Messung der Laktase enzymatische Aktivität in das Lehrlabor

Biology
 

Summary

Die enzymatische Aktivität der Laktase ist essentiell für die katabolen Verarbeitung von Disaccharid Laktose. Hier ist die Aktivität der Laktase in Nahrungsergänzungsmitteln gefunden untersucht mit Hilfe eines kolorimetrischen Assays. Dies bietet Studenten eine experimentelle Plattform für die Aktivität der Laktase und Enzym Kinetik zu verstehen.

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Leksmono, C. S., Manzoni, C., Tomkins, J. E., Lucchesi, W., Cottrell, G., Lewis, P. A. Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab. J. Vis. Exp. (138), e54377, doi:10.3791/54377 (2018).

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Abstract

Verstehen, wie Enzyme funktionieren und über dies die Beispiele aus der Praxis, ist entscheidend für eine Vielzahl von Bachelor-Grad in der biologischen und biomedizinischen Wissenschaften. Diese einfach zu folgen Protokoll wurde für Studenten im ersten Studienjahr Bachelor Apotheke entwickelt und bietet eine Entry-Level-Einführung in enzymatischen Reaktionen und analytischen Verfahren für die Enzym-Analyse. Das Enzym Wahl ist Laktase, da dies ein Beispiel für eine handelsübliche Enzym für die menschliche Krankheit/pharmazeutischen Praxis relevant ist. Laktase ist Nahrungsergänzungsmittel Tabletten entnommen und anhand eines kolorimetrischen Assays basiert auf Hydrolyse von einem künstlichen Substrat für Laktase (ortho-Nitrophenol -Beta-D-Galactopyranoside, ONPG). Freisetzung von ortho-Nitrophenol nach die hydrolytische Spaltung von ONPG durch Laktase wird gemessen, indem eine Änderung der Extinktion bei 420 nm und die Wirkung der Temperatur auf die Enzymreaktion wird durch die Durchführung der Reaktion auf Eis, bei Raumtemperatur und bei 37 ausgewertet ° C. Erweiterte Analyse kann mithilfe dieses Protokolls durch Beurteilung der Enzym-Aktivität unter verschiedenen Bedingungen und mit unterschiedlichen Reagenzien umgesetzt werden.

Introduction

Enzyme sind eine spezielle Art von Protein, das als biologischer Katalysator für chemische Reaktionen in lebenden Organismen1. Die Handlung von Enzymen ist von entscheidender Bedeutung für das Leben, Energie, Entsorgung von Abfällen und die Organismen funktionieren. Verständnis Enzyme ist daher entscheidend für ein umfassendes Verständnis des Lebens. Solches Wissen ist essentiell für eine Vielzahl von Ebenen Studiengänge Universität, von der Medizin bis hin zu Biologie. Während ein detaillierten Hintergrund von Prinzipien der Katalyse bis hin zu theoretischen Modellen der Enzym-Aktivität für Studenten mit Vorträgen und lesestoff zur Verfügung gestellt werden kann, sind die Eigenschaften der enzymatischen Reaktionen am besten mit den Händen auf praktische Erfahrungen von Begriffen. Enzyme in Aktion gezeigt wie vorher2. Dieses Protokoll bietet eine einfach zu experimentellen Paradigma zur Messung der Enzymaktivität unter Laborbedingungen mit Laktase als ein Beispiel für ein Enzym mit einer Aktivität, die für die menschliche Ernährung und Gesundheit relevanten folgen.

Die glykosidisch Hydrolase Laktase (EC 3.2.1.23/26) ist ein Enzym Ernährungs zentral für Säugetiere3. Die Aktivität der Laktase ist stark durch die Evolution konserviert und leitet sich aus der Beta-Galaktosidase-Familie der Enzyme – eine Familie von Escherichia coli durch Homo Sapiens (Abbildung 1, PDB 1JZ8)4vorhanden. Die entscheidende Bedeutung der Laktase inmitten der menschlichen Ernährung ergibt sich aus seiner Rolle darin, dass der Abbau von Laktose in seine konstituierenden Monosaccharid-Bestandteile, die dann zur Energiegewinnung im Körper verwendet werden können. Laktase katalysiert die Hydrolyse der Glykosid-Bindung in das Disaccharid Laktose, Freisetzung von Galaktose und Glukose (Abbildung 2)5. Diese Monosaccharide werden dann in erster Linie zur Erzeugung von Adenosintriphosphat (ATP) über den Zitronensäurezyklus und Oxidative Phosphorylierung6verwendet. Während Neugeborene und kindliche Entwicklung Laktase hoch drückt sich in das menschliche Verdauungssystem, Abbau von Laktose erhielt von Muttermilch welche Laktose die primäre Kohlenhydrat-Komponente und eine der wichtigsten Quellen der Ernährung während der frühen Jahre ist 7. die medizinische Bedeutung der Laktase wird hervorgehoben durch angeborene Laktasemangel (CLD), eine seltene autosomal rezessive Erkrankung, verursacht durch Mutationen in dem Laktase-gen (LCT) Kodierung für die Laktase-Enzym-8. Neugeborene mit CLD weisen sehr wenig Laktase-Aktivität, daher können nicht sie mit Muttermilch, jede andere Art von Milch oder Formel, enthält Laktose zugeführt werden.

Während der Kindheit wird Laktase Ausdruck normalerweise reduziert; Diese Reduktion nach Entwöhnung variiert jedoch geographisch, mit etwa 35 % der Erwachsenen weltweit weiterhin die Enzym-9zum Ausdruck bringen. Nachhaltig Ausdruck der Laktase, bekannt als laktasepersistenz, kann weiterhin Milch und Produkte aus den unterschiedlichsten Quellen zu verdauen. Im Gegensatz dazu kann der Verlust von Laktase Ausdruck zu Laktose-Intoleranz, auch bekannt als Erwachsenen-Typ Hypolactasia (ATH), infolge der Unfähigkeit zum Abbau von Laktose im Darm führen. ATH zeichnet sich durch einen Build, der Laktose im Darm nach der Einnahme von Milchzucker mit Lebensmitteln. Im Dickdarm wird die kumulierte Laktose durch mikrobielle Flora Darm, Freigabe Gase wie Wasserstoff, Methan und Kohlendioxid vergoren. Die Produktion dieser Gase in den Einzelpersonen mit Laktase Enzymmangel fördern, abdominale Blähungen, verstärkte Blähungen, Schmerzen, Übelkeit und Borborygmi (Bauch Rumpeln)7. Höheres Maß an Laktose im Verdauungstrakt führen auch zu weicher Stuhl.

Die Kontrolle der LCT -gen-Expression wird durch Polymorphismen befindet sich in Introns des nahe gelegenen Gens MCM6 moduliert. Personen mit anhaltenden Ausdruck der Laktase tragen Polymorphismen, die als starke distalen Enhancer für LCT -gen-Expression, kompensieren die normale down-Regulation der LCT Transkription während der Entwöhnung, fungieren und somit tragenden Laktase Ausdruck im Erwachsenenalter3. Enhancer-Polymorphismen, positiv im Anschluss an die Domestizierung von Rindern und Kamelen im Nahen Osten vor über fünftausend Jahren ausgewählt wurden vorgeschlagen worden9,10.

Die Symptome der ATH daraus können durch Reduktion Laktose Aufnahme, zum Beispiel indem Sie Milchprodukte aus der Ernährung verwaltet werden. Ein alternativer Ansatz für ATH und den Ansatz der Wahl für CLD, ist die Verwendung von Laktase Ergänzungen, weit verbreitet in Apotheken erhältlich. Diese Ergänzungen stellen Laktase isoliert aus einer Vielzahl von Quellen, einschließlich Hefen und Bakterien, in flüssigen oder Pille-basierten Form, die mit genommen oder Laktose enthalten Lebensmittel hinzugefügt werden kann. Der Zuschlag wird einen Teil des Milchzuckers vorhanden in der Nahrung in Glukose und Galaktose Produkte, damit ihre Absorption bei schönem und verhindert Ansammlung von Substrat unverdaute Laktose im Darm hydrolyseneigung.

Basierend auf die Verwendung von Laktase Ergänzungen als diätetische Hilfe, haben wir eine einfache Enzymologie Laborexperiment geeignet für biomedizinische Wissenschaft oder Apotheke Studenten im ersten Studienjahr entwickelt. Diese Labor-Experiment nutzt die im Handel erhältlichen Laktase Ergänzungen und Verwendungen ortho-Nitrophenol -Beta-D-Galactopyranoside (ONPG) zu einer kolorimetrischen Endpunkt zur Messung der Spaltung von Glykosid-Bindungen durch Laktase ( Abbildung 3)11. ONPG wirkt einem künstlichen Substrat für Laktase, die bei Hydrolyse durch dieses Enzym produziert D-Galaktose und ortho-Nitrophenol. Die letztgenannte Ware hat eine gelbe Farbe, absorbieren Licht bei einer Wellenlänge von 420 nm. Durch Quantifizierung der Extinktion bei 420 nm folgende Änderungen gegenüber der ONPG Laktase, ist es möglich, die Aktivität dieses Enzyms zu schätzen. Diese Labor-Experiment bietet eine Demonstration der enzymatischen Hydrolase-Aktivität. Durch den Bau in zusätzliche Wiederholungen und Durchführung von Tests unter verschiedenen Bedingungen, ist es möglich, komplexere Analysen der Enzym-Kinetik, bietet ein wertvolles realen Beispiel von Enzymen in Aktion für die menschliche Gesundheit zu übernehmen.

Protocol

Hinweis: Das folgende Protokoll wurde entwickelt, um im Laufe von zwei Stunden (einschließlich der Abschluss-Klasse Arbeitsblätter) gehalten werden in einem speziell angefertigten Lehre-Labor. Die experimentellen Schritte waren absichtlich zu ausschließen, genauere Analyse der Enzym-Kinetik (durchgeführt im Rahmen dieses Kurses mit Modelldaten); aber – wie in der Diskussion erwähnt – das Protokoll stellt eine Vorlage für fortgeschrittene Analysen je nach Zeit, Einrichtungen und Schüler Zielerreichungsgrad.

Sicherheit: Diese praktische erfolgt nach den Regeln der guten chemischen Labor Praxis (GCLP) – persönliche schützende Ausrüstung, einschließlich befestigt Laborkittel, Einweg-Handschuhe und Schutzbrille sollte getragen werden, bei aller Zeiten im Labor .

(1) extrahieren das Enzym

  1. Zerdrücken Sie eine Laktase-Tablette mit 200 mg des Enzyms zu einer sogar Pulver mit einem Mörser und Stößel.
  2. Das resultierende Pulver in eine 15 mL-Tube "Aussetzung" gekennzeichnet und Aufschwemmen in 10 mL 100 mM Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
  3. Vortex für 1 min, Enzym-Extraktion zu maximieren.
  4. Überführen Sie 1 mL aus der Suspension in eine 1,5 mL Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge für 1 min bei 10.000 X g solide trubstoffe.
  5. Eine saubere 1,5 mL-Tube beschriftet "Extrakt Laktase" übermitteln Sie 500 µL des Überstands.

2. beobachten die kolorimetrischen Reaktion

  1. Platz 390 µL 100 mm PBS in ein 1,5 mL Röhrchen beschriftet "A-Reaktion".
  2. Fügen Sie 100 µL 5 mM ONPG-Lösung und Mischung gut aufschütteln hinzu.
    Achtung: Diese praktische verwendet ortho-Nitrophenol -Beta-D-Galactopyranoside (ONPG) als Ersatz für Laktose. Da ONPG eine phenolische Verbindung ist, sollte es mit Vorsicht gehandhabt werden. Bei Hautkontakt mit ONPG sollte die Haut sofort gewaschen werden. Alle mögliche Überläufe sollten sofort mit Küchenpapier in den entsprechenden Abfallstrom entsorgt werden abgewischt werden.
  3. 10 µL des Extraktes in das Reaktionsgefäß A und die Mischung gut aufschütteln hinzufügen.
  4. Beobachten Sie das Reaktionsgemisch für 5 Minuten zu und notieren Sie farbmetrischen Änderungen an der Lösung.

3. Messung der Enzymaktivität

  1. Richten Sie zwei 1,5 mL Röhrchen: eine "Reaktion B", eine beschriftete "Control" gekennzeichnet.
  2. Die Reaktion B Schlauch, 400 µL 100 mm PBS, die kontrollröhrchen fügen Sie 390 µL 100 mm PBS hinzu und dann jedes Rohr 100 µL 5 mM ONPG hinzu.
  3. Mischen Sie den Inhalt durch aufschütteln.
  4. Das Reaktionsgefäß B 10 µL der Laktase-Extrakt hinzufügen, mischen durch Vortexen und die Reaktion auf 1 min. bei Zimmertemperatur gehen lassen.
  5. Nach Ablauf 1 min fügen Sie 500 µL 1 M Natriumcarbonat beider Röhren das Laktase-Enzym zu hemmen, indem man den pH-Wert, wodurch die Reaktion beendet hinzu.
  6. 500 µL aus jeder Tube in sauberen Spektrofotometer Küvetten und Messung der Extinktion bei 420 nm mit dem Spektralphotometer.
  7. Beachten Sie Absorption für Reaktion B und Kontrollproben und dann subtrahieren Sie der Kontrollwert von reaktionswert, die Änderung der Extinktion durch Hydrolyse von ONPG im Beisein von aktives Enzym abzuleiten.

4. Einfluss der Temperatur auf die Enzymaktivität

  1. Drei kontrollröhrchen und drei Reaktionsgefäßen eingerichtet, wie in Abschnitt 3 beschrieben und beschriften Sie diese "4 ° C", "Zimmertemperatur" und "37 ° C".
  2. Nach Zugabe des Enzyms zu extrahieren, eine Röhre auf Eis, bei Raumtemperatur und bei 37 ° C (im Wasserbad vorgewärmt) inkubieren.
  3. Die Reaktionen auf fahren für 1 min und dann kündigen die Reaktion durch Zugabe von 500 µL 1 M Natriumcarbonat auf jedes Rohr zu ermöglichen.
  4. Messung der Extinktion bei 420 nm für jedes Rohr wie in Abschnitt 3 beschrieben. Notieren Sie die Werte Subtrahieren der Kontrollwert von reaktionswert in jedem Fall.

Representative Results

Repräsentative Ergebnisse für Abschnitt 2 des Protokolls werden in Abbildung 4Aangezeigt. Der Kontrollreaktion in Abwesenheit des Enzyms Laktase, übersichtlich bleibt, während die Reaktionslösung mit Extrakt aus der Laktase Tablette gelb dargestellt wird, wie ONPG hydrolysiert wird die Freigabe ortho- Nitrophenol. Abbildung 4 b zeigt Quantifizierung mit beliebigen Einheiten aus Abschnitt 4 des Protokolls, folgende Analyse von Proben mit dem Spektralphotometer. Produktion von ortho-Nitrophenol ist höchsten und tiefsten bei die Reaktion auf Eis inkubiert wird, wenn die Reaktion erfolgt bei 37 ° C.

Figure 1
Abbildung 1 : E. Coli Beta-Galaktosidase. (A) Kristallstruktur des Beta-Galaktosidase aus Escherichia coli, zeigen die tetrameres Struktur des aktiven Komplex. (B) Allolactose (rot dargestellt) verpflichtet, der aktiven Seite des Beta-Galaktosidase. Bilder aus PDB 1JZ84generiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Enzymatische Wirkung von Laktase. Hydrolyse von Laktose durch Laktase, Beta-D-Galaktose und Beta-D-Glucose zu produzieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Hydrolyse von ortho-Nitrophenol - Beta -D-Galactopyranoside. ONPG Hydrolyse durch Laktase zu produzieren Beta-D-Galaktose und ortho-Nitrophenol (das ist in der Farbe gelb), so dass Schätzung der Laktase-Aktivität durch Messung der Extinktion bei 420 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Figure 4
Abbildung 4 : ONPG Hydrolyse. Repräsentative Ergebnisse der ONPG Hydrolyse, zeigt Kontrolle und Reaktion (A) und repräsentative Daten aus Abschnitt 4 des Protokolls aufgenommen am-Klasse Arbeitsblätter, zeigt roh Extinktion in beliebigen Einheiten bei 420 nm, korrigiert für Hintergrund und bei drei verschiedenen Temperaturen (B). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Versuchsbedingung Experimentellen Variablen
Temperatur 10 ° C, 20 ° C, 30 ° C, 0 ° C, 50 ° C
Substratkonzentration 0 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM ONPG
Wettbewerbsfähige Hemmung 5 mM ONPG plus 0 mM, 1 mM, 5 mM oder 10 mM Laktose
Zeitabhängigkeit 0 s, 15 s, 30 s, 1 min, 5 min, 10 min, 20 min
Hitze-Denaturierung Laktase-Extrakt beheizt bis 100 ° C für 10 min vor der Testdurchführung

Tabelle 1: Potential erweitert versuchsbedingung. Vorgeschlagenen erweiterten Experimente, in dreifacher Ausfertigung, Untersuchung von bestimmten Aspekten der Laktase Biologie durchgeführt werden.

Discussion

Ein detailliertes Wissen und Verständnis von Enzymen, enzymatischen Reaktionen und Enzym-Kinetik ist erforderlich für eine breite Palette von Themen aus Biologie, Biomedizin und Pharmakologie. Das oben beschriebene Protokoll verwendet Laktase als Beispiel für ein Enzym, das für die menschliche Gesundheit relevant für den Nachweis der enzymatischer Reaktionen, Bereitstellung von Schlüsselqualifikationen, die in erweiterten Labor Experimente verwendet werden können.

Dieses Protokoll wurde absichtlich so robust wie möglich, so dass Schüler mit wenig oder gar keine nassen Laborerfahrung interpretierbare Ergebnisse in kurzer Zeit werden. Im akademischen Jahr 2014/2015 an der University of Reading School of Pharmacy durchgeführt insgesamt 144 Studenten, organisiert in Gruppen von 3, die "Messung der Laktase" Experiment mit allen Gruppen in der Lage, gewisse enzymatische Aktivität von Laktase Tablette zu erkennen Extrakte.

Es gibt eine Reihe von kritischen Schritte in diesem Protokoll. Erstens ist es wichtig, dass dem ersten extrahieren effizient ist, Solubilisierung von genügend aktive Enzym für spätere Analysen ermöglicht. Nach unserer Erfahrung können erste Jahr Studenten dies erreichen durch nach dem Protokoll wie beschrieben; Allerdings bedurfte es an dieser Stelle einige Hinweise von Labor-Demonstranten. Obwohl es eine selbstverständliche Punkt scheinen würde, ist ein Schlüsselfaktor für den Erfolg dieses Protokolls die Fähigkeit, sorgfältig messen Volumen, korrekt beschriften Röhren und Anweisungen folgen. Während ein gewisses Maß an Leistungsfähigkeit kann, für viele Studenten ausgegangen werden, sorgfältige Überwachung und eine klare Aufforderung für Studierende um Hilfe bitten, wenn sie unsicher sind, bietet was zu tun ist als nächstes die größte Wahrscheinlichkeit eines erfolgreichen Assays.

Studentischen Evaluation kann durch das in Klasse Arbeitsblatt (als Zusatzmaterial erhältlich), Kursteilnehmer, Daten aus den Experimenten, kommentieren Sie ihre Ergebnisse und die Verknüpfung mit Hintergrund Informationen/Lesung aus Vorlesungsunterlagen, Fragen oder mehr durchgeführt werden detaillierte, aus Klasse Bewertung mit Modelldaten zur Verfügung gestellt, damit kinetische Analysen versucht und bewertet werden.

Das Protokoll enthaltenen ist ein einfaches Beispiel für einen Laktase-Aktivität-Assay unter Laborbedingungen zu unterrichten, und gibt es reichlich Gelegenheit, erhöht die Komplexität des Experiments um erweiterte Analysen zu ermöglichen. Insbesondere der vorgestellte Protokoll bietet eine Einführung in das Konzept der Enzym-Kinetik aber nicht für kinetische Analyse experimenteller Daten ermöglichen. So empfehlen wir die Anzeigen des beschriebenen Protokolls als erste Vorlage für Klassen, die genaue Angaben, die die spezifischen Ziele und Talente der Schüler-Kohorte, die Durchführung der Experimente angepasst. Beispiele für erweiterte Experimente könnten: wiederholte Messungen bei verschiedenen Temperaturen, mit verschiedenen Substrat-Konzentrationen damit statistische Analyse, kinetische Analyse der Daten (geeignet für Biochemie Studierende/Majors), beginnend mit mehrere verschiedene Tabletten und ermöglicht die Schülern unterschiedliche Aktivität des Enzyms in jedem (mit dem Zusatz von Kontrolle Tabletten, geeignet für forensische Wissenschaft Studenten/Majors) bewerten, Bewertung der Auswirkungen von Hitze Denaturierung oder Durchführung Wettbewerbs Experimente durch Zugabe von Laktose oder Inhibitoren der Laktase (Tabelle 1). Ein detailliertes Protokoll für kinetische Analyse der Laktase bislang veröffentlichten12.

Eine wichtige Stärke dieses Protokolls ist, dass es eine grundlegende Einführung in Enzymologie und Enzym Kinetik mit einer realen Fallstudie der Enzymologie in der Medizin kombiniert. Dies macht dieses Labor-Experiment von besonderer Bedeutung für die Studenten der Medizin, Pharmazie, Biomedizin und verwandte Fächer. Wichtig ist, die Tatsache, dass es eine schwerwiegende Erkrankung und eine breitere diätetische Problem mit Milchzucker Katabolismus bietet die Möglichkeit, eine Vielzahl von medizinischen und ethischen Fragen mit den Studenten zu erhöhen. Dies könnte umfassen Themen rund um Gentests für Erkrankungen und verbundenen Diskussionen im Zusammenhang mit Gentherapie und genetische Beratung sowie den Einsatz und Verkauf von medizinischen Ergänzungen. Eine große Einschränkung ist, dass das Protokoll keine genaue Einschätzung der Enzym-Konzentration, durch das Ausgangsmaterial für die Gewinnung verwendet zulässt. Eine Änderung an, dies zu berücksichtigen wäre jedoch Reagenz Grade Enzym für den Test verwenden. Wichtig ist, würde dies auch für eine genauere Berechnung der Bewegungslehre für die Laktase-Enzym ermöglichen.

Prüfen Sie abschließend die Aktivität der Laktase in ein Lehrlabor Umfeld bietet eine robuste, fesselnde und interessante Einführung in das Feld der Enzym-Biologie für frühzeitige Studenten.

Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Acknowledgments

PAL wurde von einer Parkinson UK Research Fellowship (Stipendium F1002) finanziert. Diese Arbeit wurde unterstützt durch eine MRC neue Investigator Research Grant (MR/L010933/1) und vom MRC-Programm gewähren MR/N026004/1 PAL und durch BBSRC Zugehörigkeit BB/M017222/1 Jet. Wir danken die 2014 / 15-Kohorte MPharm Teil 1-Studenten an der University of Reading für Ihre Teilnahme an der ersten Iteration dieses praktische und nachfolgende Kohorten für ihre Feedbacks und Inputs.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lactase tablet Lamberts 8511-60
Phosphate buffered saline (powdered) Sigma P3813 Dissolved in deionized water to a final concentration of 100 mM
ONPG Sigma N1127 Dissolved in deionized water to a final concentration of 5 mM
Sodium Carbonate Sigma 451614 Dissolved in deionized water to a final concentration of 1 M
De-ionized water NA NA
Pestle and mortar VWR
Spectrophotometer Jenway 6315
Pipettes Gilson
15 mL tubes VWR
1.5 mL tubes Eppendorf
Spectrophotometer cuvettes Jenway
Vortex Vortex genie 2
Centrifuge Beckman
Ice bucket VWR
Water bath Thermo-Scientific
Weighing scales Thermo-Scientific

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References

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