탠덤 선호도 태그 방법을 사용하여 구조 연구에 대한 기본 공단의 정화

Biology

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van der Feltz, C., Pomeranz Krummel, D. Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method. J. Vis. Exp. (113), e54389, doi:10.3791/54389 (2016).

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Abstract

선호도 정화 방법은 단백체 특성에 대한 기본 복합체를 분리에 성공했다. 구조 이질성과 단지의 조성 이질성의 정도는 일반적으로 연구를 수행의 진행을 방해하지 않습니다. 반대로, 구조적 특성을위한 복합 구성물은 구조적으로 균일뿐만 아니라 프로테오믹스에 필요한 것보다 더 높은 농도 인 상태에서 정제한다. 최근 큰 거대 분자 복합체의 구조 결정을위한 전자 현미경의 적용에 상당한 발전이 있었다. 이것은 전자 현미경으로 구조 결정을위한 충분한 품질과 양의 천연 복합체를 정제하는 방법에 대한 관심이 높아지고있다. 탠덤 선호도 정화 (TAP) 메소드가 18 서브 유닛을 추출하고 정제 최적화되었습니다 ~ 신진 효모에서 0.8 MDA의 리보 어셈블리 (사카로 마이 세스 세레 비지)

Introduction

다수의 주요 세포 과정 큰 단백질 및 단백질 RNA 복합체 (1)에 의해 수행된다. 같은 단지의 생물 물리학 및 구조 연구를 수행에 중요한 병목 현상은 적절한 품질 (즉, 균질성)의 적절한 농도를 얻을 수있다. 기본 소스에서 복합체를 분리하는 것은 서브 유닛의 관련 포스트 전사 및 / 또는 번역 후 변형을 유지하고 적절한 복잡한 어셈블리를 보장 등 많은 장점을 가지고 있습니다. 그러나, 큰 세포 복합체는 낮은 카피 수에서 종종 세포에 존재하고 정화는 고도로 효율적인하고 복잡한 무결성을 유지하기 위해 주변의 생리적 조건에서 발생해야합니다. 진핵 소스에서 복잡한 정제 특별히 도전하고 재정적으로 금지 될 수 있습니다. 따라서, 효율적이고 균일 한 복합체를 수득 전략 또는 방법이 매우 바람직하다.

된 전략초기 특성화 진핵 세포에서 네이티브 단지를 정화에 성공적 탠덤 선호도 정화 (TAP) 방법 2,3입니다. 탭 방법은 처음 인자 (들)이 상호 작용하는 복잡한의 신진 효모 (S. cerevisiae의)에서 천연 단백질을 정제하기 위해 고안되었다. 탭 방식은 두 개의 태그, 동일한 단백질을 코딩하는 유전자 서열과 나란히 융합 각 태그를 이용했다. 타이트 선택적 생리 용액 상태의 가까이 유지하려는 욕구와 친 화성 수지에 결합하기위한 필요성의 균형을하도록 태그를 선택 하였다. 이 균형은 정제 후 특성에 대한 계수 (들)와 상호 작용하는 태깅 된 단백질의 안정한 상호 작용 (들)을 유지하는 역할을한다. 태그가 단지 위에 20 kDa의의 부가 - genomically 혼입 TAP 태그 끝에 배치하고, 단백질 - 코딩 유전자 (단말 C)의 단백질 A 뒤에 펩타이드 (CBP)을 바인딩 모듈 린을 코딩하는 서열로 구성된 단백질. CBP는이 짧다(6) 아미노산 및 의해 인식 ~ 17 kDa의 단백질, 칼 모듈 린 10-9 M의 순서 (4)에 K D와 칼슘의 존재 (CAM). 단백질 A는 ​​태그의 반복 사이에 짧은 링커 잔기의 58 개의 반복 이루어진 크다. 각 58 아미노산 반복은 K D ~ 10 -8 M (5) 면역 글로불린 G (IgG의)에 의해 인식된다. 이 두 태그 사이에 TEV 단백질 분해 효소, 담배 엣지 바이러스 6, 7에서 엔도 펩 티다 제에 대한 인식 사이트를 통합했다. 탭 단백질 태그에있어서의 제 연관 단계에서,도 1에 도시 된 바와 같이 태그 단백질 TEV 단백질 분해 효소, 특히 사이트 사이의 절단의 첨가시 열 절단에 의해 용출 된 단백질 A. 통해 IgG의 수지에 바인딩 두 태그입니다. 이것의 IgG의 상호 작용 등의 필요한 단계 및 단백질 A가 매우 강해에만 적절 변성 용액 조건 교란 될 수있다. 홍보 부족태그 otein 단백질은 칼슘의 존재 캠 수지에 결합 된 금속 이온 킬 레이터의 EGTA (에틸렌 글리콜 테트라 산) (도 1)을 첨가하여이 수지로부터 용출시켰다.

탭 방식의 도입은 그것이 생성하는 대규모 연구에 사용 된 바로 후에 S. 복잡한 상호 작용 '맵핑' cerevisiae의 8. 중요한 것은 이러한 노력 전체 효모-TAP 태그 오픈 리딩 프레임 (ORF) 라이브러리의 결과뿐만 아니라 개별 TAP로 (9)는 상용 소스에서 사용할 수 개의 ORF 태그. 따라서, 하나는 효모 복잡한에 대한 태그 단백질과 어떤 효모를 얻을 수 있습니다. 상기 탭 방법도 포함 변형 또는 TAP 태그의 변형 가했다 기타 진핵뿐만 아니라 박테리아 세포 10,11에서 착물 정제의 사용; 단백질 A 및 CBP는 다른 단백질 (12)에 배치되는 것을 특징으로 "분할 태그"의 디자인; 그리고 타예컨대 칼슘 또는 EGTA (13) 복합체의 감도, 연구자의 ​​필요를 수용하도록 GS가 바뀌었다.

모두 계측 및 방법론의 최근 발전은 거대 분자 복합체 (14)의 원자 해상도의 이미지에 가까운 높은 주도 한 구조 결정을위한 전자 현미경 (EM)의 응용 프로그램에서 상당한 진보를 주도하고있다. EM에 의해 복잡 얻어지는 해상도는, 그러나, 연구중인 복합물의 품질을 조건으로 유지된다. 이 연구는 S.에서 정화 할 수있는 TAP 태그 방식을 사용하고있다 cerevisiae의 U1 snRNP는 spliceosome (15, 16)의 일부인 18 서브 유닛 (~ 0.8 MDA) 낮은 사본 번호 리보 복잡한. 다수의 단계는 균일하고 적절한 농도가되도록이 복합체를 정제 취해왔다. 정화의 여러 단계에서 발생하는 잠재적 인 문제를 설명하고 전략 chall을 극복하기 위해 촬영enges는 강조했다. 주의 깊게 평가 및 정제 단계를 최적화함으로써, U1 snRNP 정제 품질의 음의 얼룩에 적합 전자 냉동 현미경 (냉동-EM) 연구 양이다. 구조 연구를위한 기본 복합체의 정제를위한 최적화 된 TAP 방식 프로토콜이 설명된다.

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Protocol

참고 : 다음 프로토콜 세포 배양의 4 L, 세포의 약 40g 습 중량에서 복잡한의 정제를 위해 고안되었다. 일단 준비, 모든 버퍼가 4 ° C에서 보관 및 준비 개월 이내에 사용해야합니다. 환원제와 단백질 분해 효소 억제제는 사용하기 직전에 버퍼에 추가됩니다.

탠덤 선호도 정화에 대한 전체 세포 추출물 1. 준비

  1. S.의 성장 cerevisiae의 세포
    1. 킬 원하는 TAP는 S. 태그 cerevisiae의 변형 스토리지에서 (-80 ° C) 효모 펩톤 덱 스트로스 상 (YPD) 판. 효모 세포는 흰색 털이 나타날 때까지 5 일 (30 ° C를) - 3 품어.
    2. 50 ML 원뿔 폴리 프로필렌 원심 분리 관에 10 ml의 YPD 매체로 판에서 신선한 세포의 약 2mm 2의 행진을 접종한다. 분당 180 회전 수 (rpm) 하룻밤 (° C ~ 30m)에서 튜브를 흔들어.
    3. 오버 2 ㎖를 접종2 L의 삼각 또는 삼각 플라스크에 YPD 매체의 리터당 밤 문화. 180 rpm으로 (30 °에 C)에서 흔들어. 24 시간 - 늦은 로그 단계까지 2-1.8의 OD (600), 일반적으로 20을 600 nm의 (OD 600)의 광학 밀도에서 세포의 성장을 모니터링합니다.
  2. 수확 S. cerevisiae의 세포
    1. 원심 분리하여 수확 세포 15 분 (4 °에 C)에 대한 5,400 XG에.
    2. 빨리 뜨는을 가만히 따르다 4 ° C 또는 얼음에 세포를 유지합니다.
    3. 용해 완충액 차가워 2 mL를 세포 펠렛 각각 리터 일시 (10 mM 트리스 - 염산, pH가 8.0, 300 mM의 염화나트륨, 10 mM의 KCl을 0.2 mM의 EDTA, pH가 8.0, 5 mM의 이미 다졸, pH가 8.0, 10 % 글리세롤; 0.1 % v / V를 NP-40). 소용돌이 및 / 또는 반복 피펫은 10 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여 세포를 일시 중단합니다.
      참고 : NP-40의 중요성은 복잡한 품질 및 사후 정화 분석이 아래에 설명되어 관련이있다.
    4. 빈 50 ml의 원추형 폴리 프로필렌 원심 분리 튜브 (K)에 세포 현탁액을 전송얼음에 EPT. 냉각 용해 버퍼의 추가로 2 ㎖로 각각의 원심 분리기 병을 세척하고 50 ML 튜브에 세포 현탁액에 추가 할 수 있습니다.
    5. 튜브를 칭량 빈 튜브의 중량을 감산뿐만 아니라 가산 용해 완충액으로 세포 펠렛의 습윤 중량을 결정한다.
      참고 : OD 1.8 (600)을 갖는 세포 배양의 리터가 약 10 g이다.
    6. 50 ML 원뿔 폴리 프로필렌 원심 분리 관에 액체 질소 목욕을 만듭니다. 5 ML의 주사기에 현탁 세포를 그립니다. 주사기로 16 G 바늘을 연결합니다. 셀 생성하는 주사기 / 바늘을 통과시켜 세포 현탁액을 정지 "액적." 동결의 비율은 약 1 분 / ㎖해야합니다.
    7. 냉동 세포 방울을 저장 (-80 ° C) 또는 용해를 진행합니다.
  3. 용균 세포와 해물 대한 설명
    1. 를 Lyse 커피 분쇄기를 사용하여 효모 세포. 는 C를 흔들어 섞으면 서 25 초, 버스트 연삭과를 Lyse 세포 여덟 아홉 배offee 분쇄기입니다. 사용하기 전에, 액체 질소로 커피 분쇄기 미리 차게. 연삭의 모든 두 라운드는 분쇄기에 액체 질소의 얕은 층을 추가하고이 증발 할 수 있습니다.
    2. 응집으로부터 세포를 유지하기 위해 필요에 따라 액체 질소 냉각 주걱으로 교반 하였다. 세포 응집을 초래할 수 세포의 해동을 방지하기 위해주의하십시오. 세포 용해 다음과 같은 미세한 백색 분말로 나타납니다. 효모 배양 (~ 40g)의 4 L의 최대 세포 펠릿은 시간에 접지 될 수있다.
      참고 : 용해 방법에 대한 관찰은 아래에 설명되어 있습니다.
    3. 혈구 세포 또는 다른 계산 방법을 이용하여 세포 용해의 정도를 평가한다. 적절한 분석을 제공하기 위해, 다음 샘플을 (1) 용해 전; (2) 용해 네 라운드 후; 및 (3)의 용해를 수행. 이러한 샘플을 확인하려면, 1.5 ML 튜브에 액체 질소 냉각 주걱과 장소 세포의 작은 금액을 가져 가라.
    4. 세포의 세포를 해동되면, 피펫 5 μL495 ㎕의 물을 섞는다. 40 경우 - 세포의 60 % 용해가 관찰, 프로토콜의 다음 단계로 진행합니다.
      참고 : 용해 장기간의 효과에 대한 관찰은 아래에 설명되어 있습니다.
    5. 일단 적절한 용해가 관찰, 저장 용해 세포 (-80 ° C) 또는 다음 단계로 진행합니다.
    6. 1mM의 페닐 메탄 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF), 1 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT) 및 프로테아제 억제제의 칵테일 포함 시판 15 ml의 용해 완충액으로 각이 50 ml의 원추형 폴리 프로필렌 원심 분리 튜브를 준비한다.
      주 : 단백질 분해에 중요한 관찰되면, 프로테아제 결핍 균주의 사용을 고려한다.
    7. 준비된 50 ㎖ 튜브에 고정 된 용해 세포 분말을 퍼하기 위해 액체 질소 냉각 주걱을 사용합니다. 환원제 및 프로테아제 억제제 (들) 모두를 함유하는 용해 버퍼 점진적 고체 전지 분말을 추가 /.
    8. 해동로 / 형성되는 거품을 방지 할 세포를 용해하지만, 그래서 부드럽게 RT에서 50 ㎖ 튜브를 회전합니다. 에이셀 분말 / 고체 용해가 추가 세포를 고체 / 분말을 추가에요.
    9. 각각 약 20 세포의 g 또는 추가 된 모든 셀이 될 때까지이 50 ㎖ 튜브를 각각 입력합니다. 50 ml의 튜브에서 관찰 동결 된 세포 덩어리가 없을 때까지 해동 / 용해를 계속합니다. 이 약 50 분 소요됩니다.
    10. 25,000 XG (4 ℃)에서 20 분 동안 현탁 된 세포 용 해물을 원심 분리기. 잘 용해 세포 흑색 침전물을 소량을 나타낼 수있다.
    11. 초 원심 분리기 튜브 (사용 26.3 ml의 튜브) 폴리 카보네이트와 각 전체 튜브에 10 ㎕의 200 mM의 PMSF를 추가하는 상층 액의 50 ㎖를 전송합니다.
    12. 100,000 XG (4 °에 C)에서 1 시간 동안 원심 분리기. 4 층은 아래에서 위로, 볼 수 있어야합니다 : (1) 하드 명확한 펠렛, 리보솜 복합체를 함유 (2) 소프트 지질 과다 펠렛; (3) 세포의 가용성 단백질 및 복합체의 대부분을 함유하는 큰 투명한 황색 띤 층; 및 (4) '비늘'상층 지질 이루어지는.
    13. 모든의를 수행추운 방 (4 ° C)에서 ubsequent 단계. 1 ml를 피펫을 사용하여 가능한 한 최고 '비늘'지질 층의 정도를 제거하고 폐기합니다. 옐로우, 클리어 층의 대부분을 복구하는 데 10 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용합니다.
    14. 아래 두 층을 방해하지 않도록하기 위해 1 ML의 피펫을 사용하여이 계층의 마지막 몇 mL로 복구 할 수 있습니다. 40g 습윤 세포 펠릿에서 중간층의 약 48 ml의 통상적 회수 및 지방층 8 ml를 폐기 / 제거.
      주 : 칼럼 정제 흐름이 크게 후술 또한 복합체의 품질이 저하 될 수 지질의 존재에 의해 방해된다.

2. 열 정제 단계 1 : IgG의 크로마토 그래피

  1. 수지 평형 및 바인딩
    1. 세포 펠렛 40 g을하는 300 μL의 IgG 세 파로스 슬러리를 준비한다. 슬러리 피펫을 용이하게하기 위해 1 ml의 피펫 팁의 끝 부분을 잘라. 워시 / 5 ml의 IgGD150 Buffe와 IgG의 수지 세 번, 매번 평형R (10 mM 트리스 - 염산, pH가 8.0, 150 mM의 NaCl을 150 밀리미터의 KCl, 1 mM의의 MgCl 2, 5 mM의 이미 다졸, pH가 8; 0.1 % V / V의 NP-40 1 mM의 DTT 50 당 단백질 분해 효소 억제제 태블릿 ML의 볼륨).
      1. 스핀은 세척 사이 160 XG (4 °에 C)에서 펠렛과 뜨는을 제거합니다.
    2. 2 시간 (4 °에 C)에 대한 적절한 회전을 사용하여, 중간 단계의 상층 액과 세포의 40g 당 두 개의 미니 프로테아제 억제제 정제와 IgG의 수지를 돌립니다. 이 배치의 IgG 용액이다.
    3. 평면 컷을 생성하기 위해 컬럼의 끝을 절단하여 사용이 10 ml의 폴리 준비 열을 준비합니다. 중력 흐름에 의한 열의 포장 및 세척을 촉진하기 위해, ~ 10 ml의 컬럼 당 IgG에 배치 용액 25 ml에 200 포장의 IgG 수지의 μL 또는 최대로드합니다.
    4. 열로 IgG를 배치 솔루션을 붓고 중력에 의해 침전 할 수 있습니다. 침전이 30 분보다 더 오래 걸리는 경우 원심 분리기 t에서 중간 단계를 복구 할 때, 가장 가능성이 지질 오염을 발생했습니다ubes.
    5. IgGD150 버퍼의 네 개의 연속 10 ml의 볼륨으로 충전 탑을 씻으십시오.
  2. 열 TEV 절단에
    1. 칼럼의 바닥을 밀봉 IgGD150 버퍼 1 mL 및 TEV 프로테아제 100 ㎕ 추가 (0.6 ㎎ / ㎖ 주식을, TEV의 돌연변이 변종 S219V는 자체 생산). 칼럼의 상단을 밀봉하고 20 분 (18 ° C를) 750 rpm으로 진탕, 열 믹서를 사용하여 혼합한다. 재현 탁 수지는 1 시간 배양 총 반복, 20 분 동안 다시 한 번 더 혼합.
      참고 : 최소 배양 시간을 유지하는 것이 중요하다.
    2. 4 ° C에 열을 반환하고 중력에 의해 단백질 / 복합을 용출. IgGD150 버퍼의 추가 200 μL와 죽은 볼륨을 용출.

3. 칼럼 정제 단계 2 : 칼 모듈 린 친 화성 크로마토 그래피

  1. 수지 평형 및 바인딩
    1. 셀의 40g 당 칼 모듈 린 친 화성 수지의 200 μl를 준비작은 공. 150 mM의 염화나트륨, 10 mM의 KCl을 5 ml의 칼 모듈 린은 버퍼 (10 mM 트리스 - 염산, pH가 8.0 바인딩과 수지 세 번, 매번 세척 1 ㎜의 MgCl 2, 5 mM의 이미 다졸, pH가 8; 2 mM의 CaCl2를 0.1 % v / V를의 NP-40 10 MM의 β-머 캅토 에탄올), 160 XG (4 ° C)에서 원심 분리는 각각의 세척을위한 펠렛합니다.
    2. 각 1 ml의 IgG의 용출에, 버퍼 바인딩 칼 모듈 린의 3 볼륨을 추가합니다. 일정 칼슘 수준을 유지하기 위해, 염화칼슘 (2) 및 β-머 캅토 에탄올은 IgG의 용출에 이러한 성분의 부족을 고려하여 추가 할 수 있습니다. 최종 농도는 2 mM의 염화칼슘이 10 MM의 β-머 캅토 에탄올해야합니다.
    3. 칼 모듈 린 수지에 샘플을 추가하고 튜브 회를 사용하여 1 시간 (4 °에 C)에 대한 결합한다.
  2. 포장 및 칼 모듈 린 수지에서 용리
    1. 평면 구멍을 만드 럼의 끝을 절단하여 100 ㎕의 칼 모듈 린 슬러리 당 2 ml의 폴리 준비 열을 준비합니다. 공동마다 더 이상 100 ㎕의 칼 모듈 린 슬러리를로드하지시료 수지의 양을 최소화 lumn 용출시에 접촉.
    2. 중력에 의해 열을 포장하고 5 ml의 칼 모듈 린 바인딩 버퍼로 열 세 번 수지를 씻는다.
    3. 150 mM의 염화나트륨, 10 mM의 KCl을 1 밀리미터의 MgCl 2, 5 mM의 이미 다졸, pH가 8.0, 4 mM의 EGTA, pH가 8.0, 0.08 %의 V 200 μL 모듈 린 용출 완충액 (10 mM 트리스 - 염산, pH가 8.0을 첨가하여 단백질을 용리 / V NP-40 10 MM의 β-머 캅토 에탄올). 칼 모듈 린 용출 버퍼 200 μL의 6 배 추가를 반복합니다.
    4. 용리 1 내지 3의 경우, 컬럼에 볼륨을 적용하고 즉시 용출액을 수집한다. 용출 4 칼럼의 바닥을 밀봉하고 2.5 분 동안 용출 완충액으로 부화 후 개봉 및 중력에 의해 용출 할 수있다. 용출 5, 5 분 동안 배양 한 후 봉인을 해제하고 용출. 용출 6, 10 분 동안 배양 한 후 봉인을 해제하고 용출.
      참고 : 복잡한의 무결성 용리 다릅니다 / 분획 (대표 결과 섹션 참조) <./ 리>
    5. 용리 2 개별적 밤새 적절한 마이크로 투석 법을 이용하여 투석을 6. 투석 버퍼에 대한 분수 투석 (10 mM 트리스 - 염산, pH가 8.0, 150 mM의 NaCl을 10 밀리미터의 KCl을 1 밀리미터의 MgCl 2, 5 mM의 이미 다졸, pH가 8; 10 MM의 β-머 캅토 에탄올).
      참고 : NP-40은 투석막을 통해, 모든 경우에, 상당히 전달하지 않습니다.

4. 후 정화 분석은 복잡한 품질을 평가하는

  1. 기본 젤과 실버 염색
    1. 제조업체의 지침에 따라 단지의 분석을 위해 16 % 프리 캐스트 기본 젤 - 4를 준비합니다. 젤 위에 투석 칼 모듈 린의 용출 / 분수의 각각의 적절한 분자량 단백질 표준 및로드 15 μl를 사용합니다.
    2. 약 3 시간 (4 °에 C) 150 V에서 젤을 Electrophorese.
    3. 실버 여섯 용리 각각의 품질을 평가하는 젤을 염색. 또는, 동등하게 중요한 상업을 사용형광 염색 (들). 이 단계에서, 착물의 농도는 쿠마시 블루 염색의 검출 레벨 이하 대부분이다.
  2. 추가 젤 분석 방법
    1. 웨스턴 블로 팅에 의해 단백질을 감지하기 위해, SDS 또는 기본 PAGE에 의해 복잡한을 해결 한 후 제조업체의 지침에 따라 같은 TAP 태그 항체를 사용하여 칼 모듈 린 바인딩 펩타이드 (CBP) 에피토프의 젤을 조사.
    2. 특정 형광 염색 (들)을 사용하여, 정제 TAP 컴플렉스의 존재하에 단백질 및 / 또는 핵산의 무결​​성을 확인한다. 더 스펙트럼 중첩이 얼룩 사이에 감지되지 않도록주의하십시오.
  3. 네거티브 얼룩 전자 현미경 시각화
    1. 복잡한 응용 프로그램의 30 분 이내에, 글로우 방전 30 초 동안 -15 mA에서 연속 탄소 격자를 사용합니다.
    2. 그리드에 (일반적으로 1 nm의 농도) TAP 정제 단지의 3 μl를 적용합니다. 분 동안 품어. 오 F여분의 버퍼를 제거하는 격자의 측면 ROM.
    3. 탈 이온수 20 μl의 방울 두 번 씻으십시오. 세척과 측면 오.
    4. 50 μl의 부정적인 얼룩 드롭에 그리드를 적용하고 분 동안 품어. 우라 닐 아세테이트 (2 %) 또는 우라 닐 포르 메이트 (0.75 %)와 염색을 권장합니다.
      주의 : 우라 닐 염 및 솔루션은 약하게 방사성하고 중금속이 포함되어 있습니다. 이러한 관심과 제도적 권장 폐기물 지침에 따라 폐기해야합니다 이러한 솔루션과 접촉하는 모든 물질로 처리해야합니다.
    5. 블로 팅하지 않고, 신선한 50 μl의 부정적인 얼룩 드롭에 그리드를 적용합니다. A 최소, 다음 측 오 부화, 그리고 마지막으로 건조 공기 및 시각화.
  4. 극저온 전자 현미경 (극저온 EM) 시각화
    1. 최적화해야 할 수도 있지만 제조 업체의 프로토콜에 따라, TAP 정제 복합체 냉동-EM을 수행합니다.
      참고 : 세제의 존재를 높은 농도의 엄마에Y 진행을 방해하고 아래에 설명되어 있습니다.

5. 복잡한 스토리지

  1. 스토리지에 대한 복잡한 준비
    1. 필요한 경우 복합체에 대한 적절한 분자량 컷 - 오프를 갖는 원심 필터를 사용하여, 상기 복합체를 농축시킨다. 원하는 농도에 도달 할 때까지 1 분 간격으로 14,000 XG 스핀.
      참고 : 필터도 투석 막을 통과하지 않는 NP-40 농도는 집중하는 동안 농도가 증가 할 것이다.
    2. 플래시는 액체 질소 나 드라이 아이스에 30 μL 씩의 복잡한 에탄올 욕을 냉각 동결하고 -80 ° C에 저장합니다.
  2. 세제의 선택 후 정제 제거

참고 사항 : NP-40 및 방해 또는 일부 애플리케이션에 대한 진행을 억제 할 수는 임계 미셀 농도의 상기 농도의 세제의 존재. 프로토로부터 제거의 결과다른 첨가제 또는 공용 매와 ​​COL뿐만 아니라 교체는 아래에 설명되어 있습니다. 더 NP-40가 요구되지 않는 경우, 옵션은 예 바이오 비드, 제거를위한 상용 프로그램을 사용하는 것이다.

  1. 투석 버퍼에 미리 평형 시판 세제 흡수 구슬. (일반적으로 10 nM의 농도에서) 단지의 30 μL에 5 구슬을 섞는다.
  2. 얼음에 15 분 동안 TAP 정제 단지와 단계 5.2.1에서 평형 구슬을 품어. 세제의 제거 다음 몇 시간 내에 복잡한을 사용합니다.

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Representative Results

수정 된 TAP 방법 S.로부터 정제 하였다 U1 snRNP, 18 서브 유닛의 리보 핵산 단백질 복합체를 cerevisiae의. 게시 된 프로토콜 2,3 다음 단지의 초기 TAP 정화는 실버 세 밴드는 천연 폴리 아크릴 아미드 겔 (그림 2A)을 염색으로 마이그레이션, 이기종 등장 복합체를 얻었다. 탭 방식의 최적화의 여러 라운드는보다 균일 어셈블리 (그림 2A)를 나타내는 기본 겔로 주로 단일 밴드를 마이그레이션 복합체를 얻었다. 형광 염료를 사용하여 단백질 및 핵산 모두에 대해 염색하기 위해서는 정제 된 복합체가 모두 생체 고분자 본 (도 2b)을 설치 한 것으로 하였다.

정제 된 복합체는 SDS 페이지와 TAP 태그 항체 (도 3a)을 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석 하였다. NATI과 일치젤 결과를했습니다, 게시 된 프로토콜에 따라 정제 복잡한은 TAP의 단백질 분해 단백질 (Snu71를) 태그 보였다. 단백질 분해의 양 단, 크게 TAP 방법의 변형으로 감소되었다. 거의 모든 U1 snRNP 복합체의 열일곱 단백질은 SDS 페이지에 의해 해결하고 긍정적으로 MALDI 질량 분석 (그림 3B)에 의해 확인되었다. 뿐만 아니라 네이티브 및 SDS 페이지로 복잡한 품질은 부정적인 얼룩 전자 현미경 (그림 4)에 의해 정화의 다른 단계에서 평가 하였다. 4C에서 그림 4aB에서 관찰하지만 결석 단 분산 입자 구조 연구를위한 좋은 샘플의 예입니다. 이 분석 방법은 TAP 방식의 변경의 영향에 관한 중요한 통찰력을 제공.

탭있어서, 상기 비이 온성 세제 NP-40 포함되도록하고 진한에서 호출그 임계 미셀 농도 (CMC)의 상기 entration. 프로토콜에 기재된 착물의 ​​품질을 평가하기위한 방법의 견고성은 당 양쪽이 온성 계면 활성제 CHAPS, 글리세롤 없거나 보조 용매는 NP-40 모든 버퍼에서 (도 5)로 대체 한 실험에 의해 증명된다. 천연 PAGE 및 네거티브 얼룩 EM으로 U1 snRNP에는 보조 용매를 첨가하지 글리세롤 CHAPS에서 안정성이 감소하는 NP-40의 가장 균일하고 안정적​​으로 나타난다. 그것은 효모 U1의 snRNP는 소수성면이 표면을 코팅하여 NP-40을 방지 집계의 존재를 가지고있을 수 있습니다. 불행히도, NP-40을 투석에 의해 제거 될 수없고 단지 농축하여 후 NP-40에 집중된다. 높은 NP-40은 복잡한 교란을하지 않은 것으로 보입니다 반면, 부정적 관찰되었다 냉동-EM 큰 미셀 같은 집계에 대한 유리체 얼음 입자의 동결에 영향을 미칠 않았다. 세제 흡수 비즈 연구에 성공적으로 사용되었다가져 가십시오 구조적으로 복잡한 영향을 나타나지 않고 NP-40 U1 snRNP 샘플로부터의 대부분.

입자와 특유의 대표 클래스의 평균 (그림 6)의 잔디의 이미지에 의해 입증 프로토콜, 부정적인 얼룩 및 냉동-EM 모두 복잡한 적합한에 설명 된 수정과 복잡한의 정제에 이어, 얻었다.

그림 1
그림 탠덤 선호도 정화 (TAP) 방법 1. 개요. (A) 두 단계 TAP 방법의 개략도. 관심 (회색)의 복합은 TAP가 (블랙, U1 snRNP 서브 유닛 Snu71) 서브 유닛 태그 포함 genomically 칼 모듈 린 바인딩 펩타이드로 구성된 순서와 융합 (CBP, 녹색), 사이트 별 단백질 분해 효소에 대한 인식 부위 TEV (블루) 두 IgG의가 (잠를 단백질 A의 영역을 결합 레드). 첫 번째 단계에서, 세포 용 해물은 IgG의 수지와 함께 배양하고, 복합 단백질 시퀀스와의 상호 작용을 통해 유지된다. 복잡한은 TEV 매개 절단에 의해 수지로부터 방출된다. 제 2 단계에서, 복합체는 칼 모듈 린 수지, 칼슘 의존적 반응과 함께 배양된다. 복잡한은 칼슘 킬레이트 EGTA의 추가를 통해 발표된다. TAP에 다음 (B) 웨스턴 블롯은 (A)에 도시 된 정제 단계를 통해 단백질 태그. 샘플은 첫번째 단계 후에, 세포 용 해물의 촬영 및 TAP 방법의 제 2 단계 이후 하였다. 세포 용 해물에서 관찰 반응성 단백질은 TEV 단백질 분해 효소 절단 및 단백질 시퀀스의 따라서 손실 다음, 1 단계 이후 빠르게 마이그레이션합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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탭 방법 2. 최적화 그림. (A) 실버 TAP 정제 단지의 기본 젤 스테인드. 의 기본 페이지 : 단백질 표준 (레인 1); 복잡한 원래 TAP 방법 3 (레인 2)에 따라 정제, 세 밴드가 관찰 (화살촉); 버퍼링 변경 다음과 같은 TAP 정화에서 세 개의 연속 용리는 두 개의 밴드 (화살촉) (레인 3-5)을 관찰; 주로 ~ 800 kDa의에서 마이그레이션하는 하나의 복잡한 밴드 (레인 6)를 산출 탭 방법을 추가로 변경. (B) 정제 단지의 조성 분석 단백질과 RNA 반응 얼룩 모두 하나의 겔 차선을 염색하여. 의 기본 페이지 : 단백질 형광 염색으로 염색 단백질 표준 (레인 1); 복잡한 단백질 형광 염색 (레인 2), 관찰이 밴드 군데; 레인 2는 동일 차선 지금 핵산 형광 염색 (레인 3), 두 개의 밴드가 관찰 이미지화; 이상 형광 신호레인 2, 3 (레인 4)에서 염색 단지의 배치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
TAP 방법 3. 최적화 그림. (A) 복잡한 품질 개선의 웨스턴 블롯 분석은 다음과 TAP는 서브 유닛 Snu71은 α-TAP 항체로 프로빙 태그. 몇몇 proteolyzed 밴드 (레인 1) 처음에 가시적이지만 개선이 상당히 낮은 대역의 양 (레인 2 및 3). (B) 형광 단백질 겔 염색을 대표 SDS 겔을 감소시킨다. 젤 복합체의 17 단백질 서브 유닛 (12) 해결합니다. 밴드에서 단백질의 정체성은 질량 분석에 의해 설립되었습니다. larg의를 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 어 버전입니다.

그림 4
. 복잡한 후의 네거티브 얼룩 전자 현미경에 의한 네거티브 얼룩 전자 현미경 평가에 의해 평가 탭 방법에서의 단계에서도 4의 샘플 품질 : (B) TAP의 2 차 공정 (A) TAP의 1 회분 공정 (C ) 단지는 불안정. 스케일 바, 125 nm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
TAP 방법 버퍼에 존재 첨가제의 샘플 품질 그림 5. 영향 레인 1 -. 4 (c)의 TAP 정화의 최종 2 단계의 처음 네 용리 있습니다의 존재하에 정제 omplex : (A) 비 - 이온 성 세제 노닐 phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), 천연 PAGE (위)과 음극 얼룩 EM (아래)에 의해 분석하여, (B)에 양쪽이 온성 세제 3 - [(3- 기본 페이지 (위)와 음의 얼룩 EM (아래)에 의해 분석 (C) 글리세롤; 기본 페이지 (위)과 음극 얼룩 EM (아래)에 의해 분석 cholamidopropyl) dimethylammonio] -1- 프로판 설포 네이트 (CHAPS); 및 기본 페이지 (위)과 음극 얼룩 EM (아래)에 의해 분석 (D) 아니 첨가제,. 스케일 바, 50 나노 미터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
TAP 방법 그림 6. 시각화는 복잡한 정제. (A) 탑, 부정적인 얼룩 전자 microsco의 대표 이미지평 (EM) 현미경 사진. 유사하게 모양의 입자의 잔디가 인 관찰이는 최적화 된 TAP 방법에 의해 정제, 박스 있습니다. 바닥, 입자 구별 기능을 강조 입자의 촬영 수준의 평균의 선택. 스케일 바, 50 nm의. (B) 탑, 크라이-EM 현미경의 대표 이미지입니다. 박스 이러한 두 영역을 참조 관측은, 입자의 높은 콘트라스트의 대표적인 지역이다. 유리체 얼음에 고정 선택된 입자의 하단 수준의 평균. 스케일 바, 50 나노 미터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

탭 방식 꽉 선택적 생리 용액 상태의 가까이 유지하려는 욕구와 친 화성 수지에 결합하기위한 필요성의 균형을 두 개의 태그를 이용한다. 이 균형은 정제 후 특성에 대한 계수 (들)와 상호 작용하는 태깅 된 단백질의 안정한 상호 작용 (들)을 유지하는 역할을한다. 또한, 개별 TAP 한 어떤 효모 복잡한에 대한 태그 단백질과 어떤 효모를 얻을 수 있도록하는 ORF는 상용 소스에서 사용할 수있는 태그. 복합체의 무결성 및 정제에 대한 복소 상이한 태그 된 단백질 서브 유닛의 사용을 테스트 할 수있는 자원의 가용성을 보존하는 천연 복합체를 정제 용 TAP 방법을 이용하는 두 가지 장점이있다. 그러나 원래 TAP 방식 프로토콜은 복잡한 정제가 구조적으로 그리고 구조적으로 균일하도록 고안되지 않았다. 이 목표를 달성하기 위하여, 위에서 설명한 바와 같이 TAP 방식은 따라서 수정되었다.

여러TAP 방법의 단계는 조성 및 구조 균일 한 복합체를 정화 할 수있는 최적의 방법과 조건을 설정하는 평가 하였다. 초기 중요한 단계는 세포 용해된다. 즉, 동종, 얻어진 복합체는 고품질 인 것을 보장하면서이 공정은 높은 수율 때문에 최대 용해 하나의 욕구의 균형을 요구한다. 용균 효모 세포에 다른 접근이 비드 비터 높은 투명 유체 프로세서 및 볼밀 포함 탐구 하였다. 덜 비싼 커피 분쇄기의 사용은 다른 방법보다 효율적이었다 (40-60% 용해)하지만, 이러한 접근 방법의 몇 가지 중 하나를 교란 입자의 무결성 또는 응집이 발생할에 등장하는 동안 고립 된 복잡 정제는 단 분산 나타났다. 고품질 착체를 얻었다 보장하도록 결국 세포의 상당수는 용해되지 않았다. 40 동안 - 60 %의 용해가 효모 U1의 snRNP에 이상적인이 프로토콜을 적용 할 때, 최적화 제안 새로운 생물학적 복잡한.

이는 복잡한 무결성 희석으로 인해 세포 프로테아제 소단위 해리에 의해 손상되지 않았 음을 확인하기 위해 정제를 촉진 할 수있는 방법의 단계를 식별하는 데 중요이고, TEV 단백질 분해 효소 절단 동안 18 ° C에서 배양을 연장. 시간을 효율적으로 정화를 달성하기 위해 하나의 간단한 단계는 지질 중력 정화 동안의 흐름을 방해하기 때문에 지질은, 초기 해물 설명에서 이월되지 않았 음을 확인했다. 다른 단계들은 효율적인 정제 및 최대 유속을 달성하기 위해 양 수지 컬럼 크기 / 치수의 최적 균형을 식별 포함. 특히 중요한 단계 TEV 단백질 분해 효소에 의해 열 분해에서의 시간을 단축 할 수 있었다. 사용 TEV 단백질 분해 효소는 무료 및 고농도 (17)에 그것을했다 프로테아제 / 뉴 클레아을 보장하기 위해 집에서 정제 하였다. TEV 단백질 분해 효소의 상당한 양의 시간에서의 완전한 분열을 얻기 위해 사용되었다.

초기 TAP 정제를 단백질 분해에 ontent는 "> 관찰 하였다. 정제 동안 단백질 분해가 효율적으로 작동 억제제 전지를 첨가하고, 정제 염분 세척 포함한 의해 제한 될 수있다. 정제의 전반에 걸쳐 공급되는 프로테아제 억제제의 광범위한 크게 TAP의 안정성이 단백질과 복합체를 태그로 개선되었다. 또한, 단백질 가수 분해는 세포 용해 및 정제 IgG의 단계에서 300 mM의 500의 일가의 농도를 증가시킴으로써 최소화 하였다. 심지어 TAP 방식으로 상기 수정을 연속 용출 작곡 균질성의 학위에 달라진다 CBP 친 화성 수지의 오프 분획. 따라서, 둘째, CBP 크로마토 그래피 단계에서 분수의 선택 풀링, 보증합니다.

특히 포커스 TAP 수신 방법의 일 실시 형태는 복잡한 정제 및 CMC보다 높은 농도로 비 이온 세제 NP-40의 중요성이다. NP-4의 존재0.08 % 이상의 농도에서 0 복잡한 무결성 최종 수율의 전반적인 유익한 효과를 가지고 있었다. NP-40의 외관상의 유익한 효과 (들)은 수지 복합체 사이의 비특이적 인 상호 작용을 감소시키는 것에 부분적으로 기인 할 수있다. NP-40을 정제하는 동안 유익한 효과를 갖는 것으로 나타나는 반면, 복잡한 응집시키지 않고 정제 후 제거 될 수있다.

마지막으로, 구조의 연구에 대한 TAP 방법을 최적화하는 중요한 컴플렉스의 완전성 및 균질성을 평가하기 위해 사용되는 여러 상보 분석 하였다. 이 포함 된 광 산란, SDS 및 천연 PAGE 웨스턴 블롯 및 / 또는 형광 염료로 염색뿐만 아니라 네거티브 얼룩 전자 현미경에 의해 TAP 항체를 사용하는 프로브. 여기에 설명 된 TAP 방법에 대한 변경 사항은 전자 현미경을위한 충분한 양의 균일 한 복합체를 얻었다. 특히 억제 추가 변경, 다른 단지에 대한 TAP 방법에 대한 될 필요가있다NP-40의 중요성 mination.

요약하면, TAP 정제 방법이 성공적으로 구조 연구에 적합한 품질의 진핵 소스 고분자 복합체를 정제하기 위해 사용될 수있다. 우리는 S.의 정화에 적합한 접근 방법을 설립 cerevisiae의 U1 snRNP 및 세부 이러한 변화의 많은 이론적 근거뿐만 아니라 촬영 단계. 다른 단지를 들어, 우리는 조사 마찬가지로 충분한 양의 복잡한의 품질을 얻을 수있는 프로토콜의 단계를 탐구하는 것이 좋습니다. 검사해야하는 단계는 세포 용해, 소금, 첨가제의 종류 및 세제 등의 농도, 칼슘 및 금속 킬레이트 EGTA에 복잡한 감도를 포함한다. 또한, 복잡한 구조를 교란하지 않고 동결 및 해동 될 수있는 장기 연구에 중요하다. 중요한 것은, 하나는 복잡한 구조를 분석하는 여러 가지 다른 방법 중 및 정제를 다음 있어야합니다. 네이티브차 SDS 페이지, 부정적 얼룩 EM 및 빛의 산란이 가장 TAP 방법을 사용하여 균일 한 복합체를 정제하는 방법에 대한 조사에서 잘 우리를 역임했다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
S. cerevisiae TAP tagged strain Open Biosystems YSC1177 This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6
Coffee grinder Mr. Coffee IDS77 Used for cell lysis
Hemocytometer, Bright Line Hausser Scientific 3120 Used to assess cell lysis
JA 9.100 centrifuge rotor  Beckman Coulter, Inc. Used to harvest the yeast cells
JA 20 fixed-angle centrifuge rotor Beckman Coulter, Inc. Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material
Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor Beckman Coulter, Inc. Used to further clear the soluble cell extract
Thermomixer Eppendorf R5355 Temperature controlled shaker
Novex gel system Thermo Fisher Scientific 
IgG resin GE Healthcare 17-0969-01 Sepharose 6 fast flow
Calmodulin resin Agilent Technologies, Inc. 214303 Affinity resin
Protease inhibitor cocktail, mini tablets Sigma Aldrich 589297 Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets
Protease inhibitor cocktail, large tablets Sigma Aldrich 5892953 cOmplete ultra EDTA-free tablets
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Dissolved in isopropanol
2 ml Bio-spin column Bio-Rad Laboratories, Inc. 7326008 Used to pack and wash the Calmodulin resin
10 ml poly-prep column Bio-Rad Laboratories, Inc. 7311550 Used to pack and wash the IgG resin
Precast native PAGE Bis-Tris gels Life Technologies BN1002 Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% precast polyacrylamide gels
NativeMark protein standard Thermo Fisher Scientific LC0725 Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 μl for a silver stained gel and 5 μl for a SYPRO Ruby stained gel
Precast SDS PAGE Bis-Tris gels Life Technologies NP0321 Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% precast polyacrylamide gels 
PageRuler protein standard Thermo Fisher Scientific 26614 Unstained protein standard used for Western blotting
SDS running buffer Life Technologies NP0001 1x NuPAGE MOPS SDS Buffer
TAP antibody Thermo Fisher Scientific CAB1001 Primary antibody against CBP tag
Secondary antibody Thermo Fisher Scientific 31341 Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated
BCIP/NBT Thermo Fisher Scientific 34042 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium 
Dialaysis units Thermo Fisher Scientific 88401 Slide-A-Lyzer mini dialysis units
Centrifugal filter units, 100kDa MWCO EMD Millipore UFC5100008 Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane
Detergent absorbing beads Bio-Rad Laboratories, Inc. 1523920 Bio-bead SM-2 absorbants
SYBR Green II Thermo Fisher Scientific S-7564 Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm
SYPRO Ruby Molecular Probes S-12000 Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm
Copper grids Electron Microscopy Sciences G400-CP

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