Mesure de l’activité enzymatique Lactase dans le laboratoire d’enseignement

Biology
 

Summary

L’activité enzymatique de la lactase est essentielle pour le traitement catabolique du lactose disaccharides. Ici, l’activité de la lactase dans les compléments alimentaires est analysée à l’aide d’un dosage colorimétrique. Cela prépare les stagiaires à une plateforme expérimentale permettant de comprendre l’activité de la lactase et enzyme cinétique.

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Leksmono, C. S., Manzoni, C., Tomkins, J. E., Lucchesi, W., Cottrell, G., Lewis, P. A. Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab. J. Vis. Exp. (138), e54377, doi:10.3791/54377 (2018).

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Abstract

Comprendre comment les enzymes fonctionnent et cela concernant les exemples réels, sont essentielles à un large éventail de diplômes de premier cycle en sciences biologiques et biomédicales. Aussi facile à suivre protocole a été développé pour les étudiants de premier cycle de pharmacie première année et fournit une introduction d’entrée de gamme aux réactions enzymatiques et méthodes analytiques pour l’analyse des enzymes. L’enzyme de choix est la lactase, comme il s’agit d’un exemple d’une enzyme commercialement disponible pertinente pour la pratique de la maladie humaine et pharmaceutiques. La lactase est extraite de comprimés de complément alimentaire et évalués à l’aide d’un dosage colorimétrique basée par hydrolyse d’un substrat artificiel de lactase (ortho-nitrophénol -bêta-D-galactopyranoside, ONPG). Libération d’ortho-nitrophénol suite au clivage hydrolytique de l’ONPG en lactase est mesurée par un changement d’absorbance à 420 nm et l’effet de la température sur la réaction enzymatique est évaluée en effectuant la réaction sur la glace, à la température ambiante et à 37 ° C. Une analyse plus approfondie peut être implémentée en utilisant ce protocole en évaluant l’activité enzymatique dans des conditions différentes et en utilisant des réactifs différents.

Introduction

Les enzymes sont un type spécialisé de protéines qui agissent comme des catalyseurs biologiques pour des réactions chimiques dans la vie des organismes1. L’action des enzymes est essentielle pour la vie, fournir de l’énergie, des déchets et permettant aux organismes de fonctionner. Enzymes de la compréhension est donc essentielle pour une compréhension complète de la vie. Une telle connaissance est essentielle pour une grande variété de programmes de diplôme de niveau universitaire, allant de la médecine à la biologie. Alors que le fond détaillé, allant des principes de la catalyse à des modèles théoriques de l’activité enzymatique peut être offert aux élèves à l’aide de conférences et de matériel de lecture, les propriétés des réactions enzymatiques sont mieux comprises par les mains sur l’expérience pratique de enzymes dans l’action comme précédemment démontré2. Ce protocole prévoit un simple à suivre un modèle expérimental permettant de mesurer l’activité enzymatique dans des conditions de laboratoire, à l’aide de lactase à titre d’exemple d’une enzyme dont l’activité pertinente pour la santé et la nutrition humaine.

La lactase glycosidique hydrolase (EC 3.2.1.23/26) est une enzyme nutritionnelles essentielles pour mammifères3. L’activité de la lactase est hautement conservée à travers l’évolution et dérive de la famille des bêta-galactosidase d’enzymes — une famille présente d' Escherichia coli par le biais d' Homo sapiens (Figure 1, APB 1JZ8)4. L’importance cruciale de lactase dans un cadre nutritionnel humain provient de son rôle en permettant la dégradation du lactose dans ses éléments constitutifs monosaccharide, qui peuvent ensuite servir à produire de l’énergie dans le corps. La lactase catalyse l’hydrolyse de la liaison glycosidique dans le lactose disaccharides, libérant le galactose et le glucose (Figure 2)5. Ces monosaccharides sont ensuite utilisés principalement pour la production d’adénosine triphosphate (ATP) via le cycle de Krebs et la phosphorylation oxydative6. Pendant le nouveau-né et le développement de l’enfant, la lactase est fortement exprimée dans le système digestif humain, en brisant le lactose provenant du lait maternel, que de lactose, qui est le composant principal hydrates de carbone et l’une des sources principales de la nutrition au cours des premières années 7. l’importance médicale de lactase est soulignée par un déficit en lactase congénitale (CLD), une maladie récessive autosomique rare causée par des mutations dans le gène de la lactase (LCT) codant pour l' enzyme de lactase8. Nouveaux-nés avec le CLD pièce très petite activité lactasique, donc ils ne peuvent pas être nourris sur le lait maternel, tout autre type de lait, ou une formule contenant du lactose.

Au cours de l’enfance, expression de la lactase est normalement réduite ; Toutefois, cette réduction après le sevrage varie géographiquement, avec environ 35 % des adultes dans le monde entier continue d’exprimer l' enzyme9. Une expression durable de lactase, connue comme la persistance de la lactase, permet aux gens de continuer à digérer le lait et les produits laitiers d’une variété de sources. À l’inverse, la perte d’expression de la lactase peut conduire à une intolérance au lactose, également connu sous le nom de type adulte hypolactasie (ATH), résultant d’une incapacité à briser le lactose dans l’intestin. ATH est caractérisée par une accumulation jusqu'à de lactose dans le côlon après l’ingestion de lactose contenant des produits alimentaires. Dans le côlon, le lactose accumulé est fermenté par la flore microbienne intestinale, libérant des gaz comme l’hydrogène, le méthane et le dioxyde de carbone. La production de ces gaz chez les individus atteints d’une déficience d’enzyme lactase promouvoir météorisme, flatulence accrue, douleur, nausée et borborygmi (grondement d’estomac)7. Accroissement de la lactose dans le tube digestif peut aussi conduire à des selles molles.

Contrôle de l’expression du gène LCT est modulé par les polymorphismes situés dans les introns du gène MCM6 à proximité. Individus avec une expression durable de lactase porteurs polymorphismes qui fonctionnent comme des améliorateurs distales fortes pour l’expression du gène LCT , compensant ainsi la normale vers le bas de la régulation de la transcription de LCT pendant le sevrage et par conséquent soutenir l’expression de la lactase à l’âge adulte3. Polymorphismes Enhancer ont avancé l’hypothèse d’avoir été sélectionnés positivement après la domestication du bétail et des chameaux au Moyen-Orient il y a plus de cinq mille ans9,10.

Les symptômes résultant de ATH peuvent être gérés en réduisant l’apport en lactose, par exemple en supprimant les produits laitiers provenant de l’alimentation. Une autre approche pour ATH et l’approche de choix pour les CLD, sont l’utilisation de suppléments de lactase, largement disponibles dans les pharmacies. Ces suppléments fournissent lactase isolée de diverses sources, y compris les levures et les bactéries, sous une forme liquide ou de comprimé qui peut être prise avec ou ajoutée au lactose contenant de la nourriture. Le supplément s’hydrolysent une partie du lactose présent dans les aliments aux produits de glucose et de galactose, ainsi permettant leur absorption et prévenir l’accumulation de substrat de lactose non digéré dans l’intestin.

Compte tenu de l’utilisation de suppléments de lactase comme une aide alimentaire, nous avons développé une expérience en laboratoire enzymologie simple adaptée en première année biomedical science ou la pharmacie. Cette expérience de laboratoire tire parti des suppléments de lactase disponibles dans le commerce et usages ortho-nitrophénol -bêta-D-galactopyranoside (ONPG) pour fournir un point de terminaison colorimétrique pour mesurer la rupture des liaisons glycosidiques de lactase ( Figure 3)11. ONPG agit un substrat artificiel de la lactase, qui lorsqu’ils sont soumis à l’hydrolyse de cette enzyme produit D-galactose et ortho-nitrophénol. Ce dernier produit a une couleur jaune, absorbant la lumière à une longueur d’onde de 420 nm. En quantifiant toute modification l’absorbance à 420 qui suit nm l’exposition d’ONPG à la lactase, il est possible d’estimer l’activité de cette enzyme. Cette expérience de laboratoire fournit une démonstration de l’activité enzymatique hydrolase. En construisant en répétitions supplémentaires et effectuer des essais dans des conditions différentes, il est possible d’intégrer des analyses plus sophistiquées de la cinétique enzymatique, fournissant un précieux exemple de vie réelle des enzymes à action pertinente pour la santé humaine.

Protocol

Remarque : Le protocole ci-dessous a été développé pour se tenir au cours de deux heures (y compris la réalisation de fiches d’exercices en classe) dans un laboratoire d’enseignement spécialisé. Les mesures expérimentales ont été délibérément afin d’exclure une analyse plus détaillée de la cinétique enzymatique (réalisée dans le cadre de ce cours à l’aide des données du modèle) ; Toutefois, comme mentionné dans la discussion — le protocole fournit un modèle pour des analyses plus avancées selon le niveau de réalisation de temps, les installations et les étudiants.

SÉCURITÉ : Cette pratique doit être effectué selon les règles de bonne pratique de laboratoire chimique (GCLP) — équipement de protection individuelle, y compris le manteau attaché de laboratoire, gants jetables et des lunettes de sécurité doit être porté à tout moment dans le laboratoire .

1. extraction de l’Enzyme

  1. Écraser un comprimé de lactase, contenant 200 mg d’enzyme, pour un même poudre à l’aide d’un mortier et un pilon.
  2. Placez la poudre obtenue dans un tube de 15 mL étiqueté « suspension » et remettre en suspension dans 10 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate de 100 mM (PBS).
  3. Vortex pendant 1 min maximiser l’extraction de l’enzyme.
  4. Transférer 1 mL de la suspension dans un tube à centrifuger de 1,5 mL et centrifuger pendant 1 min à 10 000 x g de particules solides et les sédiments.
  5. Transférer 500 µL du liquide surnageant dans un tube propre 1,5 mL étiqueté « Extrait de Lactase ».

2. observer la réaction colorimétrique

  1. Place 390 µL de 100 mM PBS dans un tube de 1,5 mL étiqueté « Réaction A ».
  2. Ajouter 100 µL de solution d’ONPG 5 mM et mélanger bien au vortex.
    ATTENTION : Cette pratique utilise ortho-nitrophénol -bêta-D-galactopyranoside (ONPG) comme substitut au lactose. Puisque l’ONPG est un composé phénolique, il doit être manipulé avec précaution. En cas de contact cutané avec ONPG, on doit laver immédiatement la peau exposée. Tout déversement doit être essuyés immédiatement avec du papier essuie-tout à immerger dans le flux de déchets approprié.
  3. Ajouter 10 µL de l’extrait dans le tube à essais A et mélanger bien au vortex.
  4. Observer le mélange réactionnel pendant 5 minutes et noter tout changement colorimétrique à la solution.

3. mesure de l’activité enzymatique

  1. Mis en place deux tubes de 1,5 mL : l’un portant la mention « Réaction B », une étiquette « Control ».
  2. Ajouter 390 µL de 100 mM PBS à la réaction tube B, 400 µL de 100 mM PBS au tube de contrôle et ensuite ajouter 100 µL de 5 mM ONPG dans chaque tube.
  3. Mélanger le contenu au vortex.
  4. Ajouter 10 µL de l’extrait de lactase dans le tube de réaction B, mélanger au vortex et permettre la réaction de procéder pendant 1 min à température ambiante.
  5. A l’expiration de 1 min, ajouter 500 µL de carbonate de sodium 1 M dans les deux tubes pour inhiber l’enzyme lactase en augmentant le pH, en terminant ainsi la réaction.
  6. Transférer 500 µL de chaque tube dans des cuvettes de spectrophotomètre propre et mesurer l’absorbance à 420 nm à l’aide du spectrophotomètre.
  7. Noter l’absorbance pour réaction B et des échantillons de contrôle et ensuite soustraire la valeur de contrôle de la valeur de la réaction pour calculer la différence d’absorption due à l’hydrolyse d’ONPG en présence de l’enzyme active.

4. effet de la température sur l’activité enzymatique

  1. Mettre en place le contrôle trois tubes et trois tubes de réaction comme décrit à l’article 3 et étiqueter ces « 4 ° C », « Température ambiante » et « 37 ° C ».
  2. Après ajout d’enzyme extrait, Incuber un tube sur la glace, l’un à la température ambiante et l’autre à 37 ° C (dans un bain-marie préchauffé).
  3. Permettre les réactions de procéder pendant 1 min et puis mettre fin à la réaction en ajoutant 500 µL de carbonate de sodium 1 M dans chaque tube.
  4. Mesurer l’absorbance à 420 nm pour chaque tube tel que décrit à l’article 3. Enregistrez les valeurs, en soustrayant la valeur du contrôle de la valeur de la réaction dans chaque cas.

Representative Results

Des résultats représentatifs de l’article 2 du protocole sont indiquées dans la Figure 4 a. La réaction du contrôle, en l’absence d’enzyme lactase, reste claire, alors que la solution de réaction, contenant l’extrait de la tablette de la lactase, vire au jaune comme l’ONPG est hydrolysé en libérant ortho- nitrophénol. Figure 4 b montre la quantification en unités arbitraires de l’article 4 du protocole, suivant l’analyse des échantillons à l’aide du spectrophotomètre. Production d’ortho-nitrophénol est plus faible lorsque la réaction est incubée sur la glace et le plus élevé lorsque la réaction est réalisée à 37 ° C.

Figure 1
Figure 1 : E. coli bêta-galactosidase. (A) la structure cristalline de bêta-galactosidase d' Escherichia coli, montrant la structure tétramère de l’active complexe. (B) Allolactose (indiqué en rouge) lié au site actif de la bêta-galactosidase. Images produites d’APB 1JZ84. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : L’action enzymatique de lactase. Hydrolyse du lactose par la lactase pour produire des bêta-D-galactose et bêta-D-glucose. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : L’hydrolyse de l’ortho-nitrophénol - bêta -D-galactopyranoside. Hydrolyse d’ONPG de lactase pour produire des bêta-D-galactose et ortho-nitrophénol (ce qui est jaune en couleur), estimation de l’activité lactasique permettant la mesure de l’absorbance à 420 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 4
Figure 4 : Hydrolyse d’ONPG. Les résultats représentatifs de l’hydrolyse d’ONPG, montrant les tubes de contrôle et de réaction (A) et des données représentatives de l’article 4 du protocole enregistrées sur les feuilles de travail en classe, montrant l’absorbance brute en unités arbitraires à 420 nm, corrigé pour le fond et à trois températures différentes (B). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Conditions expérimentales Variables expérimentales
Température 0 ° C, 10 ° C, 20 ° C, 30 ° C, 50 ° C
Concentration du substrat 0 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM ONPG
Inhibition compétitive lactose ONPG plus 0 mM, 1 mM, 5 mM ou 10 mM de 5 mM
Dépendance du temps 0 s, 15 s, 30 s, 1 min, 5 min, 10 min, 20 min
Dénaturation par la chaleur Extrait de la lactase chauffé à 100 ° C pendant 10 min avant l’essai

Tableau 1 : potentiel étendu condition expérimentale. Propose des expériences étendues, à réaliser en trois exemplaires, enquêter sur des aspects spécifiques de la biologie de la lactase.

Discussion

Une connaissance approfondie et la compréhension des enzymes, les réactions enzymatiques et cinétique enzymatique est requis pour un large éventail de sujets couvrant la biologie, la pharmacologie et la biomédecine. Le protocole décrit ci-dessus utilise la lactase à titre d’exemple d’une enzyme pertinente pour la santé humaine pour avoir fait preuve de réactions enzymatiques, fournissant des compétences clés qui peuvent être utilisés dans des expériences en laboratoire plus avancés.

Ce protocole a été délibérément conçu pour être aussi robuste que possibles, permettant aux étudiants avec peu ou aucune expérience de laboratoire humide pour produire des résultats interprétables dans un court laps de temps. Durant l’année scolaire à l’école de l’Université de Reading de la pharmacie de 2014/2015, un total de 144 élèves, organisés en groupes de 3, réalisé l’expérience de « mesurer la lactase », avec tous les groupes en mesure de détecter certains niveaux de l’activité enzymatique de comprimés de lactase extraits.

Il y a un certain nombre d’étapes cruciales dans le présent protocole. Tout d’abord, il est essentiel que l’extraction initiale soit efficace, ce qui permet la solubilisation de suffisamment enzyme active pour les analyses suivantes. Dans notre expérience, première année étudiants peuvent atteindre cet objectif en suivant le protocole décrites ; toutefois quelques indications des manifestants de laboratoire était nécessaire à ce stade. Bien qu’il semblerait un point évident en soi, un facteur clé dans la réussite de ce protocole est la capacité à soigneusement mesurer les volumes, correctement étiqueter les tubes et suivez les instructions. Alors qu’un certain niveau de compétence peut être supposé pour beaucoup d’étudiants, une surveillance attentive et une demande de suppression pour les élèves à demander de l’aide dans le cas où ils sont incertains de ce qu’il faut faire fournit ensuite la plus grande probabilité d’un essai réussi.

Évaluation des élèves peut être effectuée par la feuille en classe (disponible sous forme de matériel supplémentaire), demandant aux élèves de noter les données des expériences, commentaire sur leurs résultats et un lien vers informations/lecture de base de matériel de conférence, ou plus détaillées, d’évaluation de classe avec les données de modèle fournies permettant des analyses cinétiques à tenté et à évaluer.

Le protocole présenté ci-après est un exemple simple d’une analyse d’activité de la lactase en vertu des conditions de laboratoire d’enseignement, et il y a amplement l’occasion d’accroître la complexité de l’expérience pour permettre des analyses plus avancés. En particulier, le protocole présenté propose une introduction à la notion de cinétique enzymatique, mais ne permet pas une analyse cinétique des données expérimentales. Par conséquent, nous recommandons Regarde un protocole décrit comme un modèle initial pour les classes, avec les précisions adaptées pour répondre aux objectifs spécifiques et talents de la cohorte d’étudiants entreprise les expériences. Exemples de longues expériences pourraient inclure : mesures à différentes températures, en utilisant des concentrations de substrat différentes pour permettre une analyse statistique, analyse cinétique des données (adaptées aux étudiants/majors de biochimie), commençant par répétées plusieurs différents comprimés et permettre aux étudiants d’évaluer différente activité de l’enzyme dans chacun (avec l’ajout de tablettes de contrôle, adaptés aux étudiants/majors de criminalistique), évaluation de l’impact de la dénaturation par la chaleur ou effectuant des concours expériences par addition de lactose ou inhibiteurs de lactase (tableau 1). Un protocole détaillé pour l’analyse cinétique de lactase a été précédemment publié12.

Une force importante de ce protocole est qu’il combine une introduction de base à l’enzymologie et enzyme cinétique avec une étude de cas réels d’enzymologie en médecine. Ce qui rend ce laboratoire expérience particulièrement importants pour les étudiants en médecine, pharmacie, sciences biomédicales et des questions connexes. Ce qui est important, le fait qu’il y a des fois une maladie sérieuse et un problème alimentaire plus répandu associée du catabolisme de lactose fournit l’occasion d’évoquer un large éventail de questions médicales et éthiques avec les élèves. Cela pourrait inclure les questions entourant les tests génétiques pour les conditions médicales et associés discussions portant sur la thérapie génique et conseil génétique, ainsi que l’utilisation et la vente de suppléments médicinaux. Une limitation majeure est que le protocole ne permet pas une estimation précise de la concentration de l’enzyme, en raison de la matière première utilisée pour l’extraction. Une modification pour tenir compte de ceci, cependant, serait d’utiliser enzyme grade réactif pour le dosage. Ce qui est important, cela permettrait également un calcul plus précis de la cinétique de l’enzyme lactase.

En conclusion, dosage de l’activité de la lactase dans un laboratoire d’enseignement environnement fournit une introduction robuste, attrayante et intéressante au domaine de la biologie de l’enzyme de stade précoce étudiants universitaires.

Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Acknowledgments

PAL a été financée par une maladie de Parkinson UK Research Fellowship (fief F1002). Ce travail a été soutenu par une subvention de recherche enquêteur nouvelles de MRC (MR/L010933/1) et par MRC Programme accorde MR/N026004/1 en PAL et par stagiaire BBSRC BB/M017222/1 à JET. Nous remercions la cohorte 2014-15 du chef partie 1 étudiants à l’Université de Reading, pour avoir participé à la première itération de cette pratique et les suivantes cohortes pour leurs commentaires et la rétroaction.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lactase tablet Lamberts 8511-60
Phosphate buffered saline (powdered) Sigma P3813 Dissolved in deionized water to a final concentration of 100 mM
ONPG Sigma N1127 Dissolved in deionized water to a final concentration of 5 mM
Sodium Carbonate Sigma 451614 Dissolved in deionized water to a final concentration of 1 M
De-ionized water NA NA
Pestle and mortar VWR
Spectrophotometer Jenway 6315
Pipettes Gilson
15 mL tubes VWR
1.5 mL tubes Eppendorf
Spectrophotometer cuvettes Jenway
Vortex Vortex genie 2
Centrifuge Beckman
Ice bucket VWR
Water bath Thermo-Scientific
Weighing scales Thermo-Scientific

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References

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