariaLLS o los que son de crecimiento lento, debido a la naturaleza a largo plazo de este método. ensayos de punto final, tales como el ensayo basado en luminiscencia, no son muy adecuados para el análisis de crecimiento de las células a largo plazo.

Este protocolo ha descrito tres métodos diferentes para medir la proliferación celular in vitro. Cada método se puede realizar de forma rutinaria en el laboratorio para medir el crecimiento celular, y la mayoría de los laboratorios podría poseer las habilidades necesarias para llevar a cabo uno de estos métodos. Sin embargo, también hay una serie de otros ensayos disponibles para la medición de las células en división. Estos pueden incluir los métodos que miden la síntesis de ADN, la actividad metabólica, antígenos asociados de la proliferación o la concentración de ATP 9. Por ejemplo, un número de ensayos han sido desarrollados para medir la tasa de síntesis de ADN de las células mediante el etiquetado de las células con una sustancia radiactiva, tal como 3H-timidina. Un inconveniente de este método es el uso evidente de sustancias radiactivas, y su eliminación. Otrométodos que se utilizan rutinariamente para medir la proliferación de células incluyen el uso de BrdU etiquetado de ADN recién formado, que puede ser medida mediante citometría de flujo 18. La citometría de flujo se puede utilizar para analizar tanto el número de células así como la información del ciclo celular. Esto puede ser un resultado ventajoso para experimentos particulares, sin embargo las desventajas de este método incluyen el tiempo adicional y pasos, reactivos caros y el aumento de habilidades entrenados por el usuario con el fin de operar el citómetro de flujo y analizar los datos resultantes 18. Por lo tanto, hay muchos ensayos disponibles para los científicos para evaluar el crecimiento de las células, y el método elegido depende en gran medida del tipo de célula usado, el usuario y su nivel de habilidad, y el tipo de los datos requeridos en el punto final del experimento.

En conclusión, tres métodos diferentes de medir la proliferación celular se compararon utilizando células de cáncer de mama. Cada método tiene muchas ventajas y disadvantagES, y por tanto es fácil de dependiente y en función de sus requisitos de cada experimento, en términos de determinar el ensayo más adecuado para llevar a cabo el recuento de células.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red ThermoFisher Scientific 21063-045 Supplemented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 µg/ml insulin and 1 µg/ml puromycin
L-glutamine solution (100x) ThermoFisher Scientific 25030-081
Insulin solution human Sigma-Aldrich I9278-5ML
Fetal bovine serum (FBS) Bovogen Biologicals SFBS-F-500ml
Puromycin dihydrochloride Sigma-Aldrich P9620-10ML
0.5% trypsin-EDTA solution (10x) ThermoFisher Scientific 15400-054 Dilute to 2x in DPBS
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x) ThermoFisher Scientific 30028-02
Tissue culture flask, 75 cm2 growth area Greiner Bio-One 658175
Scepter 2.0 Cell Counter Merck Millipore Automated cell counter
96 well multiwell plate, flat bottom Nunc 167008
Improved Neubauer Hemocytometer BOECO Germany BOE 01
Olympus IX51 inverted microscope Olympus IX51
CellTiter-Glo 2.0 Assay Promega G9242 Luminescence-based assay
Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader BioTek Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging
Gen5 Data Analysis Software BioTek GEN5

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References

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