Vergleich von drei verschiedenen Methoden zur Bestimmung Zellproliferation in Brustkrebs-Zelllinien

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Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. J. Vis. Exp. (115), e54350, doi:10.3791/54350 (2016).

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Abstract

Introduction

Der Tumor - Suppressor - Gen, p53, ist ein wesentlicher Regulator von einer Anzahl von zellulären Prozessen, einschließlich der Zellzyklusarrest, Apoptose und Seneszenz 1. Es ist verantwortlich für genomische Stabilität beibehalten wird, und ist daher von entscheidender Bedeutung, das Gleichgewicht von Zelltod und Zellwachstum aufrechtzuerhalten. Mutationen in p53 sind häufig in Krebs und sind die Hauptursache der p53 - Inaktivierung zu unkontrollierter Zellproliferation Krebs führenden 2. Interessanterweise p53 - Mutationen in machen nur etwa 25% der Brustkrebse 3, was vermuten lässt , dass andere Mechanismen für den Verlust der p53 - Funktion verantwortlich sind. Die kürzlich entdeckten p53 - Isoformen wurden in einer Reihe von menschlichen Krebsarten überexprimiert gezeigt zu werden, und kann p53 - Funktion 4,5 modulieren. Wir haben gezeigt, dass die zuvor p53 Isoform, Δ40p53, ist die stark exprimiert Isoform bei Brustkrebs und deutlich in Brustkrebszellen hochreguliert wird, wenn in den normalen benachbarten tiss verglichenue 6. Im Anschluss daran transduzierten wir stabil den menschlichen Brustkrebszelllinie MCF-7 Δ40p53 mit dem lego-iG2-puro + Vektor (GFP +) 7 überexprimiert. Diese Zellen wurden verwendet, um zu untersuchen, ob hohe Δ40p53 Ausdruck erhöht die Zellproliferationsraten in Brustkrebszellen.

Es gibt viele direkte und indirekte Methoden der Zellproliferation von kultivierten Zellen in vitro 8,9 gemessen wird . Diese können entweder als kontinuierliche Messungen über die Zeit durchgeführt werden, oder als Endpunkt - Assays 10. Herkömmliche Verfahren sind immer noch nützlich, wie beispielsweise Zellzählung unter Verwendung eines Hämozytometers. Dieser Assay ist eine kostengünstige und direktes Maß für die Zellzahl, es gibt aber verlassen sich auf große Zellzahlen und hoch qualifizierten Trainingsfehler und großen Standardabweichungen von den Zählungen zu minimieren. Die Notwendigkeit, die Messungen durchführen kompatibel mit Hochdurchsatz-Format hat zur Entwicklung von Multi-Well-Platte-Assays führte. Diese Lumineszenz-basierten Assays Measure Zellzahlen auf einem Leuchtsignal basiert, die auf die Stoffwechselaktivität der Zelle 11,12 proportional ist. In jüngerer Zeit hat die Einführung von hohen Gehalt Bildgebungsplattformen für neue Werkzeuge erlaubt , die Zellproliferation zu überwachen , während quantitative und qualitative phänotypischen Datenerfassung, und enthält eine Vielzahl von Systemen 13. Alle diese Verfahren bieten Wege Zellwachstum entweder durch kontinuierliche Messung oder Endpunktassays und besitzen jeweils eine Reihe von Vor- und Nachteile in Bezug auf Empfindlichkeit, den Durchsatz von Musternummern und Zelleninformation, welche alle entsprechend abgewogen werden je kann zu messen auf die Forschungsfrage.

Dieses Protokoll beschreibt drei verschiedene Methoden zur Messung der Zellproliferation in vitro, wobei jedes Verfahren verschiedene Bereiche der Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Multi-Well - Plattenformate verwendet. Dieses Protokoll zum Ziel, die Verwendung eines Hämocytometer Zählen cha zu vergleichenmber eine Lumineszenz basierenden Zelllebensfähigkeitstest und Zell Imager, in der Messung der Zellproliferation über einen Zeitverlauf 96 Stunden. Dazu wurde das Wachstum von Vektor-transduzierten Zellen (MCF-7-LeGo) im Vergleich zu Zellen transduziert zu überexprimieren Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), drei unterschiedliche Zelldichten verwenden. Zellproliferation wurde alle 24 Stunden gemessen, bis zu 96 Stunden. Jede Methode wurde gefunden, seine eigenen Vorteile und Nachteile haben, und je nach dem Ziel des Experiments jeweils noch eine wertvolle Methode für Informationen über die Proliferationsrate bereitstellt.

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Protocol

1. Vorbereiten Zellen für Proliferationsassays

Hinweis: Vorbereiten der zwei Zelllinien in der gleichen Weise und Saatgut in demselben Format für jede Methode analysiert werden.

  1. Wachsen MCF-7-lego und MCF-7-Δ40p53 7 - Zellen zu 75-80% Konfluenz in T 75 cm 2 Gewebekulturflaschen mit Phenolrot-freiem Dulbecco modifiziertem Eagle - Medium (DMEM) , ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) , 200 mM L-Glutamin, 2 & mgr; g / ml Insulin und 1 & mgr; g / ml Puromycin bei 37 ° C mit 5% CO 2. Behandeln Sie Zellen in einem sterilen Biosicherheitsschrank Klasse II.
    Anmerkung: Die Menge der Zeit es braucht, um die Zellen zu Konfluenz wachsen variiert je nach der Aussaat Verdünnung. In Vorbereitung für die Plattierung der Zellen für die Proliferationsassays, Samen, die Zellen in einer 1: 3-Verdünnung in DMEM, ergänzt und in normalen Wachstumsbedingungen für 3 Tage, bis 75-80% Konfluenz erhalten.
  2. Um die Zellen aus dem Kolben zu entfernen, abgießen, die Medien ineinen Abfallbehälter. Ab sofort waschen Sie die Zellschicht mit 2 ml vorgewärmten 2x Trypsin. Absaugen Trypsin. Fügen eine weitere 2 ml vorgewärmtes Trypsin zu der Zellschicht und in einen Inkubator für 5 min bei 37 ° C mit 5% CO 2.
    1. Sobald die Zellen lösen, waschen Sie die Zellen mit 10 ml erwärmter frisches DMEM ergänzt. Übertragen die Zellsuspension in ein steriles 15 ml-Röhrchen und zentrifugiert bei 491 g für 5 min bei RT. vorsichtig absaugen und entsorgen Überstand.
  3. Zellpellet in 5 ml frischem ergänzten DMEM. Durchführen einer Zellzahl die richtige Dichte zu bestimmen, die Zellen in 96-Well-Platten auf Saatgut.
    1. Verdünnte 100 ul der Zellsuspension in 900 ul 1x Dulbecco-Phosphat-gepufferter Saline (DPBS). Legen Sie eine neue 60 & mgr; m-Sensor auf der automatisierten Zellzähler. Halten Sie den Kolben nach unten und tauchen Sie den Sensor in der verdünnten Zellsuspension. Geben Sie langsam den Kolben auf der Zellzähler. Entfernen Sie den Sensor aus der Zelle counter wenn sie abgeschlossen sind.
      Anmerkung: Die Zellzahl wird auf der Zellzähler in Zellen / ml angezeigt.
  4. Samenzellen in einem Endvolumen von 100 & mgr; l (in DMEM) in einer 96-Well - Platte bei ~ 20% Konfluenz zu ermöglichen Raum für das Zellwachstum und die Messung der Proliferation über 3-5 Tage (siehe Tabelle 1). Samen alle Zelllinien in dreifacher Ausfertigung.
    Hinweis: Bei diesem Experiment wurden drei verschiedene Zelldichten beurteilt die optimale Zelldichte zu bestimmen. Die erforderlichen Zellzahlen sind in Tabelle 1. Seed - Zellen mit einer geringeren Dichte , wenn die Messung von mehr langfristiges Wachstum zusammengefasst erforderlich.
    1. Für die Hämozytometer und Lumineszenz-basierten Assays, bereiten eine Platte pro Zeitpunkt (dh 4 Platten pro Test). Für die Zell Imager Assay vorbereitet nur eine Platte für die Dauer des Experiments.
  5. Pflegen Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 24 Std.

2. Festlegung der Zellzahl Using einem Hämocytometer

  1. Vorwärmen sowohl mittlere als auch Trypsin bis 37 ° C in einer Zellkultur-Inkubator, Ofen oder Wasserbad. Aspirat Medien von Zellen in einen Abfallbehälter, wäscht einmal mit 30 ul 2x Trypsin und Trypsin die anzusaugen.
  2. Wash-Zellen wieder mit 30 ul 2x Trypsin und Inkubation für 5 Minuten bei 37 ° C. Klopfen Sie leicht Rand der Platte Zellen von der Platte zu entfernen. Zugabe von 50 & mgr; l DMEM, ergänzt und mischen Zellen durch Pipettieren, bis die Zellen eine Einzelzellsuspension zu bilden.
  3. Bereiten Sie Hemocytometer durch Oberfläche und Glasabdeckung mit 70% Ethanol reinigen.
  4. Legen Sie die Glasdeckglas über Zählkammern und bringen bis "Newtons Refraktion Ringe" werden kann zwischen den Deckglaskanten und der Hemocytometer gesehen.
    Hinweis: Diese zeigen an, dass das Deckglas richtig an den Hemocytometer eingehalten hat.
  5. Pipette vorsichtig 20 & mgr; l der Zellsuspension unter dem Deckglas, durch kapillare Bewegung der Zählkammer füllt.Legen Sie Hämozytometer unter 10-facher Vergrößerung eines Mikroskops und visualisieren die Zählkammern im Grid-Layout.
  6. Zählen von Zellen in den vier äußeren Plätzen der Grid-Layout. Zur Verbesserung der Genauigkeit, die Anzahl der Wiederholungen von zusätzlichen äußeren Quadrate , falls erforderlich, oder bis der Zählwert hat 70 erreicht - 100 Zellen 14,15.
    1. Berechnen Zellkonzentration pro ml wie folgt: Durchschnittliche Zellzahl pro x Verdünnungsfaktor Quadrat (falls verwendet) x 10 4
  7. Wiederholen Sie die Schritte 2,1-2,8 alle 24 Stunden für 96 Stunden nach der Aussaat.

3. Bestimmung der Zellproliferation eine Lumineszenz-basierten Assay unter Verwendung von

Anmerkung: Dies ist eine Endpunktmessung. Sobald das Reagens zu den Zellen gegeben wird, kann die Platte nur einmal quantifiziert werden.

  1. Auftau Lumineszenzreagenz in einem 22 ° C Wasserbad für 30 min.
  2. Vorsichtig mischen Reagenz durch die Flasche Umkehren um eine homogene Mischung zu erhalten.
  3. Äquilibrieren einer Platte gesäten Zellen (aus Schritt1.5) bei RT für 30 min.
  4. Füge 100 & mgr; l Lumineszenzreagenz zu jeder Vertiefung. Mischungs Inhalt auf einem Orbitalschüttler für 2 min. Lassen Sie Platte für 10 min bei RT inkubiert.
  5. ein Lumineszenz-Experiment unter Verwendung der Multi-Mode-Plattenleser Software einrichten.
    1. Schalten Sie Multi-Mode-Plattenlesegerät und öffnen Sie die Software. In der "Task-Manager", wählen Sie "Experimente" und Datei "von Seite Symbolleiste, und unter" Protokoll "Registerkarte, wählen Sie 'Verfahren' 'new'.Select schaffen'.
    2. Wählen Sie 'Grenier 96 Flachboden' Plattentyp, und überprüfen Sie die "Verwendung Deckel" Box. Wählen Sie "lesen" Aktion unter "Leseverfahren" ein. Wählen Sie 'Lumineszenz' Nachweisverfahren. Klicken Sie auf "OK".
    3. Im Schritt Feld zu lesen, wählen Sie die Vertiefungen unter der "vollen Teller 'Tab gescannt werden, und wählen Sie Brunnen als leere Brunnen zu handeln.
    4. Stellen Sie den Filter auf leeren Filter (zB Stecker, Em: Loch, Spiegel: keine). Stellen Sie die Verstärkung135, mit einer Integrationszeit von 0,5 sec pro Vertiefung und eine Lese Höhe von 6,5 mm. Klicken Sie auf "OK" Einstellungen für die Lumineszenz Lese zu speichern.
  6. Durchführen eines lumineszenten lesen
    1. Auswurfplattenhalter von "Gerätesteuerung" Auswahl der Registerkarte, und klicken Sie auf 'Teller out'.Place 96-Well-Platte auf den Plattenhalter, den Deckel zu gewährleisten eingeschaltet ist. Schließen Sie den Plattenhalter durch einen Klick auf "Platte in" unter "Gerätesteuerung" Tab. Klicken Sie auf "jetzt" in der Symbolleiste Leuchtlese auszuführen.
    2. Exportieren Sie die relativen Leuchteinheit (RLE) Messungen für jede Vertiefung in eine Tabelle für die weitere Analyse.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,6 Proliferation alle 24 Stunden bis zu 96 Stunden nach dem Aussäen Zellen aufzuzeichnen.

4. Bestimmung Zellzahl unter Verwendung eines Zell-Imager

  1. Einrichten eines Cell-Imaging-Experiment unter Verwendung der Multi-Mode-Zelle Imager Software
    1. Schalten Sie Multi-Mode-Zelle-Imager und offen the Software.
    2. In der "Task-Manager", wählen Sie "Experimente" Tab und "erstellen new'.On 'Datei' Symbolleiste, klicken Sie auf" Protokoll "Registerkarte und offene" Verfahren "tab.Select" Soll-Temperatur "Aktion. Set Inkubator 'auf' und setzen die Temperatur auf 37 ° C und prüfen 'vorwärmen', bevor mit dem nächsten Schritt "Box weiter. Klicken Sie auf "OK" die Einstellungen zu speichern.
    3. Wählen Sie "lesen" Aktion. Klicken Sie auf "Bild" Erkennungsmethode, wählen Sie 'Endpunkt / kinetische' lesen Art und 'Filter' Optik-Typ. Klicken Sie auf "OK'.Click auf" Vollplatte "Menü und wählen Sie Vertiefungen auf der Platte abgebildet werden. Klicken Sie auf "OK", um die Einstellungen zu speichern.
    4. Wählen Sie das 2.5X Ziel aus dem Dropdown "Ziele" Optionen. Unter Registerkarte "Kanäle", wählen Sie zwei Kanäle: GFP 469, 525 und dem Hellfeld. Überprüfen Sie 'auto' Belichtung für beide Kanäle und wählen Sie die automatische Belichtung gut.
    5. Um zu bestimmen, auto Fokuseinstellungen, wählen Sie "Autofokus" und klicken Sie auf "Optionen". Für die Autofokus-Optionen, wählen Sie die "Scan und dann Autofokus" -Methode. Klicken Sie auf "OK" die Einstellungen zu speichern.
    6. Stellen Sie die horizontalen und vertikalen Versatz von der Mitte des gut (um) bis 0.Select mehrere Bilder pro Vertiefung in einem 3 x 2 Montage, mit horizontalen Abstand (um) = 2881 und vertikalen Abstand (um) = 2127 zu scannen. Klicken Sie auf "OK" -Verfahren Einstellungen zu speichern.
      Hinweis: Siehe Tabelle 2 für den Leseparameter.
  2. Performing lesen Experiment zu ausgewählten Platte
    1. Klicken Sie auf "Gerätesteuerung" Menü und wählen Sie die "plate out" function.Place 96-Well-Platte in Plattenhalter, den Deckel zu gewährleisten eingeschaltet ist. Unter der Registerkarte "Gerätesteuerung", wählen Sie die "Platte in" Funktion. Wählen Sie "jetzt" von der Platte Registerkarte. Wiederholen Sie alle 24 Stunden bis zu 96 Stunden nach der Aussaat lesen.
  3. Die Analyse der Zellzahl unter Verwendung derHandy Imager Software.
    1. Um ein Bild zu analysieren, klicken Sie auf den "Daten" auf die Registerkarte bebilderte Platte, wählen Sie 'Bild [GFP 469, 525 + Hellfeld]'. Klicken Sie doppelt auf ein gut abgebildet.
    2. Klicken Sie auf ein geladenes Bild. Wählen Sie "analysieren" und wählen Sie ein einzelnes Bild der Montage analysiert werden. Klicken Sie auf "OK'.Check die" GFP "Kanal nur, und Parameter wie in Tabelle 3 dargestellt. Klicken Sie auf" START "Parameter auf die abgebildeten Zellen anzuwenden.
    3. Beobachten der Zellzählung Maske über den abgebildeten Zellen gegeben, die verwendet wird, um die Zellzahl pro Bild zu bestimmen. Klicken Sie auf "Änderungen übernehmen" und halten Sie diese Einstellungen für jede Platte während des gesamten Experiments abgebildet.
    4. Wieder zurück auf der bebilderte Platte, klicken Sie auf den Drop 'data' down-Menü und wählen Sie "Zellzahl". Dadurch wird die Gesamtzellzahl pro Vertiefung erzeugen.
    5. Exportieren Sie alle Daten in eine Tabelle auf der "Export" Register für die weitere Analyse o durch einen Klickf die Zellzahl pro Vertiefung.

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Representative Results

Zur Untersuchung der verschiedenen Methoden, die Proliferation von kultivierten Zellen zu messen, die Zellproliferation von MCF-7-Zellen transduziert Δ40p53 wurde im Vergleich zu den nicht-transduzierten MCF-7-LeGo Brustkrebszelllinie. Die drei Verfahren , die verglichen wurden , - das herkömmliche Verfahren Hämozytometer, die Lebensfähigkeit der Zellen Lumineszenz - Assay und Zellabbildungs ​​Auswertung- in der schematischen Darstellung (Abbildung 1) beschrieben werden. Jede Methode hat Vorteile und Nachteile genau Zellzählung über die Zeit zu messen und die effektivste Methode hängt von den Anforderungen Endpunkt des Experiments und die Informationen, die für eine Zellpopulation erfasst werden kann.

Das Wachstum von MCF-7-Lego und MCF-7- Δ40p53 Zellen wurden 4 Tage nach 24 h gemessen. Wie in 1 gezeigt ist , wurden die beiden Zelllinien bei drei verschiedenen Zelldichten ausgesät (1,5 x 10 3 3; 5 x 10 3 Zellen / Vertiefung) und Zellzählung wurde durchgeführt , 24, 48, 72 und 96 h nach dem Aussäen. Jede Methode zeigte erhöhte Zellproliferation, die unter Verwendung eines Hämozytometers, eine Lumineszenz basierenden Assays, und eine Zelle Imager (Figuren 2a, b und c, jeweils) über 96 Stunden. Die größte Zunahme der Zellproliferation wurde bei der höchsten Zelldichte (5 x 10 3 Zellen) zu sehen, und zeigte auch die am besten reproduzierbaren Ergebnisse zu jedem Zeitpunkt, was darauf hindeutet , das die optimale Zelldichte in diesen Zellen zur Messung der Proliferation zu sein. Es gab keinen signifikanten Unterschied bei der Zellproliferation zwischen den Zelllinien.

Die Messung der Zellproliferation zwischen den verschiedenen Methoden wurde durch eine lineare Regressionsanalyse 6 (; Tabelle 4 3) verglichen. Es gab eine signifikante Korrelation zwischen jeder der verschiedenen Verfahren getestet, bei einem Vergleich cell - Proliferation bei allen Zelldichten in beiden Zelllinien (3a und b). (; R 2 = 0,9805, p ≤0.0001, Figur 3a und b jeweils R 2 = 0,8899, p ≤0.0001) die stärkste Korrelation zwischen dem Vergleich der Lumineszenz basierenden Assays, und der Zellenabbildungsvorrichtung beobachtet.

Eine visuelle Darstellung der Zellproliferation , die Zell Imager gezeigt (Abbildung 4). Da dieses Verfahren kontinuierliche Messungen einer einzelnen Platte verwendet, können die Zellen alle 24 Stunden abgebildet werden, bis die Zellen nahe an 100% Konfluenz erreichen. Wie in Abbildung 2 gezeigt, waren die Wachstumsraten der MCF-7-lego und MCF-7-Δ40p53 Zellen in allen Zeitpunkten vergleichbar. Diese Methode liefert nützliche zelluläre Informationen, einschließlich in der Lage, visuell das Zellwachstum über mehrere Tage zu überwachen, und die Zellgröße und Zell Morpho vergleichenlogie zwischen den verschiedenen Zelllinien.

Abbildung 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der drei verschiedenen Methoden Zellproliferation Messzellen wurden bei drei verschiedenen Zelldichten ausgesät in mehrere 96-Well - Platten und bei 37 ° C mit 5% CO 2 für bis zu 96 Stunden.. Jede 24 Stunden, die Zellproliferation entweder durch Verwendung eines Hämocytometer, einen Lumineszenz-basierten Assays oder Cell Imaging gemessen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2:. Zellproliferation Messungen nach 96 Stunden Zellzählungen wurden alle 24 Stunden für 96 Stunden in MCF-7-LEG gemessenO und MCF-7-Zellen Δ40p53 an drei unterschiedlichen Zelldichten beimpft. Zellzählungen wurden unter Verwendung eines (a) Hämocytometer in Zellen / ml, (b) unter Verwendung eines Lumineszenz basierenden Assays in relativen Lumineszenz - Einheiten (RLU) oder (c) eine kontinuierliche Zellzahl unter Verwendung einer Zelle Imager in Zellen / Bild gemessen. Die Bedingungen für die Zelle Imager in Tabelle 2 Alle Versuche stellen den Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten ± SD gezeigt werden Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung . 3: Vergleich von drei verschiedenen Methoden zur Messung von Zellproliferation in Brustkrebs-Zelllinien Eine lineare Regressionsanalyse wurde durchgeführt , um die korrelative Beziehungen zwischen den verschiedenen m zu vergleichen ethoden zur Messung der Zellproliferation in (a) MCF-7-Zellen LeGo und (b) MCF-7-Zellen untersucht Δ40p53. Ein Pearson-Korrelationskoeffizient wurde berechnet und die Signifikanz wurde bestimmt (p <0,05) zwischen den verschiedenen Meßmethoden Zellproliferation. Alle Ergebnisse stellen den Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abb . 4: Bilder von GFP-positiven MCF-7-Lego und MCF-7-Brustkrebszellen Δ40p53 Repräsentative Bilder der Zellen von 5 x 10 3 ausgesäten Zellen alle 24 Stunden unter Verwendung eines Zell - Imager erfasst. Der Maßstab repräsentiert 1000 um. Parameter für die Zell-Bildgebung sind in Tabelle 2 zusammengefasst. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54350/54350fig4large.jpg" target = "_ blank"> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Zelldichte (Zellen / Vertiefung)
Zelltyp 1,5 x 10 3 3,0 x 10 3 5 x 10 3
MCF-7-lego 76 & mgr; l in 8,4 ml Medium 152 & mgr; l in 8,3 ml Medium 254 & mgr; l in 8,2 ml Medium
MCF-7-Δ40p53 93 & mgr; l in 8,4 ml Medium 185 & mgr; l in 8,3 ml Medium 308 & mgr; l in 8,2 ml Medium

Tabelle 1: Zellbesiedelung von Volumes für 96 - Well - Platten.

"Fo: keep-mit-next.within-page =" always "> Parameter lesen Plattentyp 96 gut Modus Image Objektiv 2.5X Farbe GFP (469, 525), Hellfeld Belichtung Auto Fokus Auto (Scan dann Autofokus)

Tabelle 2: Parameter lesen für Cell Imaging Mit dem Handy Imager.

Tabelle 3: Bildgebungsparameter für Zellzählung Analyse.

Imaging-Parameter
Schwelle 5000
Minimale Objektgröße (um) 30
Maximale Objektgröße (um) 300
MCF-7-lego
R - Quadrat p-Wert
Hemocytometer vs. Lumineszenz-basierten Assays 0,6301 0,0021
Handy - Imager vs. Hemocytometer 0,7524 0,0003
Lumineszenz-basierten Assays vs. Zelle Imager 0,8899 <0,0001
MCF-7-Δ40p53
R - Quadrat p-Wert
Hemocytometer vs. lumineszenz basierten Assay 0,8983 <0,0001
Handy - Imager vs. Hemocytometer 0,9303 <0,0001
Lumineszenz-basierten Assays vs. Zelle Imager 0,9805 <0,0001

Tabelle 4: Die lineare Regressionsanalyse der drei verschiedenen Verbreitungsmethoden getestet.

Methode Vorteile Nachteile Technische Hinweise Die fertige Ausgabe
Hemocytometer Kostengünstig Hohe menschliche Fehler mehrere Male Pipette auf Einzelzellsuspension herzustellen Zellen / ml
Erfordert minimale Ausrüstung Erfordert Einzelzellsuspension Führen Sie mehrere Zählungen Genauigkeit zu erreichen
Direkte Zellzahl Hohe Anzahl von Zellen für die genaue Beurteilung der Zellzahl erforderlich
Endpoint
Lumineszenz basierenden Assays Verwenden Sie mit Multi-Well-Plattenformate Teure Reagenzien Vor Licht schützen Relative Leuchteinheiten (RLU) / Well
Leicht durchzuführen Erfordert Leuchtplattenleser Fügen Sie Kontrollvertiefungen Hintergrund Lumineszenz zu bestimmen
Schnell-Test Temperaturempfindliche
Bietet die Lebensfähigkeit der Zellen Informationen Variabel in Abhängigkeit von Stoffwechselaktivität von Zellen
indirekte Messung
Endpoint
Handy - Imager Kontinuierliche Messung Teure Imager Stellen Sie sicher, Zelle Imager ist auf 37 ° C Zellen / Bild
Temperaturkontrolle Geschicklichkeit intensive Vermeiden Sie unnötige Erschütterungen oder Unterbrechung der Zellen
Bietet zellulären Informations Variable je nach Zusammenfluß von Zellen
Kostengünstige (wenn Sie den Imager) Relative Zählung
Eine direkte Messung
Automatische Abbildung von Multi-Well-Plattenformat

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Discussion

In diesem Protokoll drei verschiedene Methoden der Zellproliferation in kultivierten Zellen Messung untersucht. Jede Methode der Lage war, reproduzierbare und genaue Messungen der Zellproliferation über 96 h, und die Ergebnisse waren vergleichbar zwischen jedem der Verfahren getestet (Abbildung 2 und 3). Sowohl die Lumineszenz basierenden Assays und Zellbildgebungsverfahren erzeugt die robusteste Ergebnisse, linearen Anstieg der Zellproliferation nach 96 h zeigt , (2b, c). Zusätzlich dargestellt Cell Imaging im Laufe der Zeit keine signifikanten Unterschiede in den Wachstumsraten zwischen den transduzierten und nicht-transduzierten Zelllinien (Abbildung 4).

Es gibt viele Vorteile und Nachteile für jede Methode in diesem Protokoll untersucht, siehe Tabelle 5 für eine Zusammenfassung. Die herkömmliche Zelle Zählverfahren eine Zählkammer ist eine kostengünstige Methode, die sehr wenig zusätzlichen Reagenzien oder effo erfordertrt vorzubereiten und auszuführen. Darüber hinaus quantifiziert diese Methode eine absolute Zellzahl in Zellen / ml 14. Es gibt jedoch schwerwiegende Nachteile, was die zeitraubende Natur der Zellzählung umfassen Raten hoch Fehler, der in großen Standardabweichungen zwischen Zählungen führt, und die Tatsache, daß ein hoher Bereich von Zellzahlen notwendig sind für eine genaue Zellzählungen. Dies kann in Figur 2a zu sehen ist, wo die Zellzählung Hämozytometer zeigten unterschiedliche Ergebnisse bei den niedrigen Zelldichten und eine große Standardabweichung bei den späteren Zeitpunkten. Diese Nachteile machen diese Methode nützlich für die Zellzählung von kleinen Probengrößen und unzureichend für größere Hochdurchsatzmessungen, wo kleinere Plattengrößen und Einsaatdichten erforderlich sind. Diese Einschränkungen können gelindert werden, wenn die Zelldichte erhöht wurde, so daß die minimale Anzahl von Zellen bei einer Schwelle von mehr als 100 Zellen gezählt begann. Je mehr die Zellsuspension verdünnt oder in die Zelle d senkenichte, die größere Chance Zählen weniger als 100 Zellen und daher die Variabilität Erhöhung zwischen 15 nachbildet. Jedoch ist dieses Verfahren ungeeignet für eine 96-Well-Platte, aufgrund der geringen Zelloberflächenbereich und damit die unzureichende Anzahl von Zellen, die in der Analyse verwendet werden kann. Dies unterstreicht den Mangel an hohen Durchsatz Fähigkeiten dieses Verfahren und ein klarer Nachteil für die Benutzer, die diese Fähigkeit benötigen.

Die Lumineszenz basierenden Assays bestimmt durch Messung der Menge an ATP Lebensfähigkeit der Zellen, die 16 ist ein Maß für die Anwesenheit von metabolisch aktiven Zellen ist. Dieser Assay ist für Hochdurchsatz-Screening von mehreren Proben in einer 96-Well-Plattenformat ausgelegt Zellproliferation zu bestimmen. Diese einfache Methode quantifiziert Zellproliferation als eine relative Lumineszenz-Einheit (RLU) mit einem Plattenleser verwendet, die auf die ATP, die in den metabolisch aktiven Zellen proportional ist. Jedoch ist der Hauptnachteil dieser Methode ter Kosten für das Reagens und die Abhängigkeit der Messung auf der Stoffwechselaktivität der Zellen. Verschiedene Zellkulturbedingungen, wie Temperatur oder Zellzyklus - Zeitpunkten, kann leicht die Menge an ATP von den Zellen produziert beeinflussen, die direkt proportional zu dem Leuchtsignal wird durch den Test 17 ​​erzeugt. Daher ist es wichtig, empirisch zu bestimmen, dass die Bedingungen des Versuchs nicht mit der Stoffwechselaktivität der Zellen stören und potenziell die relative Lumineszenzsignal von den Zellen erzeugten behindern.

Das dritte Verfahren zur Bestimmung von Zellproliferation untersucht war eine Lebendzell Imager und Software eine relative Zellzahl auszuführen. Die Zelle hat Imager Hochdurchsatz-Funktionen, da es automatisiert werden kann mehrere Bilder für jede Vertiefung, in Echtzeit zusammen mit Temperatursteuerung, unter Verwendung der gleichen Zellen über die Dauer des Tests zu erfassen. Wie in 4 gezeigt ist , kann die Zellproliferation m seinonitored in der gleichen Platte über einen Zeitverlauf, die zusammen mit Zellzählung Analyse zusätzliche Informationen über die Zellpopulation zur Verfügung stellen kann. Dies ist sehr vorteilhaft, da sie Querplatte Variabilität und Zellaussaat Fehler beseitigt, die in 96-Well-Plattenformate alltäglich ist. Die Software der Zellenabbildungsvorrichtung begleitende ermöglicht die quantitative Bestimmung von Zellzahlen , die Parameter in Tabelle 2 und 3 skizziert werden. Es ist daher sinnvoll, in einem Hochdurchsatzaufbau und kann leicht an andere Assays gemultiplext werden, um zelluläre Funktionen wie die Apoptose oder die Zytotoxizität zu messen. Ein wesentlicher Nachteil des Systems ist die Software, die in ihrer Fähigkeit, zu spalten rührenden Objekte beschränkt ist. Während es diese Funktion in unteren Einmündung Zellen durchführen kann, ist es eine wesentliche Einschränkung des Assays und somit zelltypspezifische Optimierung erfordert. Auch während eines einzelnen Versuche Imager unter Verwendung sehr geringen Kosten auf einer Platte-für-Platte Maßstab Dieses Verfahren würde aufly kostengünstig sein, wenn das Gerät bereits in einem Labor eingerichtet ist. Daher stellt dies ein neuartiges Verfahren für die Zellproliferation von kultivierten Zellen zu messen, und hat den großen Vorteil, keine zusätzlichen Reagentien erfordern, und in der Lage ist 96-Well-Platte automatisierte Zählung dieses Verfahren geeignet für Hochdurchsatzanalyse zu machen. Dies ist eine wesentliche Verbesserung auf dem konventionellen Hämozytometer Zell Zählverfahren und ist ein kostengünstiger Option zur Lumineszenz basierenden Assays.

Der entscheidende Schritt, wenn die Zelle-Imager unter Verwendung ist bei der Analyse der aufgenommenen Bilder und anschließender Zellzahl pro Bild. Diese Bilder können unter Verwendung einer Anzahl von Zellbildgebungsplattformen verarbeitet werden. Es ist daher von größter Bedeutung, die am besten geeignete Software für den Zelltyp in Untersuchung zu bestimmen. Es wäre nützlich, um die Zellzahlen aus den Bildern von der Zelle Imager mit unterschiedlichen Imaging-Software erworben zu validieren. Dieses Protokoll könnte ein angewendet werdeny kultivierten Zellen, jedoch sind die Analyseparameter definiert für jede Zelllinie werden müssten. Dies kann Zeit sein, auf den ersten raubend, aber sobald die Parameter eingestellt worden sind, kann das Verfahren zu einem Zeitpunkt, zu Bild ganze Platten automatisiert werden.

Es ist wichtig zu beachten, dass diese Assays in der Tat ein indirektes Maß für die Proliferation sind, da sie die Zellzahl (Hämozytometer, Zell Imager) messen, oder die Stoffwechselaktivität (Lumineszenz basierenden Assays), die über einen Zeitraum. Diese Methoden können leicht zu messen andere wichtige Faktoren geändert werden, die Proliferation beeinflussen können. Zum Beispiel kann das Trypanblau-Ausschluss - Verfahren leicht in beiden Verfahren die Zählkammer oder Zell Imager integriert werden tote Zellen auszuschließen und damit die Lebensfähigkeit der Zellen 13 bestimmen. Die Lumineszenz basierenden Assays kann mit einem Zytotoxizitätstest gemultiplext werden, um zusätzliche Informationen über die Zellgesundheit zu schaffen, und die Stoffwechselaktivität bei diesem Test gemessen wird, ist auch eine Messung der Zell viabikeit 12. Daher kann die Flexibilität dieser Assays mit anderen Assays gemultiplext zusätzliche Informationen bereitzustellen zellulare ist ein starker Vorteil, jede dieser Methoden.

Dieses Protokoll verwendet, um die menschliche Brustkrebs-Zelllinie MCF-7, die mit dem lego-iG2-puro + Vektor enthält das GFP-Gen stabil transduziert wurden. Dies ermöglicht die Verwendung des GFP-Optik Filter zur Bild die Zellen, ohne die Notwendigkeit, irgendwelche Farbstoffmittel in das Kulturmedium hinzuzufügen. Dieses Verfahren kann leicht an image GFP-negativen Zellen oder primäre Zelllinien modifiziert werden, entweder durch die Zellen Abbilden des Hellfeldoptik-Typ, oder durch Markierung der Zellen mit einem Proliferationsmarker verwenden. Die Verfahren im Vergleich in diesem Protokoll sind robust genug, um in einer Vielzahl von verschiedenen Zelllinien verwendet werden, aber die optimale Protokolleinstellungen für jede einzelne Zelllinie sollte zuerst bestimmt werden. Imaging von Zellen des Hellfeldkanals unter Verwendung stellt die beste Option für die primäre cells oder solche, die langsam wachsen, aufgrund der langfristigen Charakter dieser Methode sind. End-Punkt-Assays, wie beispielsweise die Lumineszenz basierenden Assays, sind nicht gut geeignet für die Analyse von Langzeit-Zellwachstum.

Dieses Protokoll wurde zur Messung der Zellproliferation in vitro drei unterschiedliche Verfahren beschrieben. Jede Methode kann routinemäßig im Labor durchgeführt werden, das Zellwachstum zu messen und die meisten Labors würden die notwendigen Fähigkeiten besitzen eine dieser Methoden durchzuführen. Allerdings gibt es auch eine Reihe von anderen Assays für sich teilende Zellen zu messen. Diese können Verfahren umfassen , die DNA - Synthese zu messen, metabolische Aktivität, assoziierte Antigene der Proliferation oder ATP - Konzentration 9. Zum Beispiel wurde eine Reihe von Tests wurde die Rate der DNA-Synthese der Zellen durch Markierung Zellen mit einer radioaktiven Substanz, wie beispielsweise 3 H-Thymidin gemessen entwickelt. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist die offensichtliche Verwendung radioaktiver Substanzen und deren Entsorgung. AndereMethoden , die zur Messung der Zellproliferation routinemäßig verwendet werden , umfassen die Verwendung von BrdU - Markierung von DNA neu gebildet, die unter Verwendung von Durchflusszytometrie 18 gemessen werden kann. Durchflusszytometrie kann verwendet werden, um sowohl die Zellzahl als auch Zellzyklus Informationen zu analysieren. Dies kann ein vorteilhaftes Ergebnis für bestimmte Versuche sein, jedoch sind die Nachteile dieses Verfahrens umfassen die zusätzliche Zeit und Schritte, teure Reagenzien und eine erhöhte Benutzer ausgebildeten Fähigkeiten, um 18 das Durchflusszytometer und Analyse der resultierenden Daten zu betreiben. Daher gibt es viele verschiedene Assays zur Verfügung Wissenschaftler das Wachstum von Zellen zu bewerten, und die gewählte Methode ist weitgehend abhängig von der verwendeten Zelltyp, dem Benutzer und deren Fähigkeitsniveau und die Art der Daten am Endpunkt des Versuches erforderlich.

Abschließend wurden drei verschiedene Methoden zur Messung der Zellproliferation im Vergleich Brustkrebszellen verwendet wird. Jede Methode hat viele Vorteile und disadvantages und ist daher benutzerabhängig und basierend auf ihren Anforderungen für jedes Experiment in Bezug auf die am besten geeigneten Assay-Bestimmung Zellzählung durchzuführen.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red ThermoFisher Scientific 21063-045 Supplemented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 µg/ml insulin and 1 µg/ml puromycin
L-glutamine solution (100x) ThermoFisher Scientific 25030-081
Insulin solution human Sigma-Aldrich I9278-5ML
Fetal bovine serum (FBS) Bovogen Biologicals SFBS-F-500ml
Puromycin dihydrochloride Sigma-Aldrich P9620-10ML
0.5% trypsin-EDTA solution (10x) ThermoFisher Scientific 15400-054 Dilute to 2x in DPBS
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x) ThermoFisher Scientific 30028-02
Tissue culture flask, 75 cm2 growth area Greiner Bio-One 658175
Scepter 2.0 Cell Counter Merck Millipore Automated cell counter
96 well multiwell plate, flat bottom Nunc 167008
Improved Neubauer Hemocytometer BOECO Germany BOE 01
Olympus IX51 inverted microscope Olympus IX51
CellTiter-Glo 2.0 Assay Promega G9242 Luminescence-based assay
Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader BioTek Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging
Gen5 Data Analysis Software BioTek GEN5

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References

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