शिक्षण प्रयोगशाला में लैक्टेज एंजाइमी गतिविधि को मापने

Biology
 

Summary

disaccharide लैक्टोज के catabolic प्रोसेसिंग के लिए लैक्टेज की एंजाइमी गतिविधि जरूरी है । यहां, लैक्टेज की गतिविधि पूरक आहार में पाया परख एक वर्णमिति परख का उपयोग कर रहा है । यह लैक्टेज और एंजाइम कैनेटीक्स की गतिविधि को समझने के लिए एक प्रयोगात्मक मंच के साथ छात्रों को प्रदान करता है ।

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Leksmono, C. S., Manzoni, C., Tomkins, J. E., Lucchesi, W., Cottrell, G., Lewis, P. A. Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab. J. Vis. Exp. (138), e54377, doi:10.3791/54377 (2018).

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Abstract

कैसे एंजाइमों काम समझ, और वास्तविक जीवन उदाहरण के लिए इस से संबंधित है, जैविक और जैव चिकित्सा विज्ञान में स्नातक की डिग्री की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए महत्वपूर्ण है । यह आसान प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए पहले वर्ष स्नातक फार्मेसी छात्रों के लिए विकसित किया गया था और एंजाइम विश्लेषण के लिए एक प्रवेश स्तर का परिचय प्रदान करता है और विश्लेषक प्रतिक्रियाओं के लिए विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं । विकल्प के एंजाइम लैक्टेज है, के रूप में यह एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानव रोग के लिए प्रासंगिक एंजाइम/दवा अभ्यास का एक उदाहरण का प्रतिनिधित्व करता है । लैक्टेज आहार अनुपूरक गोलियों से निकाला जाता है, और लैक्टेज के लिए एक कृत्रिम सब्सट्रेट के hydrolysis पर आधारित एक वर्णमिति परख का उपयोग मूल्यांकन (ऑर्थो-nitrophenol-बीटा-डी-galactopyranoside, ONPG). ऑर्थो की रिहाई-लैक्टेज द्वारा ONPG के hydrolytic दरार के बाद nitrophenol ४२० एनएम में अवशोषक में परिवर्तन द्वारा मापा जाता है, और एंजाइमी प्रतिक्रिया पर तापमान के प्रभाव के बाहर बर्फ पर प्रतिक्रिया ले जाने से मूल्यांकन किया है, कमरे के तापमान पर और ३७ पर ° c. और अधिक उंनत विश्लेषण विभिंन स्थितियों के तहत एंजाइम गतिविधि का आकलन है और विभिंन रिएजेंट का उपयोग करके इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर कार्यांवित किया जा सकता है ।

Introduction

एंजाइमों प्रोटीन का एक विशेष प्रकार है कि जीव1में रहने वाले रासायनिक प्रतिक्रियाओं के लिए जैविक उत्प्रेरक के रूप में कार्य कर रहे हैं । एंजाइमों की कार्रवाई जीवन के लिए महत्वपूर्ण है, ऊर्जा प्रदान करने, कचरे के निपटान और जीवों को कार्य करने की अनुमति । एंजाइमों को समझना है, इसलिए, जीवन की पूरी समझ के लिए महत्वपूर्ण है । इस तरह के ज्ञान विश्वविद्यालय स्तर के डिग्री कार्यक्रमों की एक विस्तृत विविधता के लिए आवश्यक है, चिकित्सा विज्ञान से जीव विज्ञान को लेकर. जबकि एक विस्तृत catalysis के सिद्धांतों से एंजाइम गतिविधि के सैद्धांतिक मॉडल को लेकर पृष्ठभूमि व्याख्यान और पठन सामग्री का उपयोग कर छात्रों को प्रदान किया जा सकता है, एंजाइम प्रतिक्रियाओं के गुणों का सबसे अच्छा व्यावहारिक अनुभव पर हाथ से समझ रहे हैं कार्रवाई में एंजाइमों के रूप में पहले2प्रदर्शन किया । इस प्रोटोकॉल एक सरल प्रयोगशाला शर्तों के तहत एंजाइम गतिविधि को मापने के लिए प्रयोगात्मक प्रतिमान का पालन करें, एक मानव पोषण और स्वास्थ्य के लिए प्रासंगिक गतिविधि के साथ एक एंजाइम का एक उदाहरण के रूप में लैक्टेज का उपयोग प्रदान करता है ।

glycosidic hydrolase लैक्टेज (ईसी 3.2.1.23/26) स्तनधारियों के लिए केंद्रीय पोषण महत्व के एक एंजाइम है3। लैक्टेज की गतिविधि अत्यधिक विकास के माध्यम से संरक्षित है, और बीटा-एंजाइमों के galactosidase परिवार से निकला- ई कोलाई से एक परिवार के माध्यम से होमो sapiens के लिए (चित्रा 1, PDB 1JZ8)4। एक मानव पोषण की स्थापना में लैक्टेज का महत्वपूर्ण महत्व इसके घटक monosaccharide घटकों में लैक्टोज के टूटने की अनुमति देने में अपनी भूमिका से उपजा है, जो तब शरीर में ऊर्जा उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । लैक्टेज catalyzes में glycosidic बांड की hydrolysis को disaccharide लैक्टोज, जारी गैलेक्टोज और ग्लूकोज (figure2)5. ये monosaccharides तो मुख्य रूप से साइट्रिक एसिड चक्र और ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण6के माध्यम से adenosine ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) की पीढ़ी के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । neonate और शिशु विकास के दौरान, लैक्टेज अत्यधिक मानव पाचन तंत्र में व्यक्त की है, जो लैक्टोज प्राथमिक कार्बोहाइड्रेट घटक है के स्तन के दूध से प्राप्त लैक्टोज को तोड़ने, और प्रारंभिक वर्षों के दौरान पोषण के प्रमुख स्रोतों में से एक 7. लैक्टेज के चिकित्सा महत्व जंमजात लैक्टेज कमी (CLD), एक दुर्लभ autosomal अवकाश लैक्टेज जीन (LCT) लैक्टेज एंजाइम8के लिए कोडिंग में उत्परिवर्तनों की वजह से स्थितिपर प्रकाश डाला है । CLD प्रदर्शन के साथ नवजात शिशुओं बहुत कम लैक्टेज गतिविधि, इस प्रकार वे मां के दूध, दूध के किसी भी अंय प्रकार, या लैक्टोज युक्त सूत्र पर नहीं खिलाया जा सकता है ।

बचपन के दौरान, लैक्टेज अभिव्यक्ति सामान्य रूप से कम है; हालांकि, प्रातः के बाद इस कमी भौगोलिक रूप से बदलता है, दुनिया भर में वयस्कों के लगभग ३५% के साथ एंजाइम9व्यक्त करने के लिए जारी । लैक्टेज की निरंतर अभिव्यक्ति, लैक्टेज हठ के रूप में जाना जाता है, व्यक्तियों के लिए स्रोतों की एक सीमा से दूध और डेयरी उत्पादों को पचाने में जारी रखने के लिए अनुमति देता है । इसके विपरीत, लैक्टेज अभिव्यक्ति की हानि लैक्टोज असहिष्णुता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, वयस्क प्रकार hypolactasia (एथलीट) के रूप में भी जाना जाता है, एक अक्षमता पेट में लैक्टोज को तोड़ने के लिए जिसके परिणामस्वरूप. एथलीट लैक्टोज खाद्य उत्पादों युक्त की घूस के बाद बृहदांत्र में लैक्टोज का निर्माण की विशेषता है । बृहदांत्र में, संचित लैक्टोज आंत माइक्रोबियल जीव द्वारा किण्वित है, हाइड्रोजन, मीथेन, और कार्बन डाइऑक्साइड सहित gasses जारी । लैक्टेज एंजाइम की कमी के साथ व्यक्तियों में इन गैसों का उत्पादन पेट की सूजन को बढ़ावा देने, बढ़ा पेट फूलना, दर्द, मतली, और borborygmi (पेट rumbling)7. पाचन तंत्र में लैक्टोज का बढ़ता स्तर भी ढीला मल के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

LCT जीन अभिव्यक्ति का नियंत्रण पास के MCM6 जीन के introns में स्थित बहुरूपताओं द्वारा संग्राहक है. लैक्टेज की निरंतर अभिव्यक्ति के साथ व्यक्तियों बहुरूपताओं ले कि LCT जीन अभिव्यक्ति के लिए मजबूत बाहर बढ़ाने के रूप में कार्य करते हैं, इस प्रकार प्रातः के दौरान LCT प्रतिलेखन के सामांय विनियमन नीचे क्षतिपूर्ति, और फलस्वरूप वयस्कता में लैक्टेज अभिव्यक्ति बनाए रखने3. बढ़ाने बहुरूपताओं को सकारात्मक ५००० साल पहले9,10से अधिक मध्य पूर्व में मवेशियों और ऊंटों के घरेलूकरण के बाद चुना गया है सुझाव दिया गया है ।

एथलीट से उत्पन्न लक्षण लैक्टोज का सेवन कम करके प्रबंधित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए आहार से डेयरी उत्पादों को हटाने के द्वारा. एथलीट के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण, और CLD के लिए पसंद के दृष्टिकोण, लैक्टेज की खुराक का उपयोग है, फार्मेसियों से व्यापक रूप से उपलब्ध है. इन की खुराक स्रोतों की एक किस्म से पृथक लैक्टेज प्रदान करते हैं, खमीर और बैक्टीरिया सहित, एक तरल या गोली आधारित रूप है कि के साथ लिया जा सकता है या लैक्टोज युक्त भोजन में जोड़ा । पूरक ग्लूकोज और गैलेक्टोज उत्पादों के लिए भोजन में मौजूद लैक्टोज का अनुपात hydrolyze जाएगा, इस प्रकार उनके अवशोषण की अनुमति और पेट में अपच लैक्टोज सब्सट्रेट के संचय को रोकने.

एक आहार सहायता के रूप में लैक्टेज की खुराक के उपयोग पर आधारित है, हम एक सरल enzymology प्रयोगशाला प्रयोग पहले साल के लिए उपयुक्त विकसित किया है बायोमेडिकल साइंस या फार्मेसी छात्रों । इस प्रयोगशाला प्रयोग व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लैक्टेज की खुराक का लाभ लेता है, और ऑर्थो का उपयोग करता है-nitrophenolबीटा-डी galactopyranoside (ONPG) वर्णमिति द्वारा glycosidic बांड के क्लीवेज को मापने के लिए एक लैक्टेज अंत बिंदु प्रदान करने के लिए ( चित्रा 3)11. ONPG लैक्टेज के लिए एक कृत्रिम सब्सट्रेट कार्य करता है, जो जब इस एंजाइम द्वारा hydrolysis के अधीन D-गैलेक्टोज और ऑर्थो-nitrophenol पैदा करता है. उत्तरार्द्ध उत्पाद एक पीला रंग है, ४२० एनएम के एक तरंग दैर्ध्य पर प्रकाश को अवशोषित । लैक्टेज को ONPG के जोखिम के बाद ४२० एनएम में अवशोषक में किसी भी परिवर्तन को बढ़ाता है, यह इस एंजाइम की गतिविधि का अनुमान लगाने के लिए संभव है । इस प्रयोगशाला प्रयोग एंजाइमी hydrolase गतिविधि का एक प्रदर्शन प्रदान करता है । अतिरिक्त दोहराने में निर्माण और विभिंन स्थितियों में परख बाहर ले जाने से, यह एंजाइम कैनेटीक्स के अधिक परिष्कृत विश्लेषण शामिल संभव है, मानव स्वास्थ्य के लिए प्रासंगिक कार्रवाई में एंजाइमों के एक मूल्यवान वास्तविक जीवन उदाहरण प्रदान ।

Protocol

नोट: नीचे दिया गया प्रोटोकॉल एक उद्देश्य से निर्मित शिक्षण प्रयोगशाला में दो घंटे (वर्ग कार्यपत्रकों के पूरा होने सहित) के पाठ्यक्रम पर आयोजित होने के लिए विकसित किया गया था । प्रयोगात्मक कदम जानबूझ कर एक साथ डाल रहे थे एंजाइम कैनेटीक्स का अधिक विस्तृत विश्लेषण बाहर (मॉडल डेटा का उपयोग कर इस पाठ्यक्रम के संदर्भ में किए गए); हालांकि-के रूप में चर्चा में उल्लेख किया-प्रोटोकॉल और अधिक उंनत विश्लेषण के लिए समय, सुविधाओं और छात्र प्राप्ति स्तर पर निर्भर करता है एक खाका उपलब्ध कराता है ।

सुरक्षा: यह व्यावहारिक अच्छा रासायनिक प्रयोगशाला अभ्यास के नियमों के अनुसार किया जाना चाहिए (GCLP)-व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण, बांधा प्रयोगशाला कोट सहित, डिस्पोजेबल दस्ताने और सुरक्षा चश्मा प्रयोगशाला में हर समय पहना जाना चाहिए .

1. एंजाइम निकालने

  1. एक भी पाउडर एक मोर्टार और मूसल का उपयोग करने के लिए, एंजाइम के २०० मिलीग्राम युक्त, एक लैक्टेज गोली क्रश ।
  2. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब लेबल "निलंबन" में परिणामी पाउडर प्लेस और १०० mM फॉस्फेट के 10 मिलीलीटर में resuspend (पंजाब) खारा ।
  3. 1 मिनट के लिए भंवर एंजाइम निष्कर्षण अधिकतम करने के लिए ।
  4. एक १.५ मिलीलीटर में निलंबन से 1 एमएल स्थानांतरण ट्यूब और १०,००० x g पर 1 मिनट के लिए तलछट ठोस कणों के लिए केंद्रापसारक ।
  5. स्थानांतरण ५०० µ l साफ करने के लिए supernatant की १.५ मिलीलीटर ट्यूब बला "लैक्टेज निकालें" ।

2. वर्णमिति प्रतिक्रिया अवलोकन

  1. प्लेस ३९० एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में १०० mM पंजाबियों के µ एल लेबल "रिएक्शन ए" ।
  2. जोड़ें 5 मिमी ONPG समाधान के १०० µ एल और अच्छी तरह से भंवर से मिश्रण ।
    चेतावनी: यह व्यावहारिक लैक्टोज के लिए एक विकल्प के रूप में ऑर्थो-Nitrophenol-बीटा-डी-galactopyranoside (ONPG) का उपयोग करता है । चूंकि ONPG एक phenolic यौगिक है, इसलिए इसे सावधानी के साथ संभाला जाना चाहिए । ONPG के साथ त्वचा के संपर्क की स्थिति में, उजागर त्वचा तुरंत धोया जाना चाहिए । किसी भी फैल तुरंत कागज तौलिए के साथ साफ किया जाना चाहिए के लिए उपयुक्त अपशिष्ट प्रवाह में से निपटा जाएगा ।
  3. प्रतिक्रिया एक ट्यूब में निकालने के 10 µ एल जोड़ें और भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण ।
  4. 5 मिनट के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण का निरीक्षण करें और समाधान करने के लिए किसी भी वर्णमिति परिवर्तन ध्यान दें ।

3. एंजाइम गतिविधि को मापने

  1. सेट अप दो १.५ मिलीलीटर ट्यूबों: एक लेबल "प्रतिक्रिया बी", एक लेबल "नियंत्रण" ।
  2. रिएक्शन बी ट्यूब के लिए १०० mm पंजाब के ३९० µ l को जोड़ें, १०० mm पंजाब के ४०० µ l को कंट्रोल ट्यूब पर और फिर हर ट्यूब पर 5 mm ONPG का १०० µ l जोड़ें ।
  3. सामग्री को भंवर से मिलाएं ।
  4. प्रतिक्रिया बी ट्यूब करने के लिए लैक्टेज निकालने के 10 µ एल जोड़ें, भंवर द्वारा मिश्रण और प्रतिक्रिया कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए आगे बढ़ने के लिए अनुमति देते हैं ।
  5. एक बार 1 मिनट गुजर गया है, दोनों ट्यूबों के लिए 1 मीटर सोडियम कार्बोनेट के ५०० µ एल जोड़ने के लिए पीएच बढ़ाने के द्वारा लैक्टेज एंजाइम को बाधित, जिससे प्रतिक्रिया समाप्त ।
  6. spectrophotometer का उपयोग कर ४२० एनएम में स्वच्छ spectrophotometer cuvettes और उपाय अवशोषक में प्रत्येक ट्यूब से ५०० µ एल स्थानांतरण ।
  7. टिप्पणी B और नियंत्रण नमूनों के लिए अवशोषण, और फिर सक्रिय एंजाइम की उपस्थिति में ONPG के hydrolysis के कारण अवशोषण में परिवर्तन प्राप्त करने के लिए प्रतिक्रिया मान से नियंत्रण मान घटाना ।

4. एंजाइम गतिविधि पर तापमान का प्रभाव

  1. तीन नियंत्रण ट्यूबों और तीन प्रतिक्रिया ट्यूबों सेट के रूप में खंड 3 में वर्णित है और इन लेबल "4 ° c", "कमरे में अस्थायी", और "३७ ° c".
  2. एंजाइम निकालने के बाद इसके अलावा, बर्फ पर एक ट्यूब, कमरे के तापमान पर एक, और ३७ डिग्री सेल्सियस (एक पूर्व गर्म पानी के स्नान में) पर एक मशीन ।
  3. 1 मिनट के लिए आगे बढ़ने के लिए प्रतिक्रियाओं की अनुमति दें और फिर प्रत्येक ट्यूब के लिए 1 मीटर सोडियम कार्बोनेट के ५०० µ एल जोड़कर प्रतिक्रिया समाप्त ।
  4. खंड 3 में वर्णित के रूप में प्रत्येक ट्यूब के लिए ४२० एनएम पर अवशोषक उपाय । प्रत्येक मामले में प्रतिक्रिया मान से नियंत्रण मान को घटा कर, मानों को रिकॉर्ड करें ।

Representative Results

प्रोटोकॉल के अनुभाग 2 के लिए प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 4aमें दिखाए जाते हैं । नियंत्रण प्रतिक्रिया, लैक्टेज एंजाइम के अभाव में, प्रतिक्रिया समाधान whilst स्पष्ट रहता है, लैक्टेज गोली से युक्त निकालने, ONPG के रूप में पीले रंग बदल जाता है hydrolyzed ऑर्थोजारी nitrophenol. चित्रा 4B प्रोटोकॉल की धारा 4 से मनमाना इकाइयों का उपयोग कर ठहराव से पता चलता है, spectrophotometer का उपयोग नमूनों के विश्लेषण के बाद । ऑर्थो-nitrophenol का उत्पादन सबसे कम है जब प्रतिक्रिया बर्फ पर मशीनी है, और सबसे अधिक जब प्रतिक्रिया ३७ डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है ।

Figure 1
चित्रा 1 : ई. कोलाई बीटा-galactosidase । (एक) ई कोलाईसे बीटा-galactosidase की क्रिस्टल संरचना, सक्रिय परिसर के tetrameric संरचना दिखा । () Allolactose (लाल रंग में दिखाया गया है) बीटा-galactosidase के सक्रिय साइट के लिए बाध्य । PDB 1JZ84से उत्पंन छवियां । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : लैक्टेज की एंजाइमी क्रिया । बीटा-डी-गैलेक्टोज और बीटा-डी-ग्लूकोज का उत्पादन करने के लिए लैक्टेज द्वारा लैक्टोज का Hydrolysis. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : Hydrolysis of ऑर्थो-nitrophenol- beta -डी-galactopyranoside । ONPG hydrolysis लैक्टेज द्वारा बीटा डी-गैलेक्टोज और ऑर्थो-nitrophenol का उत्पादन करने के लिए (जो रंग में पीला है), ४२० एनएम पर अवशोषक की माप द्वारा लैक्टेज गतिविधि के आकलन की अनुमति । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 4
चित्र 4 : ONPG hydrolysis. ONPG hydrolysis के प्रतिनिधि परिणाम, नियंत्रण और प्रतिक्रिया ट्यूबों दिखा () और वर्ग कार्यपत्रकों पर दर्ज प्रोटोकॉल के अनुभाग 4 से प्रतिनिधि डेटा, ४२० एनएम में मनमाने ढंग से इकाइयों में कच्चे अवशोषण दिखा रहा है, पृष्ठभूमि के लिए सही है और तीन अलग तापमान पर (बी) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्रायोगिक शर्त प्रायोगिक चर
तापमान 0 ° c, 10 ° c, 20 ° c, 30 ° c, ५० ° c
सब्सट्रेट एकाग्रता 0 मिमी, 1 मिमी, 5 मिमी, 10 मिमी ONPG
प्रतिस्पर्धी निषेध 5 मिमी ONPG प्लस 0 मिमी, 1 मिमी, 5 मिमी, या 10 मिमी लैक्टोज
समय निर्भरता 0 एस, 15 एस, 30 एस, 1 मिनट, 5 मिनट, 10 मिनट, 20 मिनट
हीट विकार लैक्टेज निकालने के लिए गरम १०० ° c 10 मिनट के लिए पहले परख

तालिका 1: संभावित विस्तारित प्रायोगिक शर्त। सुझाए गए प्रयोगों, तपसिल में किए जाने वाले, लैक्टेज जीव विज्ञान के विशिष्ट पहलुओं की जांच.

Discussion

एक विस्तृत ज्ञान और एंजाइम, एंजाइमी प्रतिक्रियाओं और एंजाइम कैनेटीक्स की समझ जीव विज्ञान, जैव चिकित्सा और औषध फैले विषयों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए आवश्यक है. प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित एक एंजाइमी प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन करने के लिए मानव स्वास्थ्य के लिए प्रासंगिक एंजाइम का एक उदाहरण के रूप में लैक्टेज का उपयोग करता है, महत्वपूर्ण कौशल है कि और अधिक उंनत प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया जा सकता है प्रयोगों आधारित प्रदान ।

इस प्रोटोकॉल को जानबूझकर के रूप में संभव के रूप में मजबूत बनाया गया है, कम या कोई गीला प्रयोगशाला अनुभव के साथ छात्रों की अनुमति के लिए समय की एक छोटी जगह में व्याख्यात्मक परिणामों का उत्पादन । 2014/2015 में अकादमिक वर्ष के विश्वविद्यालय में पढ़ने के स्कूल ऑफ फार्मेसी, कुल १४४ छात्रों, 3 के समूहों में आयोजित, बाहर किया "मापने लैक्टेज" प्रयोग, सभी समूहों के साथ लैक्टेज गोली से एंजाइमी गतिविधि के कुछ स्तर का पता लगाने में सक्षम अर्क.

इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों की एक संख्या है । सबसे पहले, यह आवश्यक है कि प्रारंभिक निष्कर्षण कुशल है, बाद में विश्लेषण के लिए पर्याप्त सक्रिय एंजाइम के solubilization की अनुमति । हमारे अनुभव में, प्रथम वर्ष के स्नातकों के रूप में उल्लिखित प्रोटोकॉल का पालन करके इस लक्ष्य को प्राप्त कर सकते हैं; हालांकि प्रयोगशाला प्रदर्शनकारियों से कुछ मार्गदर्शन इस बिंदु पर की आवश्यकता थी । हालांकि यह एक आत्म स्पष्ट बात प्रतीत होता है, इस प्रोटोकॉल की सफलता में एक महत्वपूर्ण कारक के लिए ध्यान से मात्रा को मापने की क्षमता है, ठीक से लेबल ट्यूबों और निर्देशों का पालन करें । जबकि प्रवीणता के एक निश्चित स्तर पर कई छात्रों के लिए ग्रहण किया जा सकता है, सावधान निगरानी और छात्रों के लिए एक स्पष्ट अनुरोध करने के लिए घटना में सहायता के लिए पूछने के लिए कि वे क्या अगले एक सफल परख की सबसे बड़ी संभावना प्रदान करता है की अनिश्चित हैं ।

छात्र मूल्यांकन में वर्ग वर्कशीट द्वारा किया जा सकता है (पूरक सामग्री के रूप में उपलब्ध है), छात्रों को पूछने के प्रयोगों से डेटा नोट, उनके परिणामों पर टिप्पणी और पृष्ठभूमि जानकारी के लिए लिंक/व्याख्यान सामग्री से पढ़ने/ विस्तृत, मॉडल डेटा के साथ कक्षा मूल्यांकन के बाहर काइनेटिक विश्लेषण के लिए अनुमति दी और मूल्यांकन करने का प्रयास किया जाएगा ।

इस के साथ साथ प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्रयोगशाला शर्तों के तहत एक लैक्टेज गतिविधि परख का एक सरल उदाहरण है, और वहां पर्याप्त प्रयोग की जटिलता बढ़ाने के लिए और अधिक उंनत विश्लेषण की अनुमति का अवसर है । विशेष रूप से, प्रस्तुत प्रोटोकॉल एंजाइम कैनेटीक्स की अवधारणा के लिए एक परिचय प्रदान करता है, लेकिन प्रयोगात्मक डेटा के काइनेटिक विश्लेषण के लिए अनुमति नहीं है । इस तरह, हम कक्षाओं के लिए एक प्रारंभिक टेम्पलेट के रूप में वर्णित प्रोटोकॉल को देखने की सिफारिश करेंगे, सटीक विवरण के लिए विशिष्ट उद्देश्य और छात्र पलटन प्रयोगों उपक्रम की प्रतिभा के अनुरूप अनुकूलित के साथ. विस्तारित प्रयोगों के उदाहरण शामिल हो सकते हैं: विभिन्न तापमान पर दोहराया माप, सांख्यिकीय विश्लेषण की अनुमति देने के लिए विभिन्न सब्सट्रेट सांद्रता का उपयोग, डेटा के काइनेटिक विश्लेषण (जैव रसायन छात्रों के लिए उपयुक्त/ कई अलग गोलियाँ और छात्रों को प्रत्येक में एंजाइम के विभिन्न गतिविधि का मूल्यांकन करने की अनुमति (नियंत्रण गोलियों के अलावा के साथ, फोरेंसिक विज्ञान के छात्रों के लिए उपयुक्त/गर्मी विकार के प्रभाव का आकलन, या बाहर ले प्रतियोगिता लैक्टेज के लैक्टोज या अवरोधकों के अलावा द्वारा प्रयोग (तालिका 1). लैक्टेज के काइनेटिक विश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल पहले12प्रकाशित किया गया है ।

इस प्रोटोकॉल की एक महत्वपूर्ण ताकत यह है कि यह enzymology और एंजाइम कैनेटीक्स को एक वास्तविक चिकित्सा में enzymology के जीवन का मामला अध्ययन के साथ मूल परिचय को जोड़ती है । यह चिकित्सा, फार्मेसी, जैव चिकित्सा विज्ञान और संबंधित विषयों के छात्रों के लिए विशेष प्रासंगिकता के इस प्रयोगशाला प्रयोग करता है । महत्वपूर्ण बात यह है कि वहां दोनों एक गंभीर चिकित्सा हालत और एक अधिक व्यापक आहार लैक्टोज catabolism के साथ जुड़े मुद्दे को छात्रों के साथ चिकित्सा और नैतिक मुद्दों की एक विस्तृत श्रृंखला बढ़ाने का अवसर प्रदान करता है । यह चिकित्सा शर्तों के लिए आनुवंशिक परीक्षण आसपास के मुद्दों को शामिल कर सकते हैं, और जीन थेरेपी और आनुवंशिक परामर्श से संबंधित चर्चा, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उपयोग और औषधीय खुराक की बिक्री । एक प्रमुख सीमा है कि प्रोटोकॉल एंजाइम एकाग्रता के सटीक आकलन, निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल शुरू सामग्री के कारण के लिए अनुमति नहीं है । इस के लिए खाते में एक संशोधन, तथापि, परख के लिए एजेंट ग्रेड एंजाइम का उपयोग किया जाएगा । महत्वपूर्ण बात, यह भी लैक्टेज एंजाइम के लिए कैनेटीक्स के और अधिक सटीक गणना के लिए अनुमति होगी ।

अंत में, एक शिक्षण प्रयोगशाला वातावरण में लैक्टेज की गतिविधि परख प्रारंभिक चरण विश्वविद्यालय के छात्रों के लिए एंजाइम जीव विज्ञान के क्षेत्र के लिए एक मजबूत, आकर्षक और दिलचस्प परिचय प्रदान करता है ।

Disclosures

लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

पाल एक पार्किंसंस ब्रिटेन रिसर्च फैलोशिप (अनुदान F1002) द्वारा वित्त पोषित किया गया । यह काम एक MRC नए अन्वेषक अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (mr/L010933/1) और द्वारा MRC कार्यक्रम अनुदान mr/N026004/1 से पाल करने के लिए, और द्वारा BBSRC की छात्राओं BB/M017222/ हम इस व्यावहारिक की पहली पुनरावृत्ति में भाग लेने के लिए पढ़ने के विश्वविद्यालय में MPharm भाग 1 छात्रों के 2014-15 पलटन धंयवाद, और उनके प्रतिक्रिया और इनपुट के लिए बाद में साथियों ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lactase tablet Lamberts 8511-60
Phosphate buffered saline (powdered) Sigma P3813 Dissolved in deionized water to a final concentration of 100 mM
ONPG Sigma N1127 Dissolved in deionized water to a final concentration of 5 mM
Sodium Carbonate Sigma 451614 Dissolved in deionized water to a final concentration of 1 M
De-ionized water NA NA
Pestle and mortar VWR
Spectrophotometer Jenway 6315
Pipettes Gilson
15 mL tubes VWR
1.5 mL tubes Eppendorf
Spectrophotometer cuvettes Jenway
Vortex Vortex genie 2
Centrifuge Beckman
Ice bucket VWR
Water bath Thermo-Scientific
Weighing scales Thermo-Scientific

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References

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